CN116400001A - 一种珍珠透骨草的薄层鉴别方法及其应用 - Google Patents

一种珍珠透骨草的薄层鉴别方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种珍珠透骨草的薄层鉴别方法及其应用，所述薄层鉴别方法包括以下步骤：将对照品、对照药材和供试品用薄层板展开、显色，检视，供试品色谱中，在与对照品色谱、对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点；所述薄层鉴别方法中，展开剂包括乙酸乙酯和石油醚；所述对照品包括β‑谷甾醇。本发明中，所述薄层鉴别方法能够清楚、高效的分离、鉴别珍珠透骨草中的有效成分，Rf值适中；并且能够准确富集、纯化对照品，且工艺简单、无需使用有毒试剂、成本低，对于珍珠透骨草药材、标煎及其配方颗粒都能够有效鉴别，且专属性好，对于温湿度具有较好的耐用性，采用不同薄层板均可有效鉴别。

Description

一种珍珠透骨草的薄层鉴别方法及其应用
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种珍珠透骨草的薄层鉴别方法及其应用。
背景技术
透骨草始载于《本草原始》，云：“透骨草苗春生田野间，高尺余，茎圆，叶尖有齿，至夏抽三四穗，花黄色，结实三棱，类蓖麻子，五月采苗。”描述了透骨草植株形态，与现今所用之“珍珠透骨草”(即地构叶)相符，为传统药用透骨草的主流品种之一。珍珠透骨草为大戟科植物地构叶的干燥全草。其性温，味辛、苦，归肝经。具有祛风湿，舒筋，活血，止痛，解毒之功效。用于风湿疼痛，筋骨拘挛，肢体麻木、疮疡肿毒，疮癣，阴囊湿疹等症。其化学成分包括嘧啶类化合物、有机酸、挥发油类化合物、甾醇等。
珍珠透骨草作为山西的习用药材，现收录于《山西省中药材标准》(2011年版)，质量控制主要以性状鉴别、显微鉴别、浸出物含量等检验项目为主，尚未有相关指标性成分对其质量进行鉴别和评价。并且现有技术中珍珠透骨草药品的制样方法多采用减压回收、加热回流、索氏提取及萃取等，方法复杂，且提取效率低；进行薄层鉴别时，展开溶剂多采用三氯甲烷、甲苯等，但是三氯甲烷、甲苯等为易制毒、易制爆试剂，危害大；另外，珍珠透骨草药品的对照多采用对照药材，无活性成分对照品作为对照。
此外，近年来，植物甾醇由于其安全性和有效的抗炎活性而受到广泛关注。β-谷甾醇属于四环三萜类化合物，是一种化学结构与哺乳动物胆固醇类似的植物类固醇，具有降胆固醇、降血糖、抗氧化、抗炎、抑菌和类激素功能等多种生物活性，已成为生命科学各领域特别是医学领域的研究热点，而β-谷甾醇同样也是珍珠透骨草中的有效成分，因此，高效回收、富集珍珠透骨草药品中的β-谷甾醇也具有重要意义。
例如CN 103105450 A公开一种透骨草配方颗粒的薄层鉴别方法，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，对供试品以及对照药材进行展开、鉴别；所述薄层鉴别方法展开剂包括甲苯，危害大，分离效果差，并且并不适用β-谷甾醇的富集。
因此，开发一种制样效率高、分离效果好、普适性好，能够高效鉴别珍珠透骨草药材、标煎及配方颗粒中的有效成分，并且准确回收、富集β-谷甾醇，且工艺简单、成本低、无毒、环保的薄层鉴别方法，是本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种珍珠透骨草的薄层鉴别方法及其应用。所述薄层鉴别方法能够清楚、高效的分离、鉴别珍珠透骨草中的有效成分，Rf值适中；并且能够准确富集、纯化对照品，且工艺简单、无需使用有毒试剂、成本低，对于珍珠透骨草药材、标煎及其配方颗粒都能够有效鉴别，且专属性好，对于温湿度具有较好的耐用性，采用不同薄层板均可有效鉴别。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种珍珠透骨草的薄层鉴别方法，所述薄层鉴别方法包括以下步骤：
将对照品、对照药材和供试品用薄层板展开、显色，检视，供试品色谱中，在与对照品色谱、对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点；所述薄层鉴别方法中，展开剂包括乙酸乙酯和石油醚；所述对照品包括β-谷甾醇。
本发明中，所述薄层鉴别方法在以对照药材作为参照物的基础上，增加了活性成分对照品作为对照，同时采用特定的展开剂，对β-谷甾醇有更强的洗脱能力，更有利于其展开，分离效果好，薄层色谱斑点清晰，Rf值适中，实现了高效鉴别珍珠透骨草中的有效成分；所述鉴别方法重复性和专属性好，且不受环境影响，在不同温湿度下都能有效鉴别；并且能够准确富集、纯化对照品，具有很好的商业价值；工艺简单、无需使用有毒试剂、成本低，普适性好，对于珍珠透骨草药材、标煎及其配方颗粒均能够有效鉴别。
