CN116380889A - 一种天然活性胶原蛋白快速定性定量检测试剂盒、检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然活性胶原蛋白检测技术领域，具体涉及一种天然活性胶原蛋白快速定性定量检测试剂盒、检测方法及应用，该检测试剂盒包括至少一个试剂管，试剂管包括用于盛放检测液的管体、用于将管体内的溶液排出的挤出部以及用于将管体内的天然活性胶原蛋白沉淀进行截留的过滤部；该检测方法包括如下步骤：取出试剂管；吸取待测样品，滴加至试剂管中；摇匀；目视观察沉淀生成状态；将试剂管内的溶液排出，将截留的天然活性胶原蛋白沉淀进行结果比对。本发明的试剂盒可通过肉眼观察待测样本加入后是否有沉淀生成可有效鉴定活性胶原蛋白；实现定量检测时，胶原蛋白类似物(明胶、水解胶原蛋白)对结果无干扰；15分钟内可完成检测，便于实时在线检测。

Description

一种天然活性胶原蛋白快速定性定量检测试剂盒、检测方法 及应用

技术领域

本发明涉及天然活性胶原蛋白检测技术领域，具体涉及一种天然活性胶原蛋白快速定性定量检测试剂盒、检测方法及应用。

背景技术

胶原蛋白是一类具有特殊三螺旋结构，且广泛分布于皮肤、骨头、肌腱等组织的生物高分子蛋白。这种具有独特三螺旋结构的蛋白由于其可以促进细胞增长和组织修复，并且具有高的生物相容性和生物可降解性等理化特性，被广泛应用于生物医学材料、药物输送载体、组织工程、化妆品和食品等领域。胶原蛋白的三螺旋结构是其生物活性和理化特性的基础。然而，胶原蛋白的三螺旋结构易受加工环境的影响(例如：辐照灭菌)而导致结构部分或完全破坏，失去生物学活性。因此本专利检测对象主要为具有完整三螺旋结构的活性胶原蛋白。

近年来，随着检验技术的快速发展，胶原蛋白的检测手段越来越多，例如SDS-PAGE凝胶电泳、紫外光谱、磷酸盐缓冲液等可以鉴定胶原蛋白种类及纯度，高效液相-质谱联用法、羟脯氨酸比色法、免疫学检测法等可以对胶原蛋白进行定量，傅里叶红外光谱、拉曼光谱、圆二色谱等可以对胶原蛋白的结构进行检测。虽然这些方法在一定领域内能够达到研究的目的，但是这些检测方法大多数依旧存在以下技术难点：1)存在耗时长、操作繁琐、依赖大型设备、成本高、需要专业人员操作等缺陷，因此难以用于目前市面上天然胶原及相关产品实时在线定性和定量检测；2)难以区分胶原蛋白和胶原蛋白类似物。

据检索，发现如下几篇与本申请相关的专利文献：

1、公开号为CN109991227B的中国发明专利公开了一种胶原蛋白检测方法，主要采用影像学对胶原蛋白进行检测，其准确度易受操作环境因素的影响。

2、公开号为CN106383232B的中国发明专利公开了一种利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法，该方法一方面多肽探针的制备较复杂且及稳定性较差，另一方面检测对象并非样本中存在的三螺旋胶原蛋白。

3、公开号为CN108659117B的中国发明专利公开了一种定量检测胶原三股螺旋螺旋结构含量的方法和公开号为CN10988415B的中国发明专利公开了一种I型胶原蛋白三螺旋结构完整性的判定方法，两者均采用了特定生物酶对胶原蛋白进行降解，借助羟脯氨酸比色法和电泳分析法对降解产物进行分析，利用胶原蛋白降解前后肽链的差异，实现胶原蛋白的检测。该类方法能有效区分胶原蛋白类似物和具有完整三螺旋结构的活性胶原蛋白，但该方法依旧操作繁琐、耗时长。

4、1985年，Martino等人根据苦味酸-天狼星红-偏振光法改进了一种用于胶原蛋白含量测定的方法——天狼星红比色法。中国专利CN110095421B、美国专利US20030004315A1以及Biocolor公司开的商业化试剂盒(以下简称Sircol试剂盒)，均沿用了该方法。其技术核心依旧是利用天狼星红在酸中与胶原蛋白特异性结合生成红色沉淀，沉淀经离心，洗涤，碱复溶后，在特定波长540nm条件下通过测定吸光度确定胶原蛋白含量。该方法操作简单，且整个检测流程可在1小时内完成。该方法整体所涉及的试剂成分简单，染料水溶性好，结构稳定，试剂成本非常低且不需低温保存，利于后期产品的推广使用。但由于染料与明胶、水解胶原等胶原蛋白类似物结合的产物在离心和洗涤过程中难以去除，因此该检测方法的检测对象为总胶原蛋白，无法有效区分明胶、水解胶原等胶原蛋白类似物。

