CN116396178A - 用于递送核酸的可电离阳离子脂质化合物和组合物及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种式(I)化合物或其N‑氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其为可电离阳离子脂质化合物。还提供了包含前述化合物的组合物以及它们用于递送治疗剂或预防剂的用途。

Description

用于递送核酸的可电离阳离子脂质化合物和组合物及用途
本申请是中国发明专利申请(申请号：202310010951.6，申请日：2023年1月5日，发明名称：用于递送核酸的可电离阳离子脂质化合物和组合物及用途)的分案申请。
技术领域
本发明属于医药领域。本发明具体涉及一种阳离子脂质化合物、包含其的组合物及用途。
背景技术
生物活性物质如小分子药物、多肽、蛋白质和核酸尤其是核酸的有效靶向递送是一个持久的医学难题。核酸治疗剂因低细胞渗透性和对某些核酸分子(包括RNA)降解的高敏感性而面临很大挑战。
证实，含阳离子脂质的组合物、脂质体和脂质体复合物(lipoplex)作为运输媒介物，有效地将生物活性物质如小分子药物、多肽、蛋白质和核酸运送至细胞和/或细胞内隔室中。这些组合物一般包含一种或多种“阳离子性”和/或氨基(可离子化)脂质、包括中性脂质、结构脂质以及聚合物共轭脂质。阳离子性和/或可离子化脂质包括例如可容易地质子化的含胺脂质。尽管已经展示多种此类含脂质的纳米粒子组合物，但安全性、功效和特异性仍有待改良。值得注意的是，脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle,LNP)复杂性的增加使其生产复杂化，并可能增加其毒性，这是一个可能限制其临床应用的主要担忧。例如，LNP siRNA颗粒(如patisiran)需要预先使用类固醇和抗组胺药来消除不必要的免疫反应(T.Coelho,D.Adams,A.Silva,et al.,Safety and efficacy of RNAi therapy for transthyretinamyloidosis,N Engl J Med,369(2013)819-829.)。因此，需要开发有助于将治疗剂和/或预防剂如核酸递送至细胞的改进的阳离子脂质化合物，及包含其的组合物的需求。
发明内容
本发明一方面提供一种新的阳离子脂质化合物，其为式(I)化合物
Figure BDA0004170009180000021
或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中：G1为C1～6亚烷基；G2为C2～8亚烷基；R1为C6～20直链或支链烷基；R2为C12～25支链烷基；G3为：HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-，HO(CH2)2N(CH2CH3)(CH2)2-，(HO(CH2)2)2N(CH2)2-，CH3O(CH2)2N(CH3)(CH2)2-，(CH3)2N(CH2)3SC(O)O(CH2)2-，(CH3)2N(CH2)3SC(O)-，CH3NH(CH2)2N(CH3)(CH2)2-或CH3CH2NH(CH2)2-。
例如，式(I)化合物具有以下结构中的一种：
Figure BDA0004170009180000022
Figure BDA0004170009180000031
Figure BDA0004170009180000041
Figure BDA0004170009180000051
Figure BDA0004170009180000061
本发明的又一方面提供一种组合物，其包含载体，所述载体包括阳离子脂质，所述阳离子脂质包括上述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体。
本发明的又一方面提供上述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体或者上述的组合物在制备核酸药物、基因疫苗、小分子药物、多肽或蛋白质药物中的用途。
本发明的又一方面提供上述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体或者上述的组合物在制备用于治疗有需要哺乳动物的疾病或病症的药物中的用途。
附图说明
图1显示制备LNP制剂时所用载体与mRNA的不同重量比的细胞转染实验结果，a为载体:mRNA＝5:1，b为载体:mRNA＝15:1，c为载体:mRNA＝35:1；d为空白对照。
图2显示制备LNP制剂时所用阳离子脂质与中性脂质DSPC不同摩尔比的细胞转染实验结果，a为3.5:1，b为4.5:1，c为4.9:1，d为空白对照。
图3显示制备LNP制剂时聚合物共轭脂质占载体不同摩尔比的细胞转染实验结果，a为1.5％，b为10％，c为空白对照。
图4显示制备LNP制剂时载体中各成分阳离子脂质、中性脂质DSPC、结构脂质胆固醇和聚合物共轭脂质DMG-PEG2000不同比例的细胞转染实验结果，a为49:10:39.5:1.5，b为45:10:43.5:1.5，c为35:10:53.5:1.5，d为空白对照。
图5显示由不同的阳离子脂质制备的Fluc-mRNA的LNP制剂荧光吸收强度(a：YK-201；b：YK-202；c：YK-209；d：SM-102)。
图6显示由不同的阳离子脂质制备的Fluc-mRNA的LNP制剂荧光吸收强度(a：YK-204；b：YK-205；c：YK-211；d：化合物21)。
图7显示由不同的阳离子脂质制备的Fluc-mRNA的LNP制剂荧光吸收强度(a：YK-201；b：YK-202；c：YK-221；d：YK-225)。
图8显示由不同的阳离子脂质(YK-201、YK-202、YK-206、YK-207、YK-209、YK-009、SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23和HHMA)制备的Fluc-mRNA的LNP制剂以及含有Fluc-mRNA的Lipofectamine 3000制剂加入细胞培养液中，培养24小时后的细胞存活率。
图9显示由不同的阳离子脂质(YK-201、YK-202、YK-209、YK-203、YK-204、YK-205、YK-208、YK-210、YK-211、SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23和HHMA)制备的Fluc-mRNA的LNP制剂以及含有Fluc-mRNA的Lipofectamine 3000制剂加入细胞培养液中，培养24小时后的细胞存活率。
图10显示由不同的阳离子脂质(YK-201、YK-202、YK-209、YK-212、YK-213、YK-214、YK-215、YK-216、YK-217、YK-218、YK-219、YK-220、SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23和HHMA)制备的Fluc-mRNA的LNP制剂以及含有Fluc-mRNA的Lipofectamine 3000制剂加入细胞培养液中，培养24小时后的细胞存活率。
图11显示由不同的阳离子脂质(YK-201、YK-202、YK-209、YK-221、YK-222、YK-223、YK-224、YK-225、YK-226、SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23和HHMA)制备的Fluc-mRNA的LNP制剂以及含有Fluc-mRNA的Lipofectamine 3000制剂加入细胞培养液中，培养24小时后的细胞存活率。
图12显示由不同的阳离子脂质(YK-201、YK-204、YK-206、YK-217、SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23和HHMA)制备的Fluc-mRNA的LNP制剂的小鼠活体成像实验结果。
图13显示由不同的阳离子脂质(YK-202、YK-207、YK-215、SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23和HHMA)制备的Fluc-mRNA的LNP制剂的小鼠活体成像实验结果。
图14显示由不同的阳离子脂质(YK-209、YK-223、YK-009、SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23和HHMA)制备的Fluc-mRNA的LNP制剂的小鼠活体成像实验结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明可在不偏离本发明基本属性的情况下以其它具体形式来实施。应该理解的是，在不冲突的前提下，本发明的任一和所有实施方案都可与任一其它实施方案或多个其它实施方案中的技术特征进行组合以得到另外的实施方案。本发明包括这样的组合得到的另外的实施方案。
本发明中提及的所有出版物和专利在此通过引用以它们的全部内容纳入本发明。如果通过引用纳入的任何出版物和专利中使用的用途或术语与本发明中使用的用途或术语冲突，那么以本发明的用途和术语为准。
本文所用的章节标题仅用于组织文章的目的，而不应被解释为对所述主题的限制。
除非另有规定，本文使用的所有技术术语和科学术语具有要求保护主题所属领域的通常含义。倘若对于某术语存在多个定义，则以本文定义为准。
除了在工作实施例中或另外指出之外，在说明书和权利要求中陈述的定量性质例如剂量的所有数字应理解为在所有情况中被术语“约”修饰。还应理解的是，本申请列举的任何数字范围意在包括该范围内的所有的子范围和该范围或子范围的各个端点的任何组合。
本发明中使用的“包括”、“含有”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的要素涵盖出现在该词后面列举的要素及其等同，而不排除未记载的要素。本文所用的术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…组成”、或“由…组成”。
术语“药学上可接受的”在本申请中是指：化合物或组合物在化学上和/或在毒理学上与构成制剂的其它成分和/或与用其预防或治疗疾病或病症的哺乳动物相容。
术语“受试者”或“患者”在本申请中包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于：人、猩猩、猿、猴、牛、马、羊、猪、兔、狗、猫和鼠等。非哺乳动物包括但不限于鸟和鱼等。在一些实施方案中，“受试者”或“患者”是哺乳动物，例如人。
本文所用的术语“治疗”是指给患有疾病或者具有所述疾病的症状的患者或受试者施用一种或多种药物物质，用以治愈、缓解、减轻、改善或影响所述疾病或者所述疾病的症状。在本申请的上下文中，除非作出相反的具体说明，术语“治疗”也可包括预防。
术语“溶剂合物”在本申请中指的是通过组合式(I)化合物或其药学上可接受的盐和溶剂(例如乙醇或水)而形成的复合物。应理解的是，在治疗疾病或病症中使用的式(I)化合物的任何溶剂合物尽管可能提供不同的性质(包括药代动力学性质)，但是一旦吸收至受试者中，会得到式(I)化合物，使得式(I)化合物的使用分别涵盖式(I)化合物的任何溶剂合物的使用。
术语“水合物”指的是上述术语“溶剂合物”中溶剂为水的情形。
应进一步理解，式(I)化合物或其药学上可接受的盐可以溶剂合物形式分离，并且因此任何所述溶剂合物皆包括于本发明的范围内。例如，式(I)化合物或其药学上可接受的盐可以未溶剂化形式以及与药学上可接受的溶剂(诸如，水、乙醇等)形成的溶剂化形式存在。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒、无机酸或有机酸加成盐。例如，参见S.M.Berge等人“Pharmaceutical Salts”，J.Pharm.Sci.1977,66,1-19。其中，无机酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸或硝酸等；有机酸例如甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)-苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡萄糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟酸、巴莫酸、果胶酯酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、胺基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、己二酸、海藻酸、马来酸、富马酸、D-葡萄糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、天冬胺酸、磺基水杨酸等。例如，可使用HCl(或盐酸)、HBr(或氢溴酸溶液)、甲磺酸、硫酸、酒石酸或富马酸与式(I)所示的化合物形成药学上可接受的盐。
本发明的式(I)的含氮化合物可通过用氧化剂(例如间氯过氧苯甲酸、过氧化氢、臭氧)处理而转化成N-氧化物。因此，在价态和结构允许的条件下，本申请要求保护的化合物不但包括结构式所示的含氮化合物，而且还包括其N-氧化物衍生物。
本发明的某些化合物可以以一种或多种立体异构体的形式存在。立体异构体包括几何异构体、非对映异构体和对映异构体。因此，本发明要求保护的化合物还包括外消旋混合物、单一的立体异构体和具有光学活性的混合物。本领域技术人员应该理解的是，一种立体异构体可能比其它立体异构体具有更好的功效和/或更低的副作用。单一的立体异构体和具有光学活性的混合物可手性源合成法、手性催化、手性拆分等方法得到。消旋体可通过色谱拆分法或者化学拆分法进行手性拆分。例如，可通过加入手性酒石酸、手性苹果酸等手性酸类拆分试剂与本发明的化合物成盐，利用产物的物理化学性质例如溶解度不同进行分离。
本发明还包括本发明化合物所有适合的同位素变体。同位素变体定义为这样的化合物，其中至少一个原子被具有相同原子序数但其原子质量不同于自然界中常见的或主要存在的原子质量的原子替代。可以引入到本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮和氧的同位素，分别例如2H(氘)、3H(氚)、11C、13C、14C、15N、17O和18O。
术语“烷基”在本发明中是指包括具有规定碳原子数的支链和直链饱和脂族一价烃基。术语“亚烷基”在本发明中是指包括具有规定碳原子数的支链和直链饱和脂族二价烃基。Cn～m是指包括具有n至m个碳原子数的基团。例如C2～5亚烷基包括C2亚烷基、C3亚烷基、C4亚烷基、C5亚烷基。
烷基(或亚烷基)可未经取代，或烷基(或亚烷基)可经取代，其中至少一个氢被另一种化学基团代替。
“治疗有效量”为当给予患者时能改善疾病或症状的治疗剂的量。“预防有效量”为当给予受试者时能预防疾病或症状的预防剂的量。构成“治疗有效量”的治疗剂的量或“预防有效量”的预防剂的量随着治疗剂/预防剂、疾病状态及其严重性、待治疗/预防的患者/受试者的年龄、体重等而变化。本领域普通技术人员可根据其知识以及本发明常规地确定治疗有效量和预防有效量。
在本申请中，当化合物的名称与结构式不一致时，以结构式为准。
应理解，本申请所用的术语“本发明化合物”根据语境可包括：式(I)化合物、其N-氧化物、其溶剂合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体、以及它们的混合物。
本文所用术语阳离子脂质是指在选定的pH值带正电荷的脂质。
阳离子脂质体易于与带负电荷的核酸结合，即通过静电力与核酸中存在的带负电的磷酸基团相互作用，形成脂质纳米颗粒(LNP)。LNP是目前主流的递送载体之一。
发明人在筛选大量化合物时发现，筛选出满足以下条件的合适的阳离子脂质化合物是非常困难的：与现有技术代表性阳离子脂质结构有显著差别，同时具有高的包封率、载药浓度和总RNA浓度、高的转染效率和低的细胞毒性，并且在小鼠体内具有高表达及持续表达。发明人发现了一些化合物，例如YK-201、YK-202和YK-209等，与现有技术中化学结构区别很大的阳离子脂质相比，能够以显著提高的包封率、载药浓度和总RNA浓度、显著提高的细胞内转染效率，显著降低的细胞毒性，以及在动物体内的显著提高的表达量和持续时间来递送核酸。本发明至少基于下发现：
1.设计的一系列化合物，包括YK-201、YK-202和YK-209，以及YK-206和YK-207，与现有技术代表性阳离子脂质，例如SM-102(WO2017049245A2中公开的化合物25)、WO2021055833A1中公开的化合物21和化合物23、HHMA(CN112979483B中公开的化合物1)、ALC-0315(CN108368028B中公开的化合物3)和CN114044741B中公开的化合物YK-009化学结构有显著差别，G3基团完全不同，其它部位也有差别，所以在极性、酸碱性和亲水性等方面也会有很大差别。因此，无法根据上述现有技术公开的阳离子脂质化合物，推测出由此系列化合物制备的LNP制剂的细胞转染效率、细胞毒性，以及在动物体内表达情况。
SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23和HHMA化学结构如下：
Figure BDA0004170009180000121
(WO2017049245A2，说明书第29页)；
Figure BDA0004170009180000122
(CN108368028B，说明书第24页)；/>
Figure BDA0004170009180000123
(WO2021055833A1，说明书第22页)；
Figure BDA0004170009180000131
(WO2021055833A1，说明书第22页)；
Figure BDA0004170009180000132
(CN112979483B，说明书第12页)。
2.在设计的此系列化合物中，由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂，与现有技术中代表性的阳离子脂质相比，包封率、载药浓度和总RNA浓度显著提高，细胞转染活性显著提高，细胞毒性显著降低，mRNA在小鼠体内的表达量及持续时间均显著提高。
例如，包封率YK-209可比化合物23提高41％，载药浓度YK-209可达化合物23的2倍，总RNA浓度YK-201总RNA浓度可达化合物21的1.5倍；细胞转染活性YK-202可达SM-102的18倍，化合物21的21倍，化合物23的22倍；细胞存活率YK-202可比ALC-0315高26.85％，比SM-102高8.26％，比HHMA高11.25％；mRNA在小鼠体内表达量，YK-202可达SM-102的24倍，化合物21的25倍和化合物23的23倍。
在我们设计的化学结构差异很小的一系列化合物中，由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂，同其它化合物相比，细胞转染活性显著提高，细胞毒性显著降低，mRNA在小鼠体内的表达量与持续时间均显著提高。
此系列化合物结构上与YK-201、YK-202和YK-209相比，仅是个别基团相差1-2个C，或是G1减少2个C、R1减少1个C、G3引入醚键、酯键或硫原子，或是G3基团中羟基改变为甲基氨基，或是G3基团去掉羟基和与N相连的甲基，但是YK-201和YK-202和YK-209细胞转染活性可达YK-221的和YK-225的1000倍以上，细胞毒性可比YK-221降低55％，mRNA在小鼠体内的表达量可达YK-223的1000倍以上。
3.阳离子脂质化合物的结构与细胞内转染效率、对细胞产生的毒性以及由其制备的LNP制剂中的mRNA在动物体内的高表达和持续表达之间无明显的对应关系。结构差异很小的化合物，在转染效率和/或对细胞的毒性、细胞内的表达方面极有可能差异非常大。
例如，与YK-201相比，YK-204仅是G3基团与N相连多1个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-201是YK-204的78倍，对转染细胞的毒性YK-201比YK-204降低30％，mRNA在小鼠体内的表达YK-201可达YK-204的380倍；与YK-209相比，YK-225仅是G3基团中羟基改变为甲基氨基，R1和R2基团单链各多1个C，双链中每条单链各少2个C，其它结构完全相同，但细胞转染活性YK-209达到了YK-225的800倍，对转染细胞的毒性YK-209比YK-225降低30％。
因此，筛选合适的阳离子脂质化合物，能同时具有高的包封率、载药浓度和总RNA浓度、高的转染效率和对细胞的低毒性、mRNA在小鼠体内的高表达及持续表达是非常困难的事情，需要付出大量创造性劳动。
4.本发明通过独特的设计和大量的筛选，发现了一些化合物，例如YK-201、YK-202、YK-209、YK-206和YK-207，相对于现有技术的其它化合物，能够以显著提高的包封率、载药浓度和总RNA浓度、显著提高的细胞转染效率、显著降低的细胞毒性以及在动物体内显著提高的表达量和持续时间来递送核酸，取得了预料不到的技术效果。
具体如下：
1.与现有技术代表性阳离子脂质，例如SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23、YK-009和HHMA相比，化学结构有显著差别
现有技术代表性阳离子脂质，例如SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23、YK-009和HHMA，与设计的此系列化合物相比：
a.HHMA结构差别最大，HHMA与中心N原子相连的基团，仅1个侧链与此系列结构的1个侧链相近，其它部分完全不同。
b.现有技术中其它阳离子脂质，例如SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23和YK-009，G3基团完全不同。由于G3基团结构不同，因此在极性、酸碱性和亲水性等方面也会有很大差别。
c.SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23和YK-009的G1、R1、G2和R2基团也有显著差别。
2.包封率、载药浓度和总RNA浓度比现有技术中代表性阳离子脂质显著提高
1)由YK-201、YK-202、YK-206、YK-207和YK-209制备得到的LNP制剂，相比于现有技术阳离子脂质，包封率、载药浓度和总RNA浓度均显著提高。例如，YK-209包封率可比化合物23提高41％，载药浓度可达化合物23的2倍；YK-201总RNA浓度可达化合物21的1.5倍。
2)由设计的不同化合物制备得到的LNP制剂，包封率和载药量差异很大，不同化合物包封率范围为55％～99％，载药浓度在25～45μg/mL之间，总RNA浓度在25～50μg/mL之间。
3.体外细胞转染效率比现有技术中代表性阳离子脂质和结构类似的化合物显著提高
1)由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂细胞转染效率最高，比现有技术中代表性阳离子脂质活性显著提高。例如，YK-202可达SM-102的18倍，化合物21的21倍，化合物23的22倍。
2)YK-201、YK-202和YK-209在我们设计的结构最类似，仅是G1、G2、G3、R1或R2基团相差1-2个C的一系列化合物中细胞转染效率最高。YK-202可达其它化合物，例如YK-204的80倍。
3)YK-201、YK-202和YK-209与仅在个别基团有一些较小的区别，例如G1减少2个C、R1减少1个C、G3引入醚键、酯键或硫原子的化合物相比，转染效率最高。YK-202可比其它化合物，例如YK-217，高400倍以上。
4)YK-201、YK-202和YK-209与只是G3基团中羟基改变为甲基氨基，或去掉羟基和与N相连的甲基的化合物相比，细胞转染效率最高。例如，YK-201和YK-202与YK-221和YK-225相比，细胞转染效率均可提高1000倍以上。
5)化合物的结构和细胞内转染效率之间无对应关系，结构差异很小的化合物，在转染效率方面也极有可能差异非常大。因此，筛选出具有高转染效率的阳离子脂质化合物，需要进行多种设计并付出大量创造性劳动。
4.细胞毒性比现有技术中代表性阳离子脂质和结构类似的化合物显著降低
1)由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂细胞毒性最低，比现有技术中代表性阳离子脂质细胞存活率显著提高。例如，细胞存活率YK-202可比ALC-0315高26.85％，比SM-102高8.26％，比HHMA高11.25％。
2)YK-201、YK-202和YK-209在我们设计的结构最类似，即仅是G1、G2、R1或R2基团相差1-2个C的化合物中，细胞毒性最低。三者细胞存活率均可比其它化合物，例如YK-203，提高40％。
3)YK-201、YK-202和YK-209与在结构上只是个别基团有一些较小区别的化合物相比，细胞毒性最低。三者细胞存活率均可比其它化合物，例如YK-214，提高50％。
4)YK-201、YK-202和YK-209与在结构上只是G3基团的羟基改变为甲基氨基，或去掉羟基和与N相连的甲基的化合物相比，细胞毒性最低。例如，YK-201、YK-202和YK-209细胞存活率均比YK-221提高55％。
5)化合物的结构和细胞毒性之间无对应关系，即使结构差异很小的化合物，在细胞毒性方面也极有可能差异非常大。因此无法根据化学结构预测其细胞毒性，筛选出具有低细胞毒性的阳离子脂质化合物非常困难，需要付出大量创造性劳动。
5.mRNA在动物体内表达量和持续时间比现有技术中代表性阳离子脂质和结构类似的化合物显著提高
1)由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂，mRNA在小鼠体内高表达，且持续表达，比现有技术中代表性阳离子脂质显著提高。例如，YK-202可达SM-102的24倍、化合物21的25倍和化合物23的23倍。
2)YK-201、YK-202和YK-209在我们设计的结构最类似，仅是G1、G2、G3、R1或R2基团相差1-2个C的一系列化合物中，mRNA在小鼠体内表达量最高，且持续时间最长。例如，YK-202在24h可达YK-204的400倍以上，在7d仍可达40倍。
3)YK-201、YK-202和YK-209在只是G1、G2、G3、R1或R2基团稍有差别的一系列化合物中，mRNA在小鼠体内表达量最高，且持续时间最长。例如，YK-202可比YK-217提高800倍。
4)YK-201、YK-202和YK-209与在仅是G3基团中羟基改变为甲基氨基，或去掉羟基和与N相连的甲基的一系列化合物相比，mRNA在小鼠体内表达量最高，且持续时间最长。例如，三者mRNA表达量均比YK-223提高1000倍以上。
5)阳离子脂质的结构和递送的mRNA在小鼠体内的高表达及持续表达之间无对应关系，即使结构差异很小的阳离子脂质化合物，由其制备得到的LNP制剂中的mRNA在动物体内表达方面极有可能差异非常大。无法根据阳离子脂质化学结构预测mRNA在动物体内是否高表达和持续表达，筛选出具有mRNA高表达且持续表达的阳离子脂质化合物非常困难，需要付出大量创造性劳动。
本发明一方面提供一种新的用于递送治疗剂或预防剂的阳离子脂质化合物。本发明的阳离子脂质化合物可用于递送核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质。相对于已知的阳离子脂质化合物，本发明的阳离子脂质化合物表现出较高的转染效率和较小的细胞毒性，提高了递送效率和安全性。
本发明提供一种阳离子脂质，其为式(I)化合物
Figure BDA0004170009180000171
或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中
G1为C1～6亚烷基，优选为未取代的C2～5亚烷基，更优选为未取代的C5亚烷基或者未取代的C3亚烷基；
G2为C2～8亚烷基，优选为未取代的C4～7亚烷基，更优选为未取代的C7亚烷基或者未取代的C5亚烷基或者未取代的C4亚烷基；
