CN1163513C - 一种高效生产BPI-Fc重组蛋白的方法 - Google Patents
一种高效生产BPI-Fc重组蛋白的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1163513C CN1163513C CNB00107590XA CN00107590A CN1163513C CN 1163513 C CN1163513 C CN 1163513C CN B00107590X A CNB00107590X A CN B00107590XA CN 00107590 A CN00107590 A CN 00107590A CN 1163513 C CN1163513 C CN 1163513C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bpi
- recombinant protein
- prokaryotic expression
- expression carrier
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims description 84
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims description 84
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims abstract description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 46
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 28
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 9
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 7
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 4
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 3
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 3
- 235000003969 glutathione Nutrition 0.000 claims description 3
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 claims description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 108010066925 sleep-promoting factor B Proteins 0.000 claims description 3
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 claims description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 9
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 6
- 102100033735 Bactericidal permeability-increasing protein Human genes 0.000 abstract description 3
- 101000871785 Homo sapiens Bactericidal permeability-increasing protein Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract 3
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 abstract 2
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 abstract 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 abstract 1
- 102000052586 bactericidal permeability increasing protein Human genes 0.000 description 32
- 108010032816 bactericidal permeability increasing protein Proteins 0.000 description 32
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 18
- 230000006870 function Effects 0.000 description 15
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 14
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 10
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 8
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 8
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 8
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 7
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 6
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 5
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 101150043508 BPI gene Proteins 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 3
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022579 ATP dependent 26S protease Proteins 0.000 description 1
- 208000036762 Acute promyelocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 1
- 241001478240 Coccus Species 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011891 EIA kit Methods 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 241000239222 Tachypleus Species 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002070 germicidal effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001937 non-anti-biotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了采用原核表达系统表达由杀菌/渗透性增强蛋白(BPI)与免疫球蛋白重链恒定区(Fc)嵌合组成的BPI-Fc重组蛋白的高效生产方法，包括(1)、构建BPI-Fc嵌合基因表达载体；(2)、BPI-Fc重组蛋白在原核宿主细胞中表达；本发明还公开了在原核表达系统表达BPI-Fcγ1重组蛋白过程中的特异表达载体；本发明对研制新型高效抗感染生物制剂具有重要价值，在制药行业具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域重组蛋白的高效生产方法及其应用。
背景技术
细菌耐药是临床抗感染治疗中遇到的最为严重和棘手的问题，迄今尚未获得有效的解决办法。来自临床的研究报导指出，感染患者中约半数以上为革兰氏阴性(G-)菌感染，其中发展为G-菌败血症(GNS)引起休克死亡的比率也相对较高[Dahlberg PS，Acton RD and Battafarano RJ.J Surg Res.63：44-8(1996)]。目前传统抗菌素治疗[Verhoef J，Hustinx WM，Frase H and Hoepelman AI.JAntimicrob Chemother.38(2)：167-82(1996)]和采用抗脂多糖类脂A/内核心单克隆抗体或抗IL-1/TNF单克隆抗体进行免疫治疗[Mccloskey RU，Straube RC，Sander C et al.Ann Intern Med.121：1(1994)]，效果均不理想。
杀菌/渗透增强蛋白(Bactericidal/Permeability Increasing Protein，BPI)是在多形核白细胞中发现的一种56kd的阳离子抗菌糖蛋白[Weiss J，Elsbach P andOlson I et al.J Biol Chem.253：2664-72(1978)]，随后重组BPI及其N端功能片段相继研制成功[Gazzano-Santoro et al，Infect.Immun.60：4754-4761(1992)]。研究表明，上述重组蛋白与天然BPI具有完全相同的生物功能，即对细菌脂多糖和类脂A有很高的亲合力，它们不仅能非特异性杀伤G-菌，并可中和其内毒素，具有广阔的临床应用前景[Liu Y，Ammons WS and Leach WJ et al.Shock.2：324-31(1994)]。但初步应用结果表明，重组BPI及其N端功能片段作为抗感染生物制剂，易被蛋白酶降解而不稳定，在体内血清半衰期短(小于60分钟)，因而影响其临床疗效[Robert JB，Kenneth D and Nneka OI et al.Pharm-Res.14(2)：224-9(1997)]。
