CN109762841B - BPI-Fc融合蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制药领域。具体的，本发明涉及一种BPI‑Fc融合蛋白作为耐药革兰氏阴性菌感染治疗药物的用途；所述BPI‑Fc融合蛋白包含人BPI功能片段和人免疫球蛋白重链恒定区Fc或其等位体。所述BPI‑Fc融合蛋白可直接杀伤、并通过激活补体和调理吞噬快速高效杀伤耐药革兰氏阴性菌，可用于制备治疗耐药革兰氏阴性菌感染的药物组合物。本发明还涉及作为耐药革兰氏阴性菌感染治疗药物的BPI‑Fcγ1融合蛋白的高效表达和制备方法。
Description
发明领域
本发明涉及生物制药领域。具体的，本发明涉及一种BPI-Fc融合蛋 白作为耐药革兰氏阴性菌感染治疗药物的用途；所述BPI-Fc融合蛋白包 含人BPI功能片段和人免疫球蛋白重链恒定区Fc或其等位体。所述 BPI-Fc融合蛋白可直接杀伤、并通过激活补体和调理吞噬快速高效杀伤 耐药革兰氏阴性菌，可用于制备治疗耐药革兰氏阴性菌感染的药物组合物。本发明还涉及作为耐药革兰氏阴性菌感染治疗药物的BPI-Fcγ1融合 蛋白的高效表达和制备方法。
发明背景
抗生素耐药对公共卫生及人类健康构成重大威胁，近年来WHO呼 吁并引起全世界重视应对全球耐药感染问题，警示人类将进入后抗生素 时代[ANTIMICROBIAL RESISTANCEGlobal Report on surveillance 2014，WHO]。WHO引用英国Jim O’Neill发表的[Antimicrobial Resistance on the Global Agenda.Dec 1,2015]估计，在全世界范围内每年 大约有70万人死于耐药性细菌感染，如果不采取有效的措施，预计到 2050年每年会有1000万人死于耐药性细菌感染。细菌多重耐药和超级耐 药问题日益突出，其中作为引起人类感染性疾病的主要病原之一的革兰 氏阴性菌(Gram-negative bacteria，GNB)对临床常用抗生素有很强的 耐药性，是当前最受关注的耐药菌 [https://en.wikipedia.org/wiki/Antimicrobial_resistance]。2017年WHO 首次公布对人类健康构成最大威胁的12种耐药细菌名单，其中9种为革 兰氏阴性菌[Nature 543,15(02March 2017)doi:10.1038/nature.2017. 21550][https://news.un.org/zh/story/2017/02/271472]。特别指出：2009 年在肺炎克雷伯菌中发现了质粒介导的超级碳青霉烯耐药基因NDM-1， 2015年在大肠埃希氏菌中发现了质粒介导的超级黏菌素耐药基因mcr-1 [Antimicrob AgentsChemother.2009；53(12):5046][Lancet Infect Dis. 2010；10(9):597][Lancet InfectDis.2016；16(2):161]，这几乎使临床治疗 革兰氏阴性菌感染的抗生素最后防线全线失守。随着抗生素耐药日益严 重和即将到来的后抗生素时代，研发抗生素替代生物药物具有紧迫性和 巨大应用前景。
发明概述
本发明的一个方面，提供了一种BPI-Fc融合蛋白用于治疗耐药革兰 氏阴性菌感染的用途。具体地，本发明提供了一种BPI-Fc融合蛋白在制 备用于治疗耐药革兰氏阴性菌感染的药物中的用途。本发明所述的 BPI-Fc融合蛋白包含人BPI功能片段和人免疫球蛋白重链恒定区Fc或 其等位体，优选地，所述人BPI功能片段的C端与所述人免疫球蛋白重 链恒定区Fc或其等位体的N端连接。优选地，在本发明的融合蛋白中， 人BPI功能片段和人免疫球蛋白重链恒定区Fc或其等位体通过人免疫球 蛋白铰链区连接。
在具体的实施方式中，本发明所述人BPI功能片段选自选自人BPI1-199片段和人BPI1-193片段，优选为人BPI1-199片段。
在具体的实施方式中，本发明所述人免疫球蛋白重链恒定区Fc选自 Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cα1、Cα2和Cμ或其等位体；优选Fcγ1。
在具体的实施方式中，所述的耐药革兰氏阴性菌选自耐药大肠埃希 氏菌、耐药鲍曼不动杆菌和耐药肺炎克雷伯菌。
在具体的实施方式中，所述的耐药革兰氏阴性菌携带耐药基因，所 述耐药基因是超广谱耐药基因ESBLs或超级耐药基因NDM-1。
因此，本发明提供了BPI-Fc融合蛋白用于治疗耐药革兰氏阴性菌感 染的用途，以及在制备用于治疗耐药革兰氏阴性菌感染的药物中的用途， 优选地，所述耐药革兰氏阴性菌选自耐药大肠埃希氏菌、耐药鲍曼不动 杆菌和耐药肺炎克雷伯菌。在一个具体的方面，本发明提供了BPI-Fc融 合蛋白用于治疗耐药革兰氏阴性菌感染的用途，以及在制备用于治疗耐 药革兰氏阴性菌感染的药物中的用途，其中所述的耐药革兰氏阴性菌携 带耐药基因，所述耐药基因是超广谱耐药基因ESBLs或超级耐药基因 NDM-1。
在另外一个方面，本发明还提供了所述的BPI-Fc融合蛋白用于制备 治疗耐药革兰氏阴性菌感染的药物组合物的用途，所述药物组合物含有 治疗有效量的所述的BPI-Fc融合蛋白，以及药学可接受的载体。