G3为：HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-，HO(CH2)2N(CH2CH3)(CH2)2-，(HO(CH2)2)2N(CH2)2-，CH3O(CH2)2N(CH3)(CH2)2-，(CH3)2N(CH2)3SC(O)O(CH2)2-，(CH3)2N(CH2)3SC(O)-，CH3NH(CH2)2N(CH3)(CH2)2-或CH3CH2NH(CH2)2-，优选为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
R1为C6～20直链或支链烷基，优选为未取代的C8～12直链烷基或为未取代的C18支链烷基、未取代的C17支链烷基或者未取代的C15支链烷基，更优选为未取代的C11直链烷基或者未取代的C10直链烷基；
R2为C12～25支链烷基，优选为未取代的C14～22支链烷基，更优选为未取代的C17支链烷基或者未取代的C18支链烷基或者未取代的C15支链烷基；
在一种实施方案中，G1为未取代的C5亚烷基，例如，-(CH2)5-。
在一种实施方案中，G1为未取代的C3亚烷基，例如，-(CH2)3-。
在一种实施方案中，G2为未取代的C7亚烷基，例如，-(CH2)7-。
在一种实施方案中，G2为未取代的C5亚烷基，例如，-(CH2)5-。
在一种实施方案中，G2为未取代的C4亚烷基，例如，-(CH2)4-。
在一种实施方案中，G3为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
在一种实施方案中，G3为HO(CH2)2N(CH2CH3)(CH2)2-。
在一种实施方案中，G3为(HO(CH2)2)2N(CH2)2-。
在一种实施方案中，G3为CH3O(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
在一种实施方案中，G3为(CH3)2N(CH2)3SC(O)O(CH2)2-。
在一种实施方案中，G3为(CH3)2N(CH2)3SC(O)-。
在一种实施方案中，G3为CH3NH(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
在一种实施方案中，G3为CH3CH2NH(CH2)2-。
在一种实施方案中，R1为未取代的C8～12直链烷基，优选为未取代的C11直链烷基，即，-(CH2)10CH3。
在一种实施方案中，R1为未取代的C8～12直链烷基，优选为未取代的C10直链烷基，即，-(CH2)9CH3。
在一种实施方案中，R1为未取代的C18支链烷基、未取代的C17支链烷基或者未取代的C15支链烷基。例如，R1为：
Figure BDA0004170009180000181
Figure BDA0004170009180000182
或者
Figure BDA0004170009180000183
在一种实施方案中，R2为未取代的C14～22支链烷基，优选为未取代的C17支链烷基或者未取代的C18支链烷基或者未取代的C15支链烷基。例如，R2为：
Figure BDA0004170009180000184
Figure BDA0004170009180000185
在一种实施方式中，G1为-(CH2)5-，G2为-(CH2)7-，G3为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-，R1为-(CH2)10CH3，R2为：
Figure BDA0004170009180000186
在一种实施方式中，G1为-(CH2)5-，G2为-(CH2)7-，G3为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-，R1为-(CH2)10CH3，R2为：
Figure BDA0004170009180000187
在一种实施方式中，G1为-(CH2)5-，G2为-(CH2)5-，G3为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-，R1为：
Figure BDA0004170009180000188
R2为：/>
Figure BDA0004170009180000189
在一种实施方式中，G1为-(CH2)5-，G2为-(CH2)7-，G3为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-，R1为-(CH2)10CH3，R2为：
Figure BDA00041700091800001810
在一种实施方式中，G1为-(CH2)3-，G2为-(CH2)5-，G3为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-，R1为-(CH2)9CH3，R2为：
Figure BDA0004170009180000191
在示例性的实施方案中，所述的化合物选自下面的化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体：
Figure BDA0004170009180000192
/>
Figure BDA0004170009180000201
/>
Figure BDA0004170009180000211
/>
Figure BDA0004170009180000221
/>
Figure BDA0004170009180000231
本发明的又一方面提供一种组合物，其包含载体，所述载体包括阳离子脂质，所述阳离子脂质包括上述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体。
在一种实施方案中，所述组合物为纳米颗粒制剂，所述纳米颗粒制剂的平均尺寸为10nm～300nm，优选为90nm～260nm；所述纳米颗粒制剂的多分散系数≤50％，优选≤40％，更优选≤30％。
阳离子脂质
在本发明的组合物/载体的一种实施方式中，所述阳离子脂质为选自上述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体中的一种或多种。在一种实施方案中，所述阳离子脂质为选自上述的式(I)化合物。例如，阳离子脂质为化合物YK-201、YK-202、YK-203、YK-204、YK-205、YK-206、YK-207、YK-208、YK-209、YK-210、YK-211、YK-212、YK-213、YK-214、YK-215、YK-216、YK-217、YK-218、YK-219、YK-220、YK-221、YK-222、YK-223、YK-224、YK-225或YK-226。在一种优选实施方案中，所述阳离子脂质为化合物YK-201；在另一种优选实施方案中，所述阳离子脂质为化合物YK-202；在另一种优选实施方案中，所述阳离子脂质为化合物YK-209；在另一种优选实施方案中，所述阳离子脂质为化合物YK-206；在另一种优选实施方案中，所述阳离子脂质为化合物YK-207。
在本发明的组合物/载体的另一种实施方式中，所述阳离子脂质包括：(a)选自上述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体中的一种或多种；(b)一种或多种与(a)不同的其它可电离的脂质化合物。(b)阳离子脂质化合物可以是可商购的阳离子脂质，或者文献中报道的阳离子脂质化合物。例如，(b)阳离子脂质化合物可以是SM-102(WO2017049245A2中化合物25)，还可以是ALC-0315(CN108368028B中化合物3)，还可以是WO2021055833中的化合物21或化合物23，还可以是HHMA(CN112979483B中化合物1)。
在一种实施方案中，所述阳离子脂质占载体的摩尔比为25％～75％，例如30％、40％、49％、55％、60％、65％、70％。
该载体可用于递送活性成分例如治疗剂或预防剂。活性成分可包封在载体内或者与载体结合。
例如，所述治疗剂或预防剂包括核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质中的一种或多种。所述核酸包括但不限于单链DNA、双链DNA和RNA。适宜的RNA包括但不限于小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)以及其混合物。
中性脂质
载体可包含中性脂质。中性脂质在本发明中是指在选定的pH值不带电荷或者以两性离子形式存在的起辅助作用的脂质。该中性脂质可能通过促进脂质相变来调节纳米颗粒流动性成脂质双层结构并提高效率，同时还可能影响靶器官的特异性。
在一种实施方案中，所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为约1:1～15:1，例如约14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1和2:1。在一种优选的实施方案中，所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为约4.5:1。在另一种优选的实施方案中，所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为约4.9:1
例如，中性脂质可包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、神经酰胺、甾醇及其衍生物中的一种或多种。
包含阳离子脂质的组合物的载体组分可以包括一种或多种中性脂质-磷脂，如一种或多种(多)不饱和脂质。磷脂可以组装成一个或多个脂质双层。一般来说，磷脂可以包括磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。
中性脂质部分可以选自由以下组成的非限制性组：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂。脂肪酸部分可以选自由以下组成的非限制性组：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻烯酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植烷酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山萮酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。还涵盖包括带有修饰和取代的天然物种的非天然物种，所述修饰和取代包括分支、氧化、环化和炔烃。例如，磷脂可以用一种或多种炔烃(例如一个或多个双键被三键置换的烯基)官能化或与该一种或多种炔烃交联。在适当反应条件下，炔基在暴露于叠氮化物时可能经历铜催化的环加成反应。这些反应可用于使组合物的脂质双层官能化以促进膜渗透或细胞识别，或将组合物与有用组分如靶向或成像部分(例如染料)偶联。
可用于这些组合物中的中性脂质可以选自由以下组成的非限制性组：1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺(SOPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(SOPC)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)以及其混合物。
在一些实施方案中，中性脂质包括DSPC。在某些实施方案中，中性脂质包括DOPE。在一些实施方案中，中性脂质包括DSPC和DOPE两种。
结构性脂质
包含阳离子脂质的组合物的载体还可以包括一种或多种结构性脂质。结构性脂质在本发明中是指通过填充脂质之间的间隙来增强纳米颗粒的稳定性的脂质。
在一种实施方案中，所述阳离子脂质与所述结构性脂质的摩尔比为约0.6:1～3:1，例如，约1.0:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2.0:1。
结构性脂质可以选自但不限于由以下组成的组：胆固醇、非甾醇、谷固醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、皮质类固醇以及其混合物。在一些实施方案中，结构性脂质是胆固醇。在一些实施方案中，结构性脂质包括胆固醇和皮质类固醇(如泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松、泼尼松(prednisone)和氢化可的松(hydrocortisone))或其组合。
聚合物共轭脂质
包含阳离子脂质的组合物的载体还可以包括一种或多种聚合物共轭脂质。聚合物共轭脂质占载体的摩尔比为0.5％～10％，例如1％、2％、3％、4％、5％，优选为1.5％。聚合物共轭脂质主要是指聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。亲水性PEG稳定LNP，通过限制脂质融合来调节纳米颗粒大小，并通过减少与巨噬细胞的非特异性相互作用来增加纳米颗粒的半衰期。
在一种实施方案中，所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油。PEG修饰的PEG分子量通常为350-5000Da。
例如，所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)，二肉豆蔻酰甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)和甲氧基聚乙二醇双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)。
在本发明的组合物/载体的一种实施方案中，所述聚合物共轭脂质是DMG-PEG2000。
在本发明的组合物/载体的一种实施方案中，载体包括中性脂质、结构脂质以及聚合物共轭脂质，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为(25～75):(5～25):(15～65):(0.5～10)，例如(35～49):(7.5～15):(35～55):(1～5)。
在本发明的组合物/载体的一种实施方案中，载体包括中性脂质、结构脂质以及聚合物共轭脂质，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为49:10:39.5:1.5或者45:10:43.5:1.5，优选为45:10:43.5:1.5。
治疗剂和/或预防剂
组合物可以包括一种或多种治疗剂和/或预防剂。在一种实施方案中，载体与所述治疗剂或预防剂的质量比为10:1～30:1，例如12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1。
在一种实施方案中，载体与所述治疗剂或预防剂的质量比为12.5:1～20:1，优选为15:1。
所述治疗剂或预防剂包括但不限于核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质中的一种或多种。
例如，所述治疗剂或预防剂是能够引起免疫响应的疫苗或化合物。
本发明的载体可将治疗剂和/或预防剂递送至哺乳动物细胞或器官，因此本发明还提供治疗有需要哺乳动物的疾病或病症的方法，这些方法包括向哺乳动物施用包括治疗剂和/或预防剂的组合物和/或使哺乳动物细胞与该组合物接触。
治疗剂和/或预防剂包括生物活性物质并且替代地称为“活性剂”。治疗剂和/或预防剂可以是在递送至细胞或器官后在该细胞或器官中或者其它身体组织或系统中引起所希望的变化的物质。此类物种可用于治疗一种或多种疾病、病症或病况。在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是可用于治疗特定疾病、病症或病况的小分子药物。可用于组合物的药物的实例包括但不限于抗赘生剂(例如长春新碱(vincristine)、多柔比星(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、喜树碱(camptothecin)、顺铂(cisplatin)、博莱霉素(bleomycin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、甲氨蝶呤和链脲佐菌素(streptozotocin))、抗肿瘤剂(例如放线菌素D(actinomycin D)、长春新碱、长春碱(vinblastine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、蒽环霉素(anthracycline)、烷化剂、铂类化合物、抗代谢物以及核苷类似物，如甲氨蝶呤以及嘌呤和嘧啶类似物)、抗感染剂、局部麻醉剂(例如地布卡因(dibucaine)和氯丙嗪(chlorpromazine))、β-肾上腺素能阻断剂(例如普萘洛尔(propranolol)、第莫洛(timolol)和拉贝洛尔(labetalol))、抗高血压剂(例如可乐定(clonidine)和肼酞嗪(hydralazine))、抗抑郁剂(例如丙咪嗪(imipramine)、阿米替林(amitriptyline)和多虑平(doxepin))、抗痉挛剂(例如苯妥英(phenytoin))、抗组胺(例如苯海拉明(diphenhydramine)、氯苯那敏(chlorpheniramine)和异丙嗪(promethazine))、抗生素/抗细菌剂(例如庆大霉素(gentamycin)、环丙沙星(ciprofloxacin)和头孢西丁(cefoxitin))、抗真菌剂(例如咪康唑(miconazole)、特康唑(terconazole)、益康唑(econazole)、异康唑(isoconazole)、布康唑(butaconazole)、克霉唑(clotrimazole)、伊曲康唑(itraconazole)、制霉菌素(nystatin)、奈替芬(naftifine)和两性霉素B(amphotericin B))、抗寄生虫剂、激素、激素拮抗剂、免疫调节剂、神经递质拮抗剂、抗青光眼药、维生素、镇静剂以及成像剂。
在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是细胞毒素、放射性离子、化学治疗剂、疫苗、引起免疫响应的化合物和/或另一治疗剂和/或预防剂。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。实例包括但不限于紫杉酚(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱(colchicine)、多柔比星、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基蒽二酮(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔、嘌呤霉素、类美登素(maytansinoid)如美登醇(maytansinol)、拉奇霉素(rachelmycin)(CC-1065)，以及其类似物或同系物。放射性离子包括但不限于碘(例如碘125或碘131)、锶89、磷、钯、铯、铱、磷酸根、钴、钇90、钐153和镨。疫苗包括能够提供针对与感染性疾病如流感、麻疹、人乳头瘤病毒(HPV)、狂犬病、脑膜炎、百日咳、破伤风、瘟疫、肝炎和肺结核相关的一种或多种病况的免疫性的化合物和制剂并且可以包括编码感染性疾病源性抗原和/或表位的mRNA。疫苗还可以包括引导针对癌细胞的免疫响应的化合物和制剂并且可以包括编码肿瘤细胞源性抗原、表位和/或新表位的mRNA。引起免疫响应的化合物可以包括疫苗、皮质类固醇(例如地塞米松)和其它物种。在一些实施方案中，通过包括根据式(I)、(IA)、(IB)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)或(III)的化合物(例如化合物3、18、20、25、26、29、30、60、108-112或122)的组合物肌肉内施用能够引起免疫响应的疫苗和/或化合物。其它治疗剂和/或预防剂包括但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷和5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(dacarbazine))、烷化剂(例如氮芥(mechlorethamine)、噻替哌(thiotepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、拉奇霉素(CC-1065)、美法兰(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)、罗莫司丁(lomustine，CCNU)、环磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺络铂(II)(DDP)、顺铂)、蒽环霉素(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素(daunomycin))和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(dactinomycin)(以前称为放线菌素)、博莱霉素、光辉霉素(mithramycin)和安曲霉素(anthramycin，AMC))以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱、长春碱、紫杉酚和类美登素)。
在其它实施方案中，治疗剂和/或预防剂是蛋白质。可用于本发明中的纳米粒子中的治疗性蛋白质包括但不限于庆大霉素、阿米卡星(amikacin)、胰岛素、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、因子VIR、黄体激素释放激素(LHRH)类似物、干扰素、肝素、乙型肝炎表面抗原、伤寒疫苗和霍乱疫苗。
在一些实施方案中，治疗剂是多核苷酸或核酸(例如核糖核酸或脱氧核糖核酸)。术语“多核苷酸”的最广泛含义包括呈寡核苷酸链或可以并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。根据本发明使用的示例性多核苷酸包括但不限于以下一种或多种：脱氧核糖核酸(DNA)；核糖核酸(RNA)，包括信使mRNA(mRNA)、其杂交体；RNAi诱导因子；RNAi因子；siRNA；shRNA；miRNA；反义RNA；核糖酶；催化性DNA；诱导三股螺旋形成的RNA；适体等。在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是RNA。可用于本文所描述的组合物和方法中的RNA可以选自由但不限于以下组成的组：shortmer、antagomir、反义RNA、核糖酶、小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、转运RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)及其混合物。在某些实施方案中，RNA是mRNA。
在某些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是mRNA。mRNA可以编码任何所关注多肽，包括任何天然或非天然存在或以其它方式修饰的多肽。由mRNA编码的多肽可以具有任何大小并且可以具有任何二级结构或活性。在一些实施方案中，由mRNA编码的多肽当在细胞中表达时可以具有治疗作用。
在其它实施方案中，治疗剂和/或预防剂是siRNA。siRNA能够选择性降低所关注基因的表达或下调该基因的表达。例如，siRNA的选择可以使得在将包括该siRNA的组合物施用给有需要受试者后使与特定疾病、病症或病况有关的基因沉默。siRNA可以包含与编码所关注基因或蛋白质的mRNA序列互补的序列。在一些实施方案中，siRNA可以是免疫调节性siRNA。
在某些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是sgRNA和/或cas9 mRNA。sgRNA和/或cas9 mRNA可以用作基因编辑工具。例如，sgRNA-cas9复合物可以影响细胞基因的mRNA翻译。
在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是shRNA或者其编码载体或质粒。shRNA可以在将适当构建体递送至核中后在目标细胞内部产生。与shRNA相关的构建体和机制是相关领域中众所周知的。
疾病或病症
本发明的组合物/载体可以向受试者或患者递送治疗剂或预防剂。所述治疗剂或预防剂包括但不限于核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质中的一种或多种。因此，本发明的组合物可用于制备核酸药物、基因疫苗、小分子药物、多肽或蛋白质药物。由于上述治疗剂或预防剂的种类广泛，本发明的组合物可用于治疗或预防多种疾病或病症。
在一种实施方案中，所述疾病或病症以功能失常或异常的蛋白质或多肽活性为特征。
例如，所述疾病或病症选自由以下组成的组：感染性疾病、癌症和增生性疾病、遗传性疾病、自体免疫性疾病、糖尿病、神经退化性疾病、心血管和肾血管疾病以及代谢性疾病。
在一种实施方案中，所述感染性疾病选自由冠状病毒，流感病毒，或HIV病毒引起的疾病、小儿肺炎，裂谷热，黄热病，狂犬病，多种疱疹。
其它组分
组合物可以包括一种或多种除前述部分中所描述的那些外的组分。例如，组合物可以包括一个或多个疏水性小分子，如维生素(例如维生素A或维生素E)或固醇。
组合物还可以包括一个或多个渗透性增强分子、碳水化合物、聚合物、表面改变剂或其它组分。渗透性增强分子可以是例如美国专利申请公布第2005/0222064号所描述的分子。碳水化合物可以包括简单糖(例如葡萄糖)和多糖(例如糖原以及其衍生物和类似物)。
表面改变剂可以包括但不限于阴离子性蛋白质(例如牛血清白蛋白)、表面活性剂(例如阳离子性表面活性剂，如二甲基双十八烷基溴化铵)、糖或糖衍生物(例如环糊精)、核酸、聚合物(例如肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆)、粘液溶解剂(例如乙酰半胱氨酸、艾蒿、菠萝蛋白酶(bromelain)、木瓜蛋白酶、大青(clerodendrum)、溴己新(bromhexine)、羧甲司坦(carbocisteine)、依普拉酮(eprazinone)、美司钠(mesna)、氨溴索(ambroxol)、索布瑞醇(sobrerol)、多米奥醇(domiodol)、来托司坦(letosteine)、司替罗宁(stepronin)、硫普罗宁(tiopronin)、凝溶胶蛋白(gelsolin)、胸腺肽(thymosin)β4、链球菌DNA酶α(dornasealfa)、奈替克新(neltenexine)和厄多司坦(erdosteine))和DNA酶(例如rhDNA酶)。表面改变剂可以被安置在组合物的纳米粒子内和/或表面上(例如通过涂布、吸附、共价连接或其它方法)。
组合物还可以包含一种或多种官能化脂质。例如，脂质可以用炔基官能化，该炔基当在适当反应条件下暴露于叠氮化物时可能经历环加成反应。确切地说，脂质双层可以通过这一方式，用一个或多个可有效地促进膜渗透、细胞识别或成像的基团官能化。组合物的表面还可以与一种或多种有用抗体偶联。可用于靶向细胞递送、成像和膜渗透的官能团和偶联物是本领域中众所周知的。
除这些组分外，组合物可以包括可用于药物组合物中的任何物质。例如，组合物可以包括一种或多种药学上可接受的赋形剂或辅助成分，如但不限于一种或多种溶剂、分散介质、稀释剂、分散助剂、悬浮助剂、造粒助剂、崩解剂、填充剂、助流剂、液体媒剂、粘合剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、缓冲剂、润滑剂、油、防腐剂、调味剂、着色剂等。赋形剂例如淀粉、乳糖或糊精。药学上可接受的赋形剂是本领域中众所周知的(参见例如Remington’s The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro；Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006)。
稀释剂的实例可以包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、粉末状糖和/或其组合。