5、公开号为CN115586340A的中国发明专利公开了一种天然活性胶原蛋白快速鉴定试剂盒、鉴定方法及其用途。该快速鉴定方法和试剂盒采用特异性染色剂对具有完整三螺旋结构的活性胶原蛋白特异性染色，并生成可视化的染料-胶原蛋白复合物沉淀，通过观察沉淀颜色、状态及沉淀量，能够快速定性检测具有完整三螺旋结构的活性胶原蛋白。该快速鉴定方法与现有检测方法相比，简化了流程，可以对活性胶原蛋白进行快速定性，但该快速鉴定方法也存在无法定量分析以及无法有效区分明胶、水解胶原等胶原蛋白类似物的缺陷。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种天然活性胶原蛋白快速定性定量检测试剂盒、检测方法及应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种天然活性胶原蛋白快速定性定量检测试剂盒，包括至少一个试剂管，所述试剂管包括用于盛放检测液的管体、用于将管体内的溶液排出的挤出部以及用于将管体内的天然活性胶原蛋白沉淀进行截留的过滤部，所述检测液包括含有20-500μM特异性染料的酸性溶液。

优选的，所述酸性溶液为0.1-0.6M的乙酸或其缓冲液、盐酸或其缓冲液、柠檬酸或其缓冲液的至少一种。

优选的，所述检测液还包括含有20-500μM特异性染料的醇溶液，所述醇溶液为体积百分浓度在30-90％的乙醇、正丙醇和异丙醇中的至少一种。

优选的，所述特异性染料为红色染料或蓝色染料。更为优选的，所述红色染料为天狼星红、活性红195或其它直接红系列染料，所述蓝色染料为直接蓝6、台盼蓝、苯胺蓝或ABTS。所述特异性染料还可以为亮绿等绿色染料，可选择的是，所述特异性染料还可以为其它颜色的染料，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

优选的，所述过滤部为多孔滤膜或多孔滤芯，其材质为聚乙烯、聚丙烯、聚醚醚酮、尼龙或玻璃纤维。

优选的，所述管体的内表面经低吸附表面处理。

本发明的另一个目的通过下述技术方案实现：一种天然活性胶原蛋白快速定性定量检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

(1)取出试剂管；

(2)吸取待测样品，滴加至试剂管中；

(3)将加入待测样品的试剂管摇匀；

(4)观察试剂管内生成沉淀的状态，实现定性检测；

(5)将试剂管内的溶液排出，天然活性胶原蛋白沉淀截留在过滤部；

(6)清洗试剂管，将试剂管内的清洗溶液排出；

(7)将截留的天然活性胶原蛋白沉淀进行结果比对。

优选的，所述步骤(7)中，结果比对包括如下方式：

A、色卡比对：将截留的天然活性胶原蛋白沉淀的颜色与比色卡上的颜色进行比对；

B、AI识别：将截留的天然活性胶原蛋白沉淀拍照后，通过软件对截留的沉淀颜色深浅进行智能识别；

C、光谱仪检测：将截留的天然活性胶原蛋白沉淀的颜色采用简易光谱仪检测，或则将截留的天然活性胶原蛋白沉淀经碱复溶后采用紫外光谱仪检测；

D、UV检测：将截留的天然活性胶原蛋白沉淀用酸液洗涤，碱液复溶后，采用紫外分光光度计进行检测。

优选的，所述步骤(6)中，溶液排出包括如下方式：

1)挤压试剂管，挤出溶液；

2)借助离心力，甩出溶液；

3)通过抽滤，抽走溶液。

本发明的还一个目的通过下述技术方案实现：上述所述的试剂盒或者上述所述的检测方法在食品、化妆品、医疗美容产品、医药产品或胶原蛋白原材料中的天然活性胶原蛋白进行快速定性定量检测的应用。

本发明的试剂盒及其检测方法的检测原理为：利用染料对活性胶原蛋白的特异性染色，促进具有完整三螺旋结构的胶原蛋白自组装，并生成絮状的染料-胶原蛋白复合物沉淀这一特性，通过观察是否有沉淀生成以及沉淀的状态实现活性胶原蛋白的鉴定，并进一步用过滤的方式收集沉淀，直接或间接测定被滤膜滤芯截留的沉淀量，实现定量检测。由于染料-胶原蛋白复合物沉淀较粗，而染料-胶原蛋白类似物复合物沉淀极细，因此可以通过选用合适的滤膜滤芯孔径，实现染料-胶原蛋白复合物沉淀与染料-胶原蛋白类似物的有效分离，从而避开胶原蛋白类似物的干扰。

