CN116369198B - 一种克莱恩王水晶花烛的快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于克莱恩王水晶花烛繁殖技术领域，公开了一种克莱恩王水晶花烛的快速繁殖方法，包括以下步骤：克莱恩王水晶花烛种子消毒，将剥皮的克莱恩王水晶花烛种子接种于诱导培养基，培养至长出不定芽；将1.5~3cm高的状态较好的单芽切下接种于生根培养基中，培养20d；将20d生根苗半开瓶炼苗2天后，洗净培养基，种植于基质中，环境保持湿度不小于60%，温度20~30℃，每天喷一次水，一周后进入正常管理，见干见湿浇水。本发明培养方法，诱导出克莱恩王水晶花烛体细胞胚，成苗率高，炼苗移栽成活率在99%以上，且将繁殖周期缩短至80天，大大促进了克莱恩王水晶花烛的工厂化生产。
Description
技术领域
本发明属于克莱恩王水晶花烛繁殖技术领域，涉及一种克莱恩王水晶花烛的快速繁殖方法。
背景技术
克莱恩王水晶花烛（Anthurium Crystallinum King of Clarinervium）是天南星科花烛属常绿植物，叶片宽大，叶尖较短，颜色翠绿，整体和心形更加接近，且叶面的纹路清晰明显，产自荷兰，喜明亮的散射光照，适宜生长在18-28℃之间，适宜湿度在50-80%以内。克莱恩王水晶花烛四季绿意盎然，是优良奇特的室内观叶植物，用来装点居室，倍感清雅可爱，可置于客厅、书房欣赏。
目前克莱恩王水晶花烛繁殖中，由于茎尖作为外植体材料来源少、易产生细菌污染等情况，不利于大规模的工厂化生产需要，而用叶片作为外植体来源丰富，表面消毒容易，适合大规模的工厂化生产需要，但采用叶片组培的繁殖周期长达半年，不利于克莱恩王水晶花烛的快速繁殖。
发明内容
本发明的目的在于提供一种克莱恩王水晶花烛的快速繁殖方法，大大缩短了繁殖周期，促进了克莱恩王水晶花烛的工厂化生产。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种克莱恩王水晶花烛的快速繁殖方法，包括以下步骤：
a、愈伤诱导及分化：克莱恩王水晶花烛种子消毒，将剥皮的克莱恩王水晶花烛种子接种于诱导培养基，培养至长出不定芽；
b、生根培养：将1.5~3cm高的状态较好的单芽切下接种于生根培养基中，培养20d；
c、炼苗移栽：将20d生根苗半开瓶炼苗2天后，洗净培养基，种植于基质中，环境保持湿度不小于60%，温度20~30℃，每天喷一次水，一周后进入正常管理，见干见湿浇水。
在一个技术方案中，步骤a中所述消毒具体为先用75%酒精灭菌50s，冲洗，再用2%次氯酸钠消毒22min，冲洗。
在一个技术方案中，步骤a中所述诱导培养基组分如下：MS+0.3mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂。
在一个技术方案中，步骤b中所述生根培养基组分如下：1/2MS+0.2mg/L IBA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂。
在一个技术方案中，步骤c中所述基质配比为泥炭：珍珠岩=5：2。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明利用克莱恩王水晶花烛种子，通过诱导培养和生根培养，并且通过对比试验发现了种子直接诱导愈伤分化优于单芽诱导愈伤分化的培养方法，诱导出克莱恩王水晶花烛体细胞胚，成苗率高，炼苗移栽成活率在99%以上，且将繁殖周期缩短至80天，大大促进了克莱恩王水晶花烛的工厂化生产。
附图说明
图1为本发明实施例1中Y5处理单芽30d后生长情况。
图2为本发明实施例1中Y4处理单芽30d后生长情况。
图3为本发明实施例1中HZ2处理种子愈伤诱导分化出的不定芽。
图4为本发明实施例1中HZ2处理种子愈伤诱导分化出不定芽在30d后生长情况。