优选地，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:(0.25～6)，例如可以为1:0.25、1:0.3、1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.25、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.8、1:3.2、1:3.6、1:4、1:4.2、1:4.4、1:4.6、1:4.8、1:5、1:5.2、1:5.6、1:6等；进一步优选为1:(1.5～2.2)。
本发明中，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比在上述限定的范围内，对β-谷甾醇的洗脱能力更强、展开效果更好，从而提高了分离效率，使得薄层色谱更清晰，鉴别效率高。不在上述限定的范围内，会影响展开剂极性，导致展开剂的极性过大或过小，而极性的过大或过小都不利于斑点分离，从而影响鉴别结果。
优选地，所述石油醚的沸程为60～90℃。
优选地，所述薄层板展开前还包括分别制备对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液。
优选地，所述对照品溶液的制备方法包括：将对照品与第一溶剂混合，得到所述对照品溶液。
优选地，所述第一溶剂包括甲醇水溶液。
优选地，所述甲醇水溶液的体积浓度为80～100％，例如可以为80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％、100％等。
本发明中，所述体积浓度为100％，即指溶剂为甲醇。
优选地，所述对照品溶液的浓度为0.1～4mg/mL，例如可以为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL、2mg/mL、2.2mg/mL、2.4mg/mL、2.6mg/mL、2.8mg/mL、3mg/mL、3.2mg/mL、3.4mg/mL、3.6mg/mL、3.8mg/mL、4mg/mL等。
优选地，所述对照药材溶液的制备方法包括：将对照药材与第二溶剂混合，得到所述对照药材溶液。
优选地，所述对照药材包括珍珠透骨草。
优选地，所述第二溶剂包括甲醇。
优选地，所述对照药材与第二溶剂的质量体积比为(0.5～6):25g/mL，其中，(0.5～6)中的具体取值例如可以为0.5、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5、5.2、5.4、5.6、5.8、6等；进一步优选为(1～3):25g/mL。
优选地，所述对照药材与第二溶剂混合在超声条件下进行。
优选地，所述超声的时间为15～45min，例如可以为15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min等；进一步优选为25～35min。
优选地，所述混合后还包括过滤和/或浓缩的步骤。
优选地，所述供试品溶液的制备方法包括：将珍珠透骨草与第三溶剂混合，超声提取，得到所述供试品溶液。
优选地，所述珍珠透骨草包括珍珠透骨草药材、珍珠透骨草标准汤剂冻干粉或珍珠透骨草配方颗粒。
优选地，所述第三溶剂包括甲醇和/或乙酸乙酯，优选为甲醇。
优选地，所述珍珠透骨草与第三溶剂的质量体积比为(0.5～6):25g/mL，其中，(0.5～6)中的具体取值例如可以为0.5、0.6、0.8、1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5、5.2、5.4、5.6、5.8、6等；进一步优选为(1.2～2.2):25g/mL。
本发明中，所述珍珠透骨草与第三溶剂的质量体积比在上述限定的范围内，第三溶剂对所述珍珠透骨草的提取效果更好，进而更容易分离鉴别珍珠透骨草中的有效成分。
优选地，所述超声提取的时间为15～45min，例如可以为15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min等；进一步优选为25～35min。
优选地，所述超声提取后还包括过滤和/或浓缩的步骤。
本发明中，以甲醇为提取剂，并且所述甲醇与珍珠透骨草在特定的配比下，结合超声提取，制备得到供试品溶液更有利于后续薄层鉴别，能够提高薄层鉴别效率，且制样简单，样品损失少，成本低，安全环保。