本发明的有益效果在于：本发明的试剂管可以将管体内的天然活性胶原蛋白沉淀(具体为染料-天然活性胶原蛋白复合物沉淀)进行截留，将截留的天然活性胶原蛋白沉淀进行结果比对，可以对天然活性胶原蛋白进行定量检测，结构简单，检测方便，耗时短，特异性强，可有效区分明胶、水解胶原等胶原蛋白类似物。

本发明的试剂盒可通过肉眼观察待测样本加入后是否有沉淀生成可有效鉴定活性胶原蛋白；实现定量检测时，胶原蛋白类似物(明胶、水解胶原蛋白)对结果无干扰；15分钟内可完成检测，便于实时在线检测。

附图说明

图1是本发明实施例一所述试剂管的结构示意图。

图2是本发明实施例一所述试剂管另一种实施方式的结构示意图。

图3是本发明实施例二所述试剂管的结构示意图。

图4是本发明实施例三所述试剂管的结构示意图。

图5是现有商业化Sircol试剂盒的检测流程示意图。

图6是本发明试剂盒的检测流程示意图。

图7是现有商业化Sircol试剂盒检测样品结果图，其中，A为样品与染料反应状态图；B为离心后沉淀状态图；C为沉淀碱液复溶后状态图；D为沉淀碱液复溶后紫外扫描图。

图8是本发明实施例一的试剂盒检测样品结果图，其中，A为样品与染料反应状态图；B为滤膜截留沉淀图；C为滤膜截留沉淀后碱液复溶状态图。

图9是本发明实施例一挤出法与现有离心法检测结果对比图，其中，A为离心法沉淀复溶液状态图；B为挤出法滤芯沉淀及沉淀复溶液状态图；C为离心法与挤出法沉淀复溶液在544nm处吸光度对比图。

图10是本发明实施例六挤出法与现有离心法检测结果对比图，其中，A为离心法沉淀复溶液状态图；B为挤出法滤芯沉淀及沉淀复溶液状态图；C为离心法与挤出法沉淀复溶液在544nm处吸光度对比图。

图11是现有离心法所用的EP管与本发明挤出法所用的试剂管的低吸附处理结果图，其中，A为离心法EP管低吸附处理结果图；B为挤出法反应管低吸附处理结果图。

图12是本发明实施例一的试剂盒与不同浓度胶原蛋白在试剂管中反应状态及挤出后沉淀状态图。

图13是本发明人工智能开发软件读取的不同浓度胶原蛋白的滤膜信号图，其中，A为不同浓度胶原蛋白滤膜软件读取值的非线性方程图；B为建立得到的比色卡示意图。

图14是本发明实施例四采用增强液的检测样品结果图。

图15是本发明实施例一的试剂盒挤出法对不同类型胶原蛋白样品检测结果图，其中，A为检测液与不同类型胶原蛋白反应状态图；B为挤出后滤芯沉淀状态图；C为增强液与不同类型胶原蛋白反应状态图；D为滤芯上沉淀读取平均灰度值的柱状图(横坐标对应A中图例)。

图16是不同类型胶原蛋白的圆二色光谱图及Rpn值。

图17是本发明实施例一的试剂盒对含15％不同醇类的胶原蛋白样本检测结果图，其中，A为检测液与不同样本的反应状态图；B为挤出后滤芯沉淀状态图；C为滤芯上沉淀读取平均灰度值的柱状图(横坐标对应A中图例)。

图18是本发明实施例一的试剂盒对含不同添加物的胶原蛋白样本检测结果图，其中，A为检测液与不同样本的反应状态图；B为挤出后滤芯沉淀状态图；C为滤芯上沉淀读取平均灰度值的柱状图(横坐标对应A中图例)。

图19是本发明实施例六的试剂盒与不同浓度胶原蛋白样品检测结果图以及线性结果图，其中，A为样品与染料反应状态图；B为滤膜截留沉淀后碱液复溶状态图；C为不同浓度胶原蛋白在584nm处吸光度的线性方程图。

图20是本发明实施例六的试剂盒对不同类型胶原蛋白样品检测结果图，其中，A为检测液与不同类型胶原蛋白反应状态图；B为滤膜截留沉淀后碱液复溶状态图。

具体实施方式

为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1-20对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。

实施例一

见图1-2，本发明的天然活性胶原蛋白快速定性定量检测试剂盒，包括至少一个试剂管，所述试剂管包括用于盛放检测液的管体1、用于将管体1内的溶液排出的挤出部2以及用于将管体1内的天然活性胶原蛋白沉淀进行截留的过滤部3，所述检测液包括含有50μM特异性染料的酸性溶液。所述酸性溶液为0.5M的乙酸，体积为1.0mL，所述特异性染料为天狼星红。