本发明的BPI-Fcγ1融合蛋白，可直接杀伤、并通过激活补体和调理 吞噬快速高效杀伤多重耐药革兰氏阴性菌，并且所述的BPI-Fcγ1融合蛋 白在体内多重耐药革兰氏阴性菌感染模型动物治疗中取得了成功。
发明详述
杀菌/渗透增强蛋白(Bactericidal/permeablity increasing protein,BPI) 是1978年Weiss等首次在人多形核中性粒细胞中发现的一种分子量约为 55KD阳离子抗菌蛋白，该抗菌蛋白由456个氨基酸残基组成；其N端 功能片段(N端区域第1-199个氨基酸残基的BPI1-199片段及其C端截短 6个氨基酸的第1-193氨基酸残基的BPI1-193片段)具有与人天然BPI相 同的高亲和力结合革兰氏阴性菌的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和 类脂A、中和内毒素(Endotoxin)和直接杀伤革兰氏阴性菌的作用。 XOMA公司自1990s开始研发重组人BPI N端功能片段(
rBPI21)并开展了多项临床试验，但因BPI杀菌需持续较长时间(>3小时) 维持较高浓度(>10nM)，而rBPI21体内半衰期短、治疗剂量大、难以在 体内持续维持有效治疗浓度等因素，终未取得临床成功而未获FDA批准。[J.Biol.Chem.253:2664(1978)][J Biol Chem.264:9505(1989)][J.Exp. Med.174:649(1991)][J Clin Invest.90:1122(1992)][Cazzola,et al. Curr Opin Pulm Med,10:204(2004)][Mannion,et al.J.Clin.Investig. 85:853(1990)][Shock.10:161(1998)][J.Trauma.46:667(1999)] [Lancet.356:961(2000)][Crit Care Med 2001 29(7)(Suppl.):S130-S135] [ASM News.68:543(2002)]。
免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)包括一个具有许多相似结构但重 要结构不同的蛋白家族,这些不同的重要结构导致不同的抗原结合特性 和其他生物学活性。人Ig可分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE五类，其 中IgG，IgA和IgM这三类还有亚类、在抗感染免疫防御中起重要作用。 IgG的重链恒定区Fc(Fragment crystallizable,Fc)：Cγ1、Cγ2和Cγ3具有激活补体和介导调理吞噬双重功能；IgA的重链恒定区Fc：Cα1、Cα2 具有介导调理吞噬功能；IgM的重链恒定区Fc：Cμ具有强大的激活补 体功能并能通过C1b与巨噬细胞结合以促进吞噬(虽不能独立调理吞噬)。 [Medical Immunology ISBN:9787117208215]
由BPI或其N端功能片段与Ig重链恒定区Fc或其等位体嵌合组成 的Ig样BPI-Fc融合蛋白，可兼备BPI和免疫球蛋白Fc双重功能，即具 有BPI靶向结合LPS和类脂A并直接杀伤革兰氏阴性菌，还具有通过 Fc激活补体和调理吞噬快速杀伤革兰氏阴性菌，其作用机制能克服革兰 氏阴性菌耐药。
本发明构建了一种BPI-Fcγ1融合蛋白的高效表达载体 pSCm-BPI-Fcγ1并在哺乳动物细胞中高效表达BPI-Fcγ1融合蛋白。本 发明证实：BPI-Fcγ1融合蛋白在体外可直接杀伤、并通过激活补体和调 理吞噬快速高效杀伤耐药革兰氏阴性菌，并且在小鼠和人新鲜全血中杀 伤多重耐药革兰氏阴性菌，而且在体内耐药革兰氏阴性菌感染模型动物 治疗中取得了成功。
下面就本发明的目的和实施做进一步阐述，本领域的技术人员对本 发明的所涉及的范围、内容和优点是显而易见的。尽管本发明提供了优 选的实施例，本领域的技术人员将认识到各种修改和变化也在本说明的 范围内。因此，附加权利要求和将来的任何修正均在所述范围内。
BPI N端功能片段BPI1-199及其C端截短6个氨基酸的BPI1-193具有 与人天然BPI相同的中和内毒素和直接杀伤革兰氏阴性菌的作用，本发 明实施例中优选BPI1-199。
IgG Fc：Cγ1、Cγ2和Cγ3具有激活补体和介导调理吞噬双重功能； IgA Fc：Cα1、Cα2具有介导调理吞噬功能；IgM Fc：Cμ具有强大的激 活补体功能并能通过C1b与巨噬细胞结合以促进吞噬(但不能独立调理 吞噬)。本发明实施例中优选抗感染中起重要作用、具有激活补体和介导 调理吞噬双重功能的IgG1重链恒定区Fcγ1。
本发明实施例中优选耐药革兰氏阴性菌如下：
1.E.coli pBR322/BL21(DE3)
耐药基因(抗生素抗性基因)：ampR和tetR
耐药抗性：ampicillin、tetracycline
2.E.coli pET28a-EGFP/BL21(DE3)
耐药基因：kanR
耐药抗性：kanamycin
3.鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)ATCC BAA-1605(多重 耐药)
耐药抗性：ceftazidime、gentamicin、ticarcillin、piperacillin、 aztreonam、cefepime、ciprofloxacin、imipenem和meropemem