Ig样重组蛋白是应用基因工程技术产生的由某种蛋白或功能多肽片段与免疫球蛋白(Ig)或其重链恒定区(Fc)片段嵌合组成的杂合蛋白，它不仅不易被蛋白酶降解、稳定性好、在血清中半衰期长，而且具有该种蛋白或功能多肽所特有的生物功能，并具有免疫球蛋白的激活补体和调理作用等特性[Hodges TL.etal.Antimicro-Agonts-Chemother.35：2580-2586.(1991)]。由BPI或其N端功能片段与免疫球蛋白Fc片段或其等位体嵌合组成的Ig样重组蛋白(称为BPI-Fc)，在具备较好稳定性和较长血清半衰期的同时，具有BPI广谱杀伤G-菌和中和内毒素作用，并可通过Fc激活补体和调理作用增强BPI的杀菌作用，是一种理想的新型非抗生素类抗感染生物制剂。
Ig样重组蛋白具有分子较大、二硫键多、结构和功能复杂等特点，一般均采用真核表达系统表达，以便通过糖基化修饰和自然折叠，产生具有天然蛋白或其功能片段生物功能的糖基化重组蛋白；但真核表达系统存在表达量低、成本高等问题，因而影响其实际应用。BPI或其功能片段和Fc片段上均有糖基化位点[Gray PW.et al.J Biol Chem.264：9505-9509.(1989)]，而原核宿主细胞不对表达的蛋白进行糖基化修饰，迄今未见采用原核表达系统生产BPI-Fc重组蛋白的报导。但原核表达系统具有表达量高、成本低等优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用原核表达系统表达BPI-Fc重组蛋白的高效生产方法。
本发明的技术方案为：一种BPI-Fc重组蛋白的高效生产方法，包括以下步骤：
(1)、应用重组DNA技术，构建BPI-Fc重组蛋白原核表达载体pBV-BPI-Fcγ1，它包含BPI-Fc嵌合基因，由原核表达载体上的原核表达调控元件调控；把pBV-BPI-Fcγ1转化E.coli DH5α构建BPI-Fcγ1重组蛋白表达工程菌(保藏号：CGMCC No.0450)；
(2)、BPI-Fc重组蛋白原核表达载体转化原核宿主细胞大肠杆菌，构建BPI-Fc重组蛋白表达工程菌：在30℃发酵培养工程菌至OD值约0.4-0.6后，变温至42℃继续培养6小时以温控诱导表达BPI-Fcγ1重组蛋白；用超声破碎菌体，洗涤、离心收集重组蛋白包涵体，用含8M尿素裂解液溶解包涵体；用Sephadex G-100凝胶层析提取重组蛋白；分步稀释并在含5mM还原型谷胱甘肽/2mM氧化型谷胱甘肽复性液中复性；用Protein A亲和层析纯化回收复性的BPI-Fcγ1重组蛋白。
所述BPI-Fc嵌合基因为BPI-Fcγ1嵌合基因，由BPI1-199功能片段基因和人IgG1重链恒定区Fcγ1基因嵌合组成，其中连接5’端BPI1-199功能片段基因与3’端Fcγ1基因的铰链区核苷酸序列描述为5’...GAAGCTTCTAC...3’；在5’端BPI1- 199功能片段基因前加入含EcoR I位点和起始密码ATG的核苷酸序列为5’GAATTCATG 3’；在3’端Fcγ1基因后采用TAA作为终止密码。
本发明的另一个目的是提供一种高效生产BPI-Fc重组蛋白的表达载体。
本发明的这一目的是这样实现的：一种BPI-Fc重组蛋白原核表达载体，它包含BPI-Fc嵌合基因，由原核表达载体上的原核表达调控元件调控：
所述BPI-Fc嵌合基因由人BPI1-199功能片段基因和人IgG1重链恒定区Fcγ1基因嵌合组成，其中嵌合位点对应的铰链区氨基酸序列描述为：EAS：TCPPCPAPELL...；
所述的原核表达载体包括温控型原核表达载体pBV220，对应的BPI-Fc重组蛋白特异原核表达载体为pBV-BPI-Fcγ1(保藏号：CGMCC No.0450)。
本发明应用基因工程技术在原核宿主细胞中高效表达了BPI-Fc重组蛋白，表达产生的重组蛋白是非糖基化重组蛋白，经实验验证，首次发现原核表达系统表达产生的非糖基化BPI-Fc重组蛋白具有BPI的生物功能和Fc的生物功能，可通过激活补体和调理作用极大增强杀伤G-菌的作用。因此本发明对研制新型高效抗感染生物制剂具有重要价值，在制药行业具有广阔的应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明。
图I为Sepharose CL-4B Protein A亲和层析提纯BPI-Fcγ1的单一洗脱峰
图2为亲和层析纯化的BPI-Fcγ1的SDS-PAGE电泳分析
图3表示补体对BPI-Fcγ1重组蛋白杀伤G-菌的增强作用
图4表示白细胞对BPI-Fcγ1重组蛋白杀伤G-菌的增强作用
具体实施方式
实施例：
一、BPI功能片段基因和Fcγ1片段基因的克隆
