CN116338018A - 对取代的咪唑并[1,2-α]吡啶-2-基胺化合物的相关物质进行分析检测的方法 - Google Patents

对取代的咪唑并[1,2-α]吡啶-2-基胺化合物的相关物质进行分析检测的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种对含化合物I的产品中的相关物质进行分析检测的方法，所述方法包括对供试品溶液和对照溶液分别进行反相高效液相色谱分析，其中所用色谱柱为C18或C8色谱柱，所述流动相为流动相A与流动相B的混合液，流动相A为pH在3.0‑8.0范围内的乙酸盐缓冲液，流动相B为乙腈，所述流动相中流动相A与流动相B的体积比为90:10至5:95，其中采用梯度洗脱的方式进行洗脱。本发明的方法能够将化合物I与其相关物质有效地分离开来，不仅能用于包含化合物I的产品中化合物I及相关物质含量的测定，还能在制备化合物I的反应中对反应进程进行监测，而且能用于包含化合物I的制剂开发中对处方进行优化。

Description

对取代的咪唑并[1,2-α]吡啶-2-基胺化合物的相关物质进行 分析检测的方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域。具体地，本发明涉及对取代的咪唑并[1,2-α]吡啶-2-基胺的相关物质进行分析检测的方法。
背景技术
由式I所示的取代的咪唑并[1,2-α]吡啶-2-基胺(以下称为化合物I)是在WO2016119700A1中公开的一种针对JAK靶点的选择性抑制剂，可用于预防或治疗Janus激酶介导的疾病的一种或多种症状，例如类风湿性关节炎、特应性皮炎等自身免疫性疾病和/或炎性疾病。
Figure BDA0003426045060000011
化合物I可通过以下合成路线制备得到,在其制备过程中，需要能将最终产物、起始原料、各步中间产物及副产物有效分离开的分析检测方法。
Figure BDA0003426045060000012
在开发化合物I的制剂过程中，发现化合物I会发生降解，因此也需要能将降解杂质和化合物I有效分离的分析检测方法。
现有技术中对化合物I进行质控的HPLC检测方法存在以下诸多问题中的一种或多种：(1)基线波动剧烈，(2)杂质峰1-4峰型差，不利于杂质定量测试，(3)三氟醋酸体系环境危害，EHS急性毒性、皮肤腐蚀/刺激、严重眼睛损伤/眼睛刺激性、长期水生危害，(4)三氟醋酸体系主峰保留时间波动较大，(5)三氟醋酸LC-MS不兼容性，(6)检测波长的质量平衡较差。
为了确保拟开发化合物I目标药品的质量安全，需要重新开发能对化合物I的相关物质进行有效分析检测的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种对化合物I的相关物质进行分析检测的方法，以克服现有方法存在的一个或多个上述缺点。
因此，根据第一方面，本发明提供一种对含化合物I的产品中的相关物质进行分析检测的方法，
Figure BDA0003426045060000021
其中所述相关物质包括式1-8的化合物的一种或多种：
Figure BDA0003426045060000022
Figure BDA0003426045060000031
其特征在于，所述方法包括以下步骤：
i)配制供试品溶液和对照溶液；和
ii)对所述供试品溶液和对照溶液分别进行反相高效液相色谱分析，
其中所用色谱柱为C18或C8色谱柱，所述流动相为流动相A与流动相B的混合液，流动相A为pH在3.0-8.0范围内的乙酸盐缓冲液，流动相B为乙腈，所述流动相中流动相A与流动相B的体积比为90:10至5:95，
其中采用梯度洗脱的方式进行洗脱，其中第一梯度起始时，所述流动相中流动相B的比例为5％-30％，第一梯度终止时，流动相B的比例为30％-90％，第一梯度运行时间为3min-20min。
根据第二方面，本发明提供式1化合物、式3化合物或式4化合物：
Figure BDA0003426045060000032
根据第三方面，本发明提供式1化合物在包含化合物I的制剂的检测质量中用作杂质对照品的用途：
Figure BDA0003426045060000041
根据第四方面，本发明提供式3化合物在包含化合物I的制剂的检测质量中用作杂质对照品的用途：
Figure BDA0003426045060000042
根据第五方面，本发明提供式4化合物在包含化合物I的制剂的检测质量中用作杂质对照品的用途：