优选地，所述对照品、对照药材和供试品的点样量为1～25μL，例如可以为1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、11μL、12μL、13μL、14μL、15μL、16μL、17μL、18μL、19μL、20μL、21μL、22μL、23μL、24μL、25μL等；进一步优选为10～20μL。
优选地，所述供试品的点样浓度为0.2～0.8g/mL，例如可以为0.2g/mL、0.25g/mL、0.3g/mL、0.35g/mL、0.4g/mL、0.45g/mL、0.5g/mL、0.55g/mL、0.6g/mL、0.65g/mL、0.7g/mL、0.75g/mL、0.8g/mL等。
本发明中，所述供试品的点样浓度和点样量在上述限定的范围内，薄层色谱斑点更清晰、分离度更好。
优选地，所述显色的显色剂包括硫酸乙醇溶液。
优选地，所述硫酸乙醇溶液的浓度为5～15％，例如可以为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％等。
本发明中，所述硫酸乙醇溶液的浓度指质量体积比；显色剂选用特定浓度的硫酸乙醇溶液，显色后能够增加斑点信息且易观察。
优选地，所述显色在加热条件下进行。
优选地，所述加热的温度为100～110℃，例如可以为100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃等；加热的时间为3～5min，例如可以为3min、4min、5min等。
优选地，所述检视在紫外光灯照射下进行。
优选地，所述紫外光灯的波长为360～370nm，例如可以为360nm、362nm、365nm、368nm、370nm等。
作为本发明优选的技术方案，所述薄层鉴别方法包括：
(1)将β-谷甾醇与甲醇水溶液混合，得到对照品溶液；将对照药材与甲醇以质量体积比为(0.5～6):25g/mL进行混合，超声15～45min，过滤、浓缩，得到对照药材溶液；将珍珠透骨草与第三溶剂以质量体积比为(0.5～6):25g/mL进行混合，超声提取15～45min，过滤、浓缩，得到供试品溶液；所述第三溶剂包括甲醇和/或乙酸乙酯；
(2)将步骤(1)得到的对照品溶液、对照药材溶液以及供试品溶液分别点于同一薄层板上，以体积比为1:(0.25～6)的乙酸乙酯和石油醚为展开剂进行展开，随后，向薄层板表面喷以浓度为5～15％的硫酸乙醇溶液，在100～110℃条件下加热3～5min至斑点显色清晰，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱、对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。
本发明中，所述薄层板包括硅胶G薄层板。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的薄层鉴别方法在分析珍珠透骨草中有效成分的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的薄层鉴别方法，采用活性成分β-谷甾醇对照品作为对照，不仅能准确鉴别珍珠透骨草的中的β-谷甾醇活性成分，还能够在硅胶板相应Rf位置，对其进行富集、分离、纯化，具有很好的商业价值；
(2)本发明提供的薄层鉴别方法，能快速有效的鉴定珍珠透骨草中的有效成分，且重复性和专属性较好，对于温湿度具有较好的耐用性，采用不同薄层板均可有效鉴别，同时大大降低了鉴别成本，提高了鉴别效率，对含有相同物质成分中药及配方颗粒鉴别具有重要意义，具有良好的应用前景；
(3)本发明提供的薄层鉴别方法安全性高、成本低，且工艺简单。
附图说明
图1为测试例1中方法一在无显色剂条件下得到的薄层色谱图；
图2为测试例1中方法一在显色剂为5％三氯化铝溶液条件下得到的薄层色谱图；
图3为测试例1中方法一在显色剂为10％硫酸乙醇溶液条件下得到的薄层色谱图；
图4为测试例1中方法二在无显色剂条件下得到的薄层色谱图；
图5为测试例1中方法二在显色剂为5％三氯化铝溶液条件下得到的薄层色谱图；
图6为测试例1中方法二在显色剂为10％硫酸乙醇溶液条件下得到的薄层色谱图；
图7为测试例1中方法三在无显色剂条件下得到的薄层色谱图；
图8为测试例1中方法三在显色剂为5％三氯化铝溶液条件下得到的薄层色谱图；
图9为测试例1中方法三在显色剂为10％硫酸乙醇溶液条件下得到的薄层色谱图；
图10为乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:2.5下对照品β-谷甾醇溶液、对照药材溶液和供试品溶液的薄层色谱图；
图11为乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:1.2下对照品β-谷甾醇溶液、对照药材溶液和供试品溶液的薄层色谱图；
图12为测试例2不同提取溶剂下的薄层色谱图；
