CN1163516C

CN1163516C - 一种利用壳聚糖金属配合物氧化降解壳聚糖的方法

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Publication number: CN1163516C
Application number: CNB001050494A
Authority: CN
Inventors: 岐张; 张岐; 林强; 尹学琼; 于文霞; 冯玉红
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2000-04-11
Filing date: 2000-04-11
Publication date: 2004-08-25
Anticipated expiration: 2020-04-11
Also published as: CN1317496A

Abstract

一种采用“金属配位一氧化裂解”原理对壳聚糖控制降解，制备窄分子量分布寡聚壳聚糖的新方法。其原理是利用生物甲壳素脱乙酰化后壳聚糖中部分氨基及相邻羟基与加入的适宜金属在稀溶液中配位。通过控制糖与金属离子摩尔数的比例控制配位点的个数。稀溶液中配位使配位结点在壳聚糖高分子链中均匀分布，即保证了配位结点之间未配位糖苷链中糖数的均一性。氧化从配位结点或优势构象处裂解高分子链，后处理得到窄分子量分布的低聚寡聚糖。

Description

一种利用壳聚糖金属配合物氧化降解壳聚糖的方法

本发明涉及一种利用壳聚糖与金属形成配合物后氧化降解制备窄分子量分布寡聚糖的新方法。更具体地说是将壳聚糖与金属进行配位-氧化裂解，经必要后处理，得到数均分子量及分子量分布范围符合特有生物生理活性、医疗保健功能要求，有着广泛用途的低聚寡糖。

目前，壳聚糖降解制备低聚水溶性壳聚糖的方法主要有酶降解法、氧化降解法、酸降解法，其次还有微波法、超声波法、辐射法等。现有的酶降解法主要依赖于壳聚糖酶、脂肪酶、溶菌酶以及其他非专一性水解酶，能得到较高收率的六至八糖，这种糖在食品及医药方面(抗癌药物)用途广泛，但在选择合适的酶种以适合工业化大规模生产上尚存在困难，即缺乏以经济成本进行大规模工业化生产的可能；而现已用于壳聚糖产品的工业化生产(如“鲟之宝”胶囊-上海伟康生物制品公司生产)的氧化降解法，包括了H₂O₂氧化法、H₂O₂-NaClO₂法、H₂O₂-HCl法、和其他一些氧化降解法。但是这种方法对壳聚糖降解存在的最大问题是在降解过程中引入了各种反应试剂，使得对其降解副反应的控制以及在降解产物的分离纯化方面增加了难度；酸降解法，它包括HCl降解法、酸-亚硝酸盐法、过醋酸法、其他酸解法。其中用HCl降解法得到的低聚水溶性壳聚糖-盐酸盐的分子量分布比较宽。用酸-亚硝酸盐法可制备相对较高含量的12至19(分子量在2000-3000，分布相对狭窄)低聚水溶性壳聚糖。酸解法和单纯的氧化降解法都是非特异性的降解过程，其降解过程较难控制，虽然已先后用于工业化生产，并且各种分子量范围的壳聚糖产品都能得到，但要想得到特定分子量范围且具有较高收率，和能广泛应用的壳聚糖产品是比较困难的；而其他降解法如微波法、超声波法、辐射法等，也可以得到低聚水溶性壳聚糖，但仍然属于非特异性降解过程，目前尚属基础研究探索阶段。可以说除酶降解法外，凡属非特异性降解过程降解得到的产物都有其无法解决的平均分子量分布宽这一难题。

本发明的目的是避开目前工业生产中采用的以非特异性降解过程为机制的，制备低聚水溶性壳聚糖过程所表现出的种种弊端和不足，提供一种壳聚糖与金属形成配合物后氧化控制降解的新方法，人为制造特异性降解的氛围。使制备获取寡糖之目的终得以实现。

[1]具体地，本发明涉及一种利用壳聚糖金属配合物氧化降解壳聚糖的方法，其特征在于：在温度为0～100℃和pH值为1～6的条件下，使壳聚糖与金属离子形成配合物，接着使用氧化剂在20分钟至76小时时间范围内降解壳聚糖，得到壳聚寡糖。