Figure BDA0003426045060000043
本发明建立了稳健性良好的化合物I的相关物质的分析检测方法。
本发明的方法能够将化合物I与其相关物质有效地分离开来，不仅能用于包含化合物I的产品中化合物I及各相关物质含量的测定，还能在制备化合物I的反应中对反应进程进行监测，而且能用于包含化合物I的制剂开发中对处方进行优化。
可采用本发明的方法对包含化合物I的产品、化合物I制备过程中的反应液及制剂制备过程中的样品可能存在的主要杂质进行了分析，在有效分离各杂质的基础上对其进行了结构鉴定。
与现有技术相比，本发明的方法的优点和有益效果在于：
1.环境友好、基线平稳、检测波长的质量平衡好、主峰保留时间波动小、分离开的各物质峰型好，且具有LC-MS兼容性，便于杂质研究；
2.能将化合物I与其相关物质有效分离开来，专属性强且灵敏度高，可应用于化合物I的相关物质的检测分析，进而实现对化合物I的质量分析检测和控制；
3.能够将化合物I与其制备过程中的中间体及副产物、制剂过程中可能产生的降解杂质有效地分离开来，专属性强且灵敏度高，能用于化合物I制备过程中的反应进程的监控和制剂过程中处方的优化。
附图说明
下面结合附图对本发明进行更详细地说明和解释，其中：
图1显示对比实施例1中在220nm波长下对化合物I与其相关物质进行定位的色谱图。
图2显示对比实施例1中三氟醋酸体系下化合物I的保留时间随流动相pH变化关系图。
图3显示对比实施例1中245nm波长下的化合物I与其相关物质的色谱图。
图4显示实施例1中的化合物I与其相关物质的色谱图。
图5显示实施例2中的化合物I与其相关物质的色谱图。
图6显示实施例3中的化合物I与其相关物质的色谱图。
图7显示实施例4中的化合物I与其相关物质的色谱图。
图8显示实施例5中的化合物I与其相关物质的色谱图。
图9显示实施例6中的化合物I与其相关物质的色谱图。
图10显示实施例7中的化合物I与其相关物质的色谱图。
图11显示实施例8中的化合物I与其相关物质的色谱图。
图12显示实施例9中的化合物I与其相关物质的色谱图。
图13显示实施例10中的化合物I与其相关物质的色谱图。
图14显示实施例11中的化合物I与其相关物质的色谱图。
图15显示对比实施例2中的化合物I与其相关物质的色谱图。
图16显示对比实施例3中的化合物I与其相关物质的色谱图。
图17显示对比实施例4中的化合物I与其相关物质的色谱图。
具体实施方式
在下文中，将更全面地体现本发明的各方面以及更进一步的目的、特征和优点。
本发明提供一种对含化合物I的产品中的相关物质进行分析检测的方法，
Figure BDA0003426045060000061
其中所述相关物质包括式1-8的化合物的一种或多种：
Figure BDA0003426045060000062
其特征在于，所述方法包括
对供试品溶液和对照溶液分别进行反相高效液相色谱分析，
其中所用色谱柱为C18或C8色谱柱，所述流动相为流动相A与流动相B的混合液，流动相A为pH在3.0-8.0范围内的乙酸盐缓冲液，流动相B为乙腈，所述流动相中流动相A与流动相B的体积比为90:10至5:95，
其中采用梯度洗脱的方式进行洗脱，其中第一梯度起始时，所述流动相中流动相B的比例为5％-30％，第一梯度终止时，流动相B的比例为30％-100％，第一梯度运行时间为3min-20min。
本申请所述的取代的咪唑并[1,2-α]吡啶-2-基胺为式I的化合物，在本申请中，其也被称为化合物I：
Figure BDA0003426045060000071
式1-8的化合物为通常伴随化合物I存在的杂质，其中化合物6和8为制备化合物I的起始物料，化合物2和7为制备化合物I过程中的工艺中间体，化合物5为制备化合物I过程中的工艺副产物，化合物1、2、3和4为化合物I的降解杂质，其中化合物2既是工艺中间体也是降解杂质，这些化合物的具体信息汇总于表1中。
表1.化合物I的相关物质的结构
Figure BDA0003426045060000072
Figure BDA0003426045060000081
Figure BDA0003426045060000091
C18色谱柱是指键合到硅胶上的烷烃包含18个碳原子。
C8色谱柱是指键合到硅胶上的烷烃包含8个碳原子。
优选地，所述方法还包括按照以下公式对所述产品中各化合物浓度进行计算：
化合物浓度(％w/w)＝(Ax×f)/As×1％
其中，
Ax＝供试品溶液中单种化合物的峰面积
As＝1％对照溶液中化合物I的峰面积
