CN115586340A - 一种天然活性胶原蛋白快速鉴定试剂盒、鉴定方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种天然活性胶原蛋白快速鉴定试剂盒、鉴定方法及其用途。本发明所述快速鉴定方法和试剂盒采用特异性染色剂对具有完整三螺旋结构的活性胶原蛋白特异性染色，并生成可视化的染料‑胶原蛋白复合物沉淀，通过观察沉淀颜色、状态及沉淀量，能够快速定性检测具有完整三螺旋结构的活性胶原蛋白。与现有检测方法相比，本发明所述快速鉴定方法：因无需离心，复溶等操作，简化了流程，使得原来须1小时的检测缩短为15分钟内可完成；用酸和醇双试剂代替了苦味酸，使得鉴定更加直观、清晰、准确；肉眼识别，无需借助仪器设备，更加利于现场快速鉴定。

Description

一种天然活性胶原蛋白快速鉴定试剂盒、鉴定方法及其用途
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种天然活性胶原蛋白快速鉴定试剂盒、鉴定方法及其用途。
背景技术
活性胶原蛋白是具有完整三螺旋结构的由三条肽链形成的右手超螺旋纤维状蛋白质，是动物结缔组织中重要的蛋白质。结缔组织因为有较高含量的胶原蛋白，所以具有一定的结构与机械力学性质，如张力强度、拉力、弹力等以达到支撑和保护机体的作用。由于活性胶原蛋白有诸多优良性质，使得这类生物高分子化合物的用途非常广泛，遍及医药、化工、化妆品、食品等领域。
目前对可溶性活性胶原蛋白的检测方法主要有羟脯氨酸分光光度法、双缩脲法、SDS-PAGE、电泳法、、圆二色谱法、高效液相色谱法、质谱法以及免疫学检测法等。但是，现有标准中的检测方法一方面难以有效区分天然胶原蛋白、重组胶原蛋白及水解胶原产物；另一方面，现有检测方法大多数存在耗时长、操作繁琐、依赖大型设备、成本高等缺陷，难以用于活性胶原及相关产品实时在线定性和定量检测。
现有技术中与本申请技术方案最为接近的检测方法是天狼星红比色法。该方法源于1964年Sweat报道的苦味酸天狼星红(Sirius Red F3BA)组织学特异染色法。随后经Brentani等人改进后，作为经典的胶原蛋白定性检测方法沿用至今。目前市场上用于胶原蛋白组织染色的商业化试剂盒主要采用该方法。1985年，Martino等人发现天狼星红在醋酸中能与胶原蛋白特异性结合，生成红色沉淀，沉淀经离心，洗涤，碱复溶后，在特定波长540nm条件下通过测定吸光度确定胶原蛋白含量。美国专利公开号US2003/0004315A1和中国专利公开号CN103776778A中所涉及的鱼胶原蛋白提取过程中定量检测方法及其应用分别沿用了该方法，只是在酸溶剂的种类，离心速率上有所变化。Biocolor生产的SircolSoluble Collagen Assay检测试剂盒试剂盒，操作流程(见图1)，所不同的是该试剂盒依旧使用苦味酸做溶剂，主要用于提取胶原的检测。该商业试剂盒在说明书开头已注明，Sircol检测方法仅为研究工作而设计，请在具有条件的实验室操作。
然而，目前常用的天狼星红比色法主要存在以下缺陷：操作过程需要10000转/分钟以上的离心操作和紫外分光光度计进行检测，且耗时长，不利于活性胶原及相关产品实时在线快速检测；现有商业化检测试剂盒主要采用苦味酸做溶剂，苦味酸为管控药品，不利于大范围推广；现有方法并未对沉淀状态和特征进行描述，鉴定依据并不明确。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明人开发了一种新型天然活性胶原蛋白快速鉴定试剂盒。本发明所述检测方法无需离心操作，无需苦味酸，并且在原有酸试剂的基础上，增加一组醇试剂，通过对沉淀状态和特征的肉眼识别，实现了对天然活性胶原蛋白的快速鉴定。
具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：