本发明的试剂管通过采用挤出部2，可以通过挤出、抽滤或者离心的方式将管体1内的溶液排出，通过采用过滤部3，可以将管体1内的天然活性胶原蛋白沉淀(具体为染料-天然活性胶原蛋白复合物沉淀)进行截留，然后进行清洗，将截留的天然活性胶原蛋白沉淀进行结果比对，可以对天然活性胶原蛋白进行定量检测，结构简单，检测方便，耗时短，特异性强，可有效区分明胶、水解胶原等胶原蛋白类似物。

本实施例中，所述过滤部3为多孔滤膜或多孔滤芯，其材质为尼龙。通过采用上述材质的多孔滤膜或多孔滤芯，使得过滤部仅截留天然活性胶原蛋白沉淀，可以有效区分明胶、水解胶原等胶原蛋白类似物。所述多孔滤膜或多孔滤芯的孔径为1-20微米。通过控制多孔滤膜或多孔滤芯的孔径，使得过滤部3仅截留天然活性胶原蛋白沉淀，可以有效区分明胶、水解胶原等胶原蛋白类似物。

本实施例中，所述管体1的内表面经低吸附表面处理。管体1的内表面经低吸附表面处理可以使试剂管的内表面不出现粘壁现象，有利于沉淀的收集。为使本发明达到最佳使用效果：所述管体1的内表面经低吸附处理。

本实施例中，所述管体1的顶部可拆卸连接有盖体4。盖体4用于防止检测液流出管体1，盖体4可以通过插接、卡接或螺接等方式可拆卸连接于管体1的顶部，为了方便操作，本实施例采用插接的方式，具体的，所述盖体4包括用于插入管体1顶部内侧壁的插接部41以及固定于插接部41顶部外侧的圆形挡片42。

本实施例中，所述挤出部2固定于所述盖体4的顶部，挤出部2的底部与所述管体1的顶部连通，所述过滤部3可拆卸安装于盖体4内。具体的，所述过滤部3可拆卸安装于插接部41内，圆形挡片42对应挤出部2的位置开设有通孔，使得挤出部2的底部与管体1的顶部连通。可以采用一密封膜将管体1的顶部进行密封，防止检测液溢出和被污染，检测时撕去密封膜，加入胶原蛋白样品检测后盖上盖体4挤出即可。上述结构的设置便于操作，通过挤出的方式将管体1内的溶液排出，将管体1内的天然活性胶原蛋白沉淀截留在过滤部3，清洗后进行结果比对。同时，也可以采用管口2处连接抽滤或负压装置的方式将溶液抽出，实现沉淀与溶液的分离。

可选择的是，如图1所示，所述盖体4与所述管体1之间固定有柔性连接部11，可以防止盖体4遗失或被污染。盖体4可以与管体1相连，也可以独立设计。可选择的是，所述管体1的外侧壁设置有防滑纹12，便于操作者用手捏住试剂管。

本发明的另一种实施方式如图2所示，所述盖体4的一侧固定有拔出部43，便于将盖体4拔出。可选择的是，所述管体1的底部设置有手持部13，手持部13的外表面设置有防滑颗粒14，便于操作者用手拿住试剂管。

本发明的天然活性胶原蛋白快速定性定量检测试剂盒的检测方法，如图6所示，包括如下步骤：

(1)取出试剂管；

(2)吸取待测样品，滴加至试剂管中；

(3)将加入待测样品的试剂管摇匀；

(4)观察试剂管内生成沉淀的状态，实现定性检测；

(5)将试剂管内的溶液排出，天然活性胶原蛋白沉淀截留在过滤部；

(6)清洗试剂管，将试剂管内的清洗溶液排出；

(7)将截留的天然活性胶原蛋白沉淀进行结果比对。

所述步骤(7)中，结果比对包括如下方式：A、色卡比对：将截留的天然活性胶原蛋白沉淀的颜色与比色卡上的颜色进行比对；B、AI识别：将截留的天然活性胶原蛋白沉淀拍照后，通过软件对截留的沉淀颜色深浅进行智能识别；C、简易光谱仪检测：将截留的天然活性胶原蛋白沉淀的颜色采用简易光谱仪检测。另外，为了更精确的检测天然活性胶原蛋白的含量，还可以采用D、UV检测：将截留的天然活性胶原蛋白沉淀用酸液洗涤后再用碱液复溶，然后采用紫外分光光度计进行检测。

实施例二

见图3，本实施例与上述实施例1的不同之处在于：所述挤出部2固定于所述管体1的底部，挤出部2的顶部与管体1的底部连通，所述过滤部3可拆卸安装于管体1的底部内侧壁。所述管体1的底部可拆卸连接有端盖6。具体的，可以在管体1内位于过滤部3的上方贴覆一密封膜，将过滤部3进行保护，密封膜上盛放检测液，管体1的顶部和底部分别用盖体4和端盖6盖住，防止检测液溢出和被污染，打开盖体4和端盖6，加入胶原蛋白样品检测后戳破密封膜即可进行离心并截留沉淀；也可以将检测液盛放于另一可密封的EP管中，加入胶原蛋白样品检测后再转入管体1内进行离心并截留沉淀。上述结构的设置便于操作，通过离心的方式将管体1内的溶液排出，将管体1内的天然活性胶原蛋白沉淀截留在过滤部3，清洗后进行结果比对。