f＝单种化合物对应的校正因子，如下表中所示：
化合物名称 校正因子
1 2.2
2 3.7
3 1.9
4 1.7
5-8 1.0。
优选地，所述方法还包括如下所述配制供试品溶液和对照溶液：
供试品溶液：取含化合物I的产品，用稀释液溶解制成供试品溶液使得理论上每1ml供试品溶液中含500μg化合物I；
对照溶液：将供试品溶液用稀释液稀释100倍得到对照溶液。
优选地，所述稀释液选自甲醇和乙腈。
优选地，所述色谱柱的粒径为1.6-5μm
优选地，所述色谱柱的柱长为30-150mm，内径为2.1-4.6mm，粒径为1.6-5μm。
作为色谱柱的实例，可以提及Waters BEH C18，2.1*100mm，1.7μm。
优选地，色谱柱的柱温为25℃-50℃，更优选地，色谱柱的柱温为30-40℃，最优选地，色谱柱的柱温为40℃。
优选地，进样体积在1-20μl范围内，更优选地，进样体积为2-10μl。
优选地，乙酸盐缓冲液的pH值在4.0-5.0范围内，更优选地，缓冲盐的pH值为4.5。
可以采用例如乙酸作为乙酸盐缓冲液中的pH调节剂。
优选地，乙酸盐缓冲液中的乙酸盐选自乙酸铵、乙酸钾和乙酸钠。
优选地，乙酸盐缓冲液中乙酸盐浓度在0.3-4g/L范围内，更优选地，在0.7-0.8g/L范围内。
优选地，所述梯度洗脱包括至少3个梯度，例如包括4-6个梯度。
优选地，总运行时间为16-34min。
优选地，第一梯度起始时，流动相中流动相B的比例为10％-20％，更优选地，流动相B的比例为10％。
优选地，第一梯度终止时，流动相中流动相B的比例为50％。
优选地，第一梯度运行时间为10min-15min，更优选地，第一梯度运行时间为10min。
优选地，流动相的流速在0.2mL/min-0.7mL/min范围内，更优选地，流动相的流速在0.4mL/min-0.6mL/min范围内，还更优选地，流动相的流速在0.4mL/min-0.5mL/min范围内，最优选地，流动相的流速为0.45ml/min。
优选地，洗脱条件如下表：
Figure BDA0003426045060000111
优选地，检测波长在220nm-245nm范围内，更优选地，检测波长为245nm。
在一些实施方案中，采用紫外检测器进行检测。
根据第二方面，本发明提供式1化合物、式3化合物或式4化合物：
Figure BDA0003426045060000112
根据第三方面，本发明提供式1化合物在包含化合物I的制剂的检测质量中用作杂质对照品的用途：
Figure BDA0003426045060000121
具体地，在检测质量中，采用第一方面的方法测定式3化合物的含量。
当所述制剂中式1化合物的含量不超过化合物I含量的1％时，则所述制剂符合质量要求。
根据第四方面，本发明提供式3化合物在包含化合物I的制剂的检测质量中用作杂质对照品的用途：
Figure BDA0003426045060000122
具体地，在检测质量中，采用第一方面的方法测定式3化合物的含量。
当所述制剂中式3化合物的含量不超过化合物I含量的1％时，则所述制剂符合质量要求。
根据第五方面，本发明提供式4化合物在包含化合物I的制剂的检测质量中用作杂质对照品的用途：
Figure BDA0003426045060000131
具体地，在检测质量中，采用第一方面的方法测定式4化合物的含量。
当所述制剂中式4化合物的含量不超过化合物I含量的1％时，则所述制剂符合质量要求。
本申请中所述的“包含”和“包括”涵盖还包含或包括未明确提及的其它要素的情形以及由所提及的要素组成的情形。
除非另外限定，本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员通常理解的相同意义。当本说明书中术语的定义与本发明所属领域技术人员通常理解的意义有矛盾时，以本文中所述的定义为准。
除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的表达成分的量等的所有数值被理解为在被术语“约”修饰。因此，除非有相反指示，否则在这里阐述的数值参数是能够根据需要获得的所需性能来变化的近似值。
在本申请，针对量的描述，如果没有明确说明，则按照重量计。
实施例
以下将结合实施例和附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以让本领域技术人员充分地了解本发明的目的、特征和效果。本领域技术人员不难理解，此处的实施例仅仅用于示例目的，本发明的范围并不局限于此。