在第一个方面中，本发明提供了一种天然活性胶原蛋白快速鉴定试剂盒，所述试剂盒包含检测液A和检测液B，所述检测液A为20-100μM天狼星红染料的酸性溶液，所述检测液B为20-100μM天狼星红染料的醇溶液，所述天然活性胶原蛋白为具有完整三螺旋结构的胶原蛋白。
优选地，所述检测液A和所述检测液B均为50-100μM。
作为可选的方式，在上述试剂盒中，所述检测液A和所述检测液B在所述试剂盒中分隔放置，所述试剂盒使得所述天然活性胶原蛋白生成可视化的染料-胶原蛋白复合物沉淀，通过观察沉淀颜色、状态及沉淀量，能够快速定性检测具有完整三螺旋结构的活性胶原蛋白。
作为可选的方式，在上述试剂盒中，所述酸性溶液为0.1-0.6M的乙酸、盐酸、柠檬酸或其缓冲液的一种或多种，控制所述检测液A的pH为1.50-5.00。
作为可选的方式，在上述试剂盒中，所述醇溶液为体积百分浓度为30-90％的乙醇、丙酮、正丙醇、异丙醇、三氯乙酸或甲酰胺类有机溶剂的一种或多种。
在第二个方面中，本发明提供了一种天然活性胶原蛋白快速鉴定方法，所述鉴定方法使用上述第一个方面所述的试剂盒，所述鉴定方法包括以下步骤：
(1)分别取出检测液A和检测液B；
(2)吸取待测样品，滴加至所述检测液A中；
(3)吸取待测样品，滴加至所述检测液B中；
(4)分别将步骤(2)和步骤(3)中加入的所述待测样品与所述检测液A或所述检测液B混合均匀；
(5)静置2-10分钟后，观察结果。
优选地，在所述鉴定方法中，V待测样品:V检测液＝1:5-1:10。
另外优选地，所述检测液A和所述检测液B的体积是相同的；在步骤(2)和步骤(3)中使用的待测样品的体积是相同的。
作为可选的方式，在上述鉴定方法中，所述鉴定方法还包括以下读取观察结果的步骤：
阳性：如果所述检测液A和所述检测液B中均出现红色沉淀，则结果为阳性，提示待测样品中含有活性胶原蛋白；
阴性：如果仅所述检测液B中出现沉淀，或者所述检测液A和所述检测液B中均未出现红色沉淀或沉淀非红色絮状，则结果为阴性，提示待测样品中不含活性胶原蛋白或活性胶原蛋白浓度过低，低于0.10mg/mL；
弱阳性：如果初始结果为阴性，继续向所述检测液A和所述检测液B中分别滴加上述步骤(2)或步骤(3)相同体积待测样品后，结果转为阳性，则所述结果为弱阳性，提示样品中活性胶原蛋白浓度较低，约0.10mg/mL。
作为可选的方式，在上述鉴定方法中，所述鉴定方法的检测范围为0.15-5mg/mL，当所述待测样品中活性胶原蛋白含量低于检测限0.10mg/mL时，所述检测液A和所述检测液B中均无肉眼可见沉淀。
作为可选的方式，在上述鉴定方法中，所述鉴定方法2-15分钟内即可完成，仅通过肉眼识别就能对鉴定结果进行判读，适用于现场快速检测。
作为可选的方式，在上述鉴定方法中，所述待测样品应为蛋白浓度为0.5-2mg/mL的溶液样品，如果所述待测样品为固体或粉末状胶原蛋白，应使用0.5M乙酸将所述待测样品溶解稀释至蛋白浓度为0.5-2mg/mL，再进行检测。
在第三个方面中，本发明提供了上述第一方面所述的试剂盒或者上述第二个方面所述的鉴定方法在对天然活性胶原蛋白进行快速鉴定中的用途。
作为可选的方式，在上述用途中，所述试剂盒、所述鉴定方法或所述用途的检测对象为化妆品、医疗美容产品、医药产品或胶原蛋白原材料中的可溶性活性胶原蛋白。
本发明所述快速鉴定方法采用特异性染色剂对具有完整三螺旋结构的活性胶原蛋白特异性染色，并生成可视化的染料-胶原蛋白复合物沉淀，定性检测具有完整三螺旋结构的活性胶原蛋白。
本发明快速鉴定试剂盒含有A、B两种检测液。检测时，检测液A中的染料与样本中具有完整三螺旋结构的活性胶原蛋白特异性结合生成肉眼可见的絮状红色沉淀(见图2)。当活性胶原蛋白含量较低或较高时，检测液A中的沉淀较细。为了便于观察，本试剂盒引入了增强试剂——检测液B，若检测液B同时生成了絮状红色沉淀，则可判定为样本中含有具有完整三螺旋结构的活性胶原蛋白。因此，本发明所述活性胶原蛋白快速鉴定方法的检测原理与目前已有的天狼星红比色法的核心原理是完全不同的。
