CN116327613A - 一种类外泌体仿生制剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，特别是涉及一种类外泌体仿生制剂的制备方法及其应用。所述类外泌体仿生制剂包括多个类外泌体前体LPO‑EXO；所述类外泌体前体LPO‑EXO包括：仿生磷脂双分子壳体，所述仿生磷脂双分子壳体包括仿生磷脂双分子外壳体和仿生磷脂双分子内壳体，所述仿生磷脂双分子内壳体在内侧，仿生磷脂双分子外壳体在外侧；囊内物，所述囊内物包括水溶性活性物质和油溶性活性物质，所述水溶性活性物质设置在仿生磷脂双分子外壳体和仿生磷脂双分子内壳体之间，以及仿生磷脂双分子内壳体内部；所述油溶性活性物质被包裹在仿生磷脂双分子外壳体和仿生磷脂双分子内壳体之间。结构更加稳定、亲肤性更高，内含物成分可定性、定量。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别是涉及一种类外泌体仿生制剂的制备方法及其应用。
背景技术
外泌体是所有活细胞都会分泌的一种天然纳米级别的小囊泡，是细胞间信息交流的重要媒介，囊泡内富含核酸，蛋白质和脂质。脐带间充质干细胞外泌体因其含有丰富的营养物质及靶向性，被广泛运用在医药，化妆品及医美等领域。
外泌体获取难度大，资源稀缺，各种提取方法又或多或少对脐带间充质干细胞外泌体纯度、活性等产生影响。比如一、超速离心法，此法成本高，难操作，时间长，高速离心会损伤外泌体从而影响纯度；二、超滤离心，这种操作简单，成本较低，但纯度一般，会损失部分外泌体的生物活性，且存在纯度不足的问题；三、免疫亲和捕获法，实际成本高，产率低，适合游离细胞样本，癌症异质性会影响免疫识别，抗原决定簇可能被封闭；四、微流体法，缺乏大规模临床样本测试，缺乏方法学的验证，以及适合小样本量的提取。以上四种方法获得的外泌体均不易长期常温存储，并且提取获得的外泌体，内含的营养物质成分复杂，难以定性定量分析。因此急需一种类外泌体仿生制剂，可以替代现有从胎盘等生物体内提取出的获得的外泌体。进而解决医药，化妆品及医美等领域的应用需求。但目前还没有相关技术可以实现。
发明内容
本发明提供了一种类外泌体仿生制剂的制备方法及其应用，解决了现有的外泌体获取效率低，难度大，无法批量化生产，同时提取的外泌体成分易遭破坏的技术问题。
为了实现上述目的，本发明实施例，一方面公开了，一种类外泌体仿生制剂，所述类外泌体仿生制剂包括多个类外泌体前体LPO-EXO；
所述类外泌体前体LPO-EXO包括：
仿生磷脂双分子壳体，所述仿生磷脂双分子壳体包括仿生磷脂双分子外壳体和仿生磷脂双分子内壳体，所述仿生磷脂双分子内壳体在内侧，仿生磷脂双分子外壳体在外侧；
囊内物，所述囊内物包括水溶性活性物质和油溶性活性物质，所述水溶性活性物质设置在仿生磷脂双分子外壳体和仿生磷脂双分子内壳体之间的第一空间内，以及仿生磷脂双分子内壳体内部的第二空间内；所述油溶性活性物质被包裹在仿生磷脂双分子外壳体内部的第三空间内和仿生磷脂双分子内壳体内部的第四空间内。
进一步的，所述油溶性活性物质以重量份计包括：氢化卵磷脂1.8-2.5份、生育酚乙酸酯0.2-0.3份、神经酰胺0.3-0.5份和角鲨烷2-3份。
进一步的，所述水溶性活性物质以重量份计包括，所述水溶性活性物质以重量份计包括，纯水78.8-89份、甘油2-5份、羟基苯乙酮0.4-0.6份、色氨酸0.5-1.5份、吡咯烷酮羧酸2-3.5份、水解透明质酸钠0.3-1份、水解肌动蛋白0.2-0.5份、水解胶原蛋白0.2-0.5份、β-烟酰胺单核苷酸0.2-0.5份、聚脱氧核糖核苷酸0.5-1.2份和1,2己二醇0.4-0.6份。
进一步的，所述类外泌体仿生制剂表面为向外突出的软毛刺结构。
进一步的，所述类外泌体仿生制剂还包括金粉。
本发明实施例还提供了一种制备类外泌体仿生制剂的方法，包括以下步骤，
(1)将纯水78.8-89份、甘油2-5份、羟基苯乙酮0.4-0.6份混合形成A相，将A相加入70℃水相锅加热搅拌，转速30r/min，溶解充分，保温15min后降温至35℃备用；