4.肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 700603(具有荚 膜)(多重耐药，ESBLs)
耐药基因：Klebsiella pneumoniae plasmid-encoded extended-spectrumbeta-lactamase(bla SHV-18)gene
耐药抗性：ampicillin、aztreonam、cefoxitin、cefpodoxime、ceftazidime、chloramphenicol、piperacillin、tetracycline
5.大肠埃希氏菌(Escherichia coli)(NDM-1)ATCC BAA-2469
耐药基因：New Delhi metallo-beta-lactamase(NDM-1)(blaNDM-1 超级耐药基因)
耐药抗性：Carbepenem-resistant(imipenem和ertapenem)
2017年2月27日WHO发表了全球首份抗生素耐药“重点病原体” 清单，即对人类健康构成最大威胁的12种细菌种族(Families)的目录， 以指导和促进新型抗生素的研究与开发，努力解决日益严重的全球抗微 生物药物耐药性问题。WHO根据对新型抗生素的迫切需求程度将清单 分为极为重要、十分重要和中等重要三个类别。最为重要的一组包括在医院、养老院以及需要用通气机和血液导管等装置进行护理的患者中带 来特定威胁的一些耐多药细菌，包括不动杆菌属、假单胞菌属和各种肠 杆菌科，包括克雷伯氏菌属、大肠杆菌、沙雷氏菌属和变形杆菌属。这 些细菌可引起严重且常常致命的感染，例如血流感染和肺炎，而且已经 对大量抗生素产生了耐药性，包括碳青霉烯类和目前用于治疗耐多药细菌的最佳可用抗生素——第三代头孢菌素类药物。清单中的第二和第三 个层级中含有其他一些日益出现耐药并引起更常见疾病的细菌，例如淋 病和由沙门氏菌引起的食物中毒。本发明实施例中优选的耐药革兰氏阴 性菌及其耐药机制符合上述极为重要类别，并具有各类别多重耐药(包 括耐药基因)的广泛代表性；其中，多重耐药涉及：Resistant toampicillin, tetracycline(四环素类),kanamycin(氨基糖甙类),aztreonam,cefoxitin,cefpodoxime,ceftazidime,chloramphenicol,piperacillin,gentamicin(氨 基糖甙类),ticarcillin,cefepime,ciprofloxacin(喹诺酮类),meropemem, imipenem,ertapenemand carbepenem；耐药基因涉及：ampR,tetR, kanR,extended-spectrum beta-lactamasebla SHV-18,New Delhi metallo-beta-lactamase NDM-1。
综上，本发明所述的BPI-Fc融合蛋白，作为耐药革兰氏阴性菌感染 治疗药物，具有巨大应用前景。
附图说明
图1.BPI-Fcγ1融合蛋白液相层析纯化及鉴定结果。其中：A、SP 
Fast Flow阳离子交换层析图谱；B、Protein A亲和层析图谱； C、纯化BPI-Fcγ1融合蛋白SDS-PAGE电泳图；D、纯化BPI-Fcγ1融 合蛋白Western Blot检测结果。
图2.BPI-Fcγ1融合蛋白体外结合LPS。其中：A、凝胶半定量法检 测结果；B、终点显色法定量检测结果。
图3.BPI-Fcγ1融合蛋白体外杀伤并通过激活补体增强杀伤耐药革兰 氏阴性菌。其中：A、体外杀菌及小鼠血清补体增强杀菌作用；B、体外 杀菌及人血清补体增强杀菌作用。
图4.BPI-Fcγ1融合蛋白体外调理BALB/c小鼠腹腔吞噬细胞吞噬 E.colipET28a-EGFP/BL21(DE3)示踪实验。其中：A、吞噬(荧光)示 踪实验。B、各组实验吞噬现象统计结果。
图5.BPI-Fcγ1融合蛋白体外调理人单核细胞系U937细胞吞噬E. coli pET28a-EGFP/BL21(DE3)示踪实验。
图6.BPI-Fcγ1融合蛋白体外调理人外周血白细胞吞噬E.coli pET28a-EGFP/BL21(DE3)示踪实验。
图7.BPI-Fcγ1融合蛋白体外调理吞噬杀伤E.coli pBR322/BL21(DE3)。其中：A、BALB/c小鼠腹腔吞噬细胞吞噬杀菌结 果；B、U937细胞吞噬杀菌结果。
图8.BPI-Fcγ1融合蛋白在全血中杀伤耐药基因E.coli pBR322/BL21(DE3)。
图9.BPI-Fcγ1融合蛋白在全血中杀伤多重耐药鲍曼不动杆菌。其中：A、小鼠全血实验；B、人全血实验。
图10.BPI-Fcγ1融合蛋白在全血中杀伤多重耐药(包括耐药基因) 肺炎克雷伯菌。其中：A、小鼠全血实验；B、人全血实验。
图11.BPI-Fcγ1融合蛋白在全血中杀伤超级耐药基因大肠埃希氏菌 (NDM-1)。
图12.BPI-Fcγ1融合蛋白对耐药革兰氏阴性菌感染模型小鼠的保护 作用。