1.BPI功能片段基因的克隆：从早幼粒细胞白血病HL-6细胞系(ATCC CCL240)中提取mRNA，用设计合成的人BPI基因引物(P1 5’CAGAATTCATGGTCAACCCTGGCGTCGTG 3’和P2 5’GCAAGCTTCTATTTTGGTCATTACTGGCAG 3’)进行RT-PCR扩增(48℃逆转录45分钟后进行35个循环PCR扩增，循环参数为94℃变性30秒、53.5℃复性40秒、72℃延伸45秒)，得到约620bp的BPI基因片段BPI620；用EcoR I/Hind III双酶切BPI620得到约200bp的BPI基因片段BPI200(EcoR I/EcoR I粘性末端)和约420bp的BPI基因片段BPI420(EcoR I/HindIII粘性末端)；按照分子克隆操作方法[Sambrook J.et al.Molecular cloning：alaboratory manual，second edition，1989，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork.]，将BPI200和BPI420分别克隆到PUC18质粒的EcoRI位点和EcoR I/HindIII双酶切位点上得到PUC18-BPI200和PUC18-BPI420。
2.Fcγ1片段基因的克隆：从正常人外周血白细胞中提取mRNA，用设计合成的人IgG1的Fcγ1片段基因引物(P3 5’GTAAGCTTCTACATGCCCACCGTGCCCAG 3’和P4 5’TCGGATCCTTATTTACCCGGAGACAGGGAG 3’)进行RT-PCR扩增(48℃逆转录45分钟后进行35个循环PCR扩增，循环参数为94℃变性30秒、56℃复性40秒、72℃延伸45秒)，得到约700bp的Fcγ1基因片段Fcγ1 700；Fcγ1700经Hind III/BamH I双酶切后克隆到PUC18的Hind III/BamH I双酶切位点上得到PUC18-Fcγ1700。
二、pBV-BPI-Fcγ1表达载体的构建
按照分子克隆操作方法，把PUC18-BPI420上的EcoR I/Hind III双酶切片段BPI420和PUC18-Fcγ1700上的Hind III/BamH I双酶切片段Fcγ1700共连接到pBV220表达载体[张智清等.病毒学报，6：111，(1990)]的EcoR I/BamH I双酶切位点上，得到表达载体中间体pBV-BPI420-Fcγ1；再把PUC18-BPI200上的EcoR I酶切片段BPI200连接插入到pBV-BPI420-Fcγ1的EcoRI位点上，筛选得到正向插入BPI-Fcγ1嵌合基因的表达载体pBV-BPI-Fcγ1。经过双脱氧核苷酸末端终止法测序，构建于pBV-BPI-Fcγ1上的BPI-Fcγ1嵌合基因的读码框架准确无误；其中连接5’端BPI1-199功能片段基因与3’端Fcγ1基因的铰链区(hinge)核苷酸序列描述为5’...GAAGCTTCTAC...3’，对应位置的BPI-Fcγ1重组蛋白铰链区(hinge)的氨基酸序列描述为...：EAS：TCPPCPAPELL...；在5’端BPI1-199功能片段基因前加入含EcoR I位点和起始密码ATG的核苷酸序列为5’GAATTCATG 3’；在3端’Fcγ1基因后含采用的TAA终止密码和加入的BamH I位点的序列为5’TAAGGATCC3’。
三、BPI-Fcγ1重组蛋白在E.coli中高效表达
把表达载体pBV-BPI-Fcγ1转化原核宿主细胞E.coli DH5α[基因型supE44lacU169(Φ801acI M15)hsdR17 recA1 end A1 gyrA96 thi-1 relA1](保藏号：CGMCC No.0450)，在30℃LB培养基中培养至OD值约0.4-0.6时，立即转入42℃中温控诱导表达，6小时后离心收集细菌；细菌经裂解后进行SDS-PAGE电泳分析，经薄层扫描凝胶分析，BPI-Fcγ1的表达量达菌体总蛋白的25％。所用的大肠杆菌宿主细胞也可以是其它的大肠杆菌品种(如E.coliHB101、JM109等)。
四、BPI-Fcγ1重组蛋白的提纯
超声破碎诱导表达后离心收集的菌体，经洗涤、离心收集包涵体沉淀；把包涵体溶于含8M尿素的裂解液中，进行Sephadex G-100凝胶层析初步提取，收集BPI-Fcγ1重组蛋白洗脱峰；将洗脱峰分步稀释并在含5mM还原型谷胱甘肽/2mM氧化型谷胱甘肽复性液中复性；用Sepharose CL-4B Protein A亲和层析提纯复性的BPI-Fcγ1重组蛋白，如图1所示，得到并收集重组蛋白单一洗脱峰1；经SDS-PAGE电泳分析，如图2所示，纯化的非糖基化BPI-Fcγ1重组蛋白在还原条件下为单一48kd谱带2。同时，还可以利用Fc片段亲和结合特性，应用其它亲和层析介质的亲和层析方法提纯BPI-Fc重组蛋白。
五、BPI-Fcγ1重组蛋白的ELISA分析