在一些实施方案中，包括一种或多种本文所述的脂质的组合物还可以包括一种或多种佐剂，例如吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)、CpG寡聚脱氧核糖核苷酸(例如A类或B类)、多聚(I:C)、氢氧化铝和Pam3CSK4。
本发明的组合物可以制成固体、半固体、液体或气体的形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、软膏剂、酏剂、糖浆、溶液、乳液、悬浮液、注射剂、气溶胶。本发明的组合物可以通过制药领域熟知的方法来制备。例如，无菌注射溶液可通过将所需量的治疗剂或预防剂与所需的上述各种其它成分掺入适当的溶剂例如无菌蒸馏水中，然后过滤灭菌来制备。还可以加入表面活性剂以促进形成均匀的溶液或悬浮液。
例如，本发明的组合物可以经静脉内、肌肉内、皮内、皮下、鼻内或通过吸入施用。在一种实施方案中，所述组合物是皮下施用的。
本发明的组合物以治疗有效量给药，所述量不仅可以随所选择的特定试剂而变化，还可以随给药途径，所治疗疾病的性质以及患者的年龄和状况而变化，并且最终可以由主治医师或临床医生自行决定。例如，可将约0.001mg/kg至约10mg/kg剂量的所述治疗剂或预防剂施用给哺乳动物(例如人)。
本发明包括但不限于以下实施方案：
1.一种式(I)化合物
Figure BDA0004170009180000331
或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中
G1为C1～6亚烷基；
G2为C2～8亚烷基；
R1为C6～20直链或支链烷基；
R2为C12～25支链烷基；
G3为：HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-，HO(CH2)2N(CH2CH3)(CH2)2-，(HO(CH2)2)2N(CH2)2-，CH3O(CH2)2N(CH3)(CH2)2-，(CH3)2N(CH2)3SC(O)O(CH2)2-，(CH3)2N(CH2)3SC(O)-，CH3NH(CH2)2N(CH3)(CH2)2-或CH3CH2NH(CH2)2-。
2.根据实施方案1所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中G1为未取代的C2～5亚烷基。
3.根据实施方案2所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中G1为未取代的C5亚烷基或者未取代的C3亚烷基。
4.根据前述实施方案中任一项所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中G2为未取代的C4～7亚烷基。
5.根据实施方案4所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中G2为未取代的C7亚烷基或者未取代的C5亚烷基或者未取代的C4亚烷基。
6.根据前述实施方案中任一项所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中R1为未取代的C8～12直链烷基。
7.根据实施方案6所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中R1为未取代的C11直链烷基或者未取代的C10直链烷基。
8.根据前述实施方案1-5中任一项所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中R1为未取代的C18支链烷基、未取代的C17支链烷基或者未取代的C15支链烷基。
9.根据实施方案8所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中R1为
Figure BDA0004170009180000341
Figure BDA0004170009180000342
或者
Figure BDA0004170009180000343
10.根据前述实施方案中任一项所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中R2为未取代的C14～22支链烷基。
11.根据实施方案10所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中R2为未取代的C17支链烷基或者未取代的C18支链烷基或者未取代的C15支链烷基。
12.根据实施方案11所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中R2为：
Figure BDA0004170009180000344
13.根据实施方案1所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中所述式(I)化合物具有以下结构中的一种：
Figure BDA0004170009180000351
/>
Figure BDA0004170009180000361
/>
Figure BDA0004170009180000371
/>
Figure BDA0004170009180000381
/>
Figure BDA0004170009180000391
14.根据实施方案1所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中所述式(I)化合物是具有以下结构的化合物YK-201：
Figure BDA0004170009180000392
15.根据实施方案1所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中所述式(I)化合物是具有以下结构的化合物YK-202：
Figure BDA0004170009180000393
16.根据实施方案1所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中所述式(I)化合物是具有以下结构的化合物YK-209：
Figure BDA0004170009180000401
17.根据实施方案1所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中所述式(I)化合物是具有以下结构的化合物YK-206：
Figure BDA0004170009180000402
18.根据实施方案1所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中所述式(I)化合物是具有以下结构的化合物YK-207：
Figure BDA0004170009180000403
19.一种组合物，其包含载体，所述载体包括阳离子脂质，所述阳离子脂质包括根据前述实施方案中任一项所述的的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体。
20.根据实施方案19所述的组合物，其中所述阳离子脂质占载体的摩尔比为25％～75％。
21.根据实施方案19-20中任一项所述的组合物，其中所述载体还包含中性脂质。
22.根据实施方案21所述的组合物，其中所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为1:1～15:1，优选为4.5:1。
23.根据实施方案21-22中任一项所述的组合物，其中所述中性脂质包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、神经酰胺、甾醇及其衍生物中的一种或多种。
24.根据实施方案23所述的组合物，其中所述中性脂质选自以下中的一种或多种：1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺(SOPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(SOPC)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)以及其混合物。
25.根据实施方案24所述的组合物，其中所述中性脂质是DOPE和/或DSPC。
26.根据实施方案19-25中任一项所述的组合物，其中所述载体还包含结构性脂质。
27.根据实施方案26所述的组合物，其中所述阳离子脂质与所述结构性脂质的摩尔比为0.6:1～3:1。
28.根据实施方案26-27中任一项所述的组合物，其中所述结构性脂质选自以下中的一种或多种：胆固醇、非甾醇、谷固醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、皮质类固醇。
29.根据实施方案28所述的组合物，其中所述结构性脂质是胆固醇。
30.根据实施方案19-29中任一项所述的组合物，其中所述载体还包含括聚合物共轭脂质。
31.根据实施方案30所述的组合物，其中所述聚合物共轭脂质占载体的摩尔比为0.5％～10％，优选为1.5％。
32.根据实施方案30-31中任一项所述的组合物，其中所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油。
33.根据实施方案32所述的组合物，其中所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)，二肉豆蔻酰甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)和甲氧基聚乙二醇双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)。
34.根据实施方案19-33中任一项所述的组合物，其中所述载体包括中性脂质、结构脂质以及聚合物共轭脂质，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为(25～75):(5～25):(15～65):(0.5～10)。
35.根据实施方案34所述的组合物，其中所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为(35～49):(7.5～15):(35～55):(1～5)。
36.根据实施方案35所述的组合物，其中所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为45:10:43.5:1.5。
37.根据前述实施方案19-36中任一项所述的组合物，其中所述组合物为纳米颗粒制剂，所述纳米颗粒制剂的平均粒径为10nm～300nm；所述纳米颗粒制剂的多分散系数≤50％。
38.根据实施方案37所述的组合物，其中所述纳米颗粒制剂的平均粒径为90nm～260nm；所述纳米颗粒制剂的多分散系数≤40％。
39.根据实施方案19-38中任一项所述的组合物，其中所述阳离子脂质还包括一种或多种其它可电离的脂质化合物。
40.根据实施方案19-39中任一项所述的组合物，其还包含治疗剂或预防剂。
41.根据实施方案40所述的组合物，其中所述载体与所述治疗剂或预防剂的质量比为10:1～30:1。
42.根据实施方案41所述的组合物，其中所述载体与所述治疗剂或预防剂的质量比为12.5:1～20:1。
43.根据实施方案42所述的组合物，其中所述载体与所述治疗剂或预防剂的质量比为15:1。
44.根据实施方案40-43中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂或预防剂包括核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质中的一种或多种。
45.根据实施方案40-44中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂或预防剂是能够引起免疫响应的疫苗或化合物。
46.根据实施方案40-43中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂或预防剂是核酸。
47.根据实施方案40-43中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂或预防剂是核糖核酸(RNA)。
48.根据实施方案40-43中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂或预防剂是脱氧核糖核酸(DNA)。
49.根据实施方案47所述的组合物，其中所述RNA选自由以下组成的组：小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)以及其混合物。
50.根据实施方案49所述的组合物，其中所述RNA是mRNA。
51.根据实施方案19-50中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包括药物可用的赋形剂或稀释剂中的一种或多种。
52.根据实施方案1-18中任一项所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体或者如实施方案19-51中任一项所述的组合物在制备核酸药物、基因疫苗、小分子药物、多肽或蛋白质药物中的用途。
53.一种如实施方案1-18中任一项所述的通式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体或者实施方案19-51中任一项所述的组合物在制备用于治疗有需要哺乳动物的疾病或病症的药物中的用途。
54.根据实施方案52-53中任一项所述的用途，其中所述疾病或病症以功能失常或异常的蛋白质或多肽活性为特征。
55.根据实施方案54所述的用途，其中所述疾病或病症选自由以下组成的组：感染性疾病、癌症和增生性疾病、遗传性疾病、自体免疫性疾病、糖尿病、神经退化性疾病、心血管和肾血管疾病以及代谢性疾病。
56.根据实施方案55所述的用途，其中所述感染性疾病选自：由冠状病毒、流感病毒或HIV病毒引起的疾病，小儿肺炎，裂谷热，黄热病，狂犬病，或多种疱疹。
57.根据实施方案53-56中任一项所述的用途，其中所述哺乳动物是人。
58.根据实施方案52-57中任一项所述的用途，其中所述组合物经静脉内、肌肉内、皮内、皮下、鼻内或通过吸入施用。
59.根据实施方案58所述的用途，其中所述组合物是皮下施用的。
60.根据实施方案53-59中任一项所述的用途，其中将约0.001mg/kg至约10mg/kg剂量的所述治疗剂或预防剂施用给所述哺乳动物。
实施例
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明中具体实施例中，所使用的原料均可通过市售获得。除非另有说明，上下文中百分比为重量百分比，所有的温度以摄氏度给出。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1：阳离子脂质化合物的合成
1.YK-201的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000451
步骤一：十七烷-9-基-8-((2-氯乙基)(6-氧代-6-((十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(YK-201-PM1)的合成:
将SM-102(10.00g,0.014mol)加入单口瓶中，加入100mL SOCl2，室温下搅拌反应6小时。反应完毕后将反应液倒入冰水中淬灭反应，乙酸乙酯萃取。有机相真空旋干得无色油状产物(9.51g,0.013mol,93.1％),C44H86ClNO4,MS(ES):m/z(M+H+)728.5。
步骤二：十七烷-9-基-8-(2-((2-羟乙基)(甲基氨基))乙基)(6-氧代-6-((十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(YK-201)的合成
将YK-201-PM1(1.00g，1.37mmol)与2-甲氨基-乙醇(0.31g，4.11mmol)溶于乙腈(20mL)中，向上述体系加入碳酸钾(0.61g，4.41mmol)和碘化钾(38mg，0.23mmol)加热至70℃，搅拌反应7小时。反应液冷却至室温后过滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(乙酸乙酯/正己烷)纯化，得YK-201(559mg,0.73mmol,53.3％)。C47H94N2O5,MS(ES):m/z(M+H+)767.6。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.57(t,J＝5.1Hz,2H),2.57–2.52(m,5H),2.46(dt,J＝9.8,5.1Hz,4H),2.33–2.25(m,7H),1.68–1.56(m,6H),1.47(dd,J＝13.4,6.0Hz,8H),1.28(d,J＝17.7Hz,50H),0.88(t,J＝6.8Hz,9H).
2.YK-202的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000461
步骤一：2-辛基癸基-8-((2-氯乙基)(6-氧代-6-((十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(YK-202-PM1)的合成:
将YK-202-SM1(1.50g,2.07mmol)加入单口瓶中，加入10mL SOCl2，室温下搅拌反应6小时。反应完毕后将反应液倒入冰水中淬灭反应，乙酸乙酯萃取。有机相真空旋干得无色油状产物(1.63g,2.07mmol,100.0％),C45H88ClNO4,MS(ES):m/z(M+H+)742.6。
步骤二：2-辛基癸基-8-((2-(2-羟乙基(甲基)氨基)乙基)(6-氧代-6-((十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(YK-202)的合成
以上述所得YK-202-PM1(1.60g,2.07mmol)和2-甲氨基-乙醇(0.47g,6.21mmol)为原料，按照合成YK-201的方法，得到目标化合物(1.01g,1.29mmol,62.3％)。C48H96N2O5，MS(ES):m/z(M+H+)781.3。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.05(t,J＝6.7Hz,2H),3.96(d,J＝5.7Hz,2H),3.62(t,J＝4.8Hz,2H),2.72(d,J＝5.4Hz,2H),2.64(dd,J＝14.4,5.3Hz,8H),2.36(s,3H),2.30(td,J＝7.4,4.0Hz,4H),1.60(qd,J＝15.3,7.7Hz,11H),1.28(d,J＝14.9Hz,52H),0.88(t,J＝6.6Hz,9H).
3.YK-203的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000471
步骤一：3-己基壬基-8-((2-氯乙基)(6-氧代-6-((十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(YK-203-PM1)的合成:
以YK-203-SM1(280mg，0.41mmol)与SOCl2(2mL)为原料，按照合成YK-201-PM1的方法，得YK-203-PM1(250mg,0.36mmol,87.0％)。C42H82ClNO4,MS(ES):m/z(M+H+)700.6。
步骤二：3-己基壬基-8-((2-(2-羟乙基(甲基)氨基)乙基)(6-氧代-6-((十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(YK-203)的合成
以YK-203-PM1(150mg，0.22mmol)与2-甲氨基-乙醇(75mg，0.22mmol)为原料，按照合成YK-201的方法，得YK-203(120mg,0.16mmol,73.8％)。C45H90N2O5,MS(ES):m/z(M+H+)739.7。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.10(dt,J＝9.2,7.0Hz,4H),3.73–3.63(m,2H),3.51(s,3H),3.11(s,4H),2.96(t,J＝6.1Hz,2H),2.88(q,J＝7.8Hz,4H),2.79(t,J＝6.1Hz,2H),2.70(t,J＝4.9Hz,2H),2.42(s,2H),2.33(dt,J＝13.2,7.4Hz,4H),1.70–1.59(m,10H),1.37–1.27(m,41H),0.94–0.88(m,9H).
4.YK-204的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000472
步骤一：十七烷-9-基-8-(2-((2-羟乙基)(乙基氨基))乙基)(6-氧代-6-((十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(YK-204)的合成
以YK-201-PM1(88mg，0.12mmol)与2-乙氨基-乙醇(36mg，0.41mmol)为原料，按照合成YK-201的方法，得YK-204(52mg,0.07mmol,55.5％)。C48H96N2O5,MS(ES):m/z(M+H+)781.7。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ5.41–5.24(m,1H),4.85(t,J＝6.2Hz,1H),4.07(q,J＝7.7,6.7Hz,3H),3.91–3.48(m,2H),3.36(d,J＝25.5Hz,2H),3.08(s,2H),2.38–2.15(m,3H),2.11–1.96(m,1H),1.85(s,3H),1.76–1.46(m,21H),1.26(s,48H),0.94–0.83(m,9H).
5.YK-205的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000481
步骤一：十五烷-8-基-8-((2-氯乙基)(6-氧代-6-((十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(YK-205-PM1)的合成:
以YK-205-SM1(400mg，0.59mmol)与SOCl2(3mL)为原料，按照合成YK-201-PM1的方法，得YK-205-PM1(400mg,0.57mmol,96.8％)。C42H82ClNO4,MS(ES):m/z(M+H+)700.5。
步骤二：十五烷-8-基-8-((2-(2-羟乙基(乙基)氨基)乙基)(6-氧代-6-((十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(YK-205)的合成
以YK-205-PM1(200mg，0.29mmol)与2-乙氨基-乙醇(127mg，1.43mmol)为原料，按照合成YK-201的方法，得所述目标化合物(160mg,0.21mmol，73.2％)。C46H92N2O5，MS(ES):m/z(M+H+)753.7。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.86(p,J＝6.2Hz,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.57(t,J＝4.9Hz,2H),2.69–2.58(m,7H),2.54(s,4H),2.29(dt,J＝10.4,7.5Hz,4H),1.62(dq,J＝14.0,7.3Hz,6H),1.49(d,J＝6.3Hz,8H),1.29(d,J＝21.1Hz,46H),1.05(t,J＝7.1Hz,3H),0.92–0.84(m,9H).
6.YK-206的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000491
十五烷-8-基-8-((2-(2-羟乙基(甲基)氨基)乙基)(6-氧代-6-((十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(YK-206)的合成
以YK-205-PM1(200mg，0.29mmol)与2-甲氨基-乙醇(107mg，1.43mmol)为原料，按照合成YK-201的方法，得所述目标化合物(127mg,0.17mmol，58.6％)。C45H90N2O5，MS(ES):m/z(M+H+)739.7。
1H NMR(400 MHz,Chloroform-d)δ4.86(p,J＝6.2 Hz,1H),4.05(t,J＝6.8 Hz,2H),3.56(t,J＝5.1 Hz,2H),3.28(s,2H),2.92–2.71(m,1H),2.54(d,J＝10.4 Hz,6H),2.44(dt,J＝9.9,4.8 Hz,4H),2.37–2.21(m,6H),1.62(dq,J＝14.5,7.6 Hz,6H),1.46(dt,J＝27.8,9.8 Hz,8H),1.28(d,J＝15.4 Hz,43H),0.88(t,J＝6.7 Hz,9H).
7.YK-207的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000492
步骤一：2-辛基癸基-6-((2-氯乙基)(4-氧代-4-((癸氧基)丁基)氨基)己酸酯(YK-207-PM1)的合成:
以YK-207-SM1(3.0g，4.58mmol)与SOCl2(5mL)为原料，按照合成YK-201-PM1的方法，得YK-207-PM1(2.9g,4.31mmol,94.2％)。C40H78ClNO4,MS(ES):m/z(M+H+)672.3。
步骤二：2-辛基癸基-6-(2-((2-(2-羟乙基(甲基)氨基)乙基)(4-氧代-4-((癸氧基)丁基)氨基)己酸酯(YK-207)的合成
以YK-207-PM1(200mg，0.30mmol)与2-甲氨基-乙醇(22mg，0.29mmol)为原料，按照合成YK-201的方法，得YK-207(50mg,0.07mmol,23.4％)。C43H86N2O5,MS(ES):m/z(M+H+)711.7。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ5.43–5.15(m,1H),4.07(t,J＝6.8Hz,2H),3.96(d,J＝5.8Hz,2H),3.87(t,J＝4.6Hz,1H),3.34(d,J＝25.1Hz,3H),3.05(s,3H),2.70(s,2H),2.47(t,J＝6.5Hz,2H),2.34(t,J＝7.3Hz,2H),2.01(d,J＝6.9Hz,2H),1.84–1.74(m,2H),1.65(dp,J＝21.2,7.1Hz,5H),1.46–1.37(m,2H),1.37–1.17(m,44H),0.94–0.85(m,9H).
8.YK-208的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000501
/>
2-辛基癸基-6-(2-((2-(2-羟乙基(乙基)氨基)乙基)(4-氧代-4-((癸氧基)丁基)氨基)己酸酯(YK-208)的合成
以YK-207-PM1(150mg，0.22mmol)与2-乙氨基-乙醇(59mg，0.66mmol)为原料，按照合成YK-201的方法，得YK-208(140mg,0.19mmol,87.8％)。C44H88N2O5,MS(ES):m/z(M+H+)725.7。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ5.33(s,1H),4.60(s,2H),4.09(t,J＝6.8Hz,2H),3.99(d,J＝5.8Hz,2H),3.68(t,J＝4.9Hz,2H),2.93–2.54(m,11H),2.36(dt,J＝17.0,7.3Hz,4H),1.93–1.78(m,2H),1.76–1.48(m,7H),1.45–1.21(m,43H),1.15(t,J＝7.1Hz,3H),1.00–0.78(m,9H).