(2)将B相物质色氨酸0.5-1.5份、吡咯烷酮羧酸2-3.5份、水解透明质酸钠0.3-1份、水解肌动蛋白0.2-0.5份、水解胶原蛋白0.2-0.5份、β-烟酰胺单核苷酸0.2-0.5份、聚脱氧核糖核苷酸0.5-1.2份和1,2己二醇0.4-0.6份，逐一加入A相中，搅拌转速30r/min，搅拌时间30min，搅拌均匀形成水相混合物备用；
(3)将氢化卵磷脂1.8-2.5份、生育酚乙酸酯0.2-0.3份、神经酰胺0.3-0.5份、角鲨烷2-3份混合后形成C相，将C相加入上述混合物中，搅拌转速40r/min，均质40HZ，均值时间5min，初步形成乳化体系备用；
(4)将得到的流体再利用微射流均质机设置压力1000-1200bar，温度30～35℃下进行高压均质处理，得到类外泌体前体LPO-EXO；
(5)将琼脂糖0.5-0.8份和金粉0.5-1份加入乳化锅中，45r/min边搅拌边加热至75～80℃，并保温5分钟之后，降温至40-45℃后保温，加入类外泌体前体LPO-EXO100份，10r/min搅拌至均匀得到水相混合物；
(6)在油相锅内加入椰油醇-辛酸酯/癸酸酯TO 100份、聚酰胺-81.485-2.475份、季戊四醇四(双-叔丁基羟基氢化肉桂酸)酯0.015-0.025份混合加热溶解形成油相混合物；
(7)将油相混合物转入冷却降温设备，控制温度在5-10℃左右，油相搅拌速度保持在20-30r/min；
(8)将水相混合物通过0.5-3mm疏水性滤网加入油相混合物中，重量比，水相混合物：油相混合物＝1:0.5～1:1，保持油相搅拌速率不变，温度控制在5-10℃，颗粒硬化后继续搅拌1小时封存，得到类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO。
进一步的，所述制备类外泌体仿生制剂的方法，包括以下步骤，
(1)将纯水83.9份、甘油3份、羟基苯乙酮0.5份混合形成A相，将A相加入70℃水相锅加热搅拌，转速30r/min，溶解充分，保温15min后降温至35℃备用；
(2)将B相物质色氨酸1份、吡咯烷酮羧酸3份、水解透明质酸钠0.3份、水解肌动蛋白0.3份、水解胶原蛋白0.5份、β-烟酰胺单核苷酸0.3份、聚脱氧核糖核苷酸1份和1,2己二醇0.5份，逐一加入A相中，搅拌转速30r/min，搅拌时间30min，搅拌均匀形成水相混合物备用；
(3)将氢化卵磷脂2份、生育酚乙酸酯0.2份、神经酰胺0.5份、角鲨烷3份混合后形成C相，将C相加入上述混合物中，搅拌转速40r/min，均质40HZ，均值时间5min，初步形成乳化体系备用；
(4)将得到的流体再利用微射流均质机设置压力1000-1200bar，温度30～35℃下进行高压均质处理，得到类外泌体前体LPO-EXO；
(5)将琼脂糖0.7份和金粉0.8份加入乳化锅中，45r/min边搅拌边加热至75～80℃，并保温5分钟之后，降温至40-45℃后保温，加入类外泌体前体LPO-EXO TO 100份，10r/min搅拌至均匀得到水相混合物；
(6)在油相锅内加入椰油醇-辛酸酯/癸酸酯TO 100份、聚酰胺-82.475份、季戊四醇四(双-叔丁基羟基氢化肉桂酸)酯0.025份混合加热溶解形成油相混合物；
(7)将油相混合物转入冷却降温设备，控制温度在10℃左右，油相搅拌速度保持在30r/min；
(8)将水相混合物通过0.5-3mm疏水性滤网加入油相混合物中，重量比，水相混合物：油相混合物＝1:0.5，保持油相搅拌速率不变，温度控制在8℃，颗粒硬化后继续搅拌1小时封存，得到类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO。
进一步的，所述金粉用于着色。
进一步的，所述类外泌体仿生制剂用于精华液。
进一步的，类外泌体仿生制剂用于面霜、面膜、眼霜、洁面乳或爽肤水。
本发明相比现有技术的有益效果是：通过独特的内部磷脂双分子层结构，使得其具有更好的亲肤性，同时使得类外泌体仿生制剂具有更好的活性物质缓释效果；结构更加稳定，更加便于存储和运输；成分来源可控，可实现定性定量控制。
附图说明