图13为以甲醇、乙酸乙酯制备供试品溶液，不同点样量下的薄层色谱图；
图14为测试例3中不同浓度的珍珠透骨草供试品的薄层色谱图；
图15为测试例4不同供试品点样量下的薄层色谱图；
图16为测试例5专属性考察的薄层色谱图；
图17为测试例6温度为6.5℃，RH为66％下的薄层色谱图；
图18为测试例6温度为28.4℃，RH为28％下的薄层色谱图；
图19为测试例6温度为28.8℃，RH为88％下的薄层色谱图；
图20为测试例6薄层板为20200707的薄层色谱图；
图21为测试例6薄层板为1.05553.0001的薄层色谱图；
图22为测试例6薄层板为20190307的薄层色谱图；
图23为珍珠透骨草标汤冻干粉的薄层色谱图；
图24为珍珠透骨草药材的薄层色谱图；
图25为珍珠透骨草配方颗粒的薄层色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明所用仪器和材料如下：
仪器：Good Look-1000薄层成像系统(上海科哲生化科技有限公司)，JJ500电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)，MSA6.6S-OCE-DM电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)，DK-S26恒温水浴锅(中仪国科(北京)科技发展有限公司)，KQ-100DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，硅胶G板(默克化工技术有限公司，青岛海洋化工厂)；
材料：β-谷甾醇、阿魏酸、杨梅素、芦丁、咖啡酸、木犀草素、槲皮素、山奈素、香草酸。
珍珠透骨草药材：20210506-15；
珍珠透骨草标准汤剂冻干粉：20210506-1、20210506-2、20210506-3、20210506-4、20210506-5、20210506-6、20210506-7、20210506-8、20210506-9、20210506-10、20210506-11、20210506-12、20210506-13、20210506-14、20210506-15；
β-谷甾醇对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110851-201909，纯度：92.7％)；
阿魏酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110773-201614，纯度：99.0％)；
杨梅素对照品(成都埃法生物科技有限公司，批号：AF20081652，纯度：98.0％)；
芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100080-201811，纯度：92.4％)；
咖啡酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110885-200102，纯度：99.7％)；
木犀草素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111520-201605，纯度：99.6％)；
槲皮素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100081-201610，纯度：99.6％)；
山奈素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110861-201611，纯度：95.5％)；
香草酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110776-201503，纯度：99.8％)；
试剂：甲醇、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、石油醚(60～90℃)、甲酸、甲苯、乙酸丁酯、硫酸、三氯化铝为分析纯。
实施例1
本实施例提供一种珍珠透骨草的薄层鉴别方法，具体包括以下步骤：
(1)将0.5mgβ-谷甾醇对照品与1mL甲醇混合，得到对照品溶液；将1.5g珍珠透骨草对照药材与25mL甲醇混合，超声30min，过滤，将滤液浓缩至3mL，得到对照药材溶液；将1.5g珍珠透骨草供试品与25mL甲醇混合，超声提取30min，过滤，将滤液浓缩至3mL，得到供试品溶液；