9.YK-209的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000511
步骤一：双(2-辛基癸基)-6,6'-((2-羟乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(YK-209-PM1)的合成
将YK-209-SM1(1.0g，2.34mmol)和YK-209-SM2(1.15g，2.58mmol)溶于乙腈(7mL)中，向上述体系加入碳酸钾(0.97g,7.02mmol)和碘化钾(38mg，0.23mmol)，加热至70℃搅拌反应8小时。反应完毕后待反应液冷却至室温后过滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(甲醇/二氯甲烷)纯化，得YK-209-PM1(780mg,0.98mmol,41.9％),C50H99NO5,MS(ES):m/z(M+H+)794.8。
步骤二：双(2-辛基癸基)-6,6'-((2-氯乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(YK-209-PM2)的合成:
以YK-209-PM1(760mg，0.96mmol)与SOCl2(5mL)为原料，按照合成YK-201-PM1的方法，得YK-209-PM2(800mg,0.98mmol,102.5％)。C50H98ClNO4,MS(ES):m/z(M+H+)812.7。
步骤三：双(2-辛基癸基)-6,6'-((2-(2-羟乙基(甲基)氨基)乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(YK-209)的合成
以YK-209-PM2(150mg，0.18mmol)与2-甲氧基-乙醇(27mg，0.36mmol)为原料，按照合成YK-201的方法，得YK-209(120mg,0.14mmol,78.3％)。C53H106N2O5,MS(ES):m/z(M+H+)851.4。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ3.96(d,J＝5.8Hz,4H),3.69–3.65(m,2H),2.86(s,2H),2.76(s,4H),2.72–2.65(m,2H),2.41(s,3H),2.32(t,J＝7.4Hz,4H),1.66(dt,J＝15.0,7.4Hz,10H),1.26(s,62H),0.88(t,J＝6.8Hz,12H).
10.YK-210的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000521
步骤一：双(十七烷-9-基)-6,6'-((2-羟乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(YK-210-PM1)的合成
将十七烷-9-基-6-溴己酸酯(700mg，1.62mmol)和乙醇胺(55mg，0.74mmol)溶于乙腈(5mL)中，向上述体系加入碳酸钾(307mg,2.22mmol)和碘化钾(12mg，0.07mmol)，加热至70℃搅拌反应8小时。反应完毕后待反应液冷却至室温后过滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(甲醇/二氯甲烷)纯化，得YK-210-PM1(450mg,0.66mmol,79.4％),C48H95NO5,MS(ES):m/z(M+H+)766.7。
步骤二：双(十七烷-9-基)-6,6'-((2-氯乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(YK-210-PM2)的合成:
以YK-210-PM1(450mg，0.59mmol)与SOCl2(3mL)为原料，按照合成YK-201-PM1的方法，得YK-210-PM2(460mg,0.59mmol,100.0％)。C48H94ClNO4,MS(ES):m/z(M+H+)784.6。
步骤三：双(十七烷-9-基)-6,6'-((2-(2-羟乙基(甲基)氨基)乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(YK-210)的合成
以YK-210-PM2(150mg，0.19mmol)与2-甲氧基-乙醇(17mg，0.23mmol)为原料，按照合成YK-201的方法，得YK-210(136mg,0.17mmol,86.9％)。C51H102N2O5,MS(ES):m/z(M+H+)823.8。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ5.30(s,1H),4.85(p,J＝6.2Hz,2H),3.96(s,2H),3.72–3.65(m,2H),2.97(s,1H),2.90(s,3H),2.81(s,2H),2.75–2.67(m,2H),2.42(s,2H),2.30(t,J＝7.3Hz,4H),1.72–1.62(m,7H),1.50(d,J＝5.6Hz,8H),1.26(s,54H),0.88(t,J＝6.8Hz,12H).
11.YK-211的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000531
步骤一：双(3-己基壬基)-6,6'-((2-羟乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(YK-211-PM1)的合成
以6-溴己酸-3-己基壬酯(828mg，2.05mmol)和乙醇胺(50mg，0.82mmol)为原料，按照合成YK-210-PM1的方法，得到YK-211-PM1(470mg,0.66mmol,80.8％),C44H87NO5,MS(ES):m/z(M+H+)710.5。
步骤二：双(3-己基壬基)-6,6'-((2-氯乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(YK-211)-PM2的合成:
以YK-211-PM1(470mg，0.66mmol)与SOCl2(3mL)为原料，按照合成YK-201-PM1的方法，得YK-211-PM2(420mg,0.58mmol,87.5％)。C44H86ClNO4,MS(ES):m/z(M+H+)728.6。
步骤三：双(3-己基壬基)-6,6'-((2-(2-羟乙基(甲基)氨基)乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(YK-211)的合成
以YK-211-PM2(100mg，0.14mmol)与2-甲氨基-乙醇(12mg，0.16mmol)为原料，按照合成YK-201的方法，得YK-211(57mg,0.07mmol,53.1％)。C47H94N2O5,MS(ES):m/z(M+H+)767.7。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.08(t,J＝7.2Hz,4H),3.82–3.75(m,2H),3.31(d,J＝5.6Hz,4H),3.13(dd,J＝18.9,10.6Hz,5H),2.87(s,2H),2.56(s,2H),2.33(t,J＝7.2Hz,4H),1.78(p,J＝7.9Hz,3H),1.73–1.62(m,4H),1.57(q,J＝7.0Hz,4H),1.43(dt,J＝14.4,7.5Hz,6H),1.25(s,42H),0.88(t,J＝6.7Hz,12H).
12.YK-212的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000541
双(2-辛基癸基)-6,6'-((2-(双(2-羟乙基)氨基)乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(YK-212)的合成
以YK-209-PM2(100mg，0.12mmol)与二乙醇胺(26mg，0.24mmol)为原料，按照合成YK-201的方法，得YK-212(80mg,0.09mmol,75.6％)。C54H108N2O6,MS(ES):m/z(M+H+)881.8。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.00(d,J＝5.8Hz,4H),3.69(dd,J＝5.6,4.0Hz,4H),3.04–2.93(m,5H),2.85(t,J＝5.4Hz,2H),2.75(t,J＝4.8Hz,4H),2.36(t,J＝7.3Hz,4H),1.70(tq,J＝11.0,6.7,5.6Hz,10H),1.30(s,63H),0.95–0.89(m,12H).
13.YK-213的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000551
双(十七烷-9-基)-6,6'-((2-(双(2-羟乙基)氨基)乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(YK-213)的合成
以YK-210-PM2(150mg，0.19mmol)与二乙醇胺(21mg，0.20mmol)为原料，按照合成YK-201的方法，得YK-213(50mg,0.06mmol,30.8％)。C52H104N2O6,MS(ES):m/z(M+H+)853.8。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.00(d,J＝5.8Hz,4H),3.69(dd,J＝5.6,4.0Hz,4H),3.04–2.93(m,5H),2.85(t,J＝5.4Hz,2H),2.75(t,J＝4.8Hz,4H),2.36(t,J＝7.3Hz,4H),1.70(tq,J＝11.0,6.7,5.6Hz,10H),1.30(s,63H),0.95–0.89(m,12H).
14.YK-214的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000552
/>
双(3-己基壬基)-6,6'-((2-(双(2-羟乙基)氨基)乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(YK-214)的合成
将6-溴己酸-3-己基壬酯(303mg，0.75mmol)和N,N-双(2-羟乙基)乙二胺(50mg，0.34mmol)溶于乙腈(2mL)中，向上述体系加入碳酸钾(140mg,1.02mmol)和碘化钾(5.6mg，0.034mmol)，加热至70℃搅拌反应24小时。反应完毕后待反应液冷却至室温后过滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(甲醇/二氯甲烷)纯化，得YK-214(120mg,0.15mmol,44.3％),C48H96N2O6,MS(ES):m/z(M+H+)797.8。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.11(t,J＝7.2Hz,4H),4.02–3.74(m,1H),3.65(t,J＝4.9Hz,4H),2.74(dd,J＝12.4,7.4Hz,11H),2.34(t,J＝7.4Hz,4H),1.64(dq,J＝29.0,7.4Hz,11H),1.50–1.20(m,49H),0.94–0.89(m,12H).
15.YK-215的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000561
十七烷-9-基-8-((2-(2-甲氧基乙基(甲基)氨基)乙基)(6-氧代-6-((十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(YK-215)的合成
以YK-201-PM1(95mg，0.13mmol)和2-甲氧基-N-甲基乙烷-1-胺(14mg，0.16mmol)为原料，按照合成YK-201的方法，得所述目标化合物(98mg,0.12mmol，96.5％)。C48H96N2O5，MS(ES):m/z(M+H+)781.2。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.86(t,J＝6.2Hz,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.36(s,3H),3.15(t,J＝6.3Hz,3H),3.01(dq,J＝11.7,7.2,5.6Hz,6H),2.77(t,J＝5.0Hz,2H),2.45(s,2H),2.30(dt,J＝17.9,7.4Hz,4H),1.85–1.57(m,10H),1.50(d,J＝6.3Hz,4H),1.41–1.18(m,50H),0.88(t,J＝6.6Hz,9H).
16.YK-216的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000562
2-辛基癸基-6-(2-((2-(2-甲氧基乙基(甲基)氨基)乙基)(4-氧代-4-((癸氧基)丁基)氨基)己酸酯(YK-216)的合成
以YK-207-PM1(170mg，0.25mmol)与2-甲氧基-N-甲基乙烷-1-胺(89mg，0.45mmol)为原料，按照合成YK-201的方法，得YK-216(140mg,0.19mmol,77.2％)。C44H88N2O5,MS(ES):m/z(M+H+)725.6。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.09(t,J＝6.7Hz,2H),4.00(d,J＝5.8Hz,2H),3.58(t,J＝5.3Hz,2H),3.39(s,3H),2.94–2.50(m,11H),2.51–2.25(m,7H),1.88(d,J＝8.2Hz,2H),1.75–1.48(m,7H),1.50–1.20(m,43H),0.98–0.83(m,9H).
17.YK-217的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000571
3-己基壬基-11-(4-(癸氧基)-4-氧代丁基)-2-甲基-7-氧代-8-氧代-6-硫-2,11-二氮七烷-17-甲酸酯(YK-217)的合成
将YK-217-SM1(100mg，0.16mmol)、二甲氨基丙硫醇(20mg，0.32mmol)和吡啶(1.2ml)溶于二氯甲烷(5mL)中，在氮气保护下，冰浴下向上述体系分批加入三光气(77mg,0.26mmol)，撤去冰浴，自然升温至室温，搅拌反应8h。反应完毕后向反应液滴加饱和碳酸氢钠水溶液(5mL)，加入20mL二氯甲烷，分液，有机相用饱和食盐水洗，有机相经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(甲醇/二氯甲烷)纯化，得YK-217(60mg,0.03mmol,16.5％),C43H84N2O6S,MS(ES):m/z(M+H+)757.2。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.14–4.00(m,2H),3.96(t,J＝4.7Hz,2H),3.34(s,4H),2.91(td,J＝7.2,3.3Hz,2H),2.47(d,J＝7.9Hz,2H),2.31(t,J＝7.0Hz,8H),1.95–1.78(m,4H),1.62(d,J＝11.7Hz,6H),1.31–1.23(m,45H),0.87(dt,J＝7.0,3.4Hz,9H).
18.YK-218的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000572
2-辛基癸基-11-(4-(癸氧基)-4-氧代丁基)-2-甲基-7-氧代-8-氧代-6-硫-2,11-二氮七烷-17-甲酸酯(YK-218)的合成
以YK-207-SM1(100mg，0.15mmol)和二甲氨基丙硫醇(36.5mg，0.31mmol)为原料，按照合成YK-217的方法，得到YK-218(60mg,0.08mmol,50.0％),C46H90N2O6S,MS(ES):m/z(M+H+)799.7。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.23(t,J＝6.2Hz,2H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.96(d,J＝5.8Hz,2H),2.89(t,J＝7.2Hz,2H),2.70(t,J＝6.2Hz,2H),2.46(ddd,J＝12.4,8.0,6.1Hz,5H),2.31(d,J＝7.4Hz,9H),1.91–1.83(m,2H),1.77–1.68(m,2H),1.62(tt,J＝7.8,4.5Hz,5H),1.46–1.38(m,2H),1.28(d,J＝14.4Hz,46H),0.88(t,J＝6.7Hz,9H).
19.YK-219的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000581
步骤一：6-(4-(癸氧基)-4-氧代丁基)-氨基己酸-2-辛基癸酯(YK-219-PM1)的合成
以YK-219-SM1(459mg,1.19mmol)和YK-219-SM2(304mg,0.99mmol)为原料，按照合成YK-207-PM1的方法，得YK-219-PM1(310mg,0.51mmol,51.3％),C38H75NO4,MS(ES):m/z(M+H+)610.5。
步骤二：2-辛基癸基-6-(4-(癸氧基)-4-氧代丁基)(((3-(二甲氨基)丙基)硫代)羰基)氨基)己酸酯(YK-219)的合成
以YK-219-PM1(310mg,0.51mmol)和二甲氨基丙硫醇(303mg,2.54mmol)为原料，按照合成YK-217的方法，得YK-219(82mg,0.11mmol,21.3％),C44H86N2O5S,MS(ES):m/z(M+H+)755.5。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.10(q,J＝4.9,3.5Hz,2H),3.99(t,J＝4.6Hz,2H),3.37(s,3H),2.95(td,J＝7.2,3.4Hz,2H),2.50(d,J＝7.8Hz,2H),2.36(d,J＝3.6Hz,9H),2.07–1.84(m,4H),1.70–1.59(m,6H),1.43–1.26(m,47H),0.91(dt,J＝7.0,3.4Hz,9H).
20.YK-220的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000591
/>
步骤一：6-(4-(癸氧基)-4-氧代丁基)-氨基己酸-3-己基壬酯(YK-220-PM1)的合成
以YK-220-SM1(391mg,1.15mmol)和YK-220-SM2(292mg,0.95mmol)为原料，按照合成YK-210-PM1的方法，得YK-220-PM1(249mg,0.44mmol,46.2％),C35H69NO4,MS(ES):m/z(M+H+)568.5。
步骤二：3-己基壬-6-(4-(癸氧基)-4-氧代丁基)(((3-(二甲氨基)丙基)硫代)羰基)氨基)己酸酯(YK-220)的合成
以YK-220-PM1(200mg,0.35mmol)和二甲氨基丙硫醇(209mg,1.75mmol)为原料，按照合成YK-217的方法，得YK-220(76mg,0.11mmol,30.4％),C41H80N2O5S,MS(ES):m/z(M+H+)713.6。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.12–4.02(m,4H),3.35(s,4H),2.92(t,J＝7.2Hz,2H),2.49–2.40(m,2H),2.30(s,8H),1.60(dp,J＝20.8,7.2Hz,8H),1.44–1.18(m,40H),0.88(t,J＝6.8Hz,9H).
21.YK-221的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000601
步骤一：2-辛基癸基-6-(2-((2-(N-叔丁氧羰基-N-甲基氨基)乙基)(甲基氨基)乙基)(4-氧代-4-((癸氧基)丁基)氨基)己酸酯(YK-221-PM1)的合成
以YK-207-PM1(150mg，0.22mmol)与甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(45mg，0.22mmol)为原料，按照合成YK-201的方法，得YK-221-PM1(120mg,0.15mmol,66.2％)。C49H97N3O6,MS(ES):m/z(M+H+)824.7。
步骤二：2-辛基癸基-6-(2-((2-(甲基氨基)乙基)(甲基氨基)乙基)(4-氧代-4-((癸氧基)丁基)氨基)己酸酯(YK-221)的合成
将YK-221-PM1(120mg，0.15mmol)溶于3mL二氯甲烷中，滴加0.5mL三氟乙酸，室温下搅拌2h，反应完毕后真空旋干，加入10mL乙酸乙酯溶解，加入饱和碳酸氢钠水溶液萃取，有机相经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(乙酸乙酯/正己烷)纯化，得所述目标化合物(80mg,0.11mmol,73.6％)。C44H89N3O4,MS(ES):m/z(M+H+)724.6。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.06(t,J＝6.8Hz,2H),3.96(d,J＝5.8Hz,1H),3.21(s,3H),3.05(s,2H),2.91(s,1H),2.73(s,2H),2.54(s,2H),2.49–2.17(m,11H),2.03(d,J＝11.0Hz,3H),1.82(s,2H),1.61(d,J＝7.3Hz,4H),1.53–1.40(m,2H),1.26(d,J＝3.9Hz,42H),0.88(t,J＝6.7Hz,9H).22.YK-222的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000611
步骤一：十七烷-9-基-8-(2-((2-(N-叔丁氧羰基-N-甲基氨基)乙基)(甲基氨基)乙基)(6-氧代-6-((十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(YK-222-PM1)的合成
以YK-201-PM1(100mg，0.14mmol)与甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(28mg，0.15mmol)为原料，按照合成YK-201的方法，得YK-222-PM1(120mg,0.14mmol,97.4％)。C49H97N3O6,MS(ES):m/z(M+H+)880.3。
步骤二：十七烷-9-基-8-(2-((2-(甲基氨基)乙基)(甲基氨基)乙基)(6-氧代-6-((十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(YK-222)的合成
将YK-222-PM1(120mg，0.14mmol)溶于1mL二氯甲烷中，滴加1mL三氟乙酸，按照合成YK-221的方法，得所述目标化合物(67mg,0.09mmol,61.3％)。C48H97N3O4,MS(ES):m/z(M+H+)780.4。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.93–4.80(m,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.15(t,J＝5.4Hz,4H),3.02(s,3H),2.83(s,1H),2.73(s,2H),2.37–2.21(m,7H),2.01(d,J＝5.5Hz,6H),1.63(tt,J＝13.9,7.4Hz,10H),1.50(d,J＝6.4Hz,4H),1.46–1.15(m,49H),0.93–0.85(m,9H).
23.YK-223的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000612
/>
步骤一：双(2-辛基癸基)-6,6'-((2-((2-(N-Boc-N-甲基氨基)乙基)(甲基氨基)乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(YK-223-PM1)的合成
以YK-209-PM2(150mg，0.18mmol)与甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(45mg，0.24mmol)为原料，按照合成YK-201的方法，得YK-223-PM1(160mg,0.17mmol,92.2％)。C59H117N3O6,MS(ES):m/z(M+H+)964.9。
步骤二：双(2-辛基癸基)-6,6'-((2-((2-(甲基氨基)乙基)(甲基氨基)乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(YK-223)的合成
将YK-223-PM1(160mg，0.17mmol)溶于1mL二氯甲烷中，滴加0.5mL三氟乙酸，按照合成YK-221的方法，得所述目标化合物(120mg,0.14mmol,81.7％)。C54H109N3O4,MS(ES):m/z(M+H+)864.9。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.12(q,J＝7.1Hz,1H),3.97(d,J＝5.8Hz,3H),2.95(d,J＝4.8Hz,1H),2.88–2.40(m,10H),2.38–2.25(m,6H),2.05(s,2H),1.74–1.12(m,74H),0.88(d,J＝6.9Hz,12H).
24.YK-224的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000621
步骤一：双(十七烷-9-基)-6,6'-((2-((2-(N-Boc-N-甲基氨基)乙基)(甲基氨基)乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(YK-224-PM1)的合成
以YK-210-PM2(150mg，0.19mmol)与甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(43mg，0.23mmol)为原料，按照合成YK-201的方法，得YK-224-PM1(120mg,0.13mmol,55.7％)。C57H113N3O6,MS(ES):m/z(M+H+)936.8。
步骤二：双(十七烷-9-基)-6,6'-((2-((2-(甲基氨基)乙基)(甲基氨基)乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(YK-224)的合成
将YK-224-PM1(100mg，0.11mmol)溶于2mL二氯甲烷中，滴加1mL三氟乙酸，按照合成YK-221的方法，得所述目标化合物(70mg,0.08mmol,76.1％)。C52H105N3O4,MS(ES):m/z(M+H+)836.7。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.86(q,J＝6.1Hz,2H),4.12(q,J＝7.1Hz,1H),2.90–2.82(m,2H),2.76–2.41(m,9H),2.30(q,J＝8.3,7.4Hz,6H),2.04(s,1H),1.63(q,J＝7.4Hz,4H),1.57–1.39(m,12H),1.28(d,J＝15.2Hz,56H),0.88(t,J＝6.8Hz,12H).
25.YK-225的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000631
步骤一：双(3-己基壬基)-6,6'-((2-((2-(N-Boc-N-甲基氨基)乙基)(甲基氨基)乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(YK-225-PM1)的合成
以YK-211-PM2(170mg，0.21mmol)与甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(43mg，0.23mmol)为原料，按照合成YK-201的方法，得YK-225-PM1(120mg,0.14mmol,64.9％)。C53H105N3O6,MS(ES):m/z(M+H+)880.8。
步骤二：双(3-己基壬基)-6,6'-((2-((2-(甲基氨基)乙基)(甲基氨基)乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(YK-225)的合成
将YK-225-PM1(120mg，0.14mmol)溶于2mL二氯甲烷中，滴加0.5mL三氟乙酸，按照合成YK-221的方法，得所述目标化合物(80mg,0.10mmol,73.2％)。C48H97N3O4,MS(ES):m/z(M+H+)780.7。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.08(t,J＝7.1Hz,4H),3.48(s,3H),3.04–2.86(m,5H),2.29(dd,J＝17.2,9.6Hz,5H),1.61(ddd,J＝26.8,14.3,7.3Hz,10H),1.47–1.35(m,6H),1.25(s,45H),0.88(t,J＝6.1Hz,12H).