图1是本申请所述类外泌体前体LPO-EXO的光学显微镜结构示意图。
图2是本申请所述单个类外泌体前体LPO-EXO的结构示意图。
图3是本申请所述类外泌体仿生制剂整体的结构表征图。
图4是本申请所述类外泌体仿生制剂单体的结构表征图。
图5是本申请所述类外泌体仿生制剂的结构示意图。
图6是本申请所述类外泌体前体LPO-EXO的制备工艺流程图。
图7是本申请所述类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO固化的工艺流程图。
图8是本申请类外泌体仿生制剂斑贴实验结果图。
图9使用精华液后皮肤角质层含水量SCH变化图。
图10、使用面霜后皮肤角质层含水量SCH变化图。
图11、使用精华液后经皮水分散失TEWL值变化图。
图12、使用面霜后经皮水分散失TEWL值变化图。
图13、使用精华液后皮肤紧致度R0变化图。
图14、使用面霜后皮肤紧致度R0变化图。
图15、使用精华液后皮肤弹性R2变化图。
图16、使用面霜后皮肤弹性R2变化图。
附图标记说明：1、亲水基团；2、亲油基团；3、水溶性活性物；4、仿生磷脂双分子外壳体；5、油溶性活性物；6、仿生磷脂双分子内壳体；7、第三空间；8、第一空间；9、第四空间；10、第二空间。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请实施例的说明书和权利要求书中的术语“第一”和“第二”等是用于区别不同的对象，而不是用于描述对象的特定顺序。例如，第一导轮和第二导轮等是用于区别不同的介质层，而不是用于描述介质层的特定顺序。
在本申请实施例的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是指两个或两个以上。例如，多个元件是指两个元件或两个以上元件。
在本申请实施例中，“示例性的”或者“例如”等词用于表示作例子、例证或说明。本申请实施例中被描述为“示例性的”或者“例如”的任何实施例或设计方案不应被解释为比其它实施例或设计方案更优选或更具优势。确切而言，使用“示例性的”或者“例如”等词旨在以具体方式呈现相关概念。
现有技术中类外泌体用与医药，化妆品，通常都是通过提取、分离的方法获得，但是提取获得的类外泌体，成分易遭破坏，保存困难，同时类外泌体成分又具有不确定性。因此获得一种类外泌体仿生制剂及其制备方法将很好的解决该问题。
本发明实施例公开了一种类外泌体仿生制剂，包括多个类外泌体前体LPO-EXO；所述类外泌体前体LPO-EXO包括：仿生磷脂双分子壳体，所述仿生磷脂双分子壳体包括仿生磷脂双分子外壳体和仿生磷脂双分子内壳体，所述仿生磷脂双分子内壳体在内侧，仿生磷脂双分子外壳体在外侧；囊内物，所述囊内物包括水溶性活性物质和油溶性活性物质，所述水溶性活性物质设置在仿生磷脂双分子外壳体和仿生磷脂双分子内壳体之间的第一空间内，以及仿生磷脂双分子内壳体内部第二空间内；所述油溶性活性物质被包裹在仿生磷脂双分子外壳体内部的第三空间内和仿生磷脂双分子内壳体内部的第四空间内。通过内外双层设置的仿生磷脂双分子壳体进而来模仿外泌体结构，从而使其具备外泌体的靶向性和亲肤性，以及使其具备更好的活性物质缓释性。从而有效解决，外泌体获得成本高，批量制备效率低获取难度大，不易存储运输，且活性成分不确定性大，无法实现活性物质定性、定量控制的技术问题。同时通过人工合成的类外泌体仿生制剂，不仅可获得外泌体的特殊性能，同时使其在运输存储上更加便捷，通过内部水相、油相等活性物质的控制，进而使得活性物质清楚明晰、定向定量控制，另外通过特殊工艺及外部结构调整，使其具有更好的亲肤性及结构更加稳定。进而为类外泌体仿生制剂大面积应用于生物、医药、医美等奠定坚实的基础。
LPO-EXO：类外泌体前体。
MO-LPO-EXO：类外泌体仿生制剂。
纯水TO 100份:指在添加其他物质后，添加纯水，使物质整体达到100份。
椰油醇-辛酸酯/癸酸酯TO 100份：指在添加其他物质后，添加椰油醇-辛酸酯/癸酸酯，使物质整体达到100份。