(2)取步骤(1)得到的对照品溶液、对照药材溶液以及供试品溶液各15μL分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为1:2的乙酸乙酯和石油醚(60～90℃)为展开剂进行展开，随后，向薄层板表面喷洒浓度为10％的硫酸乙醇溶液，在105℃条件下加热4min至斑点显色清晰，置于365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱、对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点，从而鉴别珍珠透骨草中的有效成分。
实施例2
本实施例提供一种珍珠透骨草的薄层鉴别方法，具体包括以下步骤：
(1)将0.75mgβ-谷甾醇对照品与1mL 90％甲醇水溶液混合，得到对照品溶液；将1.2g珍珠透骨草对照药材与25mL甲醇混合，超声30min，过滤，将滤液浓缩至1.6mL，得到对照药材溶液；将1.2g珍珠透骨草供试品与25mL甲醇混合，超声提取30min，过滤，将滤液浓缩至1.6mL，得到供试品溶液；
(2)取步骤(1)得到的对照品溶液、对照药材溶液以及供试品溶液各18μL分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为1:1.8的乙酸乙酯和石油醚(60～90℃)为展开剂进行展开，随后，向薄层板表面喷洒浓度为10％的硫酸乙醇溶液，在100℃条件下加热5min至斑点显色清晰，置于365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱、对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点，从而鉴别珍珠透骨草中的有效成分。
实施例3
本实施例提供一种珍珠透骨草的薄层鉴别方法，具体包括以下步骤：
(1)将0.6mgβ-谷甾醇对照品与1mL甲醇混合，得到对照品溶液；将1.8g珍珠透骨草对照药材与25mL甲醇混合，超声30min，过滤，将滤液浓缩至3mL，得到对照药材溶液；将1.8g珍珠透骨草供试品与25mL甲醇混合，超声提取30min，过滤，将滤液浓缩至3mL，得到供试品溶液；
(2)取步骤(1)得到的对照品溶液、对照药材溶液以及供试品溶液各18μL分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为1:2.1的乙酸乙酯和石油醚(60～90℃)为展开剂进行展开，随后，向薄层板表面喷洒浓度为10％的硫酸乙醇溶液，在105℃条件下加热3min至斑点显色清晰，置于365nm紫外光灯下检视，在供试品色谱中，在与对照品色谱、对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点，从而鉴别珍珠透骨草中的有效成分。
在实施例1提供的薄层鉴别方法的基础上，进行如下测试：
测试例1
对比不同对照品、展开剂以及显色剂对珍珠透骨草供试品的薄层鉴别效果，方法如下：
方法一：同实施例1，观察分别在无显色剂、显色剂为5％三氯化铝溶液以及显色剂为10％硫酸乙醇溶液下的薄层色谱图，结果如图1(无显色剂)、图2(5％三氯化铝溶液)、图3(10％硫酸乙醇溶液)所示；
方法二：与实施例1的区别仅在于，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为3.5:1.2:1.5)的上层溶液为展开剂展开，观察分别在无显色剂、显色剂为5％三氯化铝溶液以及显色剂为10％硫酸乙醇溶液下的薄层色谱图，结果如图4(无显色剂)、图5(5％三氯化铝溶液)、图6(10％硫酸乙醇溶液)所示；
方法三：与实施例1的区别仅在于，以三氯甲烷-甲醇(体积比为30:1)为展开剂展开，观察分别在无显色剂、显色剂为5％三氯化铝溶液以及显色剂为10％硫酸乙醇溶液下的薄层色谱图，结果如图7(无显色剂)、图8(5％三氯化铝溶液)、图9(10％硫酸乙醇溶液)所示。
采用上述三种方法，以不同对照品和对照药材为对照，鉴别珍珠透骨草供试品中的有效成分；其中，薄层色谱中，从左至右依次为：1-芦丁对照品溶液；2-阿魏酸对照品溶液；3-杨梅素对照品溶液；4-咖啡酸对照品溶液；5-β-谷甾醇对照品溶液；6-木犀草素对照品溶液；7-槲皮素对照品溶液；8-山奈素对照品溶液；9-香草酸对照品溶液；10-珍珠透骨草冻干粉供试品溶液；11-珍珠透骨草对照药材溶液。
由图1-图9可知，以β-谷甾醇为对照品溶液，乙酸乙酯-石油醚(60～90℃)(1:2)为展开剂展开，能够清楚看到供试品溶液与对照品溶液、对照药材溶液在相应位置处显相同颜色的斑点，且斑点清晰，Rf值符合要求，分离效果较好；以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为3.5:1.2:1.5)上层溶液为展开剂展开时，虽然对照品溶液均展开，但无斑点与供试品溶液对应，且供试品溶液与对照药材溶液的斑点模糊；以三氯甲烷-甲醇(体积比为30:1)为展开剂展开时，供试品溶液与β-谷甾醇对照品溶液、对照药材溶液在相应位置处显相同颜色的斑点，但Rf值较大，且与对照药材溶液相对应的点个数少于以乙酸乙酯-石油醚(60～90℃)(体积比为1:2)为展开剂展开，因此以乙酸乙酯-石油醚(60～90℃)(体积比1:2)为展开剂，以β-谷甾醇为对照品溶液分离、鉴别效果更优。