主要试剂
各实施例中，所用主要试剂如以下表2所示：
表2.所用主要试剂
乙腈 HPLC级
甲醇 HPLC级
纯化水 自制
三氟醋酸(TFA) 分析级或更高级别
醋酸铵 分析级或更高级别
二甲亚砜 HPLC级
预备实施例1:化合物I的合成
步骤1：化合物7的合成：
氮气环境下，向反应釜A中加入1,4-二氧六环16L和软化水1.6L，搅拌下加入化合物8(1.60kg，5.13mol)、化合物6(2.27kg，6.15mol)和无水碳酸钾(1.42kg，10.27mol)，氮气保护。加入Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2(0.125kg，0.153mol)。升温至95℃左右，保温反应至少6小时后，取样HPLC监测显示反应完成。加水搅拌2h后，过滤得滤饼。将乙腈(24L)、水(8L)和滤饼加入反应釜A，搅拌至少2小时。过滤，收集滤饼。在55℃下真空干燥16小时后收料得化合物7(2.167kg，纯度98.6％，收率88.8％)。
1H(400MHz，DMSO-d6)δppm：7.634(1H，t)，7.495(2H，m)，7.425(1H，d，J＝7.6Hz)，7.313(2H，m)，6.920(1H，d，J＝7.2Hz)，3.832(2H，s)，3.180(4H，s)，2.973(4H，s)，1.422(9H，s)。LCMS m/z：475.2(M+H)。
步骤2：化合物2的合成：
氮气保护下，向反应釜A中加入氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M，20L)，降温至15℃，保温下搅拌分批加入化合物7(2.0kg，4.21mol)。加毕，控温15℃，搅拌至少16小时，取样HPLC监测显示反应完成。向反应釜B中加入甲醇(12L)、水(8L)、25％氨水(10L)和N-乙酰-L-半胱氨酸(0.2kg)，冷却至5℃后，搅拌下将反应釜A中的反应液滴入反应釜B中。加毕，搅拌至少2小时。过滤，收集滤饼，55℃下真空干燥。16小时后收料，称重，得化合物2(1.50kg，纯度98.6％，收率95.0％)。
1H(300MHz，DMSO-d6)δppm：7.592(1H，m)，7.429(2H，m)，7.274(1H，d，J＝8.7Hz)，7.130(1H，m)，6.752(1H，m)，6.494(1H，d，J＝2.7Hz)，5.079(1H，s)，3.815(2H，s)，3.170(4H，d，J＝5.1Hz)，3.649(4H，t)。LCMS m/z 375.1(M+H)。
步骤3：化合物I的合成
氮气保护下，向反应釜A中加入二氯甲烷(15L)，搅拌下加入化合物2(1.5kg，4.0mol)和三乙胺(0.81kg，8.0mol)，然后控制釜内温度5℃左右，往反应釜A中滴加环丙基甲酰氯(0.48kg，4.59mol)，滴毕保温搅拌至少1小时，取样送HPLC分析显示反应完成。向反应釜A中加入正庚烷(20L)、甲醇(1.5L)、25％氨水(7.5L)和N-乙酰-L-半胱氨酸(0.15kg)，调节温度至15℃，保温搅拌至少8小时。过滤，收集滤饼。向反应釜A中加入乙醇(15L)、水(10L)及滤饼，滴入浓盐酸(0.75L)，搅拌至少2小时。过滤收集滤液。向滤液中滴入25％氨水调节pH值到8～9，搅拌1小时。过滤收集滤饼。滤饼转入烘箱，55℃真空干燥。8小时后，收料，称重，得到化合物I(1.28kg，纯度99.4％，收率72.2％)。
1H(400MHz，DMSO-d6)δppm：8.05(1H，dd，J＝9.2，7.2Hz)，8.01(1H，dd，J＝9.2,1.6Hz),7.85-7.77(3H，m)，7.58(1H，dd，J＝7.2，1.6Hz)，4.65(2H，s)，3.91-3.88，(4H，m)，3.69-3.68(4H，m)，1.96-1.92(1H，m)，1.06-1.03(4H，m)。LCMS m/z：443.2(M+H)。
将以上得到的滤液合并并减压浓缩，所得到的残留物经色谱柱分离可得到副产物化合物5。
1H(300MHz，CDCl3)δppm：9.49(1H,brs)，7.86(1H，s)，7.54(2H，m)，7.41(1H，m)，7.31(1H，m)，7.25(1H，m)，6.82(1H，d)，3.77(2H，s)，3.12(4H，m)，2.98(4H，m)，2.16(3H，s)。LCMS m/z：417.1(M+H)。