下面结合附图对本申请实施例进行进一步阐述，如图1-图5所示，本发明实施例公开了一种类外泌体仿生制剂，具体所述类外泌体仿生制剂包括多个类外泌体前体LPO-EXO和囊内物，所述囊内物包括水溶性活性物质3和油溶性活性物质5；所述类外泌体前体LPO-EXO包括：仿生磷脂双分子壳体，所述仿生磷脂双分子壳体包括仿生磷脂双分子外壳体4和仿生磷脂双分子内壳体6，仿生磷脂双分子外壳体4和仿生磷脂双分子内壳体6的内侧和外侧为亲水基团1，亲油基团2朝向中间。所述仿生磷脂双分子内壳体6在内侧，仿生磷脂双分子外壳体4在外侧；所述水溶性活性物质3设置在仿生磷脂双分子外壳体4和仿生磷脂双分子内壳体6之间的第一空间8内，以及仿生磷脂双分子内壳体6内部的第二空间10内；所述油溶性活性物质5被包裹在仿生磷脂双分子外壳体4内部的第三空间7内和仿生磷脂双分子内壳体6内部的第四空间9内。进而实现水溶性活性物质3和油溶性活性物质5的依次双层包裹。
示例性的，为了使得类外泌体仿生制剂具有更好的稳定性，抗氧化性以及修护、润肤效果，所述油溶性活性物质5以重量份计包括：氢化卵磷脂1.8份、生育酚乙酸酯0.2份、神经酰胺0.3份和角鲨烷2份。为了使得类外泌体仿生制剂，具有更好的稳定性、保湿性，以及使得其具有抗衰，所述水溶性活性物质3以重量份计包括，纯水89份、甘油2份、羟基苯乙酮0.4份、色氨酸0.5份、吡咯烷酮羧酸2份、水解透明质酸钠0.3份、水解肌动蛋白0.2份、水解胶原蛋白0.2份、β-烟酰胺单核苷酸0.2份、聚脱氧核糖核苷酸0.5份和1,2己二醇0.4份。
示例性的，为了使得类外泌体仿生制剂具有更好的稳定性，抗氧化性以及修护、润肤效果，所述油溶性活性物质5以重量份计包括：氢化卵磷脂2份、生育酚乙酸酯0.2份、神经酰胺0.5份和角鲨烷3份。所述水溶性活性物质3以重量份计包括，纯水83.7份、甘油3份、羟基苯乙酮0.5份、色氨酸1份、吡咯烷酮羧酸3份、水解透明质酸钠0.5份、水解肌动蛋白0.3份、水解胶原蛋白0.5份、β-烟酰胺单核苷酸0.3份、聚脱氧核糖核苷酸1份和1,2己二醇0.5份。
示例性的，为了使得类外泌体仿生制剂具有更好的稳定性，抗氧化性以及修护、润肤效果，所述油溶性活性物质5以重量份计包括：氢化卵磷脂2.5份、生育酚乙酸酯0.3份、神经酰胺0.5份和角鲨烷-3份。为了使得类外泌体仿生制剂，具有更好的稳定性、保湿性，以及使得其具有抗衰，所述水溶性活性物质3以重量份计包括，纯水78.8份、甘油5份、羟基苯乙酮0.6份、色氨酸1.5份、吡咯烷酮羧酸3.5份、水解透明质酸钠1份、水解肌动蛋白0.5份、水解胶原蛋白0.5份、β-烟酰胺单核苷酸0.5份、聚脱氧核糖核苷酸1.2份和1,2己二醇0.6份。
羟基苯乙酮与1,2己二醇的结合，使得二者发生了协同作用，在整个类外泌体仿生制剂的试验测试中，发现二者单独都不具备防腐效果，但二者结合后使得整个类外泌体仿生制剂具有了很好的防腐功能，同时搭配温和，不刺激，同时不影响其他物质的活性。
通过色氨酸0.5-1.5份、吡咯烷酮羧酸2-3.5份、水解透明质酸钠0.3-1份、水解肌动蛋白0.2-0.5份、水解胶原蛋白0.2-0.5份、β-烟酰胺单核苷酸0.2-0.5份、聚脱氧核糖核苷酸0.5-1.2份以及生育酚乙酸酯0.2-0.3份、神经酰胺0.3-0.5份和角鲨烷2-3份的搭配组合以及结合仿生磷脂双分子外壳体和仿生磷脂双分子内壳结构的设计，从而通过人工精确匹配组合及组份，在一定范围内更好的给予皮肤保湿、修护、紧致和弹性。
优选的，所述类外泌体仿生制剂表面为向外突出的软毛刺结构，通过在固化修饰过程中，经过合适的外部冷却环境加之适宜的机械外力牵拉从而形成向外突出的软毛刺结构，从而使得类外泌体仿生制剂结构更加稳定，肤感层次化更加清晰，产品外观看起来也更加缤纷，使用起来具有更好的柔和度，同时也进一步提高产品附着力及活性物质的的缓释效果。
优选的，所述类外泌体仿生制剂还包括金粉，通过金粉的加入，有效提高产品的紫外线阻隔效果，以及抗氧化性。
在本发明的一个实施例中，如图6、图7所示，提供了一种制备类外泌体仿生制剂的方法，包括以下步骤，
(1)将纯水83.7份、甘油3份、羟基苯乙酮0.5份混合形成A相，将A相加入70℃水相锅加热搅拌，转速30r/min，溶解充分，保温15min后降温至35℃备用。
