CN116334165A - 环黄芪醇的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种环黄芪醇的制备方法，涉及生物技术领域。本发明提供的环黄芪醇的制备方法，包括以下步骤：配制黄芪甲苷、木糖苷酶和GSM菌剂的混合溶液，经转化反应后，制备得到环黄芪醇。该制备方法，通过GSM菌剂和木糖苷酶的协同配合作用，能够实现黄芪甲苷的100％转化，该制备方法简单高效，制备得到的环黄芪醇的得率高、纯度高。

Description

环黄芪醇的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种环黄芪醇的制备方法。
背景技术
黄芪甲苷是中药黄芪的主要活性成分，环黄芪醇(CA)为黄芪甲苷的苷元。环黄芪醇能够通过激活端粒酶来延长端粒，从而达到抵抗衰老，提高细胞增殖能力的效果。
环黄芪醇的化学式为C30H50O5、相对分子质量为490.71，是一种无色针状结晶，易溶于甲醇、正丁醇等。天然植物中环黄芪醇的含量极少，因此环黄芪醇的生产主要是通过水解黄芪甲苷C3位置的木糖苷键和C6位置的葡萄糖苷键实现。
目前制备环黄芪醇的方法有多种，但是都存在一定的缺陷，例如得率低、纯度低等。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种环黄芪醇的制备方法，以解决上述问题中的至少一种。
本发明的第二目的在于提供一种环黄芪醇产品。
第一方面，本发明提供了一种环黄芪醇的制备方法，包括以下步骤：
配制黄芪甲苷、木糖苷酶和GSM菌剂的混合溶液，经转化反应后，制备得到环黄芪醇；
按质量份数计，所述GSM菌剂主要由地衣芽孢杆菌40-47份、枯草杆菌38-43份和双歧杆菌12-17份组成。
作为进一步技术方案，所述混合溶液的pH为5.5-6.5；
优选地，所述混合溶液为含有黄芪甲苷、木糖苷酶和GSM菌剂的缓冲溶液；
优选地，所述缓冲溶液包括磷酸缓冲液。
作为进一步技术方案，所述转化反应的温度为36-38℃，优选为37℃；
优选地，所述转化反应的时间为20h以上，优选为30h；
优选地，所述转化反应在搅拌的条件下进行。
作为进一步技术方案，所述混合溶液中黄芪甲苷的浓度为0.0009-0.012g/mL，优选为0.009g/mL；
优选地，所述混合溶液中木糖苷酶的浓度为0.001-0.005g/mL，优选为0.002g/mL；
优选地，所述GSM菌剂为含有菌体的溶液，GSM菌剂中菌体的浓度为5×107-5×108cfu/mL；
优选地，所述混合溶液中GSM菌剂的体积百分比为0.1％-0.5％，优选为0.2％。
作为进一步技术方案，所述黄芪甲苷的制备方法包括以下步骤：
将黄芪依次进行乙醇提取、浓缩、萃取剂萃取、干燥和分离纯化后，制备得到黄芪甲苷。
作为进一步技术方案，所述乙醇提取为采用65％-75％的乙醇对黄芪浸提；
优选地，所述乙醇提取的温度为35-45℃；
优选地，所述浓缩为浓缩至提取液中无乙醇；
优选地，所述萃取剂包括乙酸乙酯或正丁醇。
作为进一步技术方案，所述分离纯化包括硅胶柱层析、活性炭除杂和甲醇重结晶。
作为进一步技术方案，所述转化反应结束后还包括对环黄芪醇进行分离纯化的步骤；
所述分离纯化包括对转化反应的溶液依次进行盐析、萃取剂萃取、干燥和重结晶。
作为进一步技术方案，采用氯化钠进行盐析；
优选地，所述萃取剂包括乙酸乙酯；
优选地，所述萃取后还包括采用饱和食盐水清洗萃取相的步骤；
优选地，所述重结晶的溶剂包括乙醇。
第二方面，本发明提供了一种环黄芪醇产品，采用上述制备方法制备得到。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的环黄芪醇的制备方法，通过GSM菌剂和木糖苷酶的协同配合作用，能够实现黄芪甲苷的100％转化，该制备方法简单高效，制备得到的环黄芪醇的得率高、纯度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为从黄芪甲苷到环黄芪醇的分子结构图；
图2为实施例1提供的环黄芪醇的核磁氢谱；
图3为实施例1提供的反应6h后反应液的TLC检测结果；
图4为实施例1提供的反应30h后反应液的TLC检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