[2]方案[1]中的方法，其中使用的原料壳聚糖是从水产养殖、海洋生物中的虾、蟹壳及昆虫、藻类和细菌生成的主要提取物之一甲壳素脱乙酰化的产物。

[3]方案[1]中的方法，其中可使用的金属离子包括：主族金属元素、过渡金属元素或稀土金属元素离子。

[4]方案[1-3]之一所述的方法，其特征在于在壳聚糖中加进0.1～10％(重量)的醋酸水溶液，在0～100℃的温度下，经过20分钟～48小时使壳聚糖溶解。

[5]方案[4]的方法，其特征在于其中主族金属元素离子在加入壳聚糖醋酸水溶液中时，其浓度为0.01～10％(重量)；稀土金属元素在加入壳聚糖醋酸水溶液中时，其浓度为0.01～10％(重量)；过渡金属元素在加入壳聚糖醋酸水溶液中时，其浓度为0.01～10％(重量)。

[6]方案[5]的方法，其特征在于其中壳聚糖与金属配合形成的壳聚糖金属配合物，采用0.01～25％(重量)的所述氧化剂，在0～100℃温度下降解。

[7]方案[6]的方法，其特征在于其中氧化剂为过氧化氢化合物。

本发明的原理是以壳聚糖(Chitosan，(1，4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-匍萄糖为主的聚合体)为原料，将这种含有氨基的壳聚糖在与金属离子形成配合物的同时，可破坏分子间及分子内氢键，降低溶液粘度，以使其能够达到经氧化降解后，制备出较为专一分子量的寡糖配合物，然后用螯合剂将“废”金属除去，便可获得专一分子量(低于1万)，具有独特的生理、生物活性和医疗特性的低聚水溶性壳聚糖(寡糖)。要想达到这一目的，必须在制备过程中准确把握每个制备环节中的每一细节。首先通过测量脱乙酰度计算出自由氨基的个数(摩尔数)，其次是根据不同金属的配位性质，将定量的金属离子加入壳聚糖溶液中，这样可使大分子壳聚糖中的部分氨基以配合物形式存在，在进行这一过程的同时也实现了降低溶液粘度，即盐效应结果。这一过程便可使金属离子靠自由扩散作用在高分子间及分子内随机均匀地形成定量的配位结点，使得大分子随机结合后，自然分成了如附图2中所示的有配位金属存在的配位结点和未参与配位的自由壳聚糖糖苷链。可形象的将金属存在的配位结点看作是附图2中网上的网结，将未参与配位的自由壳聚糖糖苷看作是附图2中网上的网线。对于有些金属来说，氧化后壳聚糖链是从金属邻近部位断裂的，而对于另一些金属来说，也可以是从配位构型造成的优势构象部位断裂。同时证明金属加入量越多，配位结点越多，网越密，网节越短。即壳聚糖糖苷链越短，降解后的糖数越少，反之，糖数则多。本发明采用的溶液介质体系包括：HAc-H₂O、NaAc-HAc-H₂O，以及其他一些除H₂O₂氧化法以外的溶解体质体系；以及本发明提到的醋酸铜、醋酸镍、醋酸镧、醋酸铁、氯化钡金属盐，及正在大范围涉及到的主族元素、稀土金属、过渡金属盐的特性。本发明在实验室中采取多重对照方式：