1.抗BPI抗体对BPI-Fcγ1重组蛋白的鉴定：取100μl不同稀释度的BPI-Fcγ1包被聚苯乙烯板，4℃过夜；洗涤，各孔加入100μl兔抗人BPI抗体，37℃作用30分钟；洗涤，各孔加入100μl HRP标记的羊抗兔IgG抗体，37℃作用30分钟；洗涤，加入100μlTMB底物，37℃作用10分钟后，加入50μl终止液终止反应，测OD值(450nm)。试验用Anti-BPI EIA Kit(Lot：030361，THEBINDING SITE，Birmingham，UK)中的BPI COATED WELLS(Code：EA141)作为阳性对照。结果表明：抗BPI抗体可特异性结合BPI-Fcγ1重组蛋白(表1)，证实该重组蛋白具有BPI结构。表1
| 重组蛋白浓度(μg/ml) | 25 | 12.5 | 6.25 | 3.125 | 1.56 | 阴性对照 | 阳性对照 |
| OD值 | 1.081 | 0.860 | 0.698 | 0.456 | 0.265 | 0.087 | 0.796 |
2.抗Fcγ1抗体对BPI-Fcγ1重组蛋白的鉴定：用100μl兔抗人BPI抗体包被聚苯乙烯板，4℃过夜；洗涤，各孔加入100μl不同稀释度的BPI-Fcγ1，37℃作用30分钟；洗涤，各孔加入100μlHRP标记的羊抗人IgG抗体，37℃作用30分钟；洗涤，加入100μlTMB底物，37℃作用10分钟后，加入50μl终止液终止反应，测OD值(450nm)。试验用稀释人血清作为阳性对照。结果表明：抗Fcγ1抗体可特异性结合BPI-Fcγ1重组蛋白(表2)，证实该重组蛋白具有Fcγ1结构。
表2
| 重组蛋白浓度(μg/ml) | 25 | 12.5 | 6.25 | 3.125 | 1.56 | 阴性对照 | 阳性对照 |
| OD值 | 0.642 | 0.370 | 0.198 | 0.178 | 0.156 | 0.076 | 0.742 |
六、BPI-Fcγ1重组蛋白对LPS的中和作用
用50μl不同稀释度的BPI-Fcγ1与50μl(1Eu/ml)纯化LPS混匀，37℃水浴60分钟；加入50μl鲎试剂混匀，37℃水浴25分钟；加入50μl显色基质鲎三肽混匀，37℃水浴3分钟；再加入偶氮试剂混匀显色，测OD值(545nm)。同时设阳性对照(只含LPS，不含BPI-Fcγ1)和阴性对照(只含BPI-Fcγ1，不含LPS)。结果表明：OD值与BPI-Fcγ1含量呈负相关(表3)，证实该重组蛋白具有中和内毒素的作用。
表3
| 重组蛋白浓度(μg/ml) | 200 | 25 | 12.5 | 6.25 | 3.125 | 1.56 | 阴性对照 | 阳性对照 |
| OD值 | 0.108 | 0.214 | 0.292 | 0.461 | 0.611 | 0.691 | 0.110 | 0.754 |
七、补体对BPI-Fcγ1重组蛋白杀伤G-菌的增强作用
本试验用E.coli(CMCC No.44101)作为杀伤靶细菌，按104/ml配成菌液。本试验分为四组，即细菌对照组、补体对照组、重组蛋白对照组和重组蛋白加补体试验组。细菌对照组：取100μl菌液加100μl生理盐水混匀，37℃水浴1小时，菌液均匀涂布四块平板(50μl/平板)，37℃16小时，菌落计数。补体对照组：取100μl菌液与100μl豚鼠新鲜血清混匀，37℃水浴1小时，菌液均匀涂布四块平板(50μl/平板)，37℃16小时，菌落计数。重组蛋白对照组：取100μl菌液分别与100μl不同稀释度BPI-Fcγ1混匀，37℃水浴16小时，每管菌液均匀涂布四块平板(50μl/平板)，37℃16小时，菌落计数。重组蛋白加补体试验组：取100μl菌液分别与100μl不同稀释度BPI-Fcγ1混匀，37℃水浴16小时，每管各加100μl豚鼠新鲜血清混匀，37℃水浴1小时，每管菌液均匀涂布四块平板(50μl/平板)，37℃16小时，菌落计数。结果表明：在补体参与下，可极大增强BPI-Fcγ1重组蛋白对细菌的杀伤作用。如图3所示，横坐标为重组蛋白浓度(μg/ml)，纵坐标为菌落数，3为细菌对照组，4为补体对照组，5、7、9、11为重组蛋白对照组，6、8、10、12为重组蛋白加补体试验组。
八、白细胞对BPI-Fcγ1重组蛋白杀伤G-菌的增强作用
本试验用E.coli(CMCC No.44101)作为杀伤靶细菌，按104/ml配成菌液。试验分为四组，即细菌对照组、白细胞对照组、重组蛋白对照组和重组蛋白加白细胞试验组。细菌对照组：取100μl菌液加100μl生理盐水混匀，37℃水浴1小时，菌液均匀涂布四块平板(50μl/平板)，37℃16小时，菌落计数。白细胞对照组：取100μl菌液与100μl白细胞(105/ml)混匀，37℃水浴1小时，菌液均匀涂布四块平板(50μl/平板)，37℃16小时，菌落计数。重组蛋白对照组：取100μl菌液分别与100μl不同稀释度BPI-Fcγ1混匀，37℃水浴3小时，每管菌液均匀涂布四块平板(50μl/平板)，37℃16小时，菌落计数。重组蛋白加白细胞试验组：取100μl菌液分别与100μl不同稀释度BPI-Fcγ1混匀，37℃水浴3小时，每管各加100μl白细胞(105/ml)混匀，37℃水浴1小时，每管菌液均匀涂布四块平板(50μl/平板)，37℃16小时，菌落计数。结果表明：在白细胞参与下，可极大增强BPI-Fcγ1重组蛋白对细菌的杀伤作用。如图4所示，横坐标为重组蛋白浓度(μg/ml)，纵坐标为菌落数，13为细菌对照组，14为白细胞对照组，15、17、19为重组蛋白对照组，16、18、20为重组蛋白加白细胞试验组。