预备实施例2:化合物1-4的制备与纯化
步骤1.化合物1-4的制备
将包含化合物I的外用制剂(配方见表3)在60℃下放置13天进行高温破坏以产生化合物1-4，取该样品按照如下步骤对化合物1、2、3和4进行提纯和表征。
表3.包含化合物I的外用制剂配方
Figure BDA0003426045060000151
Figure BDA0003426045060000161
步骤2.化合物1-4的纯化
步骤2.1第一次纯化过程
将步骤1中得到的待纯化的样品使用如下所列的制备液相参数和梯度进行纯化。
制备液相参数：
仪器：Biotage-Isolera One液相制备仪
制备柱：Agela C18 Spherical 330g
流动相A：10mmol NH4HCO3的水溶液
流动相B：ACN
收集波长：214nm
流速：100ml/min
梯度：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.0 90 10
1.0 90 10
3.0 85 15
25.0 40 60
26.5 40 60
27.0 2 98
33.0 2 98
33.2 90 10
37.0 90 10
根据MS监测结果得知，化合物1、2和3一起流出，化合物4和化合物I一起流出，待分离完成后，将含有化合物1、2和3的混合制备液进行合并、旋蒸，得到浓缩液，待二次纯化；将化合物4和化合物I的混合制备液旋干，待进一步纯化。
步骤2.2第二次纯化过程
将第一次纯化所得的含化合物1、2和3的浓缩液按照步骤2.1的方法同样纯化，根据MS监测结果得知，化合物1和辅料一起流出，化合物2和化合物3分别流出。分离完成后，将各制备液分别冷冻干燥，除去溶剂，放置2-8℃冰箱中，待后续继续纯化。
第一次纯化得到的含化合物4的粗品溶于DMF，按照步骤2.1的方法进行纯化，根据检测结果收集化合物4，故旋干放置2-8℃冰箱中，待再次纯化。
步骤2.3第三次纯化过程
取第二次纯化得到含有辅料和化合物1的混合物约600mg，加入适量溶剂，超声混匀后，按照如下所列的制备液相参数和梯度进行纯化。
制备液相参数
仪器：Biotage-Isolera One液相制备仪
制备柱：Agela C18 Spherical 20-35μm 120g
流动相A：0.1％甲酸水溶液
流动相B：ACN
收集波长：214nm
流速：60ml/min
梯度：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.0 90 10
1.0 90 10
14.0 75 25
15.0 75 25
16.0 74 26
16.2 5 95
26.2 5 95
26.5 90 10
31.0 90 10
经监测结果显示，得到的化合物1纯度大于95％，收集制备液，冷冻干燥，除去溶剂后于2-8℃冰箱中保存。
将第二次纯化得到的化合物2加入适量溶剂中，超声混匀后按照如下所列的制备液相参数和梯度进行纯化，经监测结果显示，纯度大于95％，收集制备液，待制备完成后，冷冻干燥，除去溶剂后于2-8℃冰箱中保存。
步骤2.4第四次纯化过程
取第二次纯化得到化合物3约50mg，溶于DMF中，按照如下所列的制备液相参数和梯度进行纯化。
制备液相参数
仪器：Waters-2767高压液相制备仪
制备柱：Xtimate C18 21.2*150mm 5μm
流动相A：10mM NH4HCO3水溶液
流动相B：ACN
收集波长：214nm
流速：15ml/min
梯度：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.0 70 30
0.2 70 30
8.0 55 45
8.5 5 95
10.0 5 95
10.3 70 30
经监测结果显示，纯度大于95％，待制备完成后，收集制备液，冷冻干燥，除去溶剂，放置2-8℃冰箱保存。
步骤2.5第五次纯化
取第二次纯化得到杂质4约50mg，溶于甲醇中，按照如下所列的制备液相参数和梯度进行纯化。
制备液相参数
仪器：Waters-2767液相制备仪
制备柱：Xtimate C18 21.2*150mm 5μm
流动相A：0.1％NH4OH水溶液
流动相B：ACN
收集波长：214nm
流速：15ml/min
梯度：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.0 70 30
0.2 70 30
