CN116359354A - 美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种RP‑HPLC方法检测美罗培南中的杂质，并在RP‑HPLC法基础上结合二维高效液相色谱法(2D‑HPLC法)、柱切换‑LC/Qtof法对降解浓溶液中的聚合物杂质进行确认，考察RP‑HPLC法的专属性。
Description
技术领域
本发明提供了一种检测分析方法，具体地，涉及一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法。
背景技术
ChP，EP，USP，JP对美罗培南有关物质的检测方法均有收载，其中EP和USP对美罗培南杂质A和杂质B有定性论述，各国药典均未收载美罗培南聚合物的检测方法。
CN 103245741 B采用凝胶色谱法，以TSK-GEL-G2000SWXL色谱柱分离美罗培南中的聚合物杂质，通常凝胶色谱法分离杂质时，视主峰前的色谱峰为聚合物峰，但实际在凝胶色谱系统中的洗脱顺序不一定完全按照化合物的相对分子质量大小排列，因此聚合物的检出会受到小分子杂质的共出峰干扰，导致方法的专属性差，定量不准确。
由于聚合物杂质对照品难以获得，采用高效液相色谱法测定聚合物难以定位聚合物峰。
发明内容
本发明旨在克服上述缺陷，提供一种RP-HPLC方法来检测美罗培南中的杂质，并在RP-HPLC法基础上结合二维高效液相色谱法(2D-HPLC法)、柱切换-LC/Qtof法对降解浓溶液中的聚合物杂质进行确认，考察RP-HPLC法的专属性。
本发明提供的美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，可以有效分离和检测美罗培南开环物(EP杂质A)、美罗培南二聚体1、美罗培南二聚体水解产物1、美罗培南二聚体2(EP杂质B)、美罗培南二聚体3、美罗培南二聚体4/美罗培南三聚体衍生物1/美罗培南二聚体水解产物2、美罗培南三聚体脱水产物1、美罗培南二聚体衍生物1、美罗培南三聚体衍生物2、美罗培南二聚体5、美罗培南三聚体衍生物3、美罗培南二聚体衍生物3、美罗培南三聚体脱水产物2、美罗培南三聚体脱水产物3、美罗培南二聚体6，该方法专属性好，重复性高，很好的满足美罗培南及注射用美罗培南杂质控制的要求。
本发明提供的一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，其特征在于：
采用RPHPLC法，
其中，RPHPLC的参数条件为：
流动相A：磷酸二氢钠溶液；
流动相B：醇、腈；如：甲醇、乙醇等烷基醇，或者含有CN的有机物；
洗脱方式为梯度洗脱：每隔5-20min，流动相A的体积百分数调整5-45％；
总的洗脱时间不少于50min。
进一步地，本发明提供的一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，其特征还在于：
上述梯度洗脱过程中，流动相A的体积百分数先降后升。
进一步地，本发明提供的一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，其特征还在于：
上述梯度洗脱具体方法为：
0-5min流动相A的体积百分数为95-97％；
5-25min流动相A的体积百分数由95-97％降至80-90％；
25-50min流动相A的体积百分数由80-90％降至55-65％；
50-50.1min流动相A的体积百分数由55-65％增加至95-97％；
50.1-65min流动相A的体积百分数为95-97％。
进一步地，本发明提供的一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，其特征还在于：
上述流动相A选自10-30mmol，pH为6.3-6.7的磷酸二氢钠溶液。
进一步地，本发明提供的一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，其特征还在于：
色谱柱选自以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径2.7-5μm，长度为100-250mm，内径为3-6mm的色谱柱。
检测波长：218-222nm
柱温：25-35℃
流速：0.7-1.0ml/min。
此外，本发明还提供了一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，该方法旨在实现对美罗培南中各杂质的确认分析，其特征在于：
采用一维、二维相结合法：
上述一维方法采用如上述提及的美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法的实现，
上述二维方法为柱切换LC/Qtof法；
其中，二维方法的参数条件如下：
流动相A：酸性水溶液；如：甲酸、乙酸等有机酸；
流动相B：腈；如：乙腈等含有CN的有机物质；
二维阀切换时间：根据不同杂质的出峰时间(tR)变化；
洗脱方式为梯度洗脱，根据不同杂质的出峰时间(tR)，每隔1-8min，流动相A的体积百分数调整10-45％；
总的洗脱时间不少于10min。
进一步地，本发明提供的一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，其特征还在于：
在二维方法中，
上述梯度洗脱具体方法为：
0-tRmin流动相A的体积百分数为90-95％；
tR-tR+8min流动相A的体积百分数由90-95％降至80-85％；
tR+8min-tR+15min流动相A的体积百分数由80-85％降至45-50％；
tR+15min-tR+16min流动相A的体积百分数由45-50％增加至90-95％。
进一步地，本发明提供的一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，其特征还在于：