图5为本发明实施例1中单个克莱恩王水晶花烛体胚发育图。
图6为本发明实施例1中胚状体丛发育图。
图7为本发明实施例1中克莱恩王水晶花烛组培苗上盆移栽生长情况。
图8为本发明实施例2中HY7处理叶片诱导愈伤前期。
图9为本发明实施例2中HY7处理叶片诱导愈伤后期。
图10为本发明实施例2中HY7处理叶片愈伤分化前期。
图11为本发明实施例2中HY7处理叶片愈伤分化出不定芽。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1
1、消毒灭菌
材料：克莱恩王水晶花烛种子
采集克莱恩王水晶花烛饱满种穗，将种子剥出，于超净工作台中使用75%酒精震荡摇晃灭菌50s，无菌水冲洗1遍后，再用2%（活性氯）次氯酸钠分别消毒18min、20min、22min，最后用无菌水冲洗3遍，滤纸吸干。
接种于初代培养基（HZ0），15d后统计其污染率，分别为6.25%、5%、4.7%，结果表明，三种处理均可作为灭菌方法，以处理（75%酒精50s+2%次氯酸钠22min）最优。
2、初代培养
将步骤1采用75%酒精50s+2%次氯酸钠22min消毒后的种子用镊子剥掉种皮接种于HZ0、HZ1初代培养基，培养45天，观察种子萌发情况，培养基组分如下：
HZ0：1/2MS+25g/L蔗糖+6g/L琼脂；
HZ1：1/2MS+0.2mg/L IBA+20 g/L蔗糖+6 g/L琼脂。
结果表明：培养45d后，种子萌发并生长，HZ1处理的的种子萌发率高于HZ0培养基。
由此可见，少量的生长素IBA有利于克莱恩王水晶花烛种子的生根萌发。
3、增殖培养
3.1节段法
（1）将步骤2部分种子萌发后得到的单芽接种于Y5、Y4增殖培养基，光下培养30天，观察生长情况，培养基组分如下：
Y5：1/2MS+1mg/L GA3+25g/L蔗糖+6g/L琼脂；
Y4：1/2MS+1mg/L 6-BA+0.8mg/L NAA+1mg/L GA3+25g/L蔗糖+6g/L琼脂。
Y5处理单芽30d后生长情况如图1所示；Y4处理单芽30d后生长情况如图2所示。
结果表明：光下培养30d后，均未见节间明显伸长，增殖系数（0.5~1.5）低，且Y5、Y4培养基处理的芽体畸形，未见生根或生根慢，且GA3对节间伸长作用不明显；但以6-BA及NAA处理的芽体基部出现愈伤组织，且产生分蘖。
（2）进一步设计试验配方
将步骤2得到的组培苗用节段法切下接种于HZ0、HZ1、HZ2培养基；另一部分直接用单芽接种于HZ0、HZ1、HZ2培养基，光下培养50d，观察生长情况，培养基组分如下：
HZ0：1/2MS+25g/L蔗糖+6g/L琼脂；
HZ1：1/2MS+0.2mg/L IBA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂；
HZ2：MS+0.3mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂。
结果表明：采用节段法接种，光下培养50d后，HZ0、HZ1处理的节段侧芽生长缓慢，HZ2处理的节段基部形成愈伤并见侧芽分蘖，增殖系数分别为1、1、1.5；而采用单芽接种，HZ0、HZ1处理的单芽未见分蘖，HZ2处理的单芽分蘖出侧芽，且生长状态良好，增殖系数分别为1、1、3。
综上所述，以单芽接种HZ2配方处理最优，增殖系数为3。
3.2、愈伤诱导及分化
将步骤1采用75%酒精50s+2%次氯酸钠22min消毒后的剥皮种子和步骤1经初代培养基HZ0培养得到的单芽分别接种于HZ2、HZ3、HZ4培养基愈伤诱导分化，暗光（约500lux）培养60d，观察生长情况，培养基组分如下：
HZ2：MS+0.3mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂；