黄芪甲苷制备环黄芪醇的反应流程如图1所示。对于黄芪甲苷转化环黄芪醇，从分子结构来看，高温和酸处理容易导致三元环破坏；且经发明人研究发现，碱处理效果不是很好；酶解处理脱掉木糖和葡萄糖，得率较低，纯度不高；菌处理，不能完全转化。在此基础上提出本发明方案。
第一方面，本发明提供了一种环黄芪醇的制备方法，包括以下步骤：
配制黄芪甲苷、木糖苷酶和GSM菌剂的混合溶液，经转化反应后，制备得到环黄芪醇；
按质量份数计，所述GSM菌剂主要由地衣芽孢杆菌、枯草杆菌和双歧杆菌组成。其中，地衣芽孢杆菌的质量份数例如可以为，但不限于40份、42份、44份、46份或47份；枯草杆菌的质量份数例如可以为，但不限于38份、40份、42份或43份；双歧杆菌的质量份数例如可以为，但不限于12份、14份、16份或17份。
GSM菌剂特点：可产生大量淀粉酶、蛋白酶、木糖苷酶和纤维素酶等；发酵工艺简单，菌体繁殖快，无有毒物质产生；厌氧、好氧和兼性厌氧菌种共同稳态生长，菌液抗菌、抗毒能力强，环境适应性好；复合作用机制，降解效率高，应用范围广；多层次多位点处理原料，使得提取效率高；反应迅速，缩短工艺流程。
本发明提供的环黄芪醇的制备方法，通过GSM菌剂和木糖苷酶的协同配合作用，能够实现黄芪甲苷的100％转化，该制备方法简单高效，制备得到的环黄芪醇的得率高、纯度高。
在一些优选的实施方式中，所述混合溶液的pH例如可以为，但不限于5.5、5.7、5.9、6.1、6.3或6.5，优选为6。
优选地，所述混合溶液为含有黄芪甲苷、木糖苷酶和GSM菌剂的缓冲溶液，以维持转化反应的pH稳定。
优选地，所述缓冲溶液包括但不限于磷酸缓冲液，或者采用本领域技术人员所熟知的其他缓冲，以维持混合溶液的pH稳定。
在一些优选的实施方式中，所述转化反应的温度例如可以为，但不限于36℃、37℃或38℃，优选为37℃；
优选地，所述转化反应的时间为20h以上，优选为30h；
优选地，所述转化反应在搅拌的条件下进行。通过搅拌，有助于提高转化反应的反应速率。
通过对转化反应条件的进一步优化和调整，缩短转化反应所需的时间，提高转化反应的转化率。
在一些优选的实施方式中，所述混合溶液中黄芪甲苷的浓度例如可以为，但不限于0.0009g/mL、0.001g/mL、0.003g/mL、0.006g/mL、0.008g/mL、0.010g/mL或0.012g/mL，优选为0.009g/mL；
优选地，所述混合溶液中木糖苷酶的浓度例如可以为，但不限于0.001g/mL、0.002g/mL、0.003g/mL、0.004g/mL或0.005g/mL，优选为0.002g/mL；
优选地，所述GSM菌剂为含有菌体的溶液，GSM菌剂中菌体的浓度例如可以为但不限于5×107cfu/mL、7×107cfu/mL、9×107cfu/mL、1×108cfu/mL、3×108cfu/mL或5×108cfu/mL；
优选地，所述混合溶液中GSM菌剂的体积百分比例如可以为，但不限于0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％，优选为0.2％。
在一些优选的实施方式中，所述黄芪甲苷的制备方法包括以下步骤：
将黄芪依次进行乙醇提取、浓缩、萃取剂萃取、干燥和分离纯化后，制备得到黄芪甲苷。
该制备方法简单方便，制备得到的黄芪甲苷的率高，纯度高。
在一些优选的实施方式中，所述乙醇提取为采用65％-75％的乙醇对黄芪浸提，其中，乙醇的浓度例如可以为，但不限于65％、67％、69％、71％、73％或75％。
优选地，所述乙醇提取的温度例如可以为，但不限于35℃、37℃、39℃、41℃、43℃或45℃；
优选地，所述浓缩为浓缩至提取液中无乙醇。浓缩的方式例如可以为蒸发浓缩。
优选地，所述萃取剂包括乙酸乙酯或正丁醇。
通过对黄芪甲苷的制备条件的进一步优化和调整，提高黄芪甲苷得率和纯度。
在一些优选的实施方式中，所述分离纯化包括硅胶柱层析、活性炭除杂和甲醇重结晶。
本发明中，甲醇重结晶，是指用甲醇将产品加热溶解，然后缓慢令却让晶体结晶析出的过程，甲醇的加入量例如可以为产品质量的5-10倍。
在一些优选的实施方式中，所述转化反应结束后还包括对环黄芪醇进行分离纯化的步骤；