在二维方法中，
上述梯度洗脱过程中，流动相A的体积百分数先降后升。
进一步地，本发明提供的一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，其特征还在于：
在二维方法中，
色谱柱选自以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径为1.7-3μm，长度为20-100mm，内径为2-4mm。
进一步地，本发明提供的一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，其特征还在于：
在二维方法中，
流动相A选自体积百分比浓度为0.01-0.2％的甲酸水溶液；
流速：0.1-0.3ml/min；
柱温：25-35℃；
MS模式：DualAJSESI+。
具体实验过程为：
一维过程进样量：5-50μl；
二维过程进样量：5-80μl；
供试品溶液：取本品适量，加三乙胺等胺溶液溶解。
对照品溶液：取美罗培南对照品适量，用三乙胺等胺溶液溶解。
阳性供试品溶液：取本品适量，用磷酸盐溶液溶解，40℃条件放置1天，再用三乙胺溶液稀释制成阳性供试品溶液。
系统适用性溶液：取本品适量，加磷酸盐溶液溶解，40℃条件下放置8小时，再用三乙胺溶液稀释制成系统适用性溶液。
附图说明
图1、一维色谱体系下阳性供试品色谱峰；
图2、EP杂质A的质谱图；
图3、美罗培南二聚体1的质谱图；
图4、小分子杂质的质谱图；
图5、美罗培南二聚体水解产物1的质谱图；
图6、美罗培南二聚体2(EP杂质B)的质谱图；
图7、美罗培南二聚体3的质谱图；
图8、美罗培南二聚体3的质谱图；
图9、美罗培南二聚体4、美罗培南三聚体衍生物1、美罗培南二聚体水解产物2的质谱图；
图10、美罗培南三聚体脱水产物1的质谱图；
图11、美罗培南三聚体衍生物2的质谱图；
图12、美罗培南二聚体衍生物1的质谱图；
图13、美罗培南二聚体5的质谱图；
图14、美罗培南三聚体衍生物3的质谱图；
图15、美罗培南二聚体衍生物3的质谱图；
图16、美罗培南三聚体脱水产物2的质谱图；
图17、美罗培南三聚体脱水产物3的质谱图；
图18、美罗培南二聚体6的质谱图；
图19、系统适用性图谱。
具体实施方式
实施例1
色谱条件:
三乙胺溶液：取三乙胺1.0ml，加水900ml，用磷酸溶液(1→10)调节pH值至5.0±0.1，加水稀释至1000ml。
阳性供试品溶液：取本品适量，用0.03mol/L的磷酸盐溶液(根据实际样品的差异，该磷酸盐溶液的浓度可在0.03mol/L磷酸二氢钠-0.1mol/L磷酸氢二钠的范围内进行调整)溶解并稀释制成每1ml中约含美罗培南30mg的溶液，40℃条件放置1天，作为破坏溶液储备液；精密量取破坏溶液储备液1.5ml，置10ml量瓶中，用三乙胺溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。
取阳性供试品溶液在一维色谱体系下进样，确定各目标峰出峰位置如如图1所示：
通过各个保留位置的杂质二维切换进入tof定性得到如下结果：
各聚合物杂质结构推测结果如下：
实施例2
三乙胺溶液：取三乙胺1.0ml，加水900ml，用磷酸溶液(1→10)调节pH值至5.0±0.1，加水稀释至1000ml。
供试品溶液：取本品适量，加三乙胺溶液溶解并稀释制成每1ml中约含美罗培南5mg的溶液。
对照品溶液：取美罗培南对照品适量，用三乙胺溶液溶解并稀释制成每1ml中约含美罗培南25μg的溶液。
系统适用性溶液：取本品适量，加磷酸盐溶液(0.03mol/L磷酸二氢钠-0.05mol/L磷酸氢二钠)溶解并稀释制成每1ml中约含美罗培南25mg的溶液，置40℃烘箱中加热8小时，放冷，精密量取2ml，置10ml量瓶中，用三乙胺溶液定量稀释至刻度，摇匀。
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Xbridge shield RP C18，3.5μm，4.6×150mm)，以20mmol/L磷酸二氢钠(1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.5)为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行线性梯度洗脱，柱温为30℃，流速为0.8ml/min，检测波长为220nm，进样体积10μl。
取系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图(如图19所示)。系统适用性溶液色谱图中，出峰顺序为杂质A(美罗培南开环物，相对杂质B峰保留时间约为0.2)、美罗培南、二聚体水解产物1(相对杂质B峰保留时间约为0.9)、杂质B(主峰后最大杂质峰)、二聚体3(相对杂质B峰保留时间约为1.2)、多聚体(二聚体4、三聚体衍生物1、二聚体水解产物2，相对杂质B峰保留时间约为1.3)、二聚体5(相对杂质B峰保留时间约为1.5)，上述色谱峰分离度如下。
| 峰归属 | RT(min) | RRT | 分离度 |
| 杂质A | 5.401 | 0.22 | - |
| 美罗培南 | 16.739 | 0.67 | 19.85 |
| 二聚体水解产物1 | 22.966 | 0.92 | 8.56 |
| 杂质B | 24.902 | 1.00 | 2.30 |
| 二聚体3 | 30.311 | 1.22 | 10.87 |
| 多聚体 | 32.146 | 1.29 | 2.85 |
| 二聚体5 | 36.268 | 1.46 | 5.79 |
根据使用机器型号和系统的差异，上述一维梯度洗脱的具体方法为：
0-5min流动相A的体积百分数在95-97％的范围内进行选择；
5-25min流动相A的体积百分数由95-97％降至80-90％的范围内进行选择；