HZ3：MS+0.2mg/L 6-BA+0.04mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂；
HZ4：MS+0.2mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA +30g/L蔗糖+6g/L琼脂。
HZ2处理种子愈伤诱导分化出的不定芽如图3所示；HZ2处理种子愈伤诱导分化出不定芽在30d后生长情况如图4所示。
结果表明：暗光培养30d后，HZ3、HZ2、HZ4处理的种子及芽体基部均膨大形成愈伤；种子诱导出的愈伤培养60d后即形成大愈伤团，且分化出不定芽；单芽诱导出的愈伤组织培养60d后形成愈伤团，但未分化出不定芽。
此外，在HZ2处理培养过程中可诱导产生体细胞胚胎，体胚的发生大大提高了增殖系数，且成苗率高。单个克莱恩王水晶花烛体胚发育如图5所示；胚状体丛发育如图6所示。这一研究为深入了解克莱恩王水晶花烛体胚发生的形态学及其调控技术提供支撑，为制作克莱恩王水晶花烛人工种子、提高种苗生产率和通过遗传转化获得转基因植株提供基础。
由此可见，种子直接诱导愈伤优于单芽诱导愈伤的培养方法。以种子接种于HZ2诱导愈伤及分化培养最优，增殖系数可达7。
综上，种子愈伤诱导分化不定芽的培养方式明显优于节段法，且以种子直接接种于HZ2处理结果最优，增殖系数可达7。
4、生根培养
将步骤3.2所得1.5~3cm单芽接种于HZ0、HZ1、HZ5生根壮苗培养基上，光照培养20d，观察生长情况，培养基组分如下：
HZ0：1/2MS+25g/L蔗糖+6g/L琼脂；
HZ1：1/2MS+0.2mg/L IBA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂；
HZ5：1/2MS+0.1mg/L NAA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂。
结果表明：生根培养20d后，以上三处理均生根，生根率达到80%以上，其中HZ0处理的根系短而少，HZ5处理根系有愈伤，HZ1根系长且多，因此，HZ1处理作为克莱恩王水晶花烛生根培养最优，且克莱恩王水晶花烛组培苗生长状态良好，20d后便可炼苗。
5、炼苗移栽
将20d生根苗半开瓶炼苗2天后，洗净培养基，种植于基质中，基质配比为泥炭：珍珠岩=5：2，保持环境湿度60%以上，温度20-30度之间；每天喷一次水，一周后进入正常管理，见干见湿浇水即可，成活率99%。克莱恩王水晶花烛组培苗上盆生长情况如图7所示。
实施例2（对比实验）
1、消毒灭菌
材料：克莱恩王水晶花烛嫩叶及老叶
嫩叶：流水冲洗1min+75%酒精30s+菌水冲洗1遍+2%（活性氯）次氯酸钠5min+无菌水冲洗5遍；
老叶：流水冲洗2min+75%酒精40s+菌水冲洗1遍+2%（活性氯）次氯酸钠10min+无菌水冲洗5遍；
将叶片用剪刀剪成约3×4cm的大小后，在无菌条件下进行灭菌处理，滤纸吸干水分后，剪去叶片边缘褐化部分，分割成约1×2cm大小接种于初代培养基（HY1）中，黑暗培养15d后，统计嫩叶及老叶的污染率分别6%及25%，主要为细菌污染。
2、初代培养
（1）将步骤1中的嫩叶片和老叶片分别平放于HY1、HY2、HY3培养基，黑暗培养50d，观察生长情况，培养基组分如下：
培养基HY1：1/2MS+2mg/L 6-BA+0.2mg/L 2-4D+25g/L蔗糖+6g/L琼脂；
培养基HY2：1/2MS+0.4mg/L TDZ+1mg/L 2-4D+25g/L蔗糖+6g/L琼脂；
培养基HY3：1/4MS+0.4mg/L TDZ+1mg/L 2-4D+25g/L蔗糖+6g/L琼脂。
结果表明：黑暗培养50d后，HY1处理的叶片基本全部褐化；HY2、HY3处理的老叶片完全褐化，嫩叶诱导出少部分愈伤但也出现褐化。