(2)将B相物质色氨酸1份、吡咯烷酮羧酸3份、水解透明质酸钠0.3份、水解肌动蛋白0.3份、水解胶原蛋白0.5份、β-烟酰胺单核苷酸0.3份、聚脱氧核糖核苷酸1份和1,2己二醇0.5份，逐一加入A相中，搅拌转速30r/min，搅拌时间30min，搅拌均匀形成水相混合物备用。
(3)将氢化卵磷脂2份、生育酚乙酸酯0.2份、神经酰胺0.5份、角鲨烷3份混合后形成C相，将C相加入上述混合物中，搅拌转速40r/min，均质40HZ，均值时间5min，初步形成乳化体系备用。
(4)将得到的流体再利用微射流均质机设置压力1200bar，温度30～35℃下进行高压均质处理，得到类外泌体前体LPO-EXO。
(5)将琼脂糖0.7份和金粉0.8份加入乳化锅中，45r/min边搅拌边加热至75℃，并保温5分钟之后，降温至40℃后保温，加入类外泌体前体LPO-EXO TO 100份(通过添加类外泌体前体LPO-EXO使物质总量达到100份)，10r/min搅拌至均匀得到水相混合物。
(6)在油相锅内加入椰油醇-辛酸酯/癸酸酯TO 100份(通过添加椰油醇-辛酸酯/癸酸酯使物质总量达到100份)、聚酰胺-82.475份、季戊四醇四(双-叔丁基羟基氢化肉桂酸)酯0.025份混合加热溶解形成油相混合物；
(7)将油相混合物转入冷却降温设备，控制温度在10℃左右，油相搅拌速度保持在20-30r/min。
(8)将水相混合物通过1.5mm疏水性滤网加入油相混合物中，重量比，水相混合物：油相混合物＝1:0.5，保持油相搅拌速率不变，温度控制在10℃，颗粒硬化后继续搅拌1小时封存，得到类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO。
示例性的，所述步骤(6)中，在油相锅内加入椰油醇-辛酸酯/癸酸酯TO 100份(通过添加椰油醇-辛酸酯/癸酸酯使物质总量达到100份)、聚酰胺-81.485份、季戊四醇四(双-叔丁基羟基氢化肉桂酸)酯0.015份混合加热溶解形成油相混合物。
所述类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO粒子均由多个类外泌体前体LPO-EXO微球聚集而成球体，独特的内部磷脂双分子层结构亲肤性强，满足活性物缓释，进一步的加固美化制剂后，组合物结构稳定性更好，肤感层次化更加清晰，制剂外观更加缤纷柔软；该工艺修饰美化的类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO粒子，均由多个类外泌体前体LPO-EXO微球聚集而成球体，制备工艺简单，成本较低，可实现量产，而且易于常温存储，运输。通过步骤5-8，进而使得类外泌体前体LPO-EXO得到固化修饰，从而使得结构以及活性物质更加稳定，同时经过特殊修饰后独特的表面结构，能够增加制剂与皮肤的附着力，经过按摩更好地铺展开，释放活性成分，易于皮肤吸收。水相中的琼脂糖，其熔点在62-68℃，凝固点在24-29℃，极好地保护生物来源的水相功效成分的活性，防止其因高温变性。通过金粉的添加一方面使得类外泌体仿生制剂具有更好的抗氧化性以及具有更好的紫外线阻隔效果；油相合适的稠度能够为水相提供合适的外部环境，使类外泌体仿生制剂经外力(适宜的搅拌速率)作用形成表面的细小的软毛刺结构。
如图1、图2所示，清晰可见球状双分子层结构囊泡，说明形成由磷脂双分子层包裹着功效成分的微囊结构。
如图3、图4所示，类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO表面有很多细小的软毛刺，这样可以增加其涂抹于皮肤上时的附着力，易于微囊结构破裂，释放活性物质，渗透吸收效率更高。
类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO安全性评价。
1.CAMVA鸡胚绒毛尿囊膜血管试验。
1.1测试样品将制剂类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO研磨粉碎后加水稀释成50％的溶液，室温备用。