26.YK-226的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000641
步骤一：6-((2-(N-Boc-N-乙基氨基)乙基)氨基)己酸十一烷酯(YK-226-PM1)的合成:
将YK-226-SM1(278mg,0.80mmol)与(2-氨基乙基)(乙基)氨基甲酸叔丁基酯(150mg,0.80mmol)溶于乙腈(3mL)中，向上述体系加入碳酸钾(330mg,2.38mmol)和碘化钾(13mg,0.08mmol)加热至70℃搅拌反应4小时。反应完毕后待反应液冷却至室温后过滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(甲醇/二氯甲烷)纯化，得到4-((2-羟基丁基)氨基)丁酸癸酯(190mg,0.46mmol,57.3％),C23H46N2O4,MS(ES):m/z(M+H+)415.4。
步骤二：2-辛基癸基-6-(6-(十一烷氧基)-6-氧代己基)((2-(N-Boc-N-乙基氨基)乙基)氨基)己酸酯(YK-226-PM2)的合成
将上述纯化所得YK-226-PM1(190mg，0.42mmol)、6-溴己酸-2-辛基癸酯(180mg，0.46mmol)溶于乙腈(3mL)中，向上述体系加入碳酸钾(173mg，1.26mmol)和碘化钾(7mg，0.04mmol),加热至70℃搅拌反应24小时。反应液冷却至室温后过滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(乙酸乙酯/正己烷)纯化，得所述目标化合物(281mg,0.35mmol，82.7％)。C49H96N2O6，MS(ES):m/z(M+H+)809.7。
步骤三：2-辛基癸基-6-(6-(十一烷氧基)-6-氧代己基)((2-(乙基氨基)乙基)氨基)己酸酯(YK-226)的合成
将YK-226-PM2(281mg，0.35mmol)溶于2mL二氯甲烷中，滴加1mL三氟乙酸，按照合成YK-221的方法，得所述目标化合物(210mg,0.30mmol,84.6％)。C44H88N2O4,MS(ES):m/z(M+H+)709.6。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.09(t,J＝6.8Hz,2H),4.00(d,J＝5.8Hz,2H),3.40–3.18(m,1H),2.86–2.73(m,4H),2.64(t,J＝6.0Hz,2H),2.46(q,J＝7.1Hz,4H),2.34(q,J＝7.7Hz,4H),1.73–1.58(m,7H),1.54–1.42(m,4H),1.37–1.20(m,49H),0.97–0.89(m,9H).
27.YK-009的合成
按照CN114044741B中方法，得到YK-009 159mg。
28.9-十七烷基-8-(8-((3-己基壬基)氧基)-8-氧代辛基)-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯(化合物21)的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000651
步骤一：8-溴辛酸-9-十七烷酯制备(化合物21-PM1)的合成
将9-十七醇(1.00g，3.90mmol)与8-溴辛酸(1.04g，4.66mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.90g,4.68mmol)和4-二甲基氨基吡啶(24mg,0.20mmol)，于30-35℃下搅拌反应8小时。反应完毕后将反应液用饱和碳酸钠洗涤、饱和食盐水洗涤，并经Na2SO4干燥。将混合物过滤，滤液经真空减压浓缩,经硅胶色谱法(乙酸乙酯/正己烷)纯化，得到8-溴辛酸-9-十七烷酯(1.20g，2.60mmol，66.7％)。
步骤二：9-十七烷基-8-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯(化合物21-PM2)的合成
将8-溴辛酸-9-十七烷酯(500mg，1.08mmol)与乙醇胺(119mg，3.25mmol)溶于乙腈(5mL)中，加入碳酸钾(149mg,1.08mmol)，加热至70℃搅拌反应2小时。反应完毕待反应液冷却至室温后过滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(甲醇/二氯甲烷)纯化，得9-十七烷基-8-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯(372mg,0.84mmol,78.0％),C27H55NO3,MS(ES):m/z(M+H+)442.3。
步骤三：8-溴辛酸-3-己基壬酯制备(化合物21-PM3)的合成
以3-己基壬醇(1.00g，4.38mmol)与8-溴辛酸(1.17g，5.25mmol)为原料，按照制备化合物21-PM1的方法，经硅胶色谱法(乙酸乙酯/正己烷)纯化，得到8-溴辛酸-3-己基壬酯(1.62g，3.74mmol，85.3％)。
步骤四：9-十七烷基-8-(8-((3-己基壬基)氧基)-8-氧代辛基)-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯(化合物21)的合成
将9-十七烷基-8-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯(200mg，0.46mmol)和8-溴辛酸-3-己基壬酯(336mg，0.82mmol)溶于乙腈(6mL)中，加入碳酸钾(254mg，1.84mmol)和碘化钾(8.3mg，0.05mmol)，加热至70℃搅拌反应20小时。反应液冷却至室温后过滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(乙酸乙酯/正己烷)纯化，得所述目标化合物(213mg，0.27mmol，58.4％)。C50H99NO5，MS(ES):m/z(M+H+)794.8。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.90(p,J＝6.3Hz,1H),4.21–4.02(m,2H),3.66(s,2H),2.73(s,2H),2.60(s,4H),2.43–2.20(m,4H),2.12–1.99(m,1H),1.75–1.49(m,13H),1.48–1.39(m,2H),1.42–1.15(m,56H),0.92(td,J＝6.8,2.2Hz,12H).
29.双(3-己基壬基)-8,8'-((2-羟乙基)氮杂二烷基)二辛酸酯(化合物23)的合成
合成路线如下：
Figure BDA0004170009180000661
将8-溴辛酸-3-己基壬酯(710mg，1.64mmol)和乙醇胺(40mg，0.66mmol)溶于乙腈(10mL)中，向上述体系加入碳酸钾(1.09g,7.92mmol)和碘化钾(66mg，0.39mmol)，加热至70℃搅拌反应20小时。反应完毕后待反应液冷却至室温后过滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(甲醇/二氯甲烷)纯化，得到双(3-己基壬基)-8,8'-((2-羟乙基)氮杂二烷基)二辛酸酯(150mg,0.20mmol,29.7％),C48H95NO5,MS(ES):m/z(M+H+)766.5。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.12(t,J＝7.1Hz,4H),3.62(s,2H),2.68(s,2H),2.51(d,J＝25.8Hz,4H),2.32(t,J＝7.5Hz,4H),1.72–1.57(m,8H),1.55–1.40(m,6H),1.40–1.17(m,55H),0.92(t,J＝6.8Hz,12H)。
实施例2：纳米脂质颗粒(LNP制剂)制备条件优化
1.载体(脂质体)与mRNA比例优化
Figure BDA0004170009180000671
将实施例1中合成的阳离子脂质化合物YK-202分别与DSPC(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)、胆固醇(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)和DMG-PEG2000按照49:10:39.5:1.5的摩尔比溶于乙醇，制备乙醇脂质溶液。通过乙醇注入法将乙醇脂质溶液快速加入柠檬酸盐缓冲液(pH＝4～5)，涡旋30s备用。将eGFP-mRNA在柠檬酸盐缓冲液(pH＝4～5)中稀释得到mRNA水溶液。将一定体积的脂质体溶液与mRNA水溶液，分别以总脂质与mRNA的重量比为5:1、10:1、15:1、20:1、30:1和35:1制备脂质体。25℃超声15min(超声频率40kHz，超声功率800W)。所得脂质体用PBS稀释至10倍体积后，300KDa超滤管进行超滤除乙醇。再经PBS定容至一定体积，得到使用阳离子脂质YK-202/DSPC/胆固醇/DMG-PEG2000(摩尔百分比为49:10:39.5:1.5)包封eGFP-mRNA的LNP制剂。
细胞转染实验结果显示，载体与mRNA重量比在10:1～30:1范围内，均有较好转染效果，其中转染效果最好为15:1，比例为5:1和35:1转染效果差，不能用此比例来运载mRNA。(图1)
用YK-201和YK-209制备得到的LNP制剂，得到同样的结果，图未显示。
2.阳离子脂质与中性脂质比例优化
按照1中方法制备包封eGFP-mRNA的LNP制剂，其中阳离子脂质YK-202与中性脂质DSPC摩尔比分别为1:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、4.9:1、10:1、15:1和20:1。
通过细胞转染实验可以看出，阳离子脂质与中性脂质摩尔比为1:1～15:1均有转染效果，其中转染效率最高的是4.5:1，比例为3.5:1和4.9:1也有较好的转染效果。(图2)
用YK-201和YK-209制备得到的LNP制剂，得到同样的结果，图未显示。
3.聚合物共轭脂质占载体(脂质体)比例优化
按照1中方法制备包封eGFP-mRNA的LNP制剂，载体中阳离子脂质为YK-202，其中聚合物共轭脂质DMG-PEG2000占载体摩尔比分别为0.5％、1.5％、3.5％、5％、10％和15％。
细胞转染实验结果显示，聚合物共轭脂质占载体摩尔比在0.5％～10％范围内，均有转染效果，1.5％时转染效率最高，10％时最低。(图3)
用YK-201和YK-209制备得到的LNP制剂，得到同样的结果，图未显示。
4.载体(脂质体)中各成分比例优化
按照1中方法制备包封eGFP-mRNA的LNP制剂，其中阳离子脂质YK-202、中性脂质DSPC、结构脂质胆固醇和聚合物共轭脂质DMG-PEG2000摩尔比分别为75:5:15:5、49:10:39.5:1.5、45:10:43.5:1.5、45:25:20:10、40:10:48.5:1.5、35:10:53.5:1.5和25:5:65:5。
通过细胞转染实验可知，阳离子脂质、中性脂质、结构脂质和聚合物共轭脂质摩尔比在75:5:15:5、49:10:39.5:1.5、45:10:43.5:1.5、45:25:20:10、40:10:48.5:1.5、35:10:53.5:1.5和25:5:65:5比例下均能转染，其中比例为45:10:43.5:1.5转染效果最好(图4)。说明阳离子脂质、中性脂质、结构脂质和聚合物共轭脂质摩尔比在(25～75):(5～25):(15～65):(0.5～10)范围内均可用来制备LNP制剂，其中最佳比例为45:10:43.5:1.5。
用YK-201和YK-209制备得到的LNP制剂，得到同样的结果，图未显示。
实施例3：eGFP-mRNA的LNP制剂细胞转染实验
细胞复苏与传代：将293T细胞复苏，于培养皿中培养传代至所需的细胞数量。
种板：将培养皿中的细胞消化并计数，以每孔1万个细胞铺在96孔板中，以每孔15万个细胞铺在12孔板中，过夜培养至细胞贴壁。
细胞转染实验：分别将含有1.5μg实施例2中制备的eGFP-mRNA的LNP制剂(载体中阳离子脂质为YK-202)以及eGFP-mRNA的Lipofectamin 3000制剂加入12孔板的细胞培养液中，继续培养24h后，经荧光显微镜观察，根据荧光强度考察不同样品的转染效率。
根据实验结果，最后确定了纳米脂质颗粒(LNP制剂)的制备条件：载体与mRNA比例为15:1；阳离子脂质与中性脂质摩尔比为4.9:1；聚合物共轭脂质占脂质体1.5％；阳离子脂质、中性脂质、结构脂质和聚合物共轭脂质摩尔比为49:10:39.5:1.5，此比例中本申请设计的各种阳离子脂质以及现有技术中所使用的阳离子脂质均有较优的转染效果(由实施例2确定，部分实验结果未显示)，后面的实验用此条件制备纳米脂质颗粒(LNP制剂)。
实施例4：纳米脂质颗粒(LNP制剂)的制备(最优配比)
表1阳离子脂质结构
Figure BDA0004170009180000701
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Figure BDA0004170009180000711
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Figure BDA0004170009180000721
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Figure BDA0004170009180000731
/>
Figure BDA0004170009180000741
将表1中所列阳离子脂质分别与DSPC(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)、胆固醇(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)和DMG-PEG2000按照49:10:39.5:1.5的摩尔比溶于乙醇，制备乙醇脂质溶液，通过乙醇注入法将乙醇脂质溶液快速加入柠檬酸盐缓冲液(pH＝4～5)，涡旋30s备用。将eGFP-mRNA(上海起发实验试剂有限公司)或Fluc-mRNA(上海起发实验试剂有限公司)在柠檬酸盐缓冲液(pH＝4～5)中稀释得到mRNA水溶液。将一定体积的脂质体溶液与mRNA水溶液，以总脂质与mRNA的重量比为15:1制备脂质体。25℃超声15min(超声频率40kHz，超声功率800W)。所得脂质体经用PBS稀释至10倍体积后，300KDa超滤管进行超滤除乙醇。再经PBS定容至一定体积，得到使用阳离子脂质/DSPC/胆固醇/DMG-PEG2000(摩尔百分比为49:10:39.5:1.5)包封eGFP-mRNA或Fluc-mRNA的LNP制剂。
Lipofectamine 3000转染试剂目前广泛用来进行细胞转染，具有非常好的转染性能和优异的转染效率，并可提高细胞活性，而且适用于难转染的细胞种类。我们选用Lipofectamine 3000转染试剂进行对照，按照Lipofectamine 3000(英潍捷基(上海)贸易有限公司)说明书中方法，制备得到eGFP-mRNA或Fluc-mRNA的Lipofectamin 3000制剂。
实施例5：纳米脂质颗粒粒径及多分散系数(PDI)的测定
通过动态光散射法，采用马尔文激光粒度仪测定粒径及多分散系数(PDI)。取脂质体溶液10μL，用无RNA酶去离子水稀释至1mL，加入样品池，每个样品重复测定3次。测定条件为：90°散射角，25℃。检测结果如下表：
表2粒径及多分散系数(PDI)
名称 粒径(nm) PDI(％)
YK-201 205 25.5
YK-202 173 23.4
YK-203 235 23.7
YK-204 193 17.7
YK-205 219 17.7
YK-206 216 18.8
YK-207 192 18.9
YK-208 167 24.4
YK-209 226 26.6
YK-210 224 22.9
YK-211 222 20.7
YK-212 172 19.2
YK-213 207 17.6
YK-214 203 31.5
YK-215 219 20.8
YK-216 219 13.7
YK-217 210 17.9
YK-218 222 17.2
YK-219 217 22.4
YK-220 221 26.6
YK-221 237 21.9
YK-222 218 30.4
YK-223 211 25.8
YK-224 185 30.3
YK-225 222 19.3
YK-226 246 17.0
YK-009 202 13.0
SM-102 145 19.2
ALC-0315 218 15.9
化合物21 155 15.5
化合物23 138 8.6
HMMA 135 15.1
实施例4中制备的纳米脂质颗粒粒径在130～250nm之间，均可用于递送mRNA，其中由HMMA制备的颗粒粒径最小，为135nm，由YK-226制备的颗粒粒径最大，为246nm。所有纳米脂质颗粒的多分散系数在5％～35％之间，其中最小的是化合物23，为8.6％，最大的是YK-214，为31.5％。
实施例6：包封率、载药浓度和总RNA浓度检测
包封率是脂质体的关键质量属性，指的是包封在脂质双分子层中的药物含量占总投药量的百分比，能够反映出脂质体中药物包封程度的高低。中国药典规定包封率一般不得低于80％。
载药量是脂质体中药物量与脂质体中药物和载体总量的比例，载药量的大小直接影响到药物的临床应用剂量，所以载药量越大，越能够满足临床需要。载药浓度与载药量成正比，载药浓度的相对比例可代表载药量的相对比例。总RNA浓度的相对比例可代表LNP制剂携带的mRNA量的相对比例。
试剂准备：
配制1×TE缓冲液、0.1％ Triton X-100缓冲液、RiboGreen试剂(1:200)和mRNA标准品储备液。
样品检测：
取样品适量，加入到适量1×TE缓冲液中，稀释制成每1mL中约含2.8μg的供试品溶液。然后加样至96孔板，每孔加50μL稀释后的供试品或mRNA标准品储备液，再加1×TE缓冲液和0.1％ Triton X-100缓冲液，样品37℃孵育10分钟，向96孔板每个供试品孔中加入100μL RiboGreen试剂(1:200)，离心，使用酶标仪读数，数据处理。具体数据见表3和表4。
实验结果：
(1)由YK-201、YK-202、YK-206、YK-207和YK-209制备得到的LNP制剂，相比于现有技术阳离子脂质，包封率、载药浓度和总RNA浓度均显著提高。例如，YK-209包封率可比化合物23提高41％，载药浓度可达化合物23的2倍；YK-201总RNA浓度可达化合物21的1.5倍。
表3包封率、载药浓度和总RNA浓度检测结果-1
Figure BDA0004170009180000781
从表3可以看出，由不同化合物制备的LNP制剂，包封率差别很大。YK-201、YK-202、YK-206、YK-207和YK-209，与SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23、HHMA和YK-009相比，包封率显著提高。
YK-201包封率为89.5％，比SM-102提高27.20％，比ALC-0315提高26.70％，比化合物21提高31.70％，比化合物23提高34.30％，比HHMA提高29.00％，比YK-009提高26.50％。
YK-202包封率为86.3％，比SM-102提高24.00％，比ALC-0315提高23.50％，比化合物21提高28.50％，比化合物23提高31.10％，比HHMA提高25.80％，比YK-009提高23.30％。
YK-206包封率为91.4％，比SM-102提高29.10％，比ALC-0315提高28.60％，比化合物21提高33.60％，比化合物23提高36.20％，比HHMA提高30.90％，比YK-009提高28.40％。
YK-207包封率为90.8％，比SM-102提高28.50％，比ALC-0315提高28.00％，比化合物21提高33.00％，比化合物23提高35.60％，比HHMA提高30.30％，比YK-009提高27.80％。
YK-209包封率为96.2％，比SM-102提高33.90％，比ALC-0315提高33.40％，比化合物21提高38.40％，比化合物23提高41.00％，比HHMA提高35.70％，比YK-009提高33.20％。
并且，由不同化合物制备的LNP制剂，载药浓度和总RNA浓度也有很大差别，YK-201、YK-202、YK-206、YK-207和YK-209与SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23和YK-009相比，载药浓度和总RNA浓度均显著提高。
YK-201载药浓度为40.32μg/mL，总RNA浓度为45.07μg/mL，分别为SM-102的1.58倍和1.28倍，ALC-0315的1.55倍和1.21倍，化合物21的1.78倍和1.47倍，化合物23的1.95倍和1.39倍，HHMA的1.32倍和1.19倍，YK-009的1.50倍和1.17倍。
YK-202载药浓度为37.08μg/mL，总RNA浓度为42.98μg/mL，分别为SM-102的1.46倍和1.22倍，ALC-0315的1.42倍和1.16倍，化合物21的1.64倍和1.40倍，化合物23的1.79倍和1.32倍，HHMA的1.21倍和1.14倍，YK-009的1.38倍和1.11倍。
YK-206载药浓度为38.09μg/mL，总RNA浓度为41.69μg/mL，分别为SM-102的1.50倍和1.18倍，ALC-0315的1.46倍和1.12倍，化合物21的1.69倍和1.36倍，化合物23的1.84倍和1.28倍，HHMA的1.24倍和1.10倍，YK-009的1.42倍和1.08倍。
YK-207载药浓度为39.60μg/mL，总RNA浓度为43.63μg/mL，分别为SM-102的1.56倍和1.24倍，ALC-0315的1.52倍和1.18倍，化合物21的1.75倍和1.42倍，化合物23的1.91倍和1.34倍，HHMA的1.29倍和1.15倍，YK-009的1.47倍和1.13倍。
YK-209载药浓度为41.76μg/mL，总RNA浓度为43.42μg/mL，分别为SM-102的1.64倍和1.23倍，ALC-0315的1.60倍和1.17倍，化合物21的1.85倍和1.41倍，化合物23的2.02倍和1.34倍，HHMA的1.36倍和1.15倍，YK-009的1.55倍和1.12倍。
用GraphPad Prism软件对数据进行分析，其中YK-201、YK-202、YK-206、YK-207与YK-209中的任一个，与SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23、HHMA和YK-009均有显著差异，包封率、载药浓度和总RNA浓度均显著提高。
小结：
由我们设计的一些化合物，包括YK-201、YK-202、YK-206、YK-207和YK-209，制备得到的LNP制剂，相比于现有技术阳离子脂质，例如SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23、HHMA和YK-009，包封率、载药浓度和总RNA浓度均显著提高。例如，YK-209包封率可比化合物23提高41％，载药浓度可达化合物23的2倍；YK-201总RNA浓度可达化合物21的1.5倍。
(2)由设计的不同化合物制备得到的LNP制剂，包封率和载药量差异很大，不同化合物包封率范围为55％～99％，载药浓度在25～45μg/mL之间，总RNA浓度在25～50μg/mL之间。
表4包封率、载药浓度和总RNA浓度检测结果-2
Figure BDA0004170009180000801
由表4可以看出，设计的此系列化合物，包封率为55％～99％，载药浓度在25～45μg/mL之间，总RNA浓度在25～50μg/mL之间。不同化合物之间有很大差别，包封率最高的是YK-224，达到了98.7％，最低的是YK-220，仅为57.5％；载药浓度最高的是YK-217，为42.19μg/mL，最低的是YK-220，仅为25.27μg/mL；总RNA浓度最高的是YK-219，达到了47.23μg/mL，最低的是YK-222，仅为27.43μg/mL。
小结：
由设计的不同化合物制备得到的LNP制剂，包封率和载药量差异很大，不同化合物包封率范围为55％～99％，载药浓度在25～45μg/mL之间，总RNA浓度在25～50μg/mL之间。由此可知，并不是由结构相近的化合物制备的LNP制剂，就一定具有相近的包封率和载药量。
总结：
由我们设计的一些化合物，包括YK-201、YK-202、YK-206、YK-207和YK-209，制备得到的LNP制剂，相比于现有技术阳离子脂质，例如SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23、HHMA和YK-009，包封率、载药浓度和总RNA浓度均显著提高。例如，YK-209包封率可比化合物23提高41％，载药浓度可达化合物23的2倍；YK-201总RNA浓度可达化合物21的1.5倍。
由此可知，用YK-201、YK-202、YK-206、YK-207和YK-209制备递送mRNA的载体，包封率和载药量均显著提高，因此可显著降低LNP的用量，在多价mRNA疫苗应用上，能够提供分布更均一和质量更可控的LNP-mRNA制剂产品。
设计的此系列化合物，由不同化合物制备的LNP制剂，包封率和载药量相差很大，包封率范围为55％～99％，载药浓度在25～45μg/mL之间，总RNA浓度在25～50μg/mL之间。由此可知，并不是由结构相近的化合物制备的LNP制剂，就一定具有相近的包封率和载药量。与此相反，包封率和载药量极有可能会具有显著差异，因此无法根据化合物的结构推测由其制备的LNP制剂的包封率和载药量。
实施例7：体外验证LNP递送载体的性能
细胞复苏与传代：方法同实施例3。
种板：方法同实施例3。
1.Fluc-mRNA的荧光检测
将含有0.3μg Fluc-mRNA的LNP制剂(根据实施例4制备，LNP制剂载体组分为阳离子脂质、中性脂质、结构脂质和聚合物共轭脂质，摩尔比为49:10:39.5:1.5，其中阳离子脂质为表1中所列阳离子脂质)加入96孔板的细胞培养液中，继续培养24小时后，按照GaussiaLuciferase Assay Kit说明书加入相应试剂，经IVIS荧光检测系统检测每孔荧光表达强度。本实验验证了LNP制剂在细胞内的转染效率，具体检测结果见表6-9。