对于不同显色剂的考察时，由图1-3、图4-6以及图7-9均可以看出，5％三氯化铝溶液显色前后斑点信息无明显变化，10％硫酸乙醇溶液显色后斑点信息明显增加，且易观察，因此选择10％硫酸乙醇为显色剂，观察效果更好。
此外，采用不同体积比的乙酸乙酯和石油醚为展开剂时，观察对照品β-谷甾醇、对照药材和供试品的薄层色谱(除了展开剂配比不同，其它均与实施例1相同)；结果如图10(乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:2.5)和图11(乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:1.2)所示；其中，图10、11中，薄层色谱从左向右依次为对照品β-谷甾醇溶液、对照药材溶液和供试品溶液；可见，当石油醚比例过大，斑点不好展开，Rf值偏小；当石油醚比例过小，对照药材中红色斑点(即与对照品β-谷甾醇溶液斑点相同位置下方的斑点)与目标斑点重叠，不利于观察。
测试例2
对比制备供试品溶液时，不同提取溶剂对薄层色谱的影响
提取溶剂分别为水、50％乙醇、乙醇、50％甲醇、甲醇、乙酸乙酯，观察薄层色谱的分离效果，结果如图12所示，其中，从左至右依次为：1-供试品溶液(水)；2-对照药材溶液(水)；3-供试品溶液(50％乙醇)；4-对照药材溶液(50％乙醇)；5-供试品溶液(乙醇)；6-对照药材溶液(乙醇)；7-β-谷甾醇对照品溶液；8-供试品溶液(50％甲醇)；9-对照药材溶液(50％甲醇)；10-供试品溶液(甲醇)；11-对照药材溶液(甲醇)；12-供试品溶液(乙酸乙酯)；13-对照药材溶液(乙酸乙酯)。
由图12可知，采用水、50％乙醇、50％甲醇为溶剂时，斑点信息均较少；乙醇为溶剂时斑点分离效果较差；甲醇与乙酸乙酯为溶剂时，色谱行为相一致，但因点样量较少，观察不全面，因此选择甲醇、乙酸乙酯做溶剂增大点样量，观察斑点显色情况，色谱图如图13所示，其中，从左至右依次为：1、14：β-谷甾醇对照品溶液；2、4、6：甲醇制供试品溶液(点样量分别为2μL、4μL、6μL)；3、5、7.甲醇制对照药材溶液(1μL、2μL、3μL)；8、10、12、15：乙酸乙酯制供试品溶液(2μL、4μL、6μL、10μL)；9、11、13：乙酸乙酯制对照药材溶液(1μL、2μL、3μL)。
由图13可知，分别以甲醇、乙酸乙酯制备供试品溶液，增大点样量时，二者渗透性均良好，考虑到实验的安全性，因此选择甲醇为提取溶剂。
测试例3
对比不同珍珠透骨草供试品浓度对薄层色谱鉴别的影响
制备供试品溶液时，称样量分别为0.5g、1g、1.5g、2g，按照实施例1的方法，浓缩至3mL，即得到浓度分别为0.17g/mL、0.33g/mL、0.5g/mL、0.67g/mL的珍珠透骨草供试品，薄层色谱图如图14所示，其中，从左向右依次为1.β-谷甾醇对照品溶液；2.珍珠透骨草对照药材溶液；3～6.为供试品溶液，珍珠透骨草浓度分别为0.17g/mL、0.33g/mL、0.5g/mL、0.67g/mL。
由图14可知，保证分离鉴别效果且取样量少的前提下，当珍珠透骨草供试品的浓度为0.5g/mL时，斑点清晰，分离度较好。
测试例4
点样量考察
对比不同供试品点样量对薄层鉴别方法的影响，结果如图15所示，其中，从左向右依次为1.β-谷甾醇对照品溶液；2.珍珠透骨草对照药材溶液；3-9.为不同点样量供试品溶液(依次为8μL、10μL、12μL、15μL、18μL、20μL、22μL)。
由图15可知，保证分离鉴别效果且取样量少的前提下，供试品溶液点样量为15μL时薄层色谱斑点清晰，分离度佳。
测试例5
专属性考察
取珍珠透骨草药材(供试品20210506-15)按照实施例1方法进行供试品溶液的制备，将对照品溶液、供试品溶液、珍珠透骨草对照药材溶液及甲醇溶液分别点于同一硅胶G薄层板上，其它薄层色谱条件同实施例1，其结果如图16所示，其中，从左向右依次为1.甲醇溶液；2.β-谷甾醇对照品溶液；3.珍珠透骨草对照药材溶液；4.供试品溶液。
由图16可知，供试品溶液与对照药材溶液在薄层色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，甲醇溶液无斑点，说明该方法专属性良好。
测试例6
耐用性考察
(1)不同温湿度考察
