CN116334151A - 一种合成右旋酮洛芬的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种合成右旋酮洛芬的方法。包括以下步骤：S1：以酮洛芬酰胺为原料，在反应介质、助溶剂、相转移催化剂、酰胺酶体系下进行水解反应，分离纯化，得到右旋酮洛芬和左旋酮洛芬酰胺；S2：将左旋酮洛芬酰胺在溶剂、碱存在下进行化学消旋化反应，得到酮洛芬酰胺；将酮洛芬酰胺作为原料重复步骤S1。本发明具有高的底物浓度和低的酶底比，高选择性、高转化率和产物高纯度，更高效率、低溶剂用量、更低成本、原料达到充分利用、固废排放少，可达到酶催化工业化生产需求，具有很好的工业应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及酶水解合成技术领域，尤其涉及一种合成右旋酮洛芬的方法。
背景技术
右旋酮洛芬，又称为(S)-(+)-酮洛芬、(S)-酮基布洛芬、右酮洛芬、(S)-(+)-2-(3-苯甲酰基苯基)丙酸，是2-芳基丙酸类非甾体抗炎药，其商品形式是右旋酮洛芬氨丁三醇。酮洛芬有一个手性中心，两个对映异构体，其中只有右旋酮洛芬具有抗炎抗风湿和镇痛作用，左旋酮洛芬几乎没有药理作用且有毒副作用。右旋酮洛芬于1996年由意大利Menarini公司开发并首次在西班牙上市，其消炎镇痛等作用是外消旋体的两倍，说明左旋酮洛芬是无药效的。故合成生产单一异构体右旋酮洛芬有很好的应用价值。
目前，右旋酮洛芬主要合成方法有化学非对称合成、化学拆分、酶法拆分(包括酯酶、脂肪酶、腈水解酶、腈水合酶、酰胺酶)。
化学不对称合成方法，需要用到重金属手性催化剂和高温高压条件，大部分催化剂毒性较高、会造成环境污染、另外手性催化剂成本较高；化学拆分均涉及重结晶，耗时且增加了成本、降低了产率，另外拆分剂用量大成本高，废水废溶剂多；脂肪酶或酯酶催化拆分，缺点是原料浓度太低、酶用量大、反应介质不环保、产物ee％值低、产物混合物不好分离；腈水解酶水解拆分，得到产品ee％值太低；腈水合酶和酰胺酶二步酶法水解拆分酮洛芬腈合成右旋酮洛芬，大都浓度低，产率低，二步酶法增加成本，后处理步骤繁琐。
酰胺酶水解拆分酮洛芬酰胺合成右旋酮洛芬有较多报道，如Appl.Microbiol.Biotechnol.,1994,42:1-7用来源于Agrobacterium tumefaciensstrain d3的酰胺酶反应，转化率5％，ee％值97％。BIOTECHNOLOGY LETTERS,1995,17(2):187-192介绍了微生物酰胺酶，Rhodococcus sp.C3II菌体转化2mM原料，20.5h转化率53％，右旋酮洛芬ee％值97％；Rhodococcus erythropolis MP 50菌体转化0.2mM原料，转化率49％，右旋酮洛芬ee％值99％。Protein&Peptide Letters,2008,15,617-623报道Sulfolobus solfataricus的酰胺酶反应，1.5g酮洛芬酰胺100mL甲醇溶解，500mLTris-HCl缓冲液，12mg纯化酶，70℃反应24h，光学纯度99.6％ee。CN111363736用Klebsiella酰胺酶制备右旋酮洛芬，如实施例6中0.8g酶粉，用100mL磷酸钠缓冲液重悬，4g酰胺酮洛芬溶于10mL甲苯流加入反应瓶，保温反应10h，产物ee％值为100％，转化率50.85％。CN111378637用Agrobacterium酰胺酶制备右旋酮洛芬，如实施例6中1g酶粉，用100mL磷酸钠缓冲液重悬，4g酰胺酮洛芬溶于10mL甲苯流加入反应瓶，保温反应10h，产物ee％值为99.8％，转化率50.75％。CN114134132对Rhodococcus erythropolis MP50酰胺酶进行突变，最高活力突变体反应，如实施例9中AMD03-38酶粉0.37g，100mL磷酸钠缓冲液，6g酰胺酮洛芬溶于10mL乙酸乙酯滴加入反应瓶，保温反应24h，转化率49％，产物ee％值为99.5％。
根据前述右旋酮洛芬的各种合成方法，化学不对称合成和化学拆分方法不环保、过程繁琐、溶剂用量大；其他酶催化拆分方法，存在酶活力低、反应原料浓度低、酶底比高、成本高、产物ee％偏低等问题。相对理想的方法是酰胺酶水解拆分酮洛芬酰胺方法，但存在几个问题限制了其工业应用，具体包括：