本发明表明，非糖基化BPI-Fcγ1重组蛋白具有BPI和Fc的结构和生物功能。采用原核表达系统表达产生由BPI或其N端功能片段(包含BPI N端功能片段中的糖基化位点)与各种免疫球蛋白(如IgG其它亚型，IgA，IgM等)Fc片段或其等位体嵌合组成的BPI-Fc重组蛋白时，同样可以产生具有BPI的结构和生物功能并具备Ig样重组蛋白不易被蛋白酶降解、稳定性好、在血清中半衰期长等特性的非糖基化BPI-Fc重组蛋白，对研制新型高效的BPI抗感染生物制剂、改善BPI作为抗感染生物制剂的临床疗效具有重要价值；因此，嵌合组成BPI-Fc重组蛋白的BPI或其N端功能片段和各种免疫球蛋白Fc片段或其等位体适用于本发明。再者，原核宿主细胞不对表达的蛋白进行糖基化修饰，同理，应用各种原核宿主细胞(如枯草杆菌、格氏链球菌等)均可表达产生有生物功能的非糖基化BPI-Fc重组蛋白；因此，各种原核表达系统的原核宿主细胞和对应的可稳定转化并表达BPI-Fc重组蛋白的表达载体及其构建方法也适用于本发明。
Claims (2)
1、一种BPI-Fc重组蛋白原核表达载体，其特征在于：它包含BPI-Fc嵌合基因，由原核表达载体上的原核表达调控元件调控：
所述BPI-Fc嵌合基因由人BPI1-199功能片段基因和人IgG1重链恒定区Fcγ1基因嵌合组成，其中嵌合位点对应的铰链区氨基酸序列描述为：EAS:TCPPCPAPELL...；
所述的原核表达载体包括温控型原核表达载体pBV220，对应的BPI-Fc重组蛋白特异原核表达载体为pBV-BPI-Fcγ1(保藏号：CGMCC No.0450)。
2、一种BPI-Fc重组蛋白的高效生产方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)、应用重组DNA技术，构建权利要求1所述的BPI-Fc重组蛋白原核表达载体：构建权利要求1所述的特异原核表达载体pBV-BPI-Fcγ1；把pBV-BPI-Fcγ1转化E.coli DH5α构建BPI-Fcγ1重组蛋白表达工程菌(保藏号：CGMCC No.0450)；
(2)、BPI-Fc重组蛋白原核表达载体转化原核宿主细胞大肠杆菌，构建BPI-Fc重组蛋白表达工程菌：在30℃发酵培养工程菌至OD值约0.4-0.6后，变温至42℃继续培养6小时以温控诱导表达BPI-Fcγ1重组蛋白；用超声破碎菌体，洗涤、离心收集重组蛋白包涵体，用含8M尿素裂解液溶解包涵体；用Sephadex G-100凝胶层析提取重组蛋白；分步稀释并在含5nM还原型谷胱甘肽/2mM氧化型谷胱甘肽复性液中复性；用Protein A亲和层析纯化回收复性的BPI-Fcγ1重组蛋白。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB00107590XA CN1163513C (zh) | 2000-05-22 | 2000-05-22 | 一种高效生产BPI-Fc重组蛋白的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB00107590XA CN1163513C (zh) | 2000-05-22 | 2000-05-22 | 一种高效生产BPI-Fc重组蛋白的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1324803A CN1324803A (zh) | 2001-12-05 |
| CN1163513C true CN1163513C (zh) | 2004-08-25 |
Family
ID=4578802
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB00107590XA Expired - Fee Related CN1163513C (zh) | 2000-05-22 | 2000-05-22 | 一种高效生产BPI-Fc重组蛋白的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1163513C (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1733911A (zh) * | 2004-08-13 | 2006-02-15 | 首都医科大学 | 一种包含bpi基因的重组病毒及含有其的药物组合物及其用途 |
| CN102462838A (zh) * | 2010-11-15 | 2012-05-23 | 沈浩 | 快速高效工业化生物疫苗生产系统 |
| CN102559750B (zh) * | 2011-11-25 | 2014-03-12 | 佛山安普泽生物医药有限公司 | 一种抗体的高效表达载体及其制备方法 |
| CN109762841B (zh) * | 2018-11-19 | 2021-03-02 | 厦门联合安金生物工程有限公司 | BPI-Fc融合蛋白及其用途 |