下面结合实施例和附图进一步说明本发明的技术方案，但不限于本 实施例。更具体地说，实施例一涉及BPI-Fcγ1融合蛋白的高效表达载体 及在哺乳动物细胞中高效表达和制备。实施例二涉及BPI-Fcγ1融合蛋白 体外直接杀伤并通过激活补体和调理吞噬增强杀伤耐药革兰氏阴性菌。 实施例三涉及BPI-Fcγ1融合蛋白在小鼠和人全血中杀伤耐药革兰氏阴 性菌。实施例四涉及BPI-Fcγ1融合蛋白对耐药革兰氏阴性菌感染模型动 物的保护作用。
实施例一BPI-Fcγ1融合蛋白的高效表达载体及在哺乳动物细胞中 高效表达和制备
1.BPI-Fcγ1融合蛋白的高效表达载体pSCm-BPI-Fcγ1的构建
本发明设计优化了编码BPI-Fcγ1融合蛋白的BPI-Fcγ1嵌合基因 核苷酸序列(其序列如SEQ ID NO：1所示)，依次包含编码经修饰的人 BPI信号肽(其序列如SEQ ID NO：2所示)、BPI1-199、人免疫球蛋白铰 链区和Fcγ1(其中BPI1-199、人免疫球蛋白铰链区和Fcγ1组成分泌表 达BPI-Fcγ1融合蛋白)的核苷酸序列；后由基因合成商业服务全基因 合成设计优化的BPI-Fcγ1基因(构建插入于pUC57的EcoR I/Sal I双 酶切位点上，得到pUC57-BPI-Fcγ1)。按常规分子克隆实验技术：用 EcoR I/Sal I双酶切pUC57-BPI-Fcγ1质粒，回收1.39kb BPI-Fcγ1基 因片段，将其构建插入于pSCm-dhfr真核表达载体质粒(本发明人构建) 的EcoR I/Sal I双酶切位点上(转化到E.coli TOP10)，经鉴定正确构建 得到BPI-Fcγ1融合蛋白高效表达载体pSCm-BPI-Fcγ1。
所述高效表达载体pSCm-BPI-Fcγ1业已于2018年11月1日保藏 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国 北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC NO.：16676， 分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。
2.BPI-Fcγ1融合蛋白在CHO-DG44细胞中高效表达及其稳转株
用含3％NBS的优化无血清培养基(CD DG44Medium:IMDM配比 为1:9)把CHO-DG44(Gibco)细胞按4×105cells/孔铺板于24孔板，培 养(37℃，8％CO2)24小时；更换优化无血清培养基饥饿培养1小时， 按常规PEI转染方法(DNA:PEI质量比为1:3)将pSCm-BPI-Fcγ1质粒 转染CHO-DG44细胞，静置培养6小时；更换含3％NBS的优化无血 清培养基继续培养3天，后扩培至6孔板并更换无HT优化选择培养基 (CD OptiCHOTMMedium:IMDM配比为1:4)继续培养，2天后添加并 维持25nM MTX浓度于优化选择培养基中加压培养至克隆形成；待克隆 细胞生长状态良好后逐级提高MTX浓度至50、100、200、500nM加压 筛选，期间取样进行BPI-Fcγ1表达水平检测(ELISA)并估算每个细胞 每日表达水平pcd(pg/cell/day)，保留高表达细胞孔并进行亚克隆化(维 持500nM MTX加压筛选)，最终得到6个高表达克隆(>30pcd)，选取 其中稳转高表达细胞株(称为9-H9克隆，表达水平为41.9pcd)并进行 放大培养生产BPI-Fcγ1融合蛋白。
3.BPI-Fcγ1融合蛋白的制备
CELLSPIN&Spinner flask(INTEGRA Biosciences AG)中按 2×105cells/mL接种CHO-DG44稳转高表达克隆细胞(9-H9)(培养基为 含500nM MTX的优化选择培养基)，并添加适量SP
Fast Flow共培养14天(37℃，8％CO2,60rpm)，收集SP
Fast Flow 并装柱进行层析分离纯化(如图1A)；之后再经Protein A亲和层析分离 纯化(如图1B)，收集BPI-Fcγ1融合蛋白洗脱峰；用Amicon Ultra-15 (NMWL 30KD)超滤离心浓缩并置换蛋白保存液(0.15M NaCl 20mM 柠檬酸0.1％v/v Poloxamer 188 0.002％v/vPolysorbate 80pH 5.0)，-30℃ 保存备用。经鉴定：BPI-Fcγ1融合蛋白浓度约达3mg/mL；SDS-PAGE 结果显示(如图1C)，DTT还原泳道出现预期的48kDa谱带，无DTT 还原泳道出现48和96kDa并以96kDa为主谱带；Western Blot检测结 果显示(如图1D)，DTT还原泳道出现预期的48kDa谱带，无DTT还 原泳道出现48和96kDa并以96kDa为主谱带，结果与SDS-PAGE电泳结果对应。
实施例二BPI-Fcγ1融合蛋白的生物功能：体外结合LPS、直接杀伤 并通过激活补体和调理吞噬增强杀伤耐药革兰氏阴性菌。
优选E.coli pBR322/BL21(DE3)(经氨苄青霉素选择培养)和E.coli pET28a-EGFP/BL21(DE3)(经卡那霉素选择培养，并经1mM IPTG在30℃下诱导16h表达EGFP)开展体外杀伤耐药革兰氏阴性菌研究。
1.BPI-Fcγ1融合蛋白体外结合LPS