本实施例中，所述管体1的外侧套设有用于盛放排出溶液的套管5，套管5的顶部内侧壁可拆卸连接于管体1的顶部外侧壁。管体1可以通过插接、卡接或螺接等方式可拆卸连接于套管5内，套管5用于盛放离心时甩出的溶液。具体的，如需采用UV检测读取信号，沉淀经清洗后，可将端盖6盖住挤出部2，加碱液复溶，打开端盖6，离心排出溶液至套管5，最后采用紫外分光光度计进行检测。

实施例三

见图4，本实施例与上述实施例二的不同之处在于：所述盖体4的顶部固定有用于将管体1内的溶液排出的排出部7，排出部7的底部与盖体4的顶部连通。盖体4可以为独立设计，盖体4的顶部连接有排出部7，排出部7的中部开设有通孔。可以采用一密封膜将管体1的顶部进行密封，盖上端盖6，防止检测液溢出和被污染，检测时撕去密封膜，加入胶原蛋白样品检测后盖上盖体4，打开端盖6，排出部7连接注射器(或者其他便携式工具)挤出或者通过离心将溶液排出实现沉淀截流。

实施例四

本实施例与上述实施例一的不同之处在于：所述检测液还包括含有50μM特异性染料的醇溶液，所述醇溶液为体积百分浓度在50％、60％、70％或80％的乙醇。上述检测液在本申请中又称增强液，可使细沉淀转化成肉眼更容易辨识的粗沉淀，拓宽了检测范围；上述增强液盛放于另一支试剂管中。

实施例五

本实施例与上述实施例一的不同之处在于：所述检测液中特异性染料的浓度为20μM，体积为0.1mL；所述酸性溶液为0.1M的乙酸缓冲液；所述特异性染料为活性红195；所述过滤部的材质为聚乙烯。

实施例六

本实施例与上述实施例一的不同之处在于：所述检测液中特异性染料的浓度为100μM，体积为0.5mL。所述酸性溶液为0.2M的盐酸或其缓冲液。所述特异性染料为直接蓝6。所述过滤部的材质为聚丙烯。

实施例七

本实施例与上述实施例一的不同之处在于：所述检测液中特异性染料的浓度为300μM，体积为1.5mL。所述酸性溶液为0.4M的柠檬酸或其缓冲液。所述特异性染料为台盼蓝或苯胺蓝。所述过滤部的材质为聚醚醚酮。

实施例八

本实施例与上述实施例一的不同之处在于：所述检测液中特异性染料的浓度为500μM，体积为2.0mL。所述酸性溶液为0.6M的甘氨酸或其缓冲液。所述特异性染料为ABTS。所述过滤部的材质为玻璃纤维。

对比例一

采用Sircol试剂盒进行检测，具体检测步骤如图5所示。

一、本发明的试剂盒与Sircol试剂盒的检测对比试验

Sircol试剂盒的检测步骤如图5所示，采取该试剂盒中配备的0.5mol/L乙酸溶液，将牛血清白蛋白、明胶、牛皮胶原蛋白及水解牛皮胶原蛋白分别配成1.0mg/mL的待检测样品溶液。将上述四种样品溶液使用Biocolor公司开发的Sircol试剂盒按照产品说明书中的检测步骤进行检测：以0.5mol/L乙酸溶液作为空白组，分别取待测样品溶液各100μL加入至1mL检测液，混匀，充分反应后，13000-15000r/min转速离心10min，去上清并用0.5mol/L乙酸溶液清洗沉淀，去除非特异性吸附，13000-15000r/min转速再次离心10min，去上清，取1mL浓度为1mM的NaOH溶液复溶沉淀，相机拍照记录，最后取石英比色皿将四个样品的复溶液以碱液作为空白进行300-700nm的紫外全波长扫描。