将对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液分别点于同一硅胶G薄层板上，取点样后的薄层板，分别在4～35℃的温度环境选择2个温度进行该项实验；分别在10～30％和75％～90％的湿度环境中选择2个湿度进行该项实验，其它薄层色谱条件同实施例1，结果如图17(温度为6.5℃，RH为66％)、图18(温度为28.4℃，RH为28％)、图19(温度为28.8℃，RH为88％)所示，其中，从左向右依次为1.β-谷甾醇对照品溶液；2.珍珠透骨草对照药材溶液；3.供试品溶液。
由图17～19可知，在不同温湿度条件下，供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液斑点均较清晰，供试品色谱中各斑点的分离效果均较好，表明该薄层鉴别方法对温湿度有较好的耐用性。
(2)不同薄层板考察
分别采用不同厂家生产的硅胶G薄层板，按照实施例1的方法进行。
薄层板商品名：硅胶板，厂家：青岛海洋化工有限公司，规格：100*100mm，型号：硅胶G板，批号：20200707；
薄层板商品名：硅胶板，厂家：青岛海洋化工有限公司，规格：50*50mm，型号：硅胶G板，批号：20190307；
薄层板商品名：硅胶板，厂家：默克化工技术有限公司，规格：20*20cm，型号：硅胶G板，批号：1.05553.0001；
点样方式：接触点样；
展开剂用量：乙酸乙酯-石油醚(60～90℃)(1：2)为展开剂；
展开缸规格：双槽；
展开方式与展距：上行展开，展距8cm；
饱和方式：预平衡薄层板15分钟。
结果如图20(薄层板为20200707)、图21(薄层板为1.05553.0001)、图22(薄层板为20190307)所示，其中，薄层色谱中，从左向右依次为β-谷甾醇对照品溶液；珍珠透骨草对照药材溶液；供试品溶液。
由图20～22可知，不同厂家、不同批号生产的硅胶G薄层板，获得的供试品色谱，各斑点均能得到良好的分离效果，表明该薄层鉴别方法对于不同厂家生产的薄层板有较好的耐用性。
测试例7
对不同批次的珍珠透骨草标准汤剂冻干粉、珍珠透骨草药材以及珍珠透骨草配方颗粒进行薄层鉴别检测，方法同实施例1，结果如图23(15批珍珠透骨草标准汤剂冻干粉)、图24(15批珍珠透骨草药材)、图25(3批珍珠透骨草配方颗粒)所示；其中，图23从左向右依次为1.珍珠透骨草对照药材溶液；2.β-谷甾醇对照品溶液；3.供试品溶液(20210506-1)；4.供试品溶液(20210506-2)；5.供试品溶液(20210506-3)；6.供试品溶液(20210506-4)；7.供试品溶液(20210506-5)；8.供试品溶液(20210506-6)；9.供试品溶液(20210506-7)；10.供试品溶液(20210506-8)；11.供试品溶液(20210506-9)；12.供试品溶液(20210506-10)；13.供试品溶液(20210506-11)；14.供试品溶液(20210506-12)；15.供试品溶液(20210506-13)；16.供试品溶液(20210506-14)；17.供试品溶液(20210506-15)；图24从左向右依次为DP.β-谷甾醇对照品溶液；1.供试品溶液(20210506-1)；2.供试品溶液(20210506-2)；3.供试品溶液(20210506-3)；4.供试品溶液(20210506-4)；5.供试品溶液(20210506-5)；6.供试品溶液(20210506-6)；7.供试品溶液(20210506-7)；8.供试品溶液(20210506-8)；9.供试品溶液(20210506-9)；10.供试品溶液(20210506-10)；11.供试品溶液(20210506-11)；12.供试品溶液(20210506-12)；13.供试品溶液(20210506-13)；14.供试品溶液(20210506-14)；15.供试品溶液(20210506-15)；图25从左向右依次为1.β-谷甾醇对照品溶液；2.珍珠透骨草对照药材溶液；3～5.供试品溶液(珍珠透骨草配方颗粒批号分别为：KL20210506-03、KL20210506-08、KL20210506-09)。
由图23～25可知，本发明提供的薄层鉴别方法用于鉴别珍珠透骨草标准汤剂冻干粉、珍珠透骨草药材以及珍珠透骨草配方颗粒时，均具有清晰的斑点、较好的分离度、适中的Rf值，样品与对照品斑点清晰、对应性好，符合薄层鉴别方法要求，普适性好。