1.1于无内毒素的96孔酶标板中，每孔加入200μL 0.5μg/mL PBS 稀释的羊抗人IgG-Fc(Novex)，4℃包被过夜，用PBST(含0.1％Tween-20 的PBS)清洗平板(5分钟/次，共3次)；然后每孔加入200μL含5％BSA 的PBST溶液，37℃封闭1h，再用PBST清洗平板(5分钟/次，共3次)； 于每孔中加入200μL BPI-Fcγ1融合蛋白(0μg/mL和8μg/mL)和LPS(内 毒素标准品，8EU/mL)的孵育混合物(涡旋混匀，37℃,30min)，37℃ 孵育1h。按鲎试剂(厦门鲎试剂生物科技股份有限公司)说明书凝胶半 定量实验方法操作。结果如图2A所示：BPI-Fcγ1融合蛋白能有效结合 LPS。
1.2于无内毒素的96孔酶标板中，每孔加入200μL 0.5μg/mL PBS 稀释的羊抗人IgG-Fc(Novex)，4℃包被过夜，用PBST清洗平板(5 分钟/次，共3次)；然后每孔加入200μL含5％BSA的PBST溶液，37℃ 封闭1h，再用PBST清洗平板(5分钟/次，共3次)；于每孔中加入200μL 含不同浓度BPI-Fcγ1融合蛋白(0.005μg/mL、0.025μg/mL和0.1μg/mL； 阴性及阳性对照均以等量无内毒素PBS替代)和LPS(内毒素标准品， 0.05EU/mL；阴性对照以细菌内毒素检查用水替代)的孵育混合物(涡 旋混匀，37℃,30min)，37℃孵育1h。于每孔取100μL孵育样品按 ToxinSensorTM内毒素检测试剂盒(南京金斯瑞生物科技有限公司， L00350)说明书进行显色反应，测定OD545nm值并计算样品内毒素含 量。结果如图2B所示：BPI-Fcγ1融合蛋白能有效结合LPS，且其结合 能力呈现剂量依赖关系。
2.BPI-Fcγ1融合蛋白体外杀菌并通过激活补体杀伤耐药革兰氏阴性 菌
2.1BPI-Fcγ1融合蛋白体外杀菌及小鼠血清补体增强杀菌作用
取50μL E.coli pBR322/BL21(DE3)菌液(2.5×105CFU/mL，稀释于 10％Hanks40mM Tris-HCl 0.1％酪蛋白氨基酸pH7.5；阴性对照以等量 该缓冲液替代)与50μL BPI-Fcγ1融合蛋白(0.8μg/mL、0.4μg/mL、 0.2μg/mL，稀释于蛋白保存液；阴性及阳性对照均以等量蛋白保存液替 代)混匀，37℃水浴3h；再加入100μL 4％BALB/c小鼠血清(PBS稀 释；对照组以等量PBS替代)，37℃水浴1h；菌液稀释后倾注法计数。 结果如图3A所示：BPI-Fcγ1融合蛋白在体外可有效杀伤革兰氏阴性菌， 并可通过与小鼠血清补体交叉作用、激活小鼠补体增强杀菌效应，其杀 菌效率与剂量呈正相关。
2.2 BPI-Fcγ1融合蛋白体外杀菌及人血清补体增强杀菌作用
方法如上(2.1)，采用4％人血清进行实验。结果如图3B所示： BPI-Fcγ1融合蛋白在体外可有效杀伤革兰氏阴性菌，且可通过激活人血 清补体增强杀菌效应，其杀菌效率与剂量呈正相关。
3.BPI-Fcγ1融合蛋白体外通过调理吞噬杀伤耐药革兰氏阴性菌
3.1 BPI-Fcγ1融合蛋白调理吞噬示踪实验
3.1.1分离BALB/c小鼠腹腔吞噬细胞：小鼠脱椎处死，75％乙醇浸 泡5-10min；去除小鼠腹腔皮毛，保持腹膜完整；取适量DMEM培养基 注射入小鼠腹腔，轻轻按摩5min；抽出小鼠腹腔细胞悬液，300g，5min 离心收集细胞；完全培养基(含10％NBS的DMEM培养基)重悬后接 种于24孔板(含细胞爬片)，37℃，8％CO2培养3-7天。以DiI(Beyotime) 染色20min，PBS洗涤3次备用；取110μL E.coli pET28a-EGFP/BL21(DE3)菌液(PBS洗涤并制备成2×109CFU/mL悬液； 阴性对照以等量PBS替代)与110μL BPI-Fcγ1融合蛋白(20μg/mL，稀 释于蛋白保存液；阴性及阳性对照均以等量蛋白保存液替代)混匀，37℃ 孵育20min，后均匀覆盖于细胞上，37℃孵育60min；PBS洗涤2次， 4％组织细胞固定液(SolarBio)固定10min，PBS和超纯水依次各洗涤 1次，将爬片反置于载玻片上，封片，荧光显微镜下观察。结果如图4A所示：DiI标识小鼠腹腔吞噬细胞(DiI，红色荧光)，诱导表达的EGFP 标识E.colipET28a-EGFP/BL21(DE3)(EGFP，绿色荧光)，并进行两 种标识图像叠加处理(DiI+EGFP)，箭头标示吞噬现象(细胞膜或胞内 见EGFP绿色荧光)，可见BPI-Fcγ1融合蛋白可与小鼠种属Fc受体交叉 作用并显著促进小鼠吞噬细胞吞噬E.coli pET28a-EGFP/BL21(DE3)；图4B统计结果显示添加BPI-Fcγ1融合蛋白促使吞噬率由1.5％提高至63％。
3.1.2收集人单核细胞系U937细胞(中国科学院上海生命科学研究 院细胞资源中心，4×106cells)，以DiI染色30min，PBS洗涤2次备用； 取110μL E.coli pET28a-EGFP/BL21(DE3)菌液(PBS洗涤并制备成 2×109CFU/mL悬液；阴性对照以等量PBS替代)与110μLBPI-Fcγ1融 合蛋白(40μg/mL，稀释于蛋白保存液；阴性及阳性对照均以等量蛋白 保存液替代)混匀，37℃孵育20min；取200μL混合物与U937细胞混 匀，37℃，200rpm震荡孵育2h；200g，1min离心弃上清，并以PBS洗 涤2次；4％组织细胞固定液(SolarBio)固定10min；PBS和超纯水依 次各洗涤1次，取适量封片液重悬细胞后滴加于载玻片上，封片，荧光 显微镜下观察。结果如图5所示：标识同上(3.1.1)，可见BPI-Fcγ1融 合蛋白可显著促进U937细胞吞噬E.coli pET28a-EGFP/BL21(DE3)。