(1)反应投料浓度普偏较低，酶底比高，时空产率不高，无法满足大规模工业化生产要求；
(2)由于原料几乎不溶解于水需要加入较多的助溶剂，用水溶性溶剂如甲醇等用量较多会影响酶的活力，用水不溶溶剂如甲苯和乙酸乙酯、双液相反应会造成酶界面失活、原料接触不充分、反应液乳化、溶剂用量大；
(3)无效体左旋酮洛芬酰胺均没有回收利用，导致物料成本增加和固废产生；
(4)反应介质不环保，加入大量含磷缓冲液产生含磷废水，不利于放大生产。
因此有必要开发更高效、环保、高产率的酰胺酶水解拆分方法以满足工业生产要求。
发明内容
针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种合成右旋酮洛芬的方法，其解决了现有技术中存在反应原料浓度低、酶底比高、助溶剂用量多、反应介质不环保、无效体不回收的问题。
本发明提供一种合成右旋酮洛芬的方法，包括以下步骤：
S1：以酮洛芬酰胺为原料，在反应介质、助溶剂、相转移催化剂、酰胺酶体系下进行水解反应，分离纯化，得到右旋酮洛芬和左旋酮洛芬酰胺；
S2：将左旋酮洛芬酰胺在溶剂、碱存在下进行化学消旋化反应，得到酮洛芬酰胺；将酮洛芬酰胺作为原料重复步骤S1，其反应过程如下所示：
进一步地，步骤S1中，所述反应介质为Tris-HCl缓冲液、水、三乙醇胺-HCl中的一种，优选为水；
所述相转移催化剂为苄基三甲基氯化铵、苄基三乙基氯化铵、苄基三丁基氯化铵、四甲基氯化铵、四乙基氯化铵、四丁基氯化铵、四丁基氟化铵、四丁基溴化铵中的一种，优选为四甲基氯化铵；
所述助溶剂为二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、甲苯中的一种，优选为二甲基亚砜。
因为酰胺水解产物为羧酸铵盐，过程中pH变化不大，不需要使用过量缓冲液特别是磷酸盐作为反应介质。DMSO是极性强的惰性溶剂，水溶性好、原料溶解度高、低浓度对酶影响有限。加入少量相转移催化剂，有利于原料分散和酶接触，提高反应速率。
进一步地，步骤S1中，所述酰胺酶具有选择性酮洛芬酰胺水解活性，
优选来自Rhodococcus erythropolis CCM2595酰胺酶，所述Rhodococcuserythropolis CCM2595酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，步骤S1中，所述酰胺酶的存在形式包括酶液、酶粉、菌体、固定化酶中的一种。
进一步地，步骤S1中，所述水解反应的温度为40℃；pH值为8.0。
进一步地，步骤S1中，所述酮洛芬酰胺在反应介质中的浓度为100g/L；所述酰胺酶与酮洛芬酰胺的质量比为1/20。
进一步地，所述助溶剂在反应介质中的体积浓度为1-50％，优选为5％；所述相转移催化剂在反应介质中的质量浓度为0.1-10％，优选为0.5％。
进一步地，步骤S2中，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、碳酸钠、碳酸钾中的一种，优选为氢氧化钾。
进一步地，步骤S2中，所述溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇中的一种，优选为乙醇。
进一步地，步骤S2中，所述消旋化反应的温度为20-80℃，优选为40℃。
术语“质量浓度”是指：单位体积混合物中某组分的质量称为该组分的质量浓度，以符号ρ表示，单位为g/ml。
术语“体积浓度”是指：在相同的温度和压力下，物质B的体积VB与溶液的体积V之比，称为物质B的体积分数，又称体积百分比，符号为φB，表达式为φB＝(VB÷V)×100％，V/V或ml/ml。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的酰胺酶催化制备右旋酮洛芬新方法，具有高的底物浓度和低的酶底比，底物浓度高达100g/L，酶底比低至1/20；具有高选择性、高转化率和产物高纯度，转化率﹥46％、产物光学纯度﹥99.5％，产品纯度﹥99.5％，可达到酶催化工业化生产需求，具有很好的工业应用潜力。