实验结果：
(1)本申请的化合物，其中包括YK-201、YK-202、YK-206、YK-207和YK-209，与现有技术阳离子脂质化学结构差别非常大。
本申请设计的一系列化合物，包括YK-201、YK-202、YK-206、YK-207和YK-209，与现有技术阳离子脂质化学结构差别非常大。例如，这些化合物与HHMA结构完全不同；与SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23和YK-009相比，G3基团完全不同，G1、G2、R1和R2基团也都有显著差别。具体结构对比见表5。
表5设计的化合物与现有技术代表性的阳离子脂质结构对比
Figure BDA0004170009180000831
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Figure BDA0004170009180000841
从表3可以看出，设计的这一系列化合物，包括YK-201、YK-202、YK-206、YK-207和YK-209，与现有技术代表性阳离子脂质化学结构有显著差别。YK-009在CN114044741B中公开(权利要求1)，SM-102是WO2017049245A2中公开的化合物25(说明书第29页)，ALC-0315是CN108368028B中公开的化合物3(说明书第24页)，化合物21和化合物23在WO2021055833A1中公开(说明书第22页)，HHMA为CN112979483B中公开的化合物1(说明书第12页)。
与此系列化合物相比：
a.HHMA结构差别最大，从化学结构图中可以看出，HHMA与中心N原子相连的基团，仅1个侧链与此系列结构的1个侧链相近，其它部分完全不同。
b.现有技术中其它阳离子脂质，例如SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23和YK-009，G3基团完全不同。由于G3基团结构不同，因此在极性、酸碱性和亲水性等方面也会有很大差别。
c.SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23和YK-009的G1、R1、G2和R2基团也有显著差别。
具体如下：
I.YK-201
YK-201与现有技术阳离子脂质，例如SM-102、化合物21、化合物23、YK-009和HHMA相比，结构有显著差别。
与SM-102相比，YK-201的G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-，SM-102的G3基团为HO(CH2)2-。
与ALC-0315相比，YK-201的G1基团比ALC-0315少1个C；R1基团为直链结构，而ALC-0315为支链结构；G2基团比ALC-0315多1个C；R2基团双链中1条单链多2个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。并且，G1基团和R1基团、G2基团和R2基团之间的酯键方向，YK-201与ALC-0315也均不同。
与化合物21相比，YK-201的G1基团比化合物21少2个C；R1基团为直链结构，而化合物21为支链结构；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
与化合物23相比，YK-201的G1基团比化合物23少2个C；R1基团为直链结构，而化合物23为支链结构；R2基团单链少2个C，双链中每条单链多2个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
与YK-009相比，YK-201的G1基团比YK-009多2个C；R1基团多1个C；G2基团多2个C；R2基团单链少1个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
与HHMA相比，YK-201的结构完全不同，HHMA仅1个与N原子相连的侧链与YK-201的1个侧链结构相近，其它部分有显著差别。
II.YK-202
YK-202与现有技术阳离子脂质，例如SM-102、化合物21、化合物23、YK-009和HHMA相比，结构有显著差别。
与SM-102相比，YK-202的R2基团单链比SM-102多1个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
与ALC-0315相比，YK-202的G1基团比ALC-0315少1个C；R1基团为直链结构，而ALC-0315为支链结构；G2基团多1个C；R2基团单链多1个C，双链中1条单链多2个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。并且，G1基团和R1基团、G2基团和R2基团之间的酯键方向，YK-201与ALC-0315也均不同。
与化合物21相比，YK-202的G1基团少2个C；R1基团为直链结构，而化合物21为支链结构；R2基团单链比化合物21多1个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
与化合物23相比，YK-202的G1基团少2个C；R1基团为直链结构，而化合物23为支链结构；R2基团单链少1个C，双链中每条单链各多2个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
与YK-009相比，YK-202的G1基团多2个C；R1基团多1个C；G2基团多2个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
与HHMA相比，YK-202的结构完全不同，HHMA仅1个与N原子相连的侧链与YK-202的1个侧链结构相近，其它部分有显著差别。
III.YK-206
YK-206与现有技术阳离子脂质，例如SM-102、化合物21、化合物23、YK-009和HHMA相比，结构有显著差别。
与SM-102相比，YK-206的R2基团双链中每条单链少1个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
与ALC-0315相比，YK-206的G1基团比ALC-0315少1个C；R1基团为直链结构，而ALC-0315为支链结构；G2基团多1个C；R2基团双链中1条单链多1个C，1条单链少1个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。并且，G1基团和R1基团、G2基团和R2基团之间的酯键方向，YK-201与ALC-0315也均不同。
与化合物21相比，YK-206的G1基团少2个C；R1基团为直链结构，而化合物21为支链结构；R2基团双链中每条单链各少1个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
与化合物23相比，YK-206的G1基团少2个C；R1基团为直链结构，而化合物23为支链结构；R2基团单链少2个C，双链中每条单链各少1个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
与YK-009相比，YK-206的G1基团多2个C；R1基团多1个C；G2基团多2个C；R2基团单链少1个C，双链中每条单链各少1个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
与HHMA相比，YK-206的结构完全不同，HHMA仅1个与N原子相连的侧链与YK-206的1个侧链结构相近，其它部分有显著差别。
IV.YK-207
YK-207与现有技术阳离子脂质，例如SM-102、化合物21、化合物23、YK-009和HHMA相比，结构有显著差别。
与SM-102相比，YK-207的G1基团少2个C；R1基团少1个C；G2基团少2个C；R2基团单链多1个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
与ALC-0315相比，YK-207的G1基团比ALC-0315少3个C；R1基团为直链结构，而ALC-0315为支链结构；G2基团少1个C；R2基团单链多1个C，双链中1条单链多2个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。并且，G1基团和R1基团、G2基团和R2基团之间的酯键方向，YK-201与ALC-0315也均不同。
与化合物21相比，YK-207的G1基团少4个C；R1基团为直链结构，而化合物21为支链结构；G2基团少2个C；R2基团单链多1个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
与化合物23相比，YK-207的G1基团少4个C；R1基团为直链结构，而化合物23为支链结构；G2基团少2个C；R2基团单链少1个C，双链中每条单链各多2个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
与HHMA相比，YK-207的结构完全不同，HHMA仅1个与N原子相连的侧链与YK-207的1个侧链结构相近，其它部分有显著差别。
V.YK-209
YK-209与现有技术阳离子脂质，例如SM-102、化合物21、化合物23、YK-009和HHMA相比，结构有显著差别。
与SM-102相比，YK-209的R1基团为支链结构，而SM-102为直链结构；YK-209的G2基团少2个C；R2基团单链多1个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
与ALC-0315相比，YK-209的G1基团比ALC-0315少1个C；R1基团为直链结构，而ALC-0315为支链结构；G2基团少1个C；R2基团单链多1个C，双链中1条单链多2个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。并且，G1基团和R1基团、G2基团和R2基团之间的酯键方向，YK-201与ALC-0315也均不同。
与化合物21相比，YK-209的G1基团少2个C；R1基团单链少1个C，双链中每条单链各多2个C；G2基团少2个C；R2基团单链多1个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
与化合物23相比，YK-209的G1基团少2个C；R1基团单链少1个C，双链中每条单链各多2个C；G2基团少2个C；R2基团单链少1个C，双链中每条单链各多2个C；G3基团完全不同，为HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-。
与HHMA相比，YK-209的结构完全不同，HHMA仅1个与N原子相连的侧链与YK-209的1个侧链结构相近，其它部分有显著差别。
由以上比较可知，设计的此系列化合物，包括YK-201、YK-202、YK-206、YK-207和YK-209，在化学结构上与现有技术阳离子脂质化合物，例如SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23、HHMA和YK-009差别非常大。此系列化合物与HHMA结构完全不同；与SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23和YK-009的G3基团完全不同，G1、G2、R1和R2基团也都有显著差别。
由于化学结构的显著差异，此系列化合物的理化性质，如极性、酸碱性和亲水性等同SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23、HHMA和YK-009相比，也会有显著差异。因此，无法根据现有技术公开的上述阳离子脂质化合物，推测出由此系列化合物制备的LNP制剂的细胞转染效率、细胞毒性，以及在动物体内表达情况。
(2)设计的一系列化合物中，由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂细胞转染效率最高，比现有技术中代表性阳离子脂质显著提高。例如，YK-202可达SM-102的18倍、化合物21的21倍和化合物23的22倍。
表6Fluc-mRNA的荧光检测结果-1
Figure BDA0004170009180000881
细胞转染效率差别
表6列出了由不同阳离子脂质制备的含有Fluc-mRNA的LNP制剂荧光检测结果。其中YK-009在CN114044741B中公开(权利要求1)，化合物21和化合物23在WO2021055833A1中公开(说明书第22页)，SM-102是WO2017049245A2中公开的化合物25(说明书第29页)，ALC-0315是CN108368028B中公开的化合物3(说明书第24页)，HHMA为CN112979483B中公开的化合物1(说明书第12页)；Lipofectamine 3000是目前广泛应用的细胞转染试剂，具有较好的转染性能。
由表6和图5可知，由YK-201、YK-202和YK-209制备的含有Fluc-mRNA的LNP制剂，荧光吸收最强，RLU值分别为28482617、29957419和26861465。
YK-201可达SM-102的17.10倍、ALC-0315的13.27倍、化合物21的20.04倍、化合物23的21.38倍、HHMA的13.56倍、Lipofectamine 3000的23.71倍和YK-009的5.56倍。
YK-202可达SM-102的17.98倍、ALC-0315的13.95倍、化合物21的21.08倍、化合物23的22.49倍、HHMA的14.27倍、Lipofectamine 3000的24.94倍和YK-009的5.84倍。
YK-209可达SM-102的16.12倍、ALC-0315的12.51倍、化合物21的18.90倍、化合物23的20.17倍、HHMA的12.79倍、Lipofectamine 3000的22.36倍和YK-009的5.24倍。
由YK-206和YK-207制备的含有Fluc-mRNA的LNP制剂，荧光吸收也很强，均可达到SM-102的12倍，ALC-0315的9倍、化合物21的14倍、化合物23的15倍、HHMA的10倍、Lipofectamine 3000的17倍和YK-009的4倍。
用GraphPad Prism软件对数据进行分析，其中YK-201、YK-202、YK-206、YK-207与YK-209中的任一个，与SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23、HHMA、Lipofectamine 3000和YK-009均有显著差异，转染效率显著提高。
小结：
化学结构方面，设计的一系列化合物，包括YK-201、YK-202和YK-209，与现有技术阳离子脂质相比差异非常大，例如，与HHMA结构完全不同；与SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23和YK-009相比，G3基团完全不同，G1、G2、R1和R2基团也都区别非常大。
由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂细胞转染效率最高，比现有技术中代表性阳离子脂质活性显著提高，例如，YK-202可达SM-102的18倍、化合物21的21倍和化合物23的22倍。
我们发现，并不是仅与现有技术阳离子脂质化学结构相近的化合物，才具有细胞转染活性，相反，结构差异很大的化合物，由其制备的LNP制剂有可能会具有显著提高的转染效率，具有非常强的细胞转染活性。
(3)YK-201、YK-202和YK-209在我们设计的结构最类似、仅是G1、G2、G3、R1或R2基团相差1-2个C的化合物中，细胞转染效率最高，YK-202可达其它化合物，例如YK-204的82倍。
为了对比结构类似的化合物是否具有相近的转染效率，将与YK-201、YK-202和YK-209结构最接近的化合物进行了比较，这些化合物结构上的区别仅是G1、G2、G3、R1或R2基团相差1-2个C。结果表明，此系列化合物活性差别非常大，其中YK-201、YK-202和YK-209的细胞转染效率最高，分别可达活性最低的YK-204的78倍、82倍和57倍，转染效率显著提高。
表7Fluc-mRNA的荧光检测结果-2
Figure BDA0004170009180000901
a.细胞转染效率差别
从表7和图6可以看出，这些化合物制备的LNP制剂，荧光吸收值与YK-201、YK-202和YK-209相差很大。
YK-201可达YK-203的7.36倍、YK-204的78.25倍、YK-205的27.68倍、YK-208的7.38倍、YK-210的6.15倍和YK-211的20.79倍。
YK-202可达YK-203的7.74倍、YK-204的82.30倍、YK-205的29.11倍、YK-208的7.76倍、YK-210的6.47倍和YK-211的21.87倍。
YK-209可达YK-203的5.44倍、YK-204的57.85倍、YK-205的20.46倍、YK-208的5.46倍、YK-210的4.55倍和YK-211的15.37倍。
YK-203、YK-204、YK-205、YK-208、YK-210和YK-211之间的活性差别也较大。YK-203、YK-208和YK-210制备的LNP制剂，细胞转染效率均比SM-102要强，分别为SM-102的2.32倍、2.32倍和2.78倍；YK-205和YK-211与SM-102相差不大，分别是其0.62倍和0.82倍；YK-204的细胞转染效率最低，仅为SM-102的0.22倍。
用GraphPad Prism软件对数据进行分析，YK-201、YK-202和YK-209中的任一个，与YK-203、YK-204、YK-205、YK-208、YK-210和YK-211均有显著差异，转染效率显著提高。
b.化学结构差别
此系列化合物之间结构非常类似，只是G1、G2、G3、R1或R2基团相差1-2个C。YK-201、YK-202和YK-209与其它化合物结构非常接近；其它化合物之间也都非常类似。
I.与YK-201结构区别
与YK-201相比，YK-204仅是G3基团与N相连多1个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-201是YK-204的78.25倍。
YK-205仅是G3基团与N相连多1个C，R2基团双链中每条单链少1个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-201是YK-205的27.68倍。
YK-203仅是R2基团单链多2个C，双链中每条单链少2个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-201是YK-203的7.36倍。
II.与YK-202结构区别
与YK-202相比，YK-204仅是G3基团与N相连多1个C，R2基团单链少1个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-202是YK-204的82.30倍。
YK-205仅是G3基团与N相连多1个C，R2基团单链少1个C，双链中每条单链各少1个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-202是YK-205的29.11倍。
YK-203仅是R2基团单链多1个C，双链中每条单链少2个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-202是YK-203的7.74倍。
III.与YK-209结构区别
与YK-209相比，YK-210仅是R1和R2基团单链各少1个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-209是YK-210的4.55倍。
YK-211仅是R1和R2基团单链各多1个C，双链中每条单链各少2个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-209是YK-211的15.37倍。
此外，与YK-206相比，YK-205仅是G3基团与N相连多1个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-206是YK-205的20.29倍。其它化合物也类似。
小结：
在我们设计的一系列结构非常类似，仅是G1、G2、G3、R1或R2基团相差1-2个C的化合物中，YK-201、YK-202和YK-209细胞转染效率最高，YK-202可比YK-204高80倍。
同时我们发现，化合物的结构和细胞内转染效率之间无对应关系，即使是结构最为类似的一组化合物，在细胞转染效率方面也极有可能差异非常大。
因此，从一系列结构非常相近的化合物中，筛选出具有高转染效率的阳离子脂质化合物非常困难，需要付出大量创造性劳动。
(4)YK-201、YK-202和YK-209与在结构上只是G1、G2、G3、R1或R2基团有一些较小区别的化合物相比，转染效率最高。YK-202可比其它化合物，例如YK-217，高400倍以上。
我们进一步比较了YK-201、YK-202和YK-209与其它结构类似的化合物在细胞转染效率方面的差别，此系列化合物仅在个别基团有一些较小的区别，例如G1减少2个C、R1减少1个C、G3引入醚键或酯键或硫原子。结果表明，此系列化合物与YK-201、YK-202和YK-209有显著差别，YK-201、YK-202和YK-209细胞转染效率显著高于其它化合物，甚至高400倍以上。
表8 Fluc-mRNA的荧光检测结果-3
Figure BDA0004170009180000931
a.细胞转染效率差别
虽然与YK-201、YK-202和YK-209相比，其它化合物只是G3、G1、R1、G2或R2基团有一些较小的区别，但对细胞转染效率的影响却非常大，相差可达到400倍以上。
具体来说，从表8可以看出，由YK-217和YK-220制备的LNP制剂的荧光吸收值与YK-201、YK-202和YK-209活性差别非常大。
YK-201可达YK-217的396.42倍、YK-220的131.62倍。
YK-202可达YK-217的416.94倍、YK-220的138.44倍。
YK-209可达YK-217的293.09倍、YK-220的97.32倍。
YK-213、YK-215、YK-218和YK-219与YK-201、YK-202和YK-209相比，活性相差很大。
YK-201可达YK-213的20.87倍、YK-215的29.03倍、YK-218的46.92倍和YK-219的18.91倍。
YK-202可达YK-213的21.95倍、YK-215的30.53倍、YK-218的49.35倍和YK-219的19.89倍。
YK-209可达YK-213的15.43倍、YK-215的21.46倍、YK-218的34.69倍和YK-219的13.98倍。
YK-212、YK-214和YK-216与YK-201、YK-202和YK-209活性差别也很大。
YK-201可达YK-212的7.28倍、YK-214的6.22倍和YK-216的12.49倍。
YK-202可达YK-212的7.66倍、YK-214的6.54倍和YK-216的13.14倍。
YK-209可达YK-212的5.39倍、YK-214的4.60倍和YK-216的9.24倍。
用GraphPad Prism软件对数据进行分析，YK-201、YK-202和YK-209中的任一个，与其它化合物均有显著差异，细胞转染效率显著提高。
b.化学结构差别
与YK-201、YK-202和YK-209相比，此系列化合物仅G1、G2、G3、R1或R2基团稍有区别。YK-201、YK-202和YK-209与其它化合物结构非常接近；其它化合物之间也都非常类似。
I.与YK-201结构区别
与YK-201相比，YK-213仅是G3基团与N相连多HOCH2-基团，R1基团为支链结构，G2基团少2个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-201是YK-213的20.87倍。
YK-215仅是G3基团引入醚键，与O相连多1个甲基，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-201是YK-215的29.03倍。
YK-217仅是G3基团为(CH3)2N(CH2)3SC(O)O(CH2)2-，G1基团少2个C，R1基团少1个C，G2基团少2个C，R2基团单链多2个C，双链中每条单链少2个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-201达到了YK-217的396.42倍。
YK-220仅是G3基团为(CH3)2N(CH2)3SC(O)-，G1基团少2个C，R1基团少1个C，G2基团少2个C，R2基团单链多2个C，双链中每条单链各少2个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-201达到了YK-220的131.62倍。
II.与YK-202结构区别
与YK-202相比，YK-217仅是G3基团为(CH3)2N(CH2)3SC(O)O(CH2)2-，G1基团少2个C，R1基团少1个C，G2基团少2个C，R2基团单链多1个C，双链中每条单链少2个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-202达到了YK-217的416.94倍。
YK-219仅是G3基团为(CH3)2N(CH2)3SC(O)-，G1基团少2个C，R1基团少1个C，G2基团少2个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-202是YK-219的19.89倍。
YK-220仅是G3基团为(CH3)2N(CH2)3SC(O)-，G1基团少2个C，R1基团少1个C，G2基团少2个C，R2基团单链多1个C，双链中每条单链少2个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-202达到了YK-220的138.44倍。
III.与YK-209结构区别