3.1.3采用人外周血白细胞分离液试剂盒(SolarBio)分离并收集人 白细胞(4×106cells)。方法如上(3.1.2)，其中变为：取150μL混合物与 人白细胞混匀，37℃，200rpm震荡孵育1h。结果如图6所示：标识同 上(3.1.1)，由于人白细胞为非单一组成的细胞，不同类型的吞噬细胞 DiI着色效果及荧光淬灭时间不同，DiI未能均匀标识出所有吞噬细胞， 因此增加可见光拍摄图以便对照，结果显示BPI-Fcγ1融合蛋白可显著促 进人白细胞吞噬E.coli pET28a-EGFP/BL21(DE3)。
3.2 BPI-Fcγ1融合蛋白体外通过调理吞噬杀伤耐药革兰氏阴性菌
1)分离BALB/c小鼠腹腔吞噬细胞(同上3.1.1方法)接种于96孔 板，37℃，8％CO2培养1-3天备用(汇合度>80％)；取30μL E.coli pBR322/BL21(DE3)菌液(PBS洗涤并制备成2×107CFU/mL悬液；阴性 对照以等量PBS替代)与30μL BPI-Fcγ1融合蛋白(4μg/mL、2μg/mL， 稀释于蛋白保存液；阴性及阳性对照分别以等量蛋白保存液替代)混匀， 37℃水浴10min，后均匀覆盖于细胞上，37℃孵育60分钟；各孵育样品 混匀后取20μL进行倍比稀释(10-1～10-5)，并将各稀释样分别取100μL 进行倾注法菌落计数；同时以CHO-DG44细胞作为对照，进行以上操作。
2)收集人单核细胞系U937(2×106cells)，PBS洗涤2次备用；取 60μL E.colipBR322/BL21(DE3)菌液(PBS洗涤并制备成2×107CFU/mL 悬液；阴性对照以等量PBS替代)与60μL BPI-Fcγ1融合蛋白(2μg/mL、 1μg/mL稀释于蛋白保存液；阴性及阳性对照分别以等量蛋白保存液替代) 混匀，37℃水浴20min；取100μL混合物与U937细胞混匀，37℃200rpm震荡孵育1h(96孔板中)；各孵育样品300g，5min离心收集上清，并分 别取20μL进行倍比稀释(10-1～10-5)，并将各稀释样分别取100μL进行 倾注法菌落计数；同时以CHO-DG44细胞作为对照，进行以上操作。
结果如图7所示：BPI-Fcγ1融合蛋白体外可通过调理小鼠腹腔吞噬 细胞(图7A)和U937细胞(图7B)吞噬杀伤耐药革兰氏阴性菌，其吞 噬杀菌率与BPI-Fcγ1融合蛋白浓度呈正相关。
实施例三BPI-Fcγ1融合蛋白在全血中杀伤耐药革兰氏阴性菌
优选E.coli pBR322/BL21(DE3)、鲍曼不动杆菌ATCC BAA-1605、 肺炎克雷伯菌ATCC 700603(具有荚膜)和大肠埃希氏菌(NDM-1)ATCC BAA-2469(分别经氨苄青霉素、亚胺培南、头孢西丁和亚胺培南选择培 养)开展新鲜全血(含血清补体和吞噬细胞)杀伤耐药革兰氏阴性菌研 究。
1.BPI-Fcγ1融合蛋白在全血中杀伤耐药基因E.coli pBR322/BL21(DE3)
鉴于(健康志愿者)新鲜人全血对E.coli pBR322/BL21(DE3)产生强 抵抗(如血清型反应和吞噬清除)，本研究开展在小鼠全血中杀伤E.coli pBR322/BL21(DE3)。
取20μL E.coli pBR322/BL21(DE3)菌液(5×105CFU/mL，PBS稀释； 阴性对照以等量PBS替代)与20μL不同浓度的BPI-Fcγ1融合蛋白 (5μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL，稀释于蛋白保存液；阴性及阳性对 照分别以等量蛋白保存液替代)混匀，37℃孵育10min；加入80μL新鲜 0.4％柠檬酸钠抗凝BABL/c小鼠全血，混匀并于37℃孵育3h；适当稀释 后各取100μL进行倾注法计数。结果如图8所示：BPI-Fcγ1融合蛋白在 全血中对耐药基因E.colipBR322/BL21(DE3)具有显著杀伤效果，其杀菌 效率与蛋白剂量呈正相关；其中当蛋白浓度为0.25、0.5和5μg/mL时， 相应杀菌率分别为41.7％、68.5％和90.6％。结合图3及图7结果可知 BPI-Fcγ1融合蛋白在全血中可通过激活补体及调理吞噬高效杀伤革兰氏 阴性菌。
2.BPI-Fcγ1融合蛋白在全血中杀伤多重耐药鲍曼不动杆菌(ATCC BAA-1605)
2.1在小鼠全血中杀伤鲍曼不动杆菌
取20μL鲍曼不动杆菌(ATCC BAA-1605)菌液(1×104CFU/mL) 与20μL不同浓度的BPI-Fcγ1融合蛋白(50μg/mL、5μg/mL、0.5μg/mL， 稀释于蛋白保存液；阴性及阳性对照分别以等量蛋白保存液替代)混匀， 37℃孵育10min；加入80μL新鲜0.4％柠檬酸钠抗凝BABL/c小鼠全血， 混匀并于37℃孵育1h；适当稀释后各取100μL进行倾注法计数。结果 如图9A所示：BPI-Fcγ1融合蛋白在小鼠全血中对多重耐药鲍曼不动杆 菌具有显著杀伤效果，其杀菌效率与蛋白剂量呈正相关；其中当蛋白浓 度为5和50μg/mL时，相应杀菌率分别达到56.5％和65.2％。
2.2在人全血中杀伤鲍曼不动杆菌