(2)本发明利用反应介质、低浓度助溶剂、少量相转移催化剂、酰胺酶的反应体系水解酮洛芬酰胺制备右旋酮洛芬，优选来自Rhodococcus erythropolis CCM2595酰胺酶，反应过程中反应介质(优选为水)更安全环保，助溶剂浓度(体积浓度5％)更低，相转移催化剂用量更少(质量浓度0.5％)，成本更低。
(3)在利用酰胺酶制备右旋酮洛芬的过程中，一般只有50％转化为右旋酮洛芬，不回收左旋酮洛芬酰胺，会导致产品生产成本过高，不利于酶催化工业化生产。本发明将无效体左旋酮洛芬酰胺从反应液中分离，并将无效体进行化学消旋化处理，再将消旋化的无效体作为反应原料进行循环利用，该方法使无效体的回收率达到95％以上，使原料达到充分利用，提高了原料的利用率，降低了成本和固废排放。
附图说明
图1为本发明实施例7中原料转化率的反相高效液相色谱图。
图2为本发明实施例7中产品光学纯度的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明中的技术方案进一步说明。不同酰胺酶的制备根据酶的常规制备方法获得(参见《酶工程》第四版，科学出版社，郭勇著；《基因工程》第二版，科学出版社出版，郭江峰、于威著)，即通过构建产酶的基因工程大肠杆菌，然后诱导培养表达，再制备所需酶制剂，其中Rhodococcus erythropolis CCM2595酰胺酶氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，Rhodococcus eythropolis MP50酰胺酶来自BIOTECHNOLOGY LETTERS,1995,17(2):187-192，Sulfolobus solfataricus酰胺酶来自Protein&Peptide Letters,2008,15,617-623。
实施例1不同酰胺酶测试反应
500ml反应瓶中，加入100mL pH8.0的0.1M Tris-HCl缓冲液，原料酮洛芬酰胺10g用20mL DMSO溶解后加入反应瓶中，再加入制备的不同酰胺酶，用氢氧化钠水溶液调节至pH8.0，40℃搅拌反应24h，取样分析，测定转化率和产物右旋酮洛芬ee％值，检测结果如表1所示。
表1不同酰胺酶反应的转化率和产物ee值
由表1可知：Rhodococcus erythropolis CCM2595酰胺酶的催化活性明显高于Rhodococcus eythropolis MP50酰胺酶和Sulfolobus solfataricus酰胺酶的催化活性。
实施例2不同介质酰胺酶拆分反应
500ml反应瓶中，加入100mL pH8.0缓冲液或纯水，原料酮洛芬酰胺10g用20mLDMSO溶解后加入反应瓶中，再加入Rhodococcus erythropolis CCM2595酰胺酶酶粉0.5g，用氢氧化钠水溶液调节至pH8.0，40℃搅拌反应24h，取样分析，测定转化率和产物右旋酮洛芬ee％值。结果如表2所示。
表2不同介质时酰胺酶反应的转化率和产物ee值
| 反应介质 | 转化率 | 产物ee％值 |
| 0.1MTris-HCl | 43.10％ | 99.72％ |
| 0.1M三乙醇胺-HCl | 42.65％ | 99.70％ |
| 纯水 | 42.74％ | 99.74％ |
由表2可知：纯水介质与两种缓冲反应效果相当，根据成本和环保要求，确定以纯水为反应介质。
实施例3不同助溶剂酰胺酶拆分反应
50ml反应瓶中，加入纯水10mL，原料酮洛芬酰胺1g用2mL溶剂溶解后加入反应瓶中，再加入Rhodococcus erythropolis CCM2595酰胺酶酶粉50mg，用氢氧化钠水溶液调节至pH8.0，40℃搅拌反应24h，取样分析，测定转化率和产物右旋酮洛芬ee％值，结果如表3所示。
表3不同助溶剂时酰胺酶反应的转化率和产物ee值
由表3可知：溶剂DMSO为最佳反应助溶剂。
实施例4不同DMSO浓度酰胺酶拆分反应
50ml反应瓶中，加入纯水10mL、原料酮洛芬酰胺1g、不同量DMSO，最后加入Rhodococcus erythropolis CCM2595酰胺酶酶粉50mg，用氢氧化钠水溶液调节至pH8.0，40℃搅拌反应24h，取样分析，测定转化率和产物右旋酮洛芬ee％值，结果如表4所示。
表4不同DMSO浓度时酰胺酶反应的转化率和产物ee值