与YK-209相比，YK-213仅是G3基团与N相连多HOCH2-基团，R1和R2基团单链各少1个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-209是YK-213的15.43倍。
YK-217仅是G3基团为(CH3)2N(CH2)3SC(O)O(CH2)2-，G1基团少2个C，R1基团少1个C，R2基团单链多1个C，双链中每条单链少2个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-209达到了YK-217的293.09倍。
YK-220仅是G3基团为(CH3)2N(CH2)3SC(O)-，G1基团少2个C，R1基团为单链结构，R2基团单链多1个C，双链中每条单链少2个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-209达到了YK-220的97.32倍。
此外，与YK-207相比，YK-220仅是G3基团为(CH3)2N(CH2)3SC(O)-，R2基团单链多1个C，双链中每条单链少2个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-207为YK-220的124.13倍。其它化合物也类似。
小结：
与仅在个别基团有一些较小的区别，例如G1减少2个C、R1减少1个C、G3引入醚键、酯键或硫原子的化合物相比，YK-201、YK-202和YK-209的细胞转染效率最高。例如，YK-201和YK-202比YK-217均提高400倍，比YK-220均提高130倍。
同时我们发现，化合物的结构和细胞内转染效率之间无对应关系，即使是结构上差别很小的一组化合物，在细胞转染效率方面也极有可能差异非常大。
因此，从一系列化学结构仅有很小差别的化合物中，筛选出具有高转染效率的阳离子脂质化合物非常困难，需要付出大量创造性劳动。
(5)YK-201、YK-202和YK-209与在结构上只是G3基团的羟基改变为甲基氨基，或去掉羟基和与N相连的甲基的化合物相比，转染效率最高。例如，YK-201和YK-202均比YK-221和YK-225高1000倍以上。
表9中所列化合物，与YK-201、YK-202和YK-209的区别仅在于G3基团不同，羟基改变为甲基氨基，或去掉羟基和与N相连的甲基。细胞转染效率结果表明，在此系列结构类似的化合物中，YK-201、YK-202和YK-209的细胞转染效率大大高于其它化合物，YK-201和YK-202均比YK-221和YK-225高1000倍以上。
表9 Fluc-mRNA的荧光检测结果-4
Figure BDA0004170009180000961
a.细胞转染效率差别
将YK-201、YK-202和YK-209的G3基团中羟基改变为甲基氨基，或去掉羟基和与N相连的甲基，细胞转染效率大大降低，YK-201和YK-202均可比YK-221和YK-225提高1000倍以上。
具体如下：
从表9可以看出，YK-221和YK-225，这2个化合物与YK-201、YK-202和YK-209细胞转染效率相差巨大。
YK-201细胞转染效率分别可达YK-221的1018.69倍和YK-225的1089.41倍。
YK-202细胞转染效率分别可达YK-221的1071.44倍和YK-225的1145.82倍。
YK-209细胞转染效率分别可达YK-221的753.17倍和YK-225的805.46倍。
YK-223、YK-224和YK-226，这3个化合物细胞转染效率也与YK-201、YK-202和YK-209有很大差距。
YK-201细胞转染效率分别可达YK-223的379.71倍、YK-224的323.59倍和YK-226的493.98倍。
YK-202细胞转染效率分别可达YK-223的399.37倍、YK-224的340.35倍和YK-226的519.55倍。
YK-209细胞转染效率分别可达YK-223的280.74倍、YK-224的239.25倍和YK-226的365.22倍。
YK-222与YK-201、YK-202和YK-209也相差较大，YK-201、YK-202和YK-209的荧光吸收值分别为YK-222的46.97倍、49.41倍和34.73倍。
图7所示为由YK-201、YK-202、YK-221和YK-225制备的LNP制剂的的荧光吸收图片，可以看出，同YK-201、YK-202相比，YK-221和YK-225的荧光吸收非常弱。
用GraphPad Prism软件对数据进行分析，YK-201、YK-202和YK-209中的任一个，与其它化合物均有显著差异，转染效率显著提高。
b.化学结构差别
此系列化合物与YK-201、YK-202和YK-209结构差别很小，只是G3基团中羟基改变为甲基氨基，或去掉羟基和与N相连的甲基，其它部位稍有变化；这些化合物之间结构差别也都非常小。
I.与YK-201结构区别
与YK-201相比，YK-221仅是G3基团中羟基改变为甲基氨基，G1基团少2个C，R1基团少1个C，G2基团少2个C，R2基团单链多1个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-201达到了YK-221的1018.69倍。
YK-225仅是G3基团中羟基改变为甲基氨基，R1基团为支链结构，G2基团少2个C，R2基团单链多2个C，双链中每条单链各少2个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-201达到了YK-225的1089.41倍。
YK-226仅是G3基团中去掉了羟基和与N相连的甲基，G2基团少3个C，R2基团单链多1个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-201达到了YK-226的493.98倍。
II.与YK-202结构区别
与YK-201相比，YK-221仅是G3基团中羟基改变为甲基氨基，G1基团少2个C，R1基团少1个C，G2基团少2个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-202达到了YK-221的1071.44倍。
YK-225仅是G3基团中羟基改变为甲基氨基，R1基团为支链结构，G2基团少2个C，R2基团单链多1个C，双链中每条单链少2个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-202达到了YK-225的1145.82倍。
YK-226仅是G3基团中去掉了羟基和与N相连的甲基，G2基团少3个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-202达到了YK-226的519.55倍。
III.与YK-209结构区别
与YK-209相比，YK-221仅是G3基团中羟基改变为甲基氨基，G1基团少2个C，R1基团为支链结构，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-209达到了YK-221的753.17倍。
YK-223仅是G3基团中羟基改变为甲基氨基，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-209达到了YK-223的280.74倍。
YK-225仅是G3基团中羟基改变为甲基氨基，R1和R2基团单链各多1个C，双链中每条单链各少2个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-209达到了YK-225的805.46倍。
此外，与YK-207相比，YK-221仅是G3基团中羟基改变为甲基氨基，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-207为YK-221的960.71倍。其它化合物也类似。
小结：
由上述可知，与G3基团中羟基改变为甲基氨基，或去掉羟基和与N相连的甲基的一系列化合物相比，YK-201、YK-202和YK-209的细胞转染效率最高，例如，YK-201和YK-202均可达YK-221和YK-225的1000倍以上。
同时我们发现，结构相近的化合物，根据结构差别完全无法推测出细胞转染效率的差别，即使是结构上差别很小的一组化合物，在细胞转染效率方面也极有可能差异非常大。
因此，从一系列化学结构相近的化合物中，筛选出具有高转染效率的阳离子脂质化合物非常困难，需要付出大量创造性劳动。
总结：
1)通过对化合物结构的多种设计和大量创造性劳动，我们设计并筛选出了具有高细胞转染效率的阳离子脂质化合物，例如YK-201、YK-202和YK-209。
设计的此系列化合物与现有技术中代表性阳离子脂质，例如SM-102、化合物21、化合物23、HHMA和YK-009化学结构有显著差别，G3基团完全不同，其它部位也均有差别，因此在极性、酸碱性和亲水性等方面也会有很大差别。
2)由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂细胞转染效率最高，比现有技术中代表性阳离子脂质活性显著提高。例如，YK-202可达SM-102的18倍，化合物21的21倍，化合物23的22倍。
YK-201、YK-202和YK-209在我们设计的结构最类似，仅是G1、G2、G3、R1或R2基团相差1-2个C的一系列化合物中细胞转染效率最高。YK-202可达其它化合物，例如YK-204的80倍。
YK-201、YK-202和YK-209与仅在个别基团有一些较小的区别，例如G1减少2个C、R1减少1个C、G3引入醚键、酯键或硫原子的化合物相比，转染效率最高。YK-202可比其它化合物，例如YK-217，高400倍以上。
YK-201、YK-202和YK-209与只是G3基团中羟基改变为甲基氨基，或去掉羟基和与N相连的甲基的化合物相比，细胞转染效率最高。例如，YK-201和YK-202与YK-221和YK-225相比，细胞转染效率均可提高1000倍以上。
3)化合物的结构和细胞内转染效率之间无对应关系，结构差异很小的化合物，在转染效率方面也极有可能差异非常大。因此，筛选出具有高转染效率的阳离子脂质化合物，需要进行多种设计，并付出大量创造性劳动。
2.细胞存活率测定
将含有1.5μg Fluc-mRNA的LNP制剂(根据实施例4制备，LNP制剂载体组分为阳离子脂质、中性脂质、结构脂质和聚合物共轭脂质，摩尔比为49:10:39.5:1.5，其中阳离子脂质为表1中所列阳离子脂质)以及Lipofectamine 3000制剂加入96孔板的细胞培养液中，继续培养24小时后，向每孔中加入10μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱中孵育1小时后，经酶标仪测定在450nm处的吸光度。结果见表10-13。
实验结果：
(1)设计的一系列化合物中，由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂，比现有技术中代表性阳离子脂质细胞毒性显著降低。例如，YK-202细胞存活率可比ALC-0315高26.85％，比SM-102高8.26％，比HHMA高11.25％。
表10细胞存活率-1
序号 阳离子脂质 细胞存活率(％)
1 YK-201 75.93
2 YK-202 76.81
3 YK-206 74.57
4 YK-207 73.88
5 YK-209 76.69
6 YK-009 72.88
7 SM-102 68.55
8 ALC-0315 49.96
9 化合物21 69.02
10 化合物23 70.10
11 HHMA 65.56
12 Lipofectamine 3000 23.05
a.细胞存活率差别
表10列出了由不同阳离子脂质化合物制备的LNP制剂细胞毒性检测结果。其中YK-009在CN114044741B中公开(权利要求1)，SM-102是WO2017049245A2中公开的化合物25(说明书第29页)，ALC-031 5是CN108368028B中公开的化合物3(说明书第24页)，化合物21和化合物23在WO2021055833A1中公开(说明书第22页)，HHMA为CN112979483B中公开的化合物1(说明书第12页)；Lipofectamine 3000是目前广泛应用的细胞转染试剂，具有较好的转染性能。
由表10可知，由YK-201、YK-202和YK-209制备的Fluc-mRNA的LNP制剂，细胞毒性最低，细胞存活率分别可达到75.93％、76.81％和76.69％。
YK-201比SM-102高7.38％，比ALC-0315高25.97％，比化合物21高6.91％，比化合物23高5.83％，比HHMA高10.37％，比Lipofectamine 3000高52.88％。
YK-202比SM-102高8.26％，比ALC-0315高26.85％，比化合物21高7.79％，比化合物23高6.71％，比HHMA高11.25％，比Lipofectamine 3000高53.76％。
YK-209比SM-102高8.14％，比ALC-0315高26.73％，比化合物21高7.67％，比化合物23高6.59％，比HHMA高11.13％，比Lipofectamine 3000高53.64％。
YK-206和YK-207细胞存活率分别为74.57％和73.88％，也均高于现有技术阳离子脂质，分别比SM-102高6.02％和5.33％，比ALC-0315高24.61％和23.92％，比化合物21高5.55％和4.86％，比化合物23高4.47％和3.78％，比HHMA高9.01％和8.32％，比Lipofectamine 3000高51.52％和50.83％。(图8)
用GraphPad Prism软件对数据进行分析，其中YK-201、YK-202和YK-209中的任一个，与SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23和Lipofectamine 3000均具有显著差异，细胞毒性显著降低。
b.化学结构差别
YK-201、YK-202和YK-209与现有技术中阳离子脂质化学结构差别非常大，其中与HHMA结构差别最大，从化学结构图中可以看出，HHMA与中心N原子相连的基团，仅1个侧链与此系列结构的1个侧链相近，其它部分完全不同。与SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23和YK-009相比，G3基团完全不同；G1、R1、G2和R2基团也有显著差别。
小结：
设计的一系列化合物中，由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂细胞毒性最低，比现有技术中代表性阳离子脂质细胞存活率显著提高。例如，YK-202细胞存活率可比ALC-0315高26.85％，比SM-102高8.26％，比HHMA高11.25％。YK-206和YK-207的细胞毒性也均低于现有技术中代表性阳离子脂质。
YK-201、YK-202和YK-209与现有技术中代表性阳离子脂质相比，化学结构有显著差别，G3基团完全不同，G1、R1、G2和R2基团也有显著差别。
因此，并不是仅由与现有技术阳离子脂质结构相近的化合物制备的LNP制剂，才具有较低的细胞毒性。相反，由结构有显著差别的化合物制备的LNP制剂，很有可能会有显著降低的细胞毒性。
(2)YK-201、YK-202和YK-209在我们设计的结构最类似、仅是G1、G2、G3、R1或R2基团相差1-2个C的化合物中，细胞毒性最低。三者细胞存活率可比其它化合物，例如YK-203，均提高40％。
为了对比结构类似的化合物细胞毒性差别，我们把YK-201、YK-202和YK-209与结构最接近的化合物进行了比较，这些化合物仅是G1、G2、G3、R1或R2基团相差1-2个C。结果表明，此系列化合物细胞毒性差异非常显著。其中YK-201、YK-202和YK-209细胞存活率最高，分别达到了75.93％、76.81％和76.69％。三者可比其它化合物，例如YK-203，均提高40％。
表11细胞存活率-2
序号 阳离子脂质 细胞存活率(％)
1 YK-201 75.93
2 YK-202 76.81
3 YK-209 76.69
4 YK-203 35.56
5 YK-204 42.57
6 YK-205 58.92
7 YK-208 46.68
8 YK-210 38.38
9 YK-211 52.30
10 SM-102 68.55
11 ALC-0315 49.96
12 化合物21 69.02
13 化合物23 70.10
14 HHMA 65.56
15 Lipofectamine 3000 23.05
a.细胞存活率差别
由表11可知，这些化合物制备的LNP制剂，细胞毒性差别很大，其中YK-201、YK-202和YK-209毒性最低，细胞存活率最高。细胞存活率最低的是YK-203和YK-210，仅为35.56％和38.38％。
YK-201比YK-203高40.37％，比YK-210高37.55％。
YK-202比YK-203高41.25％，比YK-210高38.43％。
YK-209比YK-203高41.13％，比YK-210高38.31％。(图9)
YK-204、YK-205、YK-208和YK-211，细胞存活率分别为42.57％、58.92％、46.68％和52.30％。
YK-201比YK-204高33.36％，比YK-205高17.01％，比YK-208高29.25％，比YK-211高23.63％。
YK-202比YK-204高34.24％，比YK-205高17.89％，比YK-208高30.13％，比YK-211高24.51％。
YK-209比YK-204高34.12％，比YK-205高17.77％，比YK-208高30.01％，比YK-211高24.39％。
用GraphPad Prism软件对数据进行分析，其中YK-201、YK-202和YK-209中任一个，与其它化合物在细胞毒性上均具有显著差异，细胞毒性显著降低。
b.化学结构差别
此系列化合物之间结构非常类似，只是个别基团稍有区别。YK-201、YK-202和YK-209与其它化合物结构非常接近；其它化合物之间也非常类似。
小结：
在结构非常接近，仅是G1、G2、G3、R1或R2基团相差1-2个C的一组化合物中，YK-201、YK-202和YK-209细胞毒性最低，三者细胞存活率分别比最低的YK-003提高40.37％、41.25％和41.13％。
同时我们发现，化合物的结构与细胞毒性之间无对应关系，即使是结构最为类似的一组化合物，细胞毒性也有极有可能差异非常大。
因此，从一系列化学结构仅有很小差别的化合物中，筛选出具有低细胞毒性的阳离子脂质化合物非常困难，需要付出大量创造性劳动。
(3)YK-201、YK-202和YK-209与在结构上只是G1、G2、G3、R1或R2基团有一些较小区别的化合物相比，细胞毒性最低。三者细胞存活率可比其它化合物，例如YK-214，提高50％。
我们进一步比较了YK-201、YK-202和YK-209与其它结构类似的化合物在细胞毒性方面的差异。此系列化合物仅在个别基团有一些较小的区别，例如G1减少2个C、R1减少1个C、G3引入醚键、酯键或硫原子。结果表明，此系列化合物细胞毒性差别非常大，YK-201、YK-202和YK-209细胞存活率最高，三者可比其它化合物，例如YK-214，提高50％。
表12细胞存活率-3
序号 阳离子脂质 细胞存活率(％)
1 YK-201 75.93
2 YK-202 76.81
3 YK-209 76.69
4 YK-212 35.26
5 YK-213 41.44
6 YK-214 25.58
7 YK-215 44.59
8 YK-216 45.80
9 YK-217 42.27
10 YK-218 72.84
11 YK-219 58.61
12 YK-220 58.99
13 SM-102 68.55
14 ALC-0315 49.96
15 化合物21 69.02
16 化合物23 70.10
17 HHMA 65.56
18 Lipofectamine 3000 23.05
a.细胞存活率差别
虽然与YK-201、YK-202和YK-209相比，其它化合物只是G1、G2、G3、R1或R2基团上一些较小的区别，但对细胞毒性的影响却非常大。细胞存活率YK-201、YK-202和YK-209最多可比其它化合物高50％。
从表12中可以看出，YK-214细胞存活率最低，仅为25.58％。YK-201比YK-214高50.35％，YK-202比YK-214高51.23％，YK-209比YK-214高51.11％。
YK-212、YK-213、YK-215、YK-216和YK-217细胞存活率分别为35.26％、41.44％、44.59％、45.80％和42.27％。
YK-201比YK-212高40.67％，比YK-213高34.49％，比YK-215高31.34％，比YK-216高30.13％，比YK-217高33.66％。
YK-202比YK-212高41.55％，比YK-213高35.37％，比YK-215高32.22％，比YK-216高31.01％，比YK-217高34.54％。
YK-209比YK-212高41.43％，比YK-213高35.25％，比YK-215高32.10％，比YK-216高30.89％，比YK-217高34.42％。
YK-219和YK-220较高，分别为58.61％和58.99％。
YK-201比YK-219高17.32％，YK-220高16.94％。
YK-202比YK-219高18.20％，YK-220高17.82％。
YK-209比YK-219高18.08％，YK-220高17.70％。
YK-218细胞存活率为72.84％，略低于YK-201、YK-202和YK-209。(图10)
用GraphPad Prism软件对数据进行分析，其中YK-201、YK-202和YK-209中的任一个，与YK-212、YK-213、YK-214、YK-215、YK-216、YK-217、YK-219和YK-220在细胞毒性上均具有显著差异，细胞毒性显著降低。
b.化学结构差别
此系列化合物仅在个别基团有一些较小的区别，例如G1减少2个C、R1减少1个C、G3引入醚键、酯键或硫原子。
小结：
与仅在个别基团有一些较小的区别，例如G1减少2个C、R1减少1个C、G3引入醚键、酯键或硫原子的化合物相比，YK-201、YK-202和YK-209细胞毒性最低。例如，YK-201、YK-202和YK-209细胞存活率均比YK-014提高50％。
同时我们发现，化合物的结构与细胞毒性之间无对应关系，结构上即使很小的不同，细胞毒性也有极有可能差异非常大。
因此，从一系列仅在个别基团有一些较小区别的化合物中，筛选出具有低细胞毒性的阳离子脂质化合物非常困难，需要付出大量创造性劳动。
(4)YK-201、YK-202和YK-209与在结构上只是G3基团的羟基改变为甲基氨基，或去掉羟基和与N相连的甲基的化合物相比，细胞毒性显著降低。例如，三者与YK-221相比，细胞存活率均可提高55％。
细胞毒性结果表明，YK-201、YK-202和YK-209中G3基团的羟基改变为甲基氨基，或去掉羟基和与N相连的甲基，细胞存活率大大降低。例如YK-201、YK-202和YK-209可比YK-221提高55％。
表13细胞存活率-4
序号 阳离子脂质 细胞存活率(％)
1 YK-201 75.93
2 YK-202 76.81
3 YK-209 76.69
4 YK-221 20.95
5 YK-222 33.75
6 YK-223 36.64
7 YK-224 23.47
8 YK-225 43.41
9 YK-226 27.90
10 SM-102 68.55
11 ALC-0315 49.96
12 化合物21 69.02
13 化合物23 70.10
14 HHMA 65.56
15 Lipofectamine 3000 23.05
a.细胞存活率差别
从表13可以看出，将YK-201、YK-202和YK-209的G3基团中羟基改变为甲基氨基，或去掉羟基和与N相连的甲基，会使细胞毒性大大增加。例如，YK-201、YK-202细胞存活率比YK-221提高55％。(图11)
具体来说，YK-221、YK-224和YK-226细胞存活率最低，都在20％-30％之间，分别为20.95％、23.47％和27.90％。
YK-201比YK-221高54.98％，比YK-224高52.46％，比YK-226高48.03％。
YK-202比YK-221高55.86％，比YK-224高53.34％，比YK-226高48.91％。
YK-209比YK-221高55.74％，比YK-224高53.22％，比YK-226高48.79％。
YK-222、YK-223和YK-225的细胞存活率分别为33.75％、36.64％和43.41％。
YK-201比YK-222高42.18％，比YK-223高39.29％，比YK-225高32.52％。
YK-202比YK-222高43.06％，比YK-223高40.17％，比YK-225高33.40％。
YK-209比YK-222高42.94％，比YK-223高40.05％，比YK-225高33.28％。
用GraphPad Prism软件对数据进行分析，其中YK-201、YK-202和YK-209中的任一个，与YK-221、YK-222和YK-223、YK-224、YK-225和YK-226均具有显著差异，细胞毒性显著降低。
b.化学结构差别
此系列化合物结构差别非常小，与YK-201、YK-202和YK-209相比，其它化合物只是G3基团中羟基改变为甲基氨基，或去掉羟基和与N相连的甲基，其它结构完全相同。
小结：
与G3基团中羟基改变为甲基氨基，或去掉羟基和与N相连的甲基的化合物相比，YK-201、YK-202和YK-209的细胞毒性最低。例如，三者细胞存活率分别比YK-221和YK-224均提高50％以上。
同时我们发现，化合物的结构与细胞毒性之间无对应关系，即使仅是G3基团结构上有一些区别，细胞毒性也有极有可能差异非常大。
因此，从一系列仅在个别基团有一些较小的区别的化合物中，筛选出具有低细胞毒性的阳离子脂质化合物非常困难，需要付出大量创造性劳动。
总结：
1)我们对由设计的一系列化合物制备得到的LNP制剂进行细胞存活率测定，筛选出了具有低细胞毒性的阳离子脂质化合物，例如YK-201、YK-202和YK-209。
设计的此系列化合物与现有技术中代表性阳离子脂质，例如SM-102、化合物21、化合物23、HHMA和YK-009化学结构有显著差别，G3基团完全不同，其它部位也均有差别，因此在极性、酸碱性和亲水性等方面也会有很大差别。