1.2测试方法将鸡胚置于微电脑全自动孵化机孵育，于第4天在鸡胚窄端钻一小孔，抽取约4mL蛋清。在鸡环位置的上方开约2cm的窗口，用保鲜膜覆盖。随后放入恒温恒湿箱继续孵育。第10天，取出鸡胚，剥去窗口周围的蛋壳，选取生长良好的鸡胚20只，随机分成2组，分别为阴性对照组10只(空白)，测试样品10只，暴露绒毛膜血管，选择血管密集处放置特富龙环，每1只鸡胚放置一个特富龙环，每环内加入各组样品40μL后再放入恒温恒湿箱孵育30分钟，取下特富龙环，用PBS冲洗，直至供试品无明显残留。以特富龙环外的区域作为对照，在体视显微镜下观察特富龙环内的血管损伤情况，根据表1对血管刺激效应进行评分。
表1为CAMVA试验评分标准。
表2为CAMVA试验得分表。
| 样品 | 得分 |
| 空白对照组 | 0 |
| 实验组 | 0 |
由评分结果可知该制剂安全性良好，无刺激。
2人体斑贴试验。
2.1测试样品将类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO研磨粉碎后加水稀释成50％的溶液，室温备用。
2.2测试方法：按照重复性开放型涂抹实验的方法进行：(1)按受试者入选标准选择参加试验的人员，至少30名。(2)以前臂屈侧作为受试部位，面积3×3cm2，受试部位应保持干燥，避免接触其他外用制剂。(3)将试验物约0.050±0.005g(mL)/次、每天1次均匀地涂于受试部位，连续6天，同时观察皮肤反应，在此过程中如出现3分或以上的皮肤反应时，应根据具体情况决定是否继续试验。(4)皮肤反应按表1重复性开放型涂抹试验皮肤反应评判标准进行观察，并记录结果。
表3为皮肤重复性开放型涂抹试验皮肤反应评判标准表。
2.3试验结果受试者涂抹组合制剂约0.050±0.005g(mL)/次、每天1次均匀地涂于受试部位，连续6天观察皮肤反应结果，如图8所示，均为阴性反应，无任何不良反应。
示例性的，所述类外泌体仿生制剂用于精华液。
精华液制备方法，将类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO加入到精华液基质中。
所述精华液配方包括水TO 100kg、EDTA二钠0.05kg、黄原胶0.25kg、丁二醇4kg、丙烯酸钠/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物0.1125kg、异十六碳烷0.0675kg、聚山梨醇醇酯-800.0225kg、山梨坦油酸酯0.0075kg、水0.090kg、双(羟甲基)咪唑烷基脲0.0395kg、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯0.0005kg、丙二醇0.06kg和类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO 5kg。
工艺如下：
将纯水TO 100kg(添加其它物质后，加水至100kg)、EDTA二钠0.05kg和黄原胶0.25kg粉末用丁二醇4kg分散好加入乳化锅，50r/min边搅拌边加热至75～80℃,然后50r/min，45HZ边搅拌边均质2min至粉末完全溶解，最后，保温15min；(2)保温状态依次加入丙烯酸钠/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物0.1125kg、异十六碳烷0.0675kg、聚山梨醇醇酯-800.0225kg、山梨坦油酸酯0.0075kg、水0.090kg，50r/min，45HZ边搅拌边均质2min(以能翻起料体为原则)然后50r/min搅拌3-5分钟，抽真空至料体消泡后保温10分钟；(3)降温至35℃，加入双(羟甲基)咪唑烷基脲0.0395kg、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯0.0005kg、丙二醇0.06kg，搅拌5分钟，得到精华基质。出一半料体作为空白对照组样品。(4)然后再加入类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO 5kg搅拌15分钟，38℃准备出料，观察均匀后，检验合格即可出料，得到精华液。