1)测定脱乙酰度，计算出原料氨基的个数，根据所需降解窄分子量要求，选择不同性质、原子半径的金属并计算出所需加入金属离子的摩尔数；2)用适宜浓度、适量体积的酸性水溶液在适宜温度、pH值及搅拌条件下溶解壳聚糖固体，并使其溶解完全；3)将配制为一定浓度的金属盐水溶液加入溶解完全的壳聚糖溶液中，调节pH值、搅拌、控温使金属离子与壳聚糖配位反应完全；4)在适宜pH值、适宜温度、搅拌条件下滴入适量摩尔浓度的氧化剂，并维持一定时间使氧化降解反应完全；5)在一定温度下用碱调节pH值，对可在pH5～8可形成氢氧化物沉淀的金属先考虑用此法过滤去除金属，无沉淀生成的考虑加入适宜金属的螯合剂用络合沉淀法过滤去除，对不易生成沉淀的金属可考虑螯合萃取去除；6)除去金属的母液经适当浓缩后即可得所需产品的一定浓度的水溶液，产品的数均分子量及分子量分布范围参数可通过粘度计和糖分析专用高效液相色谱测得；7)对于要求相差2～4糖范围的低聚壳聚糖可通过GPC(gel permeation chromatogrphy凝胶渗透色层[分离]法)专用设备作层析柱分离来获取。

以上过程明确了通过控制对金属的加入量，使糖个数与金属离子形成定比例关系，限定降解后糖数的多少，这便约束了降解后的分子量的专一性，使降解通过过氧化剂氧化来最终实现。经本发明所采取的多重实验的初步实验结果可总结如下：i)同浓度、同pH值、同温度下，加金属离子的壳聚糖溶液较不加金属离子的壳聚糖溶液的粘度低，并与加入量有关；ii)含金属离子的溶液在加入等量H₂O₂后，其降解速率比不加金属离子的要快得多；iii)不同金属离子引起的降解速率也不同，如铜离子大于镍离子；iv)改变金属及H₂O₂加入量可有效地控制降解后溶液的粘度，既控制平均分子量范围；v)完全氧化可使壳聚糖完全降解，实验中已表现出铜离子存在催化性；vi)实验经气质联用分析发现了含氮基小分子和多羟基小分子的分子离子峰，这说明降解应从配位区开始。这恰恰说明断键后片断分子量分布受配位键限制变得较为专一的结果。

以下将结合附图对本发明作一说明。

附图1是本发明壳聚糖金属配合物的形成与控制降解方法工艺流程图。

附图2是本发明理想的壳聚糖苷链金属配位后形成的网状结构示意图。图

中M为配位结点，弹簧式线段为未配位糖苷段。

由附图1和附图2可知本发明壳聚糖金属配合物的形成与控制降解是：先测定所采用原料壳聚糖的脱乙酰度，并计算出其中氨基的摩尔数，以0.1～10％的醋酸水溶液搅拌溶解，再兑稀使其形成0.001～0.5溶液。然后根据不同金属的配位能力强弱、金属离子半径大小，确定金属离子的加入量，称量后用自由扩散到大分子壳聚糖的氨基部位并形成配位键。由于高聚壳聚糖中部分氨基与金属离子形成配合物，由此将大分子变为网状结构。从附图2得知，通过控制金属加入量，使糖个数与金属离子形成定比例关系，限定未配位壳聚糖苷链大小，来约束降解后分子量的专一性，这一表现已被确定为“金属配位-氧化裂解”原理对壳聚糖控制降解过程中的核心所在。在这种情况下加入过氧化氢在一定时间内控温氧化降解，降解后的混合物通过三种附加方法除去金属离子：1)、可采用螯合沉淀法去除金属离子；2)、离子交换树脂去除金属离子；3)、使用特性柱去除金属离子。去除金属离子后，将寡聚壳糖母液进行中和、纯化，即得到最终产物的寡聚壳聚糖水溶液。按附图1中的步骤：制备或购买合乎降解指标要求的壳聚糖作为基本原料。在其与金属离子配位前，取少量测定其脱乙酰度，根据脱乙酰度计算金属离子加入量(摩尔数)。加进0.1％-10％的醋酸水溶液，在温度10～60℃之间，搅拌4～36小时使其溶解完全。再将如主族金属离子、过渡金属离子或稀土金属离子配成稀的水溶液，在搅拌条件下缓慢加入体系中。然后在温度0～80℃范围内，反应2～12小时后，调节pH值在2～6之间，使之配位反应完全。再加入摩尔数与金属离子摩尔数相同或略大于金属离子摩尔数，浓度为0.01～25％的过氧化氢(H₂O₂)，在温度0～60℃之间，0.3～24小时之间氧化降解。再用0.1～10％稀碱(NaOH、Na₂CO₃等)调节pH值，使其中可生成氢氧化物沉淀的金属先完全沉淀，过滤除去；对于不生成氢氧化物沉淀的金属用络合剂沉淀后过滤除去；对金属钠离子等用交换树脂去除金属。将去除金属的母液经真空浓缩后既得到产品。最后将所得产品送去作层析分离，收集不同分子量段的组份，给出产物参数和指标。