2)由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂细胞毒性最低，比现有技术中代表性阳离子脂质细胞存活率显著提高。例如，YK-202可比ALC-0315高26.85％，比SM-102高8.26％，比HHMA高11.25％。
YK-201、YK-202和YK-209在我们设计的结构最类似，即仅是G1、G2、R1或R2基团相差1-2个C的化合物中，细胞毒性最低。三者细胞存活率均可比其它化合物，例如YK-203，提高40％。
YK-201、YK-202和YK-209与在结构上只是个别基团有一些较小区别的化合物相比，细胞毒性最低。三者细胞存活率均可比其它化合物，例如YK-214，提高50％。
YK-201、YK-202和YK-209与在结构上只是G3基团的羟基改变为甲基氨基，或去掉羟基和与N相连的甲基的化合物相比，细胞毒性最低。例如，YK-201、YK-202和YK-209细胞存活率均比YK-221提高55％。
3)化合物的结构和细胞毒性之间无对应关系，即使结构差异很小的化合物，在细胞毒性方面也极有可能差异非常大。因此无法根据化学结构预测其细胞毒性，筛选出具有低细胞毒性的阳离子脂质化合物非常困难，需要付出大量创造性劳动。
实施例8：体内验证阳离子脂质递送载体的性能
另外，我们也验证了设计的阳离子脂质递送的mRNA在小鼠体内的蛋白质表达和持续时间。体内实验进一步证明了我们的LNP递送载体能将mRNA有效地递送至体内，并高效持续地表达。
将含有10μg Fluc-mRNA的LNP制剂(根据实施例4制备)经肌肉注射至4-6周龄、重量为17-19g的雌性BALB/C小鼠体内，并在给药后特定的时间节点(6h、24h、48h和7d)对小鼠进行腹腔注射荧光成像底物，小鼠自由活动5分钟，然后经IVIS Spectrum小动物活体成像仪检测LNP所携带的mRNA在小鼠体内表达的蛋白质的平均辐射强度(对应于荧光表达强度)。检测结果见表14-17和图12-14。
实验结果：
(1)设计的一系列化合物中，由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂，mRNA在小鼠体内高表达，且持续表达，比现有技术中代表性阳离子脂质显著提高。例如，YK-202可达SM-102的24倍、化合物21的25倍和化合物23的23倍。mRNA在小鼠体内表达方面与细胞转染活性一致。
表14小鼠活体成像实验数据-1
Figure BDA0004170009180001091
a.小鼠体内表达差别
表14列出了由不同阳离子脂质制备的含有Fluc-mRNA的LNP制剂，在小鼠体内不同时间mRNA的表达强度。其中YK-009在CN114044741B中公开(权利要求1)，SM-102是WO2017049245A2中公开的化合物25(说明书第29页)，ALC-0315是CN108368028B中公开的化合物3(说明书第24页)，化合物21和化合物23在WO2021055833A1中公开(说明书第22页)，HHMA为CN112979483B中公开的化合物1(说明书第12页)，这些阳离子脂质可用来制备递送mRNA的载体。
由表14可知，由YK-201、YK-202和YK-209制备的含有Fluc-mRNA的LNP制剂，mRNA在小鼠体内高表达，且持续表达。
YK-201平均辐射强度，在6h为2858500，是SM-102的4.21倍、ALC-0315的3.39倍、化合物21的4.76倍、化合物23的4.81倍和HHMA的4.47倍；在24h为2025680，是SM-102的17.49倍、ALC-0315的11.11倍、化合物21的18.76倍、化合物23的18.27倍和HHMA的18.47倍；在48h为730760，是SM-102的23.91倍、ALC-0315的19.16倍、化合物21的24.34倍、化合物23的22.78倍和HHMA的24.82倍；在7d为30151，是SM-102的5.11倍、ALC-0315的4.58倍、化合物21的4.94倍、化合物23的5.17倍和HHMA的5.68倍。
YK-202平均辐射强度，在6h为2935500，是SM-102的4.32倍、ALC-0315的3.48倍、化合物21的4.89倍、化合物23的4.94倍和HHMA的4.59倍；在24h为2158840，是SM-102的18.64倍、ALC-0315的11.84倍、化合物21的19.99倍、化合物23的19.47倍和HHMA的19.69倍；在48h为755000，是SM-102的24.71倍、ALC-0315的19.80倍、化合物21的25.15倍、化合物23的23.54倍和HHMA的25.64倍；在7d为33524，是SM-102的5.68倍、ALC-0315的5.09倍、化合物21的5.49倍、化合物23的5.75倍和HHMA的6.31倍。
YK-209平均辐射强度，在6h为2524250，是SM-102的3.72倍、ALC-0315的3.00倍、化合物21的4.20倍、化合物23的4.25倍和HHMA的3.95倍；在24h为1869220，是SM-102的16.14倍、ALC-0315的10.25倍、化合物21的17.31倍、化合物23的16.86倍和HHMA的17.05倍；在48h为629080，是SM-102的20.59倍、ALC-0315的16.50倍、化合物21的20.95倍、化合物23的19.61倍和HHMA的21.36倍；在7d为26361，是SM-102的4.47倍、ALC-0315的4.00倍、化合物21的4.32倍、化合物23的4.52倍和HHMA的4.96倍。
由YK-206和YK-207制备的LNP制剂，mRNA在小鼠体内也较高表达，且持续表达。例如，YK-206和YK-207均可达到SM-102、化合物21、化合物23和HHMA的16倍和ALC-0315的13倍。
用GraphPad Prism软件对数据进行分析，YK-201、YK-202和YK-209中的任一个，与SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23、HHMA和YK-009在各个时间均具有显著差异，表达量和持续时间均显著提高。
b.化学结构差别
YK-201、YK-202和YK-209与现有技术中阳离子脂质，例如SM-102、化合物21、化合物23、HHMA和YK-009相比，化学结构差别非常大。其中与HHMA结构差异最大，HHMA除了与中心N原子相连的1个铡链与YK-201、YK-202和YK-209的1个侧链相近，其它结构完全不同。与SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23和YK-009相比，YK-201、YK-202和YK-209的G3基团完全不同，G1、R1、G2和R2基团也有很大差别。
小结：
设计的一系列化合物中，由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂，mRNA在小鼠体内表达量最高，且持续表达，在6h、24h、48h和7d表达量均比现有技术中代表性阳离子脂质显著提高。例如，YK-202可达SM-102的24倍、化合物21的25倍和化合物23的23倍。mRNA在小鼠体内表达方面与与实施例7中细胞转染实验结果一致。
并且，YK-201、YK-202和YK-209与现有技术中代表性阳离子脂质结构差别非常大，G3基团完全不同，G1、R1、G2和R2基团也有显著差别。
因此，并不是仅由与现有技术阳离子脂质结构相近的化合物制备的LNP制剂，在小鼠体内才具有高表达，相反，由结构有显著差别的化合物制备的LNP制剂，mRNA也极有可能高表达，且持续表达。
(2)YK-201、YK-202和YK-209在我们设计的结构最类似，即仅G1、G2、G3、R1或R2基团相差1-2个C的化合物中，在小鼠体内mRNA表达量最高，且持续时间最长。YK-202表达量可达其它化合物，例如YK-204的400倍以上。mRNA在小鼠体内表达方面与细胞转染活性一致。
为了比较由结构最为接近，即仅G1、G2、G3、R1或R2基团相差1-2个C的化合物制备的递送载体，递送的mRNA在小鼠体内表达强度及持续时间的差别，我们把YK-201、YK-202和YK-209与YK-204进行了比较。结果表明，此系列化合物制备的LNP制剂，mRNA在小鼠体内表达差别非常大，其中YK-201、YK-202和YK-209表达量最高，且持续时间最长，YK-202表达量可达到YK-204的400倍以上。
表15小鼠活体成像实验数据-2
Figure BDA0004170009180001111
a.小鼠体内表达差别
由表15可以看出，在此系列结构最为接近、只是个别基团结构稍有不同的化合物中，由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂，mRNA在小鼠体内的表达量和持续时间均最高。
YK-201在6h为YK-204的81.10倍，在24h可达387.32倍，在48h可达299.49倍，在7d为39.99倍。
YK-202在6h为YK-204的83.29倍，在24h可达412.78倍，在48h可达309.43倍，在7d为44.46倍。
YK-209在6h为YK-204的71.62倍，在24h可达357.40倍，在48h可达257.82倍，在7d为34.96倍。
用GraphPad Prism软件对数据进行分析，YK-201、YK-202和YK-209中任一个，与其它化合物在各个时间均具有显著差异，表达量和持续时间均显著提高。
b.化学结构差别
此系列化合物结构差异非常小，仅是G1、G2、G3、R1或R2基团相差1-2个C。例如，YK-204与YK-201相比，仅是G3基团与N相连多1个C，其它结构完全相同，但mRNA表达量，YK-201可达YK-204的380倍。其它化合物也类似。
小结：
与结构最类似，即仅G1、G2、G3、R1或R2基团相差1-2个C的化合物相比，由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂，mRNA在小鼠体内表达强度最高，持续时间最长。例如，YK-202在24h可达YK-204的400倍以上，在7d仍可达40倍。mRNA在小鼠体内表达方面与与实施例7中细胞转染实验结果一致。
我们还发现，mRNA在小鼠体内表达方面与阳离子脂质结构之间无对应关系，即使是由结构最为类似，即仅G1、G2、G3、R1或R2基团相差1-2个C的一组化合物制备的LNP制剂，mRNA在小鼠体内表达程度和持续时间也极有可能差异非常大。
因此，从一系列结构最类似的化合物中筛选出在动物体内具有高表达且持续表达的阳离子脂质化合物非常困难，需要付出大量创造性劳动。
(3)YK-201、YK-202和YK-209与在结构上只是G1、G2、G3、R1或R2基团有一些较小区别的化合物相比，在小鼠体内mRNA表达量最高，且持续时间最长。YK-202表达量可达其它化合物，例如YK-217的800倍以上。mRNA在小鼠体内表达方面与细胞转染活性一致。
我们进一步比较了由YK-201、YK-202和YK-209与其它结构类似的化合物制备的包含mRNA的LNP制剂，在小鼠体内表达方面的差别。此系列化合物仅在个别基团有一些较小的区别，例如G1减少2个C、R1减少1个C、G3引入醚键、酯键或硫原子。结果表明，YK-201、YK-202和YK-209的表达量最高，且持续时间最长，显著高于其它化合物。YK-202可比YK-217提高800倍。
表16小鼠活体成像实验数据-3
Figure BDA0004170009180001131
a.小鼠体内表达差别
由表16可以看出，在此系列化合物中，由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂，mRNA在小鼠体内的表达量和持续时间均最高。
YK-201表达量在6h为YK-215的56.53倍、YK-217的116.27倍，在24h可达YK-215的297.24倍、YK-217的764.41倍，在48h可达YK-215的200.76倍、YK-217的713.63倍，在7d为YK-215的29.56倍、YK-217的57.65倍。
YK-202表达量在6h为YK-215的58.06倍、YK-217的119.40倍，在24h可达YK-215的316.78倍、YK-217的814.66倍，在48h可达YK-215的207.42倍、YK-217的737.30倍，在7d为YK-215的32.87倍、YK-217的64.10倍。
YK-209表达量在6h为YK-215的49.92倍、YK-217的102.67倍，在24h可达YK-215的274.28倍、YK-217的705.37倍，在48h可达YK-215的172.82倍、YK-217的614.34倍，在7d为YK-215的25.84倍、YK-217的50.40倍。
用GraphPad Prism软件对数据进行分析，YK-201、YK-202和YK-209中任一个，与其它化合物在各个时间均具有显著差异，表达亮和持续时间均显著提高。
b.化学结构差别
此系列化合物仅在个别基团有一些较小的区别，例如G1减少2个C、R1减少1个C、G3引入醚键、酯键或硫原子。与YK-201相比，YK-215仅是G3基团引入醚键，与O相连多1个甲基，其它结构完全相同，但mRNA表达量，YK-201可达YK-215的300倍。其它化合物也类似。
小结：
与结构非常接近，只是G1、G2、G3、R1或R2基团有一些较小区别的化合物相比，由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂，mRNA在小鼠体内表达强度最高，持续时间最长。例如，YK-202在24h可达YK-217的800倍，在7d仍可达60倍。mRNA在小鼠体内表达方面与实施例7中细胞转染实验结果一致。
我们还发现，mRNA在小鼠体内表达方面与阳离子脂质结构之间无对应关系，即使是仅在个别基团有一些较小的区别，例如G1减少2个C、R1减少1个C、G3引入醚键、酯键或硫原子，由这些化合物制备的LNP制剂，mRNA在小鼠体内表达程度和持续时间也极有可能差异非常大。
因此，从一系列仅在个别基团有一些较小的区别的化合物中，筛选出在动物体内具有高表达且持续表达的阳离子脂质化合物非常困难，需要付出大量创造性劳动。
(4)YK-201、YK-202和YK-209与在结构上只是G3基团稍有不同的化合物相比，在小鼠体内mRNA表达量最高，且持续时间最长。三者表达量可达其它化合物，例如YK-223的1000倍以上。mRNA在小鼠体内表达方面与细胞转染活性一致。
表16中所列化合物，与YK-201、YK-202和YK-209的区别仅在于G3基团稍有不同，如羟基改变为甲基氨基。小鼠体内转染结果表明，YK-201、YK-202和YK-209的表达量最高，且持续时间最长，显著高于其它化合物，三者均比YK-223高1000倍以上。
表17小鼠活体成像实验数据-4
Figure BDA0004170009180001141
a.小鼠体内表达差别
由表17可以看出，在此系列化合物中，由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂，mRNA在小鼠体内的表达量和持续时间均最高。
YK-201在6h可达YK-223的276.05倍，在24h可达1134.20倍，在48h可达1077.82倍，在7d可达68.53倍。
YK-202在6h可达YK-223的283.49倍，在24h可达1208.76倍，在48h可达1113.57倍，在7d可达76.19倍。
YK-209在6h可达YK-223的243.77倍，在24h可达1046.60倍，在48h可达927.85倍，在7d可达59.91倍。
用GraphPad Prism软件对数据进行分析，YK-201、YK-202和YK-209中任一个，与其它化合物在各个时间均具有显著差异，表达量和持续时间均显著提高。
b.化学结构差别
此系列化合物化学结构只是G3基团稍有区别。例如，与YK-209相比，YK-223仅是G3基团不同，即将YK-209中羟基改变为甲基氨基，其它结构完全相同，但YK-209表达量可达YK-223的1000倍以上。其它化合物也类似。
小结：
与结构非常接近，仅G3基团稍有不同的化合物相比，由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂，mRNA在小鼠体内表达强度最高，持续时间最长，表达量三者均可达YK-223的1000倍以上。mRNA在小鼠体内表达方面与实施例7中细胞转染实验结果一致。
我们还发现，mRNA在小鼠体内表达方面与阳离子脂质结构之间无对应关系，即使结构非常接近，仅G3基团中羟基改变为甲基氨基，或去掉羟基和与N相连的甲基，由这些化合物制备的LNP制剂，mRNA在小鼠体内表达程度和持续时间也极有可能差异非常大。
因此，从一系列结构非常接近的化合物中筛选出在动物体内具有高表达且持续表达的阳离子脂质化合物非常困难，需要付出大量创造性劳动。
总结：
1)我们对由设计的一系列化合物制备得到的LNP制剂进行动物体内递送实验，筛选出了mRNA在小鼠体内具有高表达且持续表达的阳离子脂质化合物，例如YK-201、YK-202和YK-209。
设计的此系列化合物与现有技术中代表性阳离子脂质，例如SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23、HHMA和YK-009化学结构有显著差别，G3基团完全不同，其它部位也均有差别，因此在极性、酸碱性和亲水性等方面也会有很大差别。
2)由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂，mRNA在小鼠体内高表达，且持续表达，比现有技术中代表性阳离子脂质显著提高。例如，YK-202可达SM-102的24倍、化合物21的25倍和化合物23的23倍。
YK-201、YK-202和YK-209在我们设计的结构最类似，仅是G1、G2、G3、R1或R2基团相差1-2个C的一系列化合物中，mRNA在小鼠体内表达量最高，且持续时间最长。例如，YK-202在24h可达YK-204的400倍以上，在7d仍可达40倍。
YK-201、YK-202和YK-209在只是G1、G2、G3、R1或R2基团稍有差别的一系列化合物中，mRNA在小鼠体内表达量最高，且持续时间最长。例如，YK-202可比YK-217提高800倍。
YK-201、YK-202和YK-209在仅是G3基团中羟基改变为甲基氨基，或去掉羟基和与N相连的甲基的一系列化合物中，mRNA在小鼠体内表达量最高，且持续时间最长。例如，三者mRNA表达量均比YK-223提高1000倍以上。
3)阳离子脂质的结构和递送的mRNA在小鼠体内的高表达及持续表达之间无对应关系，即使结构差异很小的阳离子脂质化合物，由其制备得到的LNP制剂中的mRNA在动物体内表达方面极有可能差异非常大。无法根据阳离子脂质化学结构预测mRNA在动物体内是否高表达和持续表达，筛选出具有mRNA高表达且持续表达的阳离子脂质化合物非常困难，需要付出大量创造性劳动。
结论：
1.设计的一系列化合物，包括YK-201、YK-202和YK-209，以及YK-206和YK-207，与现有技术阳离子脂质，例如SM-102、ALC-0315、化合物21、化合物23、HHMA和YK-009化学结构有显著差别，G3基团完全不同，其它部位也有差别，因此在极性、酸碱性和亲水性等方面也会有很大差别。
在设计的此系列化合物中，由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂，与现有技术中代表性的阳离子脂质相比，包封率、载药浓度和总RNA浓度显著提高，细胞转染效率显著提高，细胞毒性显著降低，mRNA在小鼠体内的表达量及持续时间均显著提高。例如，包封率YK-209可比化合物23提高41％，载药浓度YK-209可达化合物23的2倍，总RNA浓度YK-201总RNA浓度可达化合物21的1.5倍；细胞转染效率YK-202可达SM-102的18倍，化合物21的21倍，化合物23的22倍；细胞存活率YK-202可比ALC-0315高26.85％，比SM-102高8.26％，比HHMA高11.25％；mRNA在小鼠体内表达量，YK-202可达SM-102的24倍，化合物21的25倍和化合物23的23倍。
在我们设计的化学结构差异很小的一系列化合物中，由YK-201、YK-202和YK-209制备的LNP制剂，同其它化合物相比，细胞转染效率显著提高，细胞毒性显著降低，mRNA在小鼠体内的表达量与持续时间均显著提高。
此系列化合物结构上与YK-201、YK-202和YK-209相比，仅是个别基团相差1-2个C，或是G1减少2个C、R1减少1个C、G3引入醚键、酯键或硫原子，或是G3基团中羟基改变为甲基氨基，或是G3基团去掉羟基和与N相连的甲基，但是YK-201和YK-202细胞转染效率可达YK-221和YK-225的1000倍以上，细胞毒性可比YK-221降低55％，mRNA在小鼠体内的表达量可达YK-223的1000倍以上。
2.阳离子脂质化合物的结构与细胞内转染效率、对细胞产生的毒性以及由其制备的LNP制剂中的mRNA在动物体内的高表达和持续表达之间无明显的对应关系。结构差异很小的化合物，在转染效率和/或对细胞的毒性、细胞内的表达方面极有可能差异非常大。
例如，与YK-201相比，YK-204仅是G3基团与N相连多1个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-201是YK-204的78倍，对转染细胞的毒性YK-201比YK-204降低30％，mRNA在小鼠体内的表达YK-201可达YK-204的380倍；与YK-209相比，YK-225仅是G3基团中羟基改变为甲基氨基，R1和R2基团单链各多1个C，双链中每条单链各少2个C，其它结构完全相同，但细胞转染效率YK-209达到了YK-225的800倍，对转染细胞的毒性YK-209比YK-225降低30％。
因此，筛选合适的阳离子脂质化合物，能同时具有高的转染效率和对细胞的低毒性、mRNA在小鼠体内的高表达及持续表达是非常困难的事情，需要付出大量创造性劳动。
3.本发明通过独特的设计和大量的筛选，发现了一些化合物，例如YK-201、YK-202、YK-209、YK-206和YK-207，相对于现有技术的其它化合物，能够以显著提高的包封率、载药浓度和总RNA浓度、显著提高的细胞转染效率、显著降低的细胞毒性以及在动物体内显著提高的表达量和持续时间来递送核酸，取得了预料不到的技术效果。

Claims (13)

1.一种式(I)化合物
Figure FDA0004170009170000011
或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中
G1为C1～6亚烷基；
G2为C2～8亚烷基；
R1为C6～20直链或支链烷基；
R2为C12～25支链烷基；
G3为：HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-，HO(CH2)2N(CH2CH3)(CH2)2-，
(HO(CH2)2)2N(CH2)2-，CH3O(CH2)2N(CH3)(CH2)2-，
(CH3)2N(CH2)3SC(O)O(CH2)2-，(CH3)2N(CH2)3SC(O)-，CH3NH(CH2)2N(CH3)(CH2)2-或CH3CH2NH(CH2)2-。
2.根据权利要求1所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中G1为未取代的C2～5亚烷基。
3.根据权利要求2所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中G1为未取代的C5亚烷基或者未取代的C3亚烷基。
4.根据前述权利要求中任一项所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中G2为未取代的C4～7亚烷基。
5.根据权利要求4所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中G2为未取代的C7亚烷基或者未取代的C5亚烷基或者未取代的C4亚烷基。
6.根据前述权利要求中任一项所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中R1为未取代的C8～12直链烷基。
7.根据权利要求6所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中R1为未取代的C11直链烷基或者未取代的C10直链烷基。
8.根据前述权利要求1-5中任一项所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中R1为未取代的C18支链烷基、未取代的C17支链烷基或者未取代的C15支链烷基。
9.根据权利要求8所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中R1为
Figure FDA0004170009170000021
Figure FDA0004170009170000022
或者/>
Figure FDA0004170009170000023
10.根据前述权利要求中任一项所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中R2为未取代的C14～22支链烷基。
11.根据权利要求10所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中R2为未取代的C17支链烷基或者未取代的C18支链烷基或者未取代的C15支链烷基。
12.根据权利要求11所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中R2为：
Figure FDA0004170009170000024
13.根据权利要求1所述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中所述式(I)化合物具有以下结构中的一种：
Figure FDA0004170009170000025
Figure FDA0004170009170000031
Figure FDA0004170009170000041
Figure FDA0004170009170000051
Figure FDA0004170009170000061
Figure FDA0004170009170000071
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