Biocolor公司开发的Sircol试剂盒用于总胶原蛋白的测定。鉴于胶原蛋白的水解产物，明胶与胶原蛋白具有同源性，因此本实验采用明胶、牛皮胶原蛋白及水解牛皮胶原蛋白测试了Sircol试剂盒的特异性。结果如图7所示：1)具有活性的牛皮胶原蛋白，可以直接用肉眼直接观察到检测液中具有纤维状沉淀产生(图7A)，而其它非活性胶原蛋白样品，均未在检测液中观察到沉淀的产生，说明了该试剂盒可以用于活性胶原蛋白的检测；2)检测液经离心，去除上清液后可观察到非活性胶原蛋白样品与活性胶原蛋白样品一样均具有沉淀(图7B)，而将沉淀洗涤去除未结合的染料后用碱液溶解，四个样本均有颜色(图7C)，且在555nm处存在紫外可见吸收峰(图7D)，说明该试剂盒用于胶原蛋白用作定量检测时，胶原蛋白类似物对结果存在严重干扰。综上所述，我们获得Sircol试剂盒三点重要信息：1)通过肉眼观察待测样本加入后是否有沉淀生成可有效鉴定活性胶原蛋白，但该试剂盒检测液颜色较深(可能与溶剂苦味酸有关)，不利于观察鉴定；2)采用离心收集沉淀、复溶、测紫外光谱实现定量检测时，胶原蛋白类似物(明胶、水解胶原蛋白)对结果存在严重干扰；3)完成整个检测耗时约1小时，不利于实时在线检测。

本发明的试剂盒检测方法操作流程如图6所示：作为举例说明，发明人选用实施例一的试剂盒及检测方法(实质上，其它实施例二至实施例八也得到了同样的检测结果)对不同类型的胶原蛋白(1.0mg/mL)进行特异性实验。具体的，取出含1mL检测液的试剂管，加入100μL待测样本(牛血清白蛋白、明胶、自提取的牛皮胶原蛋白及水解牛皮胶原蛋白)与检测液混合，反应2min，观察反应状态情况；待充分反应后，挤出上清液，清洗再次挤出上清，沉淀被管口滤膜截流收集，最后观察滤膜收集的沉淀；此外，为了对比Sircol试剂盒内染色情况，将滤膜上的沉淀用碱液溶解，观察沉淀复溶液情况，拍照记录数据。

实验结果如图8所示：1)与Sircol试剂盒检测结果一致，只有活性胶原蛋白与检测液能产生肉眼可见的纤维状沉淀，且沉淀状态相对Sircol试剂盒更加清晰，易于鉴别(图8A)；2)进一步观察挤出后滤膜截留的沉淀量(图8B)和沉淀溶出状况(图8C)，只有具有活性的牛皮胶原蛋白在滤芯上留有沉淀，且溶出液为红色。实验结果表明：1)该方法可通过肉眼观察待测样本加入后是否有沉淀生成可有效鉴定活性胶原蛋白；2)该方法实现定量检测时，胶原蛋白类似物(明胶、水解胶原蛋白)对结果无干扰；3)15分钟可完成检测，便于实时在线检测。

二、本发明挤出法与现有离心法特异性比较实验

我们将Sircol试剂盒、中国专利CN110095421B以及美国专利US20030004315A1所述的天狼星比色法称为离心法，本发明的检测方法称为挤出法(或过滤法)。为了进一步论证挤出法的特异性优势，我们采用了两种方法分别检测了牛皮胶原蛋白Col、牛皮胶原蛋白+明胶Col-Gel、牛皮胶原蛋白+水解胶原蛋白Col-DCol。操作如下：取0.6mg/mL牛皮胶原蛋白溶液分别与乙酸溶液、0.6mg/mL变性牛皮胶原蛋白溶液(DCol)、0.6mg/mL明胶(Gel)溶按体积1：1混合，取0.1mL不同混合液分别加入至1mLSircol试剂盒检测液和挤出法的检测液中充分反应。离心法使用EP管，挤出法采用本发明附图1所示的试剂管，沉淀分别采用离心、挤出后，用1mL酸溶液洗涤、去上清、0.1mol/L NaOH溶液复溶，待完全溶解后用紫外分光光度计进行300-700nm的全波长扫描，收集555nm特征吸收峰值作图分析。

采用红色染料的检测结果如图9所示：1)从图9C可看出，采用挤出法与离心法对活性胶原白进行检测，获得的吸光度值高度一致，说明两种方法均能用于活性胶原蛋白检测；2)离心法得到的沉淀复溶液状态中，活性胶原蛋白混合了明胶、水解胶原蛋白的混合物组的颜色(图9A)及吸光度值(图9C)均高于单独的活性胶原蛋白组。与活性胶原蛋白组吸光度相比，加明胶组高出约29.75％，加热解胶原蛋白组高出约97.71％，说明采用离心法对胶原蛋白含量测定，胶原蛋白类似物对定量结果干扰大；3)从图9B可看出，三组样本采用挤出法得到的滤膜沉淀从肉眼观察并未有太大区别，且沉淀复溶液状态(图9B)与吸光度(图9C)测量结果一致，三组样本几乎无变化，说明挤出法可以解决胶原蛋白类似物对定量结果的干扰。该实验结果证实本发明的检测方法可有效区分活性胶原蛋白和胶原蛋白类似物。