方法如上(2.1)，采用人血进行实验。结果如图9B所示：BPI-Fcγ1 融合蛋白在人全血中对多重耐药鲍曼不动杆菌具有显著杀伤效果，其杀 菌效率与蛋白剂量呈正相关；其中当蛋白浓度为0.5、5和50μg/mL时， 相应杀菌率分别达到12.0％、29.1％和50.6％。
3.BPI-Fcγ1融合蛋白在全血中杀伤多重耐药(包括耐药基因)肺炎 克雷伯菌(ATCC 700603)
3.1在小鼠全血中杀伤肺炎克雷伯菌
取50μL肺炎克雷伯菌(ATCC 700603)(1×104CFU/mL，PBS稀释； 阴性对照以等量PBS替代)与50μL不同浓度的BPI-Fcγ1融合蛋白 (1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL，稀释于蛋白保存液；阴性及阳性 对照分别以等量蛋白保存液替代)混匀，37℃孵育3h；加入100μL新鲜 0.4％柠檬酸钠抗凝BABL/c小鼠全血，混匀并于37℃孵育1h；适当稀释 后各取100μL进行倾注法计数。结果如图10A所示：当BPI-Fcγ1融合 蛋白达到较高有效浓度时，在小鼠全血中对具有荚膜(可抵抗吞噬作用 和阻碍BPI N端功能片段结合LPS)的多重耐药(包括耐药基因)肺炎 克雷伯菌具有明显杀伤效果，其杀菌效率与蛋白剂量亦呈正相关；其中 当蛋白浓度为500和1000μg/mL时，相应杀菌率分别达到84.2％和97.4％。
3.2在人全血中杀伤肺炎克雷伯菌
方法如上(3.1)，采用人血进行实验。结果如图10B所示：同小鼠 全血杀伤效果，当BPI-Fcγ1融合蛋白达到有效浓度时，其在人全血中对 多重耐药(包括耐药基因)肺炎克雷伯菌具有明显杀伤效果，其杀菌效 率与蛋白剂量亦呈正相关；其中当蛋白浓度为250、500和1000μg/mL 时，相应杀菌率分别达到25.8％、89.7％和94.8％。
4.BPI-Fcγ1融合蛋白在全血中杀伤超级耐药基因大肠埃希氏菌 (NDM-1)(ATCCBAA-2469)
鉴于(健康志愿者)新鲜人全血对大肠埃希氏菌(NDM-1)产生强抵 抗(如血清型反应和吞噬清除)，本研究开展在小鼠全血中杀伤大肠埃希 氏菌(NDM-1)。
取20μL大肠埃希氏菌(NDM-1)(ATCC BAA-2469)(1×104CFU/mL) 与20μL不同浓度的BPI-Fcγ1融合蛋白(50μg/mL、5μg/mL、0.5μg/mL， 稀释于蛋白保存液；阴性及阳性对照分别以等量蛋白保存液替代)混匀， 37℃孵育1h；加入80μL新鲜0.4％柠檬酸钠抗凝BABL/c小鼠全血，混 匀并于37℃孵育1h；适当稀释后各取100μL进行倾注法计数。结果如 图11所示：BPI-Fcγ1融合蛋白在全血中对超级耐药基因大肠埃希氏菌 (NDM-1)具有显著杀伤效果，其杀菌效率与蛋白剂量呈正相关；其中当 蛋白浓度为5和50μg/mL时，相应杀菌率分别达到42.0％和76.8％。
实施例四BPI-Fcγ1融合蛋白对耐药革兰氏阴性菌感染模型动物的 保护作用
从前述实施例涉及的耐药革兰氏阴性菌中选取耐药E.coli pBR322/BL21(DE3)(ampR和tetR基因)(经氨苄青霉素和四环素选 择培养)开展研究。
1.耐药革兰氏阴性菌感染BALB/c小鼠的最低致死量测定
用含5％高活性干酵母
的PBS将E.coli pBR322/BL21(DE3)稀释成不同浓度菌液，对随机分组(每组10只)的 6-8周龄BALB/c小鼠腹腔注射菌液(0.5mL/只)，观察小鼠的死亡情况； 将72小时内引起90-100％小鼠感染死亡的最低菌量确定为最小致死量 (minimal lethal dose，简称MLD)。实验测定：E.coli pBR322/BL21(DE3) 腹腔注射的MLD为2.5×104CFU/0.5mL。
2.BPI-Fcγ1融合蛋白对耐药革兰氏阴性菌感染小鼠的保护作用
对随机分组(每组10只)的6-8周龄BALB/c小鼠腹腔注射MLD 致死量的E.colipBR322/BL21(DE3)菌液(用含5％高活性干酵母的 PBS配制)进行感染攻击，10min后腹腔注射BPI-Fcγ1融合蛋白 (0.468mg/只，稀释于0.3mL蛋白保存液；实验设蛋白保存液对照组)， 详细观察记录小鼠72h内的生存情况。5次重复实验(注：蛋白批次部 分不同)结果如表1及图12所示：BPI-Fcγ1融合蛋白对致死量耐药E.coli pBR322/BL21(DE3)(ampR和tetR基因)感染小鼠具有显著保护作用。
表1.对致死量耐药菌E.coli pBR322/BL21(DE3)感染攻击的保护 作用
(**P<0.01)。
序列表
<110> 厦门联合安金生物工程有限公司
安君（北京）基因科技有限责任公司
<120> BPI-Fc融合蛋白及其用途
<130> IDC180252
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaattcgcca ccatggcccg ggagaacatg gctaggggcc catgcaatgc tccaagatgg 60
gtgtccctga tggtgctggt ggctatcggc accgctgtga cagctgctgt gaaccctggc 120
gtggtggtga gaatcagcca gaagggcctg gactacgctt cccagcaggg caccgccgct 180