| DMSO浓度 | 转化率 | 产物ee％值 |
| 1％ | 36.63％ | 99.74％ |
| 5％ | 41.31％ | 99.75％ |
| 10％ | 42.69％ | 99.73％ |
| 20％ | 43.72％ | 99.75％ |
| 30％ | 40.33％ | 99.74％ |
| 50％ | 29.87％ | 99.70％ |
由表4可知：根据成本和反应效果，确定5％的DMSO用量。
实施例5不同相转移催化剂酰胺酶拆分反应
50ml反应瓶中，加入纯水10mL、原料酮洛芬酰胺1g、DMSO 0.5mL，再加入1％相转移催化剂(100mg)，最后加入Rhodococcus erythropolis CCM2595酰胺酶酶粉50mg，用氢氧化钠水溶液调节至pH8.0，40℃搅拌反应24h，取样分析，测定转化率和产物右旋酮洛芬ee％值，结果如表5所示。
表5不同相转移催化剂时酰胺酶反应的转化率和产物ee值
由表5可知：最佳相转移催化剂为四甲基氯化铵。
实施例6不同浓度四甲基氯化铵酰胺酶拆分反应
50ml反应瓶中，加入纯水10mL、原料酮洛芬酰胺1g、DMSO 0.5mL，再加入不同量四甲基氯化铵，最后加入Rhodococcus erythropolis CCM2595酰胺酶酶粉50mg，用氢氧化钠水溶液调节至pH8.0，40℃搅拌反应24h，取样分析，测定转化率和产物右旋酮洛芬ee％值。结果如表6所示。
表6不同浓度四甲基氯化铵的酰胺酶反应的转化率和产物ee值
| 四甲基氯化铵浓度 | 转化率 | 产物ee％值 |
| 0.1％ | 43.27％ | 99.75％ |
| 0.5％ | 46.39％ | 99.73％ |
| 1％ | 46.04％ | 99.71％ |
| 2％ | 44.38％ | 99.72％ |
| 5％ | 40.19％ | 99.73％ |
| 10％ | 35.67％ | 99.75％ |
由表6可知：相转移催化剂四甲基氯化铵最佳浓度为0.5％。
实施例7酰胺酶拆分酮洛芬酰胺合成右旋酮洛芬
3L反应瓶中，加入2L纯水，酮洛芬酰胺200g、100mL DMSO、四甲基氯化铵10g，开启搅拌和温度40℃，待温度达到设定温度，加入Rhodococcus erythropolis CCM2595酰胺酶粉10g，用氢氧化钠水溶液调节至pH8.0，保温反应，TLC监控反应过程，HPLC检测转化率，当转化率大于45％时，结束反应，调节至pH10.0，反应液采用等体积的乙酸乙酯萃取3次，离心分液，合并有机相，减压蒸馏，烘箱干燥后，得到无效体左旋酮洛芬酰胺100.73g，ee％值93.75％，HPLC纯度99.72％；萃取后的水相调酸后，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，减压蒸馏后，烘箱干燥，得到右旋酮洛芬86.32g，ee％值99.75％，HPLC纯度99.91％。酰胺酶反应结束时取样分析转化率的反相高效液相色谱图如图1所示，其中，酮洛芬保留时间为7.299min、酮洛芬酰胺的保留时间分别为10.148min。反应结束时分样取样分析产品光学纯度的正相手性高效液相色谱图如图2所示，涉及产物右旋酮洛芬和左旋酮洛芬、原料右旋酮洛芬酰胺和左旋酮洛芬酰胺，其中，左旋酮洛芬的保留时间分别为8.148min，右旋酮洛芬保留时间为10.297min、右旋酮洛芬酰胺保留时间为11.377min、左旋酮洛芬酰胺的保留时间分别为13.798min。
实施例8不同溶剂中左旋酮洛芬酰胺的消旋反应
在50mL反应瓶中依次加入2g左旋酮洛芬酰胺、10mL溶剂、0.04g氢氧化钠，50℃搅拌反应3h，反应结束取样，测定酰胺的ee％值，结果如表7所示。
表7不同溶剂左旋酮洛芬酰胺的消旋反应结果
| 溶剂 | 消旋前酰胺ee％值 | 消旋后酰胺ee％值 |
| 甲醇 | 93.75％ | 0.61％ |
| 乙醇 | 93.75％ | 0.27％ |
| 正丙醇 | 93.75％ | 1.53％ |
| 异丙醇 | 93.75％ | 2.98％ |
由表7可知：消旋反应的最佳溶剂为乙醇。
实施例9不同碱中左旋酮洛芬酰胺的消旋反应
在50mL反应瓶中依次加入2g左旋酮洛芬酰胺、10mL乙醇、0.04g碱，50℃反应3h，反应结束后取样，测定酰胺的ee％值，结果如表8所示。