采用蓝色染料的检测结果如图10所示，与红色染料结果基本相同，可以证实本发明的检测方法可有效区分活性胶原蛋白和胶原蛋白类似物。

三、本发明管壁低吸附处理效果

现有离心法所用的EP管与本发明挤出法所用的试剂管的低吸附处理结果如图11所示，结果显示：未进行低吸附处理的试剂管存在严重的粘附现象，而经低吸附处理后的反应管均未出现粘壁现象，表明本发明的低吸附处理成功有效。低吸附表面处理的具体操作为本领域公知常识，在此不再赘述。

四、本发明比色卡的制作及线性关系

取上述稀释配好的不同浓度胶原蛋白溶液，按照实施例一的操作，收集沉淀，最后观察不同浓度胶原蛋白与检测液反应后滤芯上沉淀的截留量，平行多组，分别采用不同的拍照方式，包括角度、亮度、曝光、拍照设备等，大量收集图片数据；再通过Python3与Pytorch语言，由团队计算机程序员进行网络模型设计并进行训练，图像训练完成后的模型部署至高性能服务器上，最后提供WebAPI接口方便后续客户端软件进行调用。

我们进一步对挤出法的信号读取方式进行可行性验证，采用建立比色卡的方式进行胶原蛋白的快速半定量。依照图6中的操作，取线性关系对比实验中稀释配好的不同浓度胶原蛋白溶液0.1mL分别与1mL优化检测液充分反应，经挤出，洗涤，再挤出后观察不同浓度胶原蛋白与检测液反应后滤芯上沉淀的截留量。结果如图12所示：反应状态目视观察在0.15mg/mL浓度时可明显观察到沉淀，且沉淀量随着胶原蛋白的加入量增加而增多，且线性关系良好。

利用人工智能技术读取并开发的软件进行不同浓度胶原蛋白与检测液反应得到的滤膜的相对灰度值读取并分析结果如图13A所示：不同浓度胶原蛋白与检测液反应得到的滤膜，通过软件读取数值后，发现胶原蛋白浓度与反应产生的对应滤膜沉淀量满足y＝62.28+13.54/x(R²＝0.9805)，将其用于比色卡胶原蛋白浓度的筛选，最终得到的比色卡如图13B所示。

五、本发明增强液的开发实验

在线性关系建立中，我们发现当优化检测液与浓度较高的胶原蛋白溶液反应时，产生的沉淀非常致密，并不利于观察。因此我们针对该情况对检测液进行了进一步的开发，发现了一种增强试剂。采用实施例四的操作，实验结果如图14所示，结果显示：增强液能显著增强胶原蛋白浓度过高或过低时染色现象，更利于肉眼观察定性检测。

六、本发明的试剂盒特异性实验

目前研究发现的胶原蛋白具有29种类型。受限于提取与纯化工艺的限制，常见的胶原蛋白为I、II、III、Ⅳ型，其中III型胶原蛋白主要利用基因重组技术生产获得，市场上的胶原蛋白主要为I型胶原蛋白。此外，市面上小分子胶原蛋白肽，在化妆品中领域应用广泛。本实验选取了16种样本，采用实施例一对本发明试剂盒的特异性进行了测试。实验结果如图15所示，结果显示：1)牛跟腱I型胶原蛋白、牛皮I型胶原蛋白、鼠尾I型胶原蛋白、鱼鳔I型胶原蛋白、鸡II型胶原蛋白、人胎盘IV型胶原蛋白与I型胶原蛋白对照品一致，均可观察到纤维状沉淀的形成，呈现阳性结果。2)重组人源III型胶原蛋白、人胎盘Ⅳ型胶原蛋白，牛跟腱I型小分子胶原蛋白、牛软骨II型小分子胶原蛋白、鸡II型小分子胶原蛋白、90％寡肽胶原蛋白、重组人胶原蛋白、明胶和牛血清白蛋白则无均肉眼可见沉淀生成，呈现阴性结果。

圆二色谱表征结果如图16所示，结果显示：阳性样本呈现出了完整的三螺旋结构的典型特征峰，即圆二色谱在222nm附近处存在正吸收峰、198nm附近处存在负吸收峰，正吸收峰峰值与负吸收峰峰值的绝对值之比(Rpn)在0.09-0.15之间，而阴性样本均不具有三螺旋结构特征峰，证明其不具有三螺旋结构。实验结果表明采用本发明的检测方法可以通过目视观察样本与检测液反应后是否有沉淀生成实现胶原蛋白(具有完整三螺旋结构)的快速鉴定。