综上所述，本发明提供的薄层鉴别方法，以β-谷甾醇活性成分对照品作为对照，同时采用特定种类和配比的展开剂，能够清楚、高效的分离、鉴别珍珠透骨草药品中的有效成分，Rf值适中；并且能够准确富集、纯化对照品，且工艺简单、无需使用有毒试剂、成本低，对于珍珠透骨草药材、标煎及其配方颗粒都能够有效鉴别，且专属性好，对于温湿度具有较好的耐用性，采用不同薄层板均可有效鉴别。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种珍珠透骨草的薄层鉴别方法，其特征在于，所述薄层鉴别方法包括以下步骤：
将对照品、对照药材和供试品用薄层板展开、显色，检视，供试品色谱中，在与对照品色谱、对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点；
所述薄层鉴别方法中，展开剂包括乙酸乙酯和石油醚；
所述对照品包括β-谷甾醇。
2.根据权利要求1所述的薄层鉴别方法，其特征在于，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:(0.25～6)，进一步优选为1:(1.5～2.2)；
优选地，所述石油醚的沸程为60～90℃。
3.根据权利要求1或2所述的薄层鉴别方法，其特征在于，所述薄层板展开前还包括分别制备对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液；
优选地，所述对照品溶液的制备方法包括：将对照品与第一溶剂混合，得到所述对照品溶液；
优选地，所述第一溶剂包括甲醇水溶液；
优选地，所述甲醇水溶液的体积浓度为80～100％；
优选地，所述对照品溶液的浓度为0.1～4mg/mL。
4.根据权利要求3所述的薄层鉴别方法，其特征在于，所述对照药材溶液的制备方法包括：将对照药材与第二溶剂混合，得到所述对照药材溶液；
优选地，所述对照药材包括珍珠透骨草；
优选地，所述第二溶剂包括甲醇；
优选地，所述对照药材与第二溶剂的质量体积比为(0.5～6):25g/mL，进一步优选为(1～3):25g/mL；
优选地，所述对照药材与第二溶剂混合在超声条件下进行；
优选地，所述超声的时间为15～45min，进一步优选为25～35min；
优选地，所述混合后还包括过滤和/或浓缩的步骤。
5.根据权利要求3所述的薄层鉴别方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法包括：将珍珠透骨草与第三溶剂混合，超声提取，得到所述供试品溶液；
优选地，所述珍珠透骨草包括珍珠透骨草药材、珍珠透骨草标准汤剂冻干粉或珍珠透骨草配方颗粒；
优选地，所述第三溶剂包括甲醇和/或乙酸乙酯，优选为甲醇；
优选地，所述珍珠透骨草与第三溶剂的质量体积比为(0.5～6):25g/mL，进一步优选为(1.2～2.2):25g/mL；
优选地，所述超声提取的时间为15～45min，进一步优选为25～35min；
优选地，所述超声提取后还包括过滤和/或浓缩的步骤。
6.根据权利要求1～5任一项所述的薄层鉴别方法，其特征在于，所述对照品、对照药材和供试品的点样量为1～25μL，进一步优选为10～20μL；
优选地，所述供试品的点样浓度为0.2～0.8g/mL。
7.根据权利要求1～6任一项所述的薄层鉴别方法，其特征在于，所述显色的显色剂包括硫酸乙醇溶液；
优选地，所述硫酸乙醇溶液的浓度为5～15％。
8.根据权利要求1～7任一项所述的薄层鉴别方法，其特征在于，所述显色在加热条件下进行；
优选地，所述加热的温度为100～110℃，加热的时间为3～5min；
优选地，所述检视在紫外光灯照射下进行；
优选地，所述紫外光灯的波长为360～370nm。
9.根据权利要求1～8任一项所述的薄层鉴别方法，其特征在于，所述薄层鉴别方法包括：
(1)将β-谷甾醇与甲醇水溶液混合，得到对照品溶液；将对照药材与甲醇以质量体积比为(0.5～6):25g/mL进行混合，超声15～45min，过滤、浓缩，得到对照药材溶液；将珍珠透骨草与第三溶剂以质量体积比为(0.5～6):25g/mL进行混合，超声提取15～45min，过滤、浓缩，得到供试品溶液；所述第三溶剂包括甲醇和/或乙酸乙酯；
(2)将步骤(1)得到的对照品溶液、对照药材溶液以及供试品溶液分别点于同一薄层板上，以体积比为1:(0.25～6)的乙酸乙酯和石油醚为展开剂进行展开，随后，向薄层板表面喷以浓度为5～15％的硫酸乙醇溶液，在100～110℃条件下加热3～5min至斑点显色清晰，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱、对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。
10.一种如权利要求1～9任一项所述的薄层鉴别方法在分析珍珠透骨草中有效成分的应用。
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