本发明方法检测范围为0.15-5mg/mL(100μL)。样本中活性胶原蛋白含量低于检测限0.10mg/mL(100μL)时，检测液A和检测液B管均无肉眼可见沉淀。
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
本发明所述快速鉴定方法和试剂盒采用特异性染色剂对具有完整三螺旋结构的活性胶原蛋白特异性染色，并生成可视化的染料-胶原蛋白复合物沉淀，能够快速定性检测具有完整三螺旋结构的活性胶原蛋白。与现有检测方法相比，本发明所述快速鉴定方法：因无需离心操作，简化了流程，使得原来须1小时的检测缩短为2-15分钟内可完成；用酸和醇双试剂代替了苦味酸，使得鉴定更加直观、清晰、准确；肉眼识别，避开原有技术对检测仪器例如显微镜、紫外分光光度计的依赖，更加利于现场快速检测。
附图说明
图1：Sircol Soluble Collagen Assay检测试剂盒的操作流程示意图。
图2：不同浓度活性胶原蛋白加入检测液A和检测液B后生成沉淀的效果图。
图3：使用本发明快速鉴定试剂盒的快速鉴定方法的操作流程图。
图4：使用本发明快速鉴定试剂盒的快速鉴定方法的检测结果示意图。
图5：使用本发明快速鉴定试剂盒的快速鉴定方法的特异性检测结果。
图6：多种不同类型胶原蛋白的电泳实验结果。
图7：牛皮I型胶原(自提)在胰蛋白酶解前后电泳图。
具体实施方式
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例：
1.本发明快速鉴定试剂盒的代表性实施例
实施例1
本发明快速鉴定试剂盒含有A、B两种检测液。
检测液A包含：50μM天狼星红染料、0.5M乙酸。
检测液B包含：50μM天狼星红染料、0.5M乙酸、80％(体积比)乙醇。
检测时，按V待测样品:V检测液＝1:10的比例取待测液加入至检测液A，按V待测样品:V检测液＝1:10的比例取待测液加入至检测液B，来回颠倒混匀数次，静置2-10分钟后，观察结果。
实施例2
本发明快速鉴定试剂盒含有A、B两种检测液。
检测液A包含：50μM天狼星红染料、0.5M乙酸-乙酸盐缓冲液，pH 2.0-5.0。
检测液B包含：50μM天狼星红染料、0.5M乙酸-乙酸盐缓冲液，pH 2.0-5.0、80％(体积比)乙醇。
检测时，按V待测样品:V检测液＝1:10的比例取待测液加入至检测液A，按V待测样品:V检测液＝1:10的比例取待测液加入至检测液B，来回颠倒混匀数次，静置2-10分钟后，观察结果。
实施例3
本发明快速鉴定试剂盒含有A、B两种检测液。
检测液A包含：100μM天狼星红染料、0.5M乙酸。
检测液B包含：50μM天狼星红染料、0.5M乙酸、80％(体积比)乙醇。
检测时，按V待测样品:V检测液＝1:10的比例取待测液加入至检测液A，按V待测样品:V检测液＝1:10的比例取待测液加入至检测液B，来回颠倒混匀数次，静置2-10分钟后，观察结果。
实施例4
本发明快速鉴定试剂盒含有A、B两种检测液。
检测液A包含：50μM天狼星红染料、0.5M乙酸。
检测液B包含：50μM天狼星红染料、0.5M乙酸、80％(体积比)正丙醇或异丙醇。
检测时，按V待测样品:V检测液＝1:10的比例取待测液加入至检测液A，按V待测样品:V检测液＝1:10的比例取待测液加入至检测液B，来回颠倒混匀数次，静置2-10分钟后，观察结果。
实施例5
本发明快速鉴定试剂盒含有A、B两种检测液。
检测液A包含：50μM天狼星红染料、0.5M乙酸。
检测液B包含：50μM天狼星红染料、0.5M乙酸、80％(体积比)乙醇。
检测时，按V待测样品:V检测液＝1:5的比例取待测液加入至检测液A，按V待测样品:V检测液＝1:5的比例取待测液加入至检测液B，来回颠倒混匀数次，静置2-10分钟后，观察结果。