表8不同碱左旋酮洛芬酰胺的消旋反应结果
| 碱 | 消旋前酰胺ee％值 | 消旋后酰胺ee％值 |
| 氢氧化钠 | 93.75％ | 0.35％ |
| 氢氧化钾 | 93.75％ | 0.23％ |
| 氢氧化锂 | 93.75％ | 3.50％ |
| 碳酸钠 | 93.75％ | 37.53％ |
| 碳酸钾 | 93.75％ | 1.24％ |
由表8可知：消旋反应最佳碱为氢氧化钾。
实施例10不同温度左旋酮洛芬酰胺的消旋反应
在50mL反应瓶中依次加入2g左旋酮洛芬酰胺、10mL乙醇、0.04g氢氧化钾，不同温度反应，过程取样，测定酰胺的ee％值。结果如表9所示。
表9不同温度左旋酮洛芬酰胺的消旋反应结果
| 温度 | 消旋前酰胺ee％值 | 消旋后酰胺ee％值 | 消旋时间 |
| 20℃ | 93.75％ | 1.75％ | 10h |
| 40℃ | 93.75％ | 0.25％ | 4h |
| 60℃ | 93.75％ | 0.26％ | 2h |
| 80℃ | 93.75％ | 0.17％ | 1h |
由表9可知：根据安全、能耗、反应效率，消旋反应最佳温度为40℃。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种合成右旋酮洛芬的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：以酮洛芬酰胺为原料，在反应介质、助溶剂、相转移催化剂、酰胺酶体系下进行水解反应，分离纯化，得到右旋酮洛芬和左旋酮洛芬酰胺；
S2：将左旋酮洛芬酰胺在溶剂、碱存在下进行化学消旋化反应，得到酮洛芬酰胺；将酮洛芬酰胺作为原料重复步骤S1，其反应过程如下所示：
2.如权利要求1所述的一种合成右旋酮洛芬的方法，其特征在于：步骤S1中，所述反应介质为Tris-HCl缓冲液、水、三乙醇胺-HCl中的一种，优选为水；
所述相转移催化剂为苄基三甲基氯化铵、苄基三乙基氯化铵、苄基三丁基氯化铵、四甲基氯化铵、四乙基氯化铵、四丁基氯化铵、四丁基氟化铵、四丁基溴化铵中的一种，优选为四甲基氯化铵；
所述助溶剂为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、甲苯中的一种，优选为二甲基亚砜。
3.如权利要求1所述的一种合成右旋酮洛芬的方法，其特征在于：步骤S1中，所述酰胺酶具有选择性酮洛芬酰胺水解活性，
优选来自Rhodococcus erythropolis CCM2595酰胺酶，所述Rhodococcuserythropolis CCM2595酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求1所述的一种合成右旋酮洛芬的方法，其特征在于：步骤S1中，所述酰胺酶的存在形式包括酶液、酶粉、菌体、固定化酶中的一种。
5.如权利要求1所述的一种合成右旋酮洛芬的方法，其特征在于：步骤S1中，所述水解反应的温度为40℃，pH值为8.0。
6.如权利要求1所述的一种合成右旋酮洛芬的方法，其特征在于：步骤S1中，所述酮洛芬酰胺在反应介质中的浓度为100g/L；所述酰胺酶与酮洛芬酰胺的质量比为1/20。
7.如权利要求1所述的一种合成右旋酮洛芬的方法，其特征在于：步骤S1中，所述助溶剂在反应介质中的体积浓度为1-50％，优选为5％；所述相转移催化剂在反应介质中的质量浓度为0.1-10％，优选为0.5％。
8.如权利要求1所述的一种合成右旋酮洛芬的方法，其特征在于：步骤S2中，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、碳酸钠、碳酸钾中的一种，优选为氢氧化钾。
9.如权利要求1所述的一种合成右旋酮洛芬的方法，其特征在于：步骤S2中，所述溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇中的一种，优选为乙醇。
10.如权利要求1所述的一种合成右旋酮洛芬的方法，其特征在于：步骤S2中，所述消旋化反应的温度为20-80℃，优选为40℃。
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