ctgcagaagg agctgaagcg catcaagatc ccagactatt ctgatagctt caagatcaag 240
cacctgggca agggccacta cagcttctat tccatggata tccgggagtt tcagctgcca 300
agctcccaga tctctatggt gcccaacgtg ggcctgaagt tttccatctc taacgccaat 360
atcaagatca gcggcaagtg gaaggctcag aagaggttcc tgaagatgag cggcaatttt 420
gacctgtcca tcgagggcat gagcatctcc gccgatctga agctgggctc caaccctacc 480
tctggcaagc caaccatcac agcttctagc tgctcctctc acatcaattc cgtgcacgtg 540
cacatctcta agagcaaagt gggctggctg atccagctgt tccacaagaa gatcgagtct 600
gccctgagaa acaagatgaa tagccaggtg tgcgagaagg tgaccaacag cgtgagctcc 660
aagctgcagc cctactttca gaccctgcct gtgatgacaa agatcgaagc ttctacatgc 720
cccccttgtc cagctccaga gctgctggga ggaccttccg tgttcctgtt tccacccaag 780
ccaaaggaca ccctgatgat ctctcgcacc ccagaggtga catgcgtggt ggtggacgtg 840
agccacgagg accccgaggt gaagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcacaat 900
gccaagacaa agcccagaga ggagcagtac aattctacct atcgcgtggt gagcgtgctg 960
acagtgctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtata agtgcaaggt gtccaataag 1020
gccctgcctg ctccaatcga gaagaccatc tctaaggcta agggacagcc ccgggagcct 1080
caggtgtaca cactgcctcc aagcagggac gagctgacca agaaccaggt gtccctgaca 1140
tgtctggtga agggcttcta tccctccgat atcgctgtgg agtgggagtc taatggccag 1200
cctgagaaca attacaagac cacaccccct gtgctggact ctgatggcag cttctttctg 1260
tattccaagc tgaccgtgga taagtctagg tggcagcagg gcaacgtgtt ttcctgttct 1320
gtgatgcacg aggccctgca caatcactat acacagaaga gcctgtccct gtctcctggc 1380
aagtgaggat ccgtcgac 1398
<210> 2
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ala Arg Glu Asn Met Ala Arg Gly Pro Cys Asn Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Ser Leu Met Val Leu Val Ala Ile Gly Thr Ala Val Thr Ala Ala
20 25 30
Claims (2)
1.BPI-Fc融合蛋白在制备用于治疗耐药革兰氏阴性菌感染的药物中的用途，其中所述BPI-Fc融合蛋白包含人BPI功能片段和人免疫球蛋白重链恒定区Fc，其中所述的耐药革兰氏阴性菌是耐药鲍曼不动杆菌，其中所述人BPI功能片段的C端与所述人免疫球蛋白重链恒定区Fc的N端通过人免疫球蛋白铰链区连接，其中所述人BPI功能片段是人BPI1-199片段，其中所述人免疫球蛋白重链恒定区Fc是Fcγ1，并且其中所述BPI-Fc融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO：1所示。
2.用于表达BPI-Fcγ1融合蛋白的高效表达载体pSCm-BPI-Fcγ1，其于2018年11月1日保藏在地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：16676。
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| BPIm23-Fcγ1重组抗菌蛋白在CHO细胞中的表达及其对耐药菌的作用;靖学芳等;《首都医科大学学报》;20060430;第27卷(第2期);第150-154页 * |
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