2.本发明快速鉴定方法的示例性鉴定流程
示例性操作步骤如下(如图3所示)：
(1)取出检测液A管和检测液B管及双气囊吸管。
(2)打开检测液A、B管盖，捏紧双气囊吸管最上端气囊，吸取待测样品(注意溶液上端液面要达到第一气囊连接处即为吸满，约100μL)，挤出滴加至检测液A管中。
(3)重复操作(2)，挤出滴加至检测液B管中。
(4)拧紧A、B管盖，来回颠倒混匀数次。
(5)静置2分钟后，观察结果。
(6)对结果判读存在疑问时，可采用本试剂盒中质控品(白盖管)重复(1)-(5)操作。
3.本发明快速鉴定方法检测结果的解释
使用本发明快速鉴定试剂盒的快速鉴定方法的检测结果示意图如图4所示。
阳性：检测液A、B两管均有如下图红色沉淀出现(+、+)，为阳性结果。
阴性：仅检测液B管有沉淀(-、+)、两管均无红色沉淀出现(-、-)，为阴性结果。
弱阳性：初始结果为阴性(-、+)，继续向A、B管中加入1滴管样本后结果转为阳性(+、+)，为弱阳性结果。
无效：质控品加入检测液A、B管，无沉淀生成，视为检测结果无效。
阳性结果表示：待测样品中含有活性胶原蛋白(具有完整三螺旋结构)。
阴性结果表示：待测样品中不含活性胶原蛋白或活性胶原蛋白浓度过低(低于0.10mg/mL)。
弱阳性结果表示：待测样品中含活性胶原蛋白浓度较低(约0.10mg/mL)。
无效结果表示：检测液或质控品已失效，或操作环境温度过高(>45℃)。
本发明实施例的第1部分实施例1-5所述的快速鉴定试剂盒均能够成功快速定性检测具有完整三螺旋结构的活性胶原蛋白。
4.本发明快速鉴定方法的特异性
作为举例说明，发明人选用实施例1(实质上，其他实施例2-5也得到了同样的检测结果)对不同类型的胶原蛋白(1mg/mL)进行特异性实验。实验结果如图5所示：牛I型胶原蛋白对照品、牛跟腱I型胶原、牛皮I型胶原蛋白(自提)、鼠尾I型胶原、鱼鳔I型胶原、鸡II型胶原以及人胎盘IV型胶原均呈现阳性结果，其他小分子胶原、重组胶原及胶原水解产物明胶均呈现阴性结果。结合SDS-PAGE电泳实验结果(图6)说明该鉴定方法能有效区分具有完整三螺旋结构的活性胶原蛋白、重组胶原蛋白和小分子胶原，具有良好的特异性。
为进一步论证上述结果，发明人继续采用了酶降解实验验证上述结果。胰蛋白酶能有效降解多肽，而不能降解具有完整三螺旋结构胶原蛋白，是一种常用的鉴定胶原蛋白是否具有完整三螺旋结构的工具酶。下图7牛皮I型胶原蛋白(自提)的电泳结果显示：牛皮I型胶原蛋白(自提)能有效抵抗胰蛋白酶降解且呈现出了I型胶原蛋白的三条特征多肽。证明牛皮I型胶原蛋白(自提)具有完整的三螺旋结构。牛I型胶原蛋白对照品、牛跟腱I型胶原、鼠尾I型胶原、鱼鳔I型胶原、鸡II型胶原以及人胎盘IV型胶原均呈现牛皮I型胶原蛋白类似的电泳结果。然而，小分子胶原、重组胶原及胶原水解产物明胶经胰蛋白酶降解后均无特征条带出现，证明该类分子均无完整的三螺旋结构。电泳结果与图6鉴定结果一致，证明该鉴定方法能有效分具有完整三螺旋结构的胶原蛋白、重组胶原蛋白和小分子胶原。
5.对本发明快速鉴定方法的总结
与现有技术对比，本发明活性胶原蛋白快速鉴定方法具有以下区别和改进：1)目前常用方法并未对染色后的沉淀进行详尽的描述，且需要借助离心复溶后的操作或者显微镜观察。本发明方法对染色后的沉淀进行了详尽的描述，并提出直接通过肉眼观察沉淀状态进行定性鉴定，大大简化了流程，缩短了鉴定时间；2)本发明快速鉴定方法无需苦味酸，改为常用的酸和醇试剂，更加便于肉眼观察。苦味酸属于管控药品，且颜色(如图1所示)很深，不便于肉眼观察沉淀状态；3)在原有酸试剂的基础上，本发明快速鉴定方法增加了一组醇试剂，通过对两组试剂中沉淀状态和特征的肉眼识别，快速鉴定天然活性胶原蛋白。该鉴定方法更加直观清晰。