| CN109762791B (zh) * | 2018-11-19 | 2021-02-09 | 厦门联合安金生物工程有限公司 | 包含BPI-Fc嵌合基因的重组腺病毒及其用途 |
-
2000
- 2000-05-22 CN CNB00107590XA patent/CN1163513C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1324803A (zh) | 2001-12-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Doering et al. | Melanin as a potential cryptococcal defence against microbicidal proteins | |
| CN111892646B (zh) | 抗菌肽衍生物及其在制备抗细菌感染药物中的应用 | |
| CN114181293B (zh) | 一种人源抗菌肽ll-37改造体及其应用 | |
| Kanost et al. | Peptidoglycan fragments elicit antibacterial protein synthesis in larvae of Manduca sexta | |
| Lakhtin et al. | Lectins of beneficial microbes: system organisation, functioning and functional superfamily | |
| Oh et al. | Activities of synthetic hybrid peptides against anaerobic bacteria: aspects of methodology and stability | |
| Osada et al. | Polymorphonuclear leukocyte activation by a synthetic muramyl dipeptide analog | |
| CN112625107A (zh) | 一种绿海龟抗菌肽的改造体抗菌肽c-cm8及其制备方法和应用 | |
| CN1163513C (zh) | 一种高效生产BPI-Fc重组蛋白的方法 | |
| Tsubery et al. | Neopeptide antibiotics that function as opsonins and membrane-permeabilizing agents for gram-negative bacteria | |
| CN112625109A (zh) | 一种绿海龟抗菌肽的改造体抗菌肽c-cm6及其制备方法和应用 | |
| CN112625108A (zh) | 一种绿海龟抗菌肽的改造体抗菌肽c-cm5及其制备方法和应用 | |
| Vassallo et al. | Vitronectin and fibronectin function as glucan binding proteins augmenting macrophage responses to Pneumocystis carinii | |
| CN102603885B (zh) | 防御素及其在制备抗菌药物中的应用 | |
| US20080241281A1 (en) | Compositions & methods for activation and inhibition of Staphylococcus aureus biofilm development | |
| US5703040A (en) | Broad spectrum antibiotic peptide | |
| CN113956340B (zh) | 一种衍生自羊源抗菌肽rlr及其制备方法和应用 | |
| CN114686462B (zh) | 能瓦解细菌生物被膜和杀灭细菌的蛋白酶LasA及应用 | |
| CN103131686A (zh) | 一种二型肽聚糖识别蛋白及其制备和应用 | |
| CN102516392A (zh) | 一种癌靶向超抗原融合蛋白及制备方法及用途 | |
| Kotecha et al. | Microbial lectins: Roles and applications | |
| CN113999297B (zh) | 一种抗菌肽hrNCM及其制备方法与应用 | |
| CN115043924A (zh) | 一种改造体抗菌肽及其应用 | |
| CN109627285B (zh) | 迦得拟微绿球藻抗菌肽及其应用 | |
| CN113185593A (zh) | 长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6、制备方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20040825 Termination date: 20110522 |