8.0 55 45
8.5 5 95
10.0 5 95
10.3 70 30
13.0 70 30
根据检测结果，收集到的化合物4纯度大于95％，待制备完成后收集化合物4制备液，冷冻干燥，除去溶剂，放置2-8℃冰箱保存。
步骤3.化合物检测
采用LCMS检测方法进行检测，所用液相参数和质谱参数如下，所得结果见：液相参数
仪器：Waters UPLC-SQDMS
分析柱：Waters BEH C18，50*2.1mm，1.7μm
流动相A：0.1％甲酸水溶液
流动相B：0.1％甲酸的ACN溶液
波长：245nm
梯度：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.0 95 5
0.2 95 5
2 40 95
3.12 5 95
3.22 95 5
3.5 95 5
质谱参数
毛细管电压：3.5kv
锥孔电压：30-40v
离子源温度：120℃
脱溶剂气温度：350气
脱溶剂气流速：600L/min
Cone气：30L/min
质谱范围(m/z)：100-1000
HPLC检测方法
仪器：Waters e2695-2489
分析柱：Welch XB-C18 4.6*150mm 5μm
流动相A：称取醋酸铵约0.1612g，加入至1L蒸馏水中，超声混匀后用醋酸调节pH至4.7左右即可。
流动相B：ACN
柱温：30℃
波长：245nm
流速：1.0ml/min
溶剂：ACN
梯度：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.0 90 10
8.0 50 50
13.0 20 80
16.0 20 80
16.1 90 10
20.0 90 10
核磁检测方法
仪器：BRUKER AV Ⅲ 400MHz超导核磁共振谱仪
溶剂：DMSO-d6
检测结果
测试内容 化合物1 化合物2 化合物3 化合物4
外观性状 淡黄色粉末 浅橙色粉末 类白色粉末 棕色固体
1HNMR 与结构一致 与结构一致 与结构一致 与结构一致
LC-MS[M+H]+ 376.09 375.21 336.22 897.47
HPLC纯度(245nm) 99.28％ 95.03％ 99.25％ 99.25％
外用制剂的制备
将包含化合物I的外用制剂(配方组成见表4)在60℃下放置5天进行高温破坏，使其含化合物1、2、3和4。
表4.包含化合物I的外用制剂配方
Figure BDA0003426045060000201
供试品溶液和对照溶液的配制：
称取破坏后的外用制剂样品适量(理论上含10mg化合物I)至20ml量瓶内，加入适量甲醇，涡旋至分散均匀，加入适量杂质5、6、7和8，加甲醇定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。
将供试品溶液用甲醇稀释100倍得到对照溶液。
对比实施例1
用表5所示的色谱条件对供试品溶液的化合物I与其相关物质进行定位，所得色谱图见图1。
表5.
Figure BDA0003426045060000211
从图1可以发现，基线波动剧烈且化合物1-4峰型较差，不利于定量测试。
图2显示对比实施例1中三氟醋酸体系下化合物I的保留时间随流动相pH变化关系图。
从图2可以发现，在三氟醋酸体系下，pH约为2.2，该pH处于保留时间变化极快的陡坡中，这表明在该体系下，化合物I的保留时间波动会较大。
将检测提取波长由220nm设定为245nm，其余色谱条件保持不变。
图3显示对比实施例1中245nm波长下的化合物I与其相关物质的色谱图。
计算并比较220nm和245nm检测波长下，经高温破坏后的供试品中质量平衡情况，所得结果见表6。
从表6可见，采用本对比实施例的方法在220nm波长下质量平衡较差，仅为93.4％，而若采用245nm检测波长，其质量平衡可达到98.8％。
表6.
Figure BDA0003426045060000221
实施例1
按照如表7所示的色谱条件对供试品溶液的化合物I及其相关物质进行定位，所得色谱图见图4。
表7.对化合物I及其有关物质进行定位的色谱条件
Figure BDA0003426045060000222
从图4可见，色谱图的基线平稳，化合物I及其有关杂质的分离良好且峰型好。
实施例2-11
采用实施例1的色谱条件，而改变实施例1中的洗脱条件(如表8中所示)，其它未列出的参数与实施例1中相同，对供试品溶液进行检测分析所得色谱图如图5至图14所示。
表8.