所述分离纯化包括对转化反应的溶液依次进行盐析、萃取剂萃取、干燥和重结晶。
在一些优选的实施方式中，采用氯化钠进行盐析，加入氯化钠可以减小例如乙酸乙酯和产品在水里面的容解度，更高效更大里的将产品从水相苹取出来。
优选地，所述萃取剂包括乙酸乙酯；
优选地，所述萃取后还包括采用饱和食盐水清洗萃取相的步骤，以去除萃取相中残留的杂质；
优选地，所述重结晶的溶剂包括乙醇。
第二方面，本发明提供了一种环黄芪醇产品，采用上述制备方法制备得到。
该环黄芪醇产品纯度高。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
需要说明的是，按质量份数计，以下实施例中GSM菌剂由地衣芽孢杆菌40-47份、枯草杆菌38-43份和双歧杆菌12-17份组成。菌剂中菌体的浓度大概为1×108cfu/mL，此菌剂为发明人培养得到，由于培养条件等因素的影响，菌剂中各个菌种的含量存在波动，但上述配比的菌剂与木糖苷酶配合均能够实现对黄芪甲苷的100％转化。
实施例1
一种环黄芪醇的制备方法，包括以下步骤：
黄芪甲苷的制备：黄芪10kg(甘肃)，50L 70％乙醇60℃提取1h，过滤，提取3次，合并提取液，浓缩至无乙醇味，约20L，用正丁醇10L-8L-8L萃取(即依次采用10L、8L、8L的正丁醇进行萃取，然后合并萃取相)，旋干,过AB-8大孔树脂柱，甲醇结晶得到6.8g黄芪甲苷,含量90.2％。
环黄芪醇的转化反应：100ml三口瓶中依次加入50ml 0.04MNaH2PO4-NaOH PH 6.0缓冲溶液中，90.2％黄芪甲苷0.50g，木糖苷酶0.10g，GSM菌剂0.1ml，37℃磁力搅拌反应30h。以黄芪甲苷和环黄芪醇标品作对照，分别取反应6h和30h后溶液0.6-0.8ml，加入乙酸乙酯1ml，摇匀后，取有机相做TLC爬板，展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇＝5：0.8：0.5(体积比)，结果如图3(图3中从左至右依次为黄芪甲苷、转化反应6h后的反应液和环黄芪醇标品的结果)和图4(图4中从左至右依次为黄芪甲苷、转化反应30h后的反应液和环黄芪醇标品的结果)所示，从图3中可以看出，经过6h反应，黄芪甲苷去掉了一个糖，还没有完全转化为环黄芪醇。从图4中可以看出，转化反应结束后，黄芪甲苷完全反应，产物为环黄芪醇，实现了100％转化。
环黄芪醇的制备：100ml三口瓶中依次加入50ml 0.04M NaH2PO4-NaOH PH 6.0缓冲溶液中，90.2％黄芪甲苷0.50g，木糖苷酶0.10g，GSM菌剂0.1ml，37℃磁力搅拌30h。加入氯化钠10g，乙酸乙酯萃取5次，饱和食盐水洗萃取相2次。有机相旋干称重得黄色粉末，取样检测含量90.5％，5-10倍无水乙醇重结晶2次得淡黄色晶体0.250g，HPLC-ESLD检测含量99.39％，总得率88.1％。所得环黄芪醇做核磁氢谱如图2。
实施例2
一种环黄芪醇的制备方法，包括以下步骤：
黄芪甲苷的制备：黄芪10kg(甘肃)，50L 70％乙醇60℃提取1h，过滤，提取3次，合并提取液，浓缩至无乙醇味，约20L，用正丁醇10L-8L-8L萃取，旋干,过AB-8大孔树脂柱，甲醇结晶得到6.8g黄芪甲苷,含量90.2％。
环黄芪醇的转化反应：100ml三口瓶中依次加入50ml 0.04MNaH2PO4-NaOH PH 6.0缓冲溶液中，90.2％黄芪甲苷0.050g，木糖苷酶0.10g，GSM菌剂0.1ml，37℃磁力搅拌20h。采用实施例1的方法进行TLC检测，结果显示黄芪甲苷完全反应，产物为环黄芪醇，实现了100％转化。
环黄芪醇的制备：100ml三口瓶中依次加入50ml 0.04M NaH2PO4-NaOH PH 6.0缓冲溶液中，90.2％黄芪甲苷0.050g，木糖苷酶0.10g，GSM菌剂0.1ml，37℃磁力搅拌20h。加入氯化钠10g，乙酸乙酯萃取5次，饱和食盐水洗萃取相2次。有机相旋干称重得黄色粉末，取样检测含量90.25％，5-10倍无水乙醇重结晶2次得淡黄色晶体0.026g，HPLC-ESLD检测含量99.18％，总得率91.1％。
实施例3
一种环黄芪醇的制备方法，包括以下步骤：