由此可见，克莱恩王水晶花烛嫩叶更适宜进行愈伤诱导培养；6-BA可能不适合诱导其叶片愈伤培养或浓度过高；无机盐浓度对叶片褐化无显著影响；TDZ及2-4D浓度较高可能导致愈伤褐化。
（2）进一步设计试验配方
将步骤1中的嫩叶片和老叶片分别平放于HY4~HY7培养基，黑暗培养90d，观察生长情况，培养基组分如下：
培养基HY4：1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L 2-4D+25g/L蔗糖+6g/L琼脂；
培养基HY5：1/2MS+0.1mg/L TDZ+1mg/L 2-4D+25g/L蔗糖+6g/L琼脂；
培养基HY6：1/2MS+0.01mg/L TDZ+0.5mg/L 2-4D+25g/L蔗糖+6g/L琼脂；
培养基HY7：1/2MS+0.01mg/L TDZ+0.5mg/L 2-4D+300mg/L CH+25g/L蔗糖+6g/L琼脂，其中CH为酸水解酪蛋白。
HY7处理叶片诱导愈伤前期如图8所示。HY7处理叶片诱导愈伤后期如图9所示。
结果表明：黑暗培养50d后，HY4处理的叶片基本全部褐化；HY5、HY6处理的叶片诱导出的愈伤组织较之前状态较好，但褐化仍旧较为严重；HY7处理的未完全黄化嫩叶得到愈伤组织，黑暗培养90d后，未诱导出愈伤的叶片组织完全褐化，但愈伤组织状态良好。
由此可见，6-BA可能不适合诱导其叶片愈伤培养；TDZ及2-4D浓度较低更适宜诱导其叶片愈伤培养；CH对其叶片愈伤培养及减少褐化及促进不定芽分化有较大作用。
3、诱导分化
将步骤2得到的愈伤组织接种于HY7培养基，黑暗培养90d，观察生长情况。
培养基HY7：1/2MS+0.01mg/L TDZ+0.5mg/L 2-4D+300mg/L CH+25g/L蔗糖+6g/L琼脂。
HY7处理叶片愈伤分化前期如图10所示。HY7处理叶片愈伤分化出不定芽如图11所示。培养过程中诱导出体细胞胚，但极少。
结果表明：黑暗培养90d后，大部分愈伤组织状态良好，待其愈伤组织顶部变成红色后转光下培养，可诱导出不定芽。
由此可见，CH对促进克莱恩王水晶花烛叶片愈伤组织分化有较大作用。因此，以HY7处理作为克莱恩王水晶花烛叶片愈伤诱导及分化培养基较好。
但比较采用种子进行克莱恩王水晶花烛繁殖，采用叶片为外植体的繁殖过程，培养基成分复杂，培养周期较长（约200天），不利于克莱恩王水晶花烛的快工厂化繁殖。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。
Claims (1)
1.一种克莱恩王水晶花烛的快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、愈伤诱导及分化：克莱恩王水晶花烛种子消毒，所述消毒具体为先用75%酒精灭菌50s，冲洗，再用2%次氯酸钠消毒22min，冲洗；将剥皮的克莱恩王水晶花烛种子接种于诱导培养基，所述诱导培养基组分如下：MS+0.3mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，培养至长出不定芽；
b、生根培养：将1.5~3cm高的状态较好的单芽切下接种于生根培养基中，所述生根培养基组分如下：1/2MS+0.2mg/L IBA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂，培养20d；
c、炼苗移栽：将20d生根苗半开瓶炼苗2天后，洗净培养基，种植于基质中，所述基质配比为泥炭：珍珠岩=5：2，环境保持湿度不小于60%，温度20~30℃，每天喷一次水，一周后进入正常管理，见干见湿浇水。
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