25-50min流动相A的体积百分数由80-90％降至55-65％的范围内进行选择；
50-50.1min流动相A的体积百分数由55-65％增加至95-97％的范围内进行选择；
50.1-65min流动相A的体积百分数为95-97％的范围内进行选择。
二维梯度洗脱具体方法为：
0-tRmin流动相A的体积百分数为90-95％的范围内进行选择；
tR-tR+8min流动相A的体积百分数由90-95％降至80-85％的范围内进行选择；
tR+8min-tR+15min流动相A的体积百分数由80-85％降至45-50％的范围内进行选择；
tR+15min-tR+16min流动相A的体积百分数由45-50％增加至90-95％的范围内进行选择。
Claims (10)
1.一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，其特征在于：
采用RPHPLC法，
其中，RPHPLC的参数条件为：
流动相A：磷酸二氢钠溶液；
流动相B：醇、腈；
洗脱方式为梯度洗脱：每隔5-20min，流动相A的体积百分数调整5-45％；
总的洗脱时间不少于50min。
2.如权利要求1所述得一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，其特征在于：
所述梯度洗脱过程中，流动相A的体积百分数先降后升。
3.如权利要求1所述的一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，其特征在于：
所述梯度洗脱具体方法为：
0-5min流动相A的体积百分数为95-97％；
5-25min流动相A的体积百分数由95-97％降至80-90％；
25-50min流动相A的体积百分数由80-90％降至55-65％；
50-50.1min流动相A的体积百分数由55-65％增加至95-97％；
50.1-65min流动相A的体积百分数为95-97％。
4.如权利要求1所述的一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，其特征在于：
所述流动相A选自10-30mmol，pH为6.3-6.7的磷酸二氢钠溶液。
5.如权利要求1所述的一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，其特征在于：
色谱柱选自以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径2.7-5μm，长度为100-250mm，内径为3-6mm的色谱柱。
检测波长：218-222nm
柱温：25-35℃
流速：0.7-1.0ml/min。
6.一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，其特征在于：
采用一维、二维相结合法：
所述一维方法采用如权利要求1-5任一所述的一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法的实现，
所述二维方法为柱切换LC/Qtof法；
其中，二维方法的参数条件如下：
流动相A：酸性水溶液；
流动相B：腈；
二维阀切换时间：根据不同杂质的出峰时间(tR)变化；
洗脱方式为梯度洗脱，根据不同杂质的出峰时间(tR)，每隔1-8min，流动相A的体积百分数调整10-45％；
总的洗脱时间不少于10min。
7.如权利要求6所述的一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，其特征在于：
在二维方法中，
所述梯度洗脱具体方法为：
0-tRmin流动相A的体积百分数为90-95％；
tR-tR+8min流动相A的体积百分数由90-95％降至80-85％；
tR+8min-tR+15min流动相A的体积百分数由80-85％降至45-50％；
tR+15min-tR+16min流动相A的体积百分数由45-50％增加至90-95％。
8.如权利要求6所述额一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，其特征在于：
在二维方法中，
所述梯度洗脱过程中，流动相A的体积百分数先降后升。
9.如权利要求6所述的一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，其特征在于：
在二维方法中，
色谱柱选自以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径为1.7-3μm，长度为20-100mm，内径为2-4mm。
10.如权利要求6所述的一种美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法，其特征在于：
在二维方法中，
流动相A选自体积百分比浓度为0.01-0.2％的甲酸水溶液；
流速：0.1-0.3ml/min；
柱温：25-35℃；
MS模式：DualAJSESI+。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202111562777.3A CN116359354A (zh) | 2021-12-20 | 2021-12-20 | 美罗培南及注射用美罗培南中杂质的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN116359354A true CN116359354A (zh) | 2023-06-30 |
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2021
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