Figure BDA0003426045060000231
从图5至14可见，在该实施例2-11采用的洗脱条件下，色谱图的基线平稳，化合物I及其有关化合物的分离良好且峰型好。
按照以下公式对各化合物浓度进行计算：
化合物浓度(％w/w)＝(Ax×f)/As×1％
其中，
Ax＝供试品溶液中单种化合物的峰面积
As＝1％对照溶液中化合物I的峰面积
f＝单种化合物对应的校正因子，如下表中所示：
化合物名称 校正因子
1 2.2
2 3.7
3 1.9
4 1.7
5-8 1.0。
对比实施例2-4
采用实施例1的色谱条件，而改变实施例1中的洗脱条件(如表9中所示)，对供试品溶液进行检测分析，所得色谱图如图15至图17所示。
表9.
Figure BDA0003426045060000241
从图15和17可以看出，在对比实施例2和对比实施例4中，化合物1-5不能被分离出来。
从图16可以看出，在对比实施例3中，化合物1峰型差。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。

Claims (22)

1.一种对含化合物I的产品中的相关物质进行分析检测的方法，
Figure FDA0003426045050000011
其中所述相关物质包括式1-8的化合物的一种或多种：
Figure FDA0003426045050000012
其特征在于，所述方法包括对所述供试品溶液和对照溶液分别进行反相高效液相色谱分析，
其中所用色谱柱为C18或C8色谱柱，所述流动相为流动相A与流动相B的混合液，流动相A为pH在3.0-8.0范围内的乙酸盐缓冲液，流动相B为乙腈，所述流动相中流动相A与流动相B的体积比为90:10至5:95，
其中采用梯度洗脱的方式进行洗脱，其中第一梯度起始时，所述流动相中流动相B的比例为5％-30％，第一梯度终止时，流动相B的比例为30％-90％，第一梯度运行时间为3min-20min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括按照以下公式对所述产品中各化合物浓度进行计算：
化合物浓度(％w/w)＝(Ax×f)/As×1％
其中，
Ax＝供试品溶液中单种化合物的峰面积
As＝1％对照溶液中化合物I的峰面积
f＝单种化合物对应的校正因子，如下表中所示：
化合物名称 校正因子 1 2.2 2 3.7 3 1.9 4 1.7 5-8 1.0。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，还包括按照如下所述配制供试品溶液和对照溶液：
供试品溶液：取含化合物I的产品，用稀释液溶解制成供试品溶液使得理论上每1ml供试品溶液中含500μg化合物I；
对照溶液：将供试品溶液用稀释液稀释100倍得到对照溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述稀释液选自甲醇和乙腈。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的粒径为1.6-5μm。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，色谱柱的柱温为25℃-50℃，优选地，色谱柱的柱温为30-40℃，更优选地，色谱柱的柱温为40℃。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，进样体积在1-20μl范围内，优选地，进样体积为2μl-10μl。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，乙酸盐缓冲液的pH值在4.0-5.0范围内，优选地，缓冲盐的pH值为4.5。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，乙酸盐缓冲液中的乙酸盐选自乙酸铵、乙酸钾和乙酸钠。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，乙酸盐缓冲液中乙酸盐浓度在0.3-4g/L范围内，优选地，在0.7-0.8g/L范围内。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱包括至少3个梯度，优选包括4-6个梯度。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，总运行时间为16-34min。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，第一梯度起始时，流动相中流动相B的比例为10％-20％。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其特征在于，第一梯度终止时，流动相中流动相B的比例为50％。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其特征在于，第一梯度运行时间为10min-15min，优选地，第一梯度运行时间为10min。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其特征在于，流动相的流速在0.2mL/min-0.7mL/min范围内，优选地，流动相的流速在0.4mL/min-0.6mL/min范围内，更优选地，流动相的流速在0.4mL/min-0.5mL/min范围内，最优选地，流动相的流速为0.45ml/min。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其特征在于，洗脱条件如下表：
Figure FDA0003426045050000031
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其特征在于，检测波长在220nm-245nm范围内，优选地，检测波长为245nm。
19.式1化合物、式3化合物或式4化合物：
Figure FDA0003426045050000041
20.式1化合物在包含化合物I的制剂的检测质量中用作杂质对照品的用途：
Figure FDA0003426045050000042
21.式3化合物在包含化合物I的制剂的检测质量中用作杂质对照品的用途：
Figure FDA0003426045050000043
22.式4化合物在包含化合物I的制剂的检测质量中用作杂质对照品的用途：
Figure FDA0003426045050000044
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