黄芪甲苷的制备：黄芪10kg(甘肃)，50L 70％乙醇60℃提取1h，过滤，提取3次，合并提取液，浓缩至无乙醇味，约20L，用正丁醇10L-8L-8L萃取，旋干,过AB-8大孔树脂柱，甲醇结晶得到6.8g黄芪甲苷,含量90.2％。
环黄芪醇的转化反应：250ml三口瓶中依次加入100ml 0.04MNaH2PO4-NaOH PH 6.0缓冲溶液中，90.2％黄芪甲苷0.50g，木糖苷酶0.08g，GSM菌剂0.1ml，37℃磁力搅拌30h。采用实施例1的方法进行TLC检测，结果显示黄芪甲苷完全反应，产物为环黄芪醇，实现了100％转化。
环黄芪醇的制备：250ml三口瓶中依次加入100ml 0.04MNaH2PO4-NaOH PH 6.0缓冲溶液中，90.2％黄芪甲苷0.50g，木糖苷酶0.08g，GSM菌剂0.1ml，37℃磁力搅拌30h转化完全。加入氯化钠25g，乙酸乙酯萃取5次，饱和食盐水洗萃取相2次。有机相旋干称重得黄色粉末，取样检测含量90.20％，5-10无水乙醇重结晶2次得淡黄色晶体0.242g，HPLC-ESLD检测含量99.26％，总得率85.2％。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种环黄芪醇的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
配制黄芪甲苷、木糖苷酶和GSM菌剂的混合溶液，经转化反应后，制备得到环黄芪醇；
按质量份数计，所述GSM菌剂主要由地衣芽孢杆菌40-47份、枯草杆菌38-43份和双歧杆菌12-17份组成。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶液的pH为5.5-6.5；
优选地，所述混合溶液为含有黄芪甲苷、木糖苷酶和GSM菌剂的缓冲溶液；
优选地，所述缓冲溶液包括磷酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述转化反应的温度为36-38℃，优选为37℃；
优选地，所述转化反应的时间为20h以上，优选为30h；
优选地，所述转化反应在搅拌的条件下进行。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶液中黄芪甲苷的浓度为0.0009-0.012g/mL，优选为0.009g/mL；
优选地，所述混合溶液中木糖苷酶的浓度为0.001-0.005g/mL，优选为0.002g/mL；
优选地，所述GSM菌剂为含有菌体的溶液，GSM菌剂中菌体的浓度为5×107-5×108cfu/mL；
优选地，所述混合溶液中GSM菌剂的体积百分比为0.1％-0.5％，优选为0.2％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述黄芪甲苷的制备方法包括以下步骤：
将黄芪依次进行乙醇提取、浓缩、萃取剂萃取、干燥和分离纯化后，制备得到黄芪甲苷。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇提取为采用65％-75％的乙醇对黄芪浸提；
优选地，所述乙醇提取的温度为35-45℃；
优选地，所述浓缩为浓缩至提取液中无乙醇；
优选地，所述萃取剂包括乙酸乙酯或正丁醇。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述分离纯化包括大孔树脂层析、活性炭除杂和甲醇重结晶。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述转化反应结束后还包括对环黄芪醇进行分离纯化的步骤；
所述分离纯化包括对转化反应的溶液依次进行盐析、萃取剂萃取、干燥和重结晶。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，采用氯化钠进行盐析；
优选地，所述萃取剂包括乙酸乙酯；
优选地，所述萃取后还包括采用饱和食盐水清洗萃取相的步骤；
优选地，所述重结晶的溶剂包括乙醇。
10.一种环黄芪醇产品，其特征在于，采用权利要求1-9任一项所述的制备方法制备得到。
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