七、本发明的试剂盒抗干扰实验

由于本发明的试剂盒主要用于市面上胶原蛋白类产品的快速检测。市场上化妆品生产中，为了保证产品的稳定性、延长产品的保存期，往往会添加各种防腐剂、保湿剂、增稠剂等，因此我们进一步考察了检测方法的抗干扰能力。我们参考了化妆品各添加剂的最大参考用量，醇类物质添加量高达15％，实验结果如图17所示，结果显示：除了三乙醇胺，图中所述添加剂对检测体系均无明显干扰，说明了本发明的试剂盒具有良好的抗干扰能力。

除了上述常见的醇类添加物，市面上胶原蛋白类化妆中往往还会添加羧甲基脱乙酰壳聚糖、D-泛醇、黄原胶、卡波姆、聚甘油醚、聚二甲基硅氧烷等，以用作保湿剂、增稠剂等。我们进一步考察不同添加物对快速检测方法定性和定量胶原蛋白的影响，实验结果如图18所示，结果显示：检测液中均可清晰观察到各添加物组内胶原蛋白与染料反应产生的粗纤维沉淀即滤膜收集沉淀量较一致，说明不同添加物对定性和定量结果几乎无影响。

八、本发明蓝色染料的开发实验

申请人通过筛选获得了另一种可以与胶原蛋白反应产生沉淀的蓝色染料，其反应条件更加温和。采用实施例六的试剂盒对不同浓度胶原蛋白样品以及不同类型胶原蛋白样品进行检测，截留的天然活性胶原蛋白沉淀用酸液洗涤后再用碱液复溶，然后采用紫外分光光度计进行检测。实验结果如图19-20所示，与采用红色染料的实施例一检测结果一致，该检测方法由于特异性呈现出了良好的线性。

上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种天然活性胶原蛋白快速定性定量检测试剂盒，包括至少一个试剂管，其特征在于：所述试剂管包括用于盛放检测液的管体、用于将管体内的溶液排出的挤出部以及用于将管体内的天然活性胶原蛋白沉淀进行截留的过滤部，所述检测液包括含有20-500μM特异性染料的酸性溶液。

2.根据权利要求1所述的一种天然活性胶原蛋白快速定性定量检测试剂盒，其特征在于：所述过滤部为多孔滤膜或多孔滤芯，其材质为聚乙烯、聚丙烯、聚醚醚酮、尼龙或玻璃纤维。

3.根据权利要求1所述的一种天然活性胶原蛋白快速定性定量检测试剂盒，其特征在于：所述管体的内表面经低吸附表面处理。

4.根据权利要求1所述的一种天然活性胶原蛋白快速定性定量检测试剂盒，其特征在于：所述酸性溶液为0.1-0.6M的乙酸或其缓冲液、盐酸或其缓冲液、柠檬酸或其缓冲液、甘氨酸或其缓冲液的至少一种。

5.根据权利要求1所述的一种天然活性胶原蛋白快速定性定量检测试剂盒，其特征在于：所述检测液还包括含有20-500μM特异性染料的醇溶液，所述醇溶液为体积百分浓度在30-90％的乙醇、正丙醇和异丙醇中的至少一种。

6.根据权利要求1或5所述的一种天然活性胶原蛋白快速定性定量检测试剂盒，其特征在于：所述特异性染料为红色染料或蓝色染料。

7.根据权利要求6所述的一种天然活性胶原蛋白快速定性定量检测试剂盒，其特征在于：所述红色染料为天狼星红、活性红195或其它直接红类染料，所述蓝色染料为直接蓝6、台盼蓝、苯胺蓝或ABTS。

8.如权利要求1-7任一项所述的一种天然活性胶原蛋白快速定性定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)取出试剂管；

(2)吸取待测样品，滴加至试剂管中；

(3)将加入待测样品的试剂管摇匀；

(4)观察试剂管内生成沉淀的状态，实现定性检测；

(5)将试剂管内的溶液排出，天然活性胶原蛋白沉淀截留在过滤部；

(6)清洗试剂管，将试剂管内的清洗溶液排出；

(7)将截留的天然活性胶原蛋白沉淀进行结果比对。

9.根据权利要求8所述的一种天然活性胶原蛋白快速定性定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤(7)中，结果比对包括如下方式：

A、色卡比对：将截留的天然活性胶原蛋白沉淀的颜色与比色卡上的颜色进行比对；

B、AI识别：将截留的天然活性胶原蛋白沉淀拍照后，通过软件对截留的沉淀颜色深浅进行智能识别；

C、简易光谱仪检测：将截留的天然活性胶原蛋白沉淀的颜色采用简易光谱仪检测；

D、UV检测：将截留的天然活性胶原蛋白沉淀用酸液洗涤，碱液复溶后，采用紫外分光光度计进行检测。

10.如权利要求1-7任一项所述的试剂盒或者如权利要求8-9任一项所述的检测方法在食品、化妆品、医疗美容产品、医药产品或胶原蛋白原材料中的天然活性胶原蛋白进行快速定性定量检测的应用。

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