增加一组醇试剂的优势在于：现有技术中常常只用一组酸试剂，当待测样品中活性胶原蛋白含量很低或则高于2mg/mL时沉淀特别细，不利于观察(见图2)。本发明快速鉴定试剂盒引入一组醇试剂后，可使细沉淀转化成肉眼更容易辨识的粗沉淀，拓宽了检测范围。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种天然活性胶原蛋白快速鉴定试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含检测液A和检测液B，所述检测液A为20-100μM天狼星红染料的酸性溶液，所述检测液B为20-100μM天狼星红染料的醇溶液，所述天然活性胶原蛋白为具有完整三螺旋结构的胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述检测液A和所述检测液B在所述试剂盒中分隔放置，所述试剂盒使得所述天然活性胶原蛋白生成可视化的染料-胶原蛋白复合物沉淀，通过观察沉淀颜色、状态及沉淀量，能够快速定性检测具有完整三螺旋结构的活性胶原蛋白。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述酸性溶液为0.1-0.6M的乙酸、盐酸、柠檬酸或其缓冲液的一种或多种，控制所述检测液A的pH为1.50-5.00。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述醇溶液为体积百分浓度30-90％的乙醇、丙酮、正丙醇、异丙醇、三氯乙酸或甲酰胺类有机溶剂的一种或多种。
5.一种天然活性胶原蛋白快速鉴定方法，其特征在于：所述鉴定方法使用权利要求1至4中任一项所述的试剂盒，所述鉴定方法包括以下步骤：
(1)分别取出检测液A和检测液B；
(2)吸取待测样品，滴加至所述检测液A中；
(3)吸取待测样品，滴加至所述检测液B中；
(4)分别将步骤(2)和步骤(3)中加入的所述待测样品与所述检测液A或所述检测液B混合均匀；
(5)静置2-10分钟后，观察结果。
6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于：所述鉴定方法还包括以下读取观察结果的步骤：
阳性：如果所述检测液A和所述检测液B中均出现红色沉淀，则结果为阳性，提示待测样品中含有活性胶原蛋白；
阴性：如果仅所述检测液B中出现沉淀，或者所述检测液A和所述检测液B中均未出现红色沉淀，则结果为阴性，提示待测样品中不含活性胶原蛋白或活性胶原蛋白浓度过低，低于0.10mg/mL；
弱阳性：如果初始结果为阴性，继续向所述检测液A和所述检测液B中分别滴加权利要求5所述步骤(2)或步骤(3)相同体积待测样品后，结果转为阳性，则所述结果为弱阳性，提示样品中活性胶原蛋白浓度较低，约0.10mg/mL。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于：所述鉴定方法的检测范围为0.15-5mg/mL，当所述待测样品中活性胶原蛋白含量低于检测限0.10mg/mL时，所述检测液A和所述检测液B中均无肉眼可见沉淀。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的鉴定方法，其特征在于：所述鉴定方法2-15分钟内即可完成，仅通过肉眼识别就能对鉴定结果进行判读，适用于现场快速检测。
9.权利要求1至4中任一项所述的试剂盒或者权利要求5至8中任一项所述的鉴定方法在对天然活性胶原蛋白进行快速鉴定中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述试剂盒、所述鉴定方法或所述用途的检测对象为化妆品、医疗美容产品、医药产品或胶原蛋白原材料中的可溶性活性胶原蛋白。
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