为了更进一步的说明本发明壳聚糖金属配合物的形成与控制降解原理，现

以实施例加以详述。

实施例1：

取壳聚糖0.5克，以1∶2～5的比例溶于HAC和水的混合溶液中，使其完全

溶解后，采用酸碱滴定法测定其游离氨基保持在原加入量的78～86％。然后称取0.005～0.05醋酸铜Cu(OAc)₂·2H₂O，加入壳聚糖溶液中，送进搅拌器在10～60℃的温度下，搅拌20～140分钟，再加入0.6～25％的氧化剂(H₂O₂)水溶液，在0～60℃的温度下继续搅拌约1～360小时后得到降解络合物。然后将降解络合物pH值调至5-6之间(弱酸性)，再加进DMBTA(自合成铜Cu络合剂)生成Cu-DMBTA沉淀，过滤去除废金属。将得到的寡聚壳聚糖母液加入4～8％碳酸钠再次调节母液pH值至6～8，真空浓缩，得寡聚壳聚糖母液主要为2～6的寡糖。

实施例2：

将准备好的壳聚糖原料取出0.5克，加入1∶2～10的HAc和水混合溶液中，壳聚糖原料溶解后，采用酸碱滴定法测定以上壳聚糖混合溶液中的游离氨其数保持在78～86％，再取0.001～0.01M的铜Cu(Ac)₂·2H₂O加入到以上溶液中，送进搅拌器后，在温度5～55℃下搅拌，反应20分钟～20小时后，再加氧化剂，再次在0～55℃的温度下进行搅拌和降解络合物约20分钟～24小时，然后对得到的降解络合物进行调节其pH值至5～6(酸性)时，再采用一种自合成的铜(Cu)络合剂DMBTA去除废金属离子后得到寡聚壳聚糖母液，将母液送去过滤，并再次调节滤液pH值至7～8(中性)时，浓缩，最终得到主要成份为6～12的寡糖。

本发明壳聚糖金属配合物的形成与控制降解有以下优特点：

1、在原理上避开了目前工业生产中采用的以非特异性降解过程为机制的种种弊端和不足，人为的制造了特异性降解的氛围。

2、可通过选择不同半径、不同用量的金属离子与高聚壳聚糖形成配合物。再通过氧化断键降解方便的得到所需降解范围窄分子量分布的低聚壳聚糖。方法简便，易操作，所选用试剂廉价易得，所得产品在实际应用中稳定、可靠。

3、可满足工业化批量生产。

Claims

1、一种利用壳聚糖金属配合物氧化降解壳聚糖的方法，其特征在于：在温度为0～100℃和pH值为1～6的条件下，使壳聚糖与金属离子形成配合物，接着使用氧化剂在20分钟至76小时时间范围内降解壳聚糖，得到壳聚寡糖，其中氧化剂是过氧化氢，过氧化氢的用量是加入壳聚糖重量的0.01～25％。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用的原料壳聚糖是从水产养殖、海洋生物中的虾、蟹壳及昆虫、藻类和细菌生成的主要提取物之一甲壳素脱乙酰化的产物。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中可使用的金属离子包括：主族金属元素、过渡金属元素或稀土金属元素离子。

4、根据权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于在壳聚糖中加进0.1～10％(重量)的醋酸水溶液，在0～100℃的温度下，经过20分钟～48小时使壳聚糖溶解。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于其中主族金属元素离子、稀土金属元素离子或过渡金属元素离子在加入壳聚糖醋酸水溶液中时，其浓度为0.01～10％(重量)。