示例性的，所述类外泌体仿生制剂用于面霜、面膜、眼霜、洁面乳或爽肤水。
面霜制备方法，将类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO加入到面霜基质中。
所述面霜配方：包括水TO 100kg、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物0.25kg、黄原胶0.15kg、羟苯甲酯0.05kg、EDTA二钠0.05kg、丁二醇5.00kg、聚甘油-6二硬脂酸酯1.92kg、霍霍巴酯类0.57kg、聚甘油-3蜂蜡酸酯0.255kg、鲸蜡醇0.255kg、C10-18脂酸甘油三酯类2kg、角鲨烷3kg、二聚季戊四醇六辛酸酯/六癸酸酯2.5kg、十三烷醇偏苯三酸酯2.50kg、聚二甲基硅氧烷2.00kg、双(羟甲基)咪唑烷基脲0.0395kg、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯0.0005kg、丙二醇0.06kg和类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO 5kg。
工艺如下：(1)将水TO 100kg(添加其他物质后，加水至100kg)、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物0.25kg、黄原胶0.15kg、羟苯甲酯0.05kg、EDTA二钠0.05kg用丁二醇5.00kg分散好加入乳化锅，50r/min边搅拌边加热至75～80℃，然后50r/min，45HZ边搅拌边均质2min至粉末完全溶解，最后，保温15分钟；(2)保温状态依次加入聚聚甘油-6二硬脂酸酯1.92kg、霍霍巴酯类0.57kg、聚甘油-3蜂蜡酸酯0.255kg、鲸蜡醇0.255kg、C10-18脂酸甘油三酯类2kg、角鲨烷3kg、二聚季戊四醇六辛酸酯/六癸酸酯2.5kg、十三烷醇偏苯三酸酯2.50kg和聚二甲基硅氧烷2.00kg，50r/min，45HZ边搅拌边均质2min(以能翻起料体为原则)然后50r/min搅拌3-5分钟，抽真空至料体消泡后保温10分钟；(3)降温至35℃，加入双(羟甲基)咪唑烷基脲0.0395kg、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯0.0005kg、丙二醇0.06kg，搅拌5分钟，得到面霜基质。出一半料体作为空白对照组样品。(4)然后再加入类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO 5kg搅拌15分钟，38℃准备出料，观察均匀后，检验合格即可出料。
针对类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO制备的精华液和面霜分别进行，角质层水分含量实验、经皮水分流失实验和紧致度、弹性实验，进而评估其在保湿、修护和抗衰方面的表现。
1、角质层水分含量实验
1.1测试样品实验组：实验组1：含有类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的精华液；实验组2：含有类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的面霜。
对照组：对照组1不含类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的精华液；对照组2不含类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的面霜。
1.2测试方法。
选择35名面部皱纹程度相近的志愿者，女性32名，男性3名，年龄18至60岁，平均年龄为35.26岁，进行人体功效测试。分别随机在每位志愿者的左脸颊或右脸颊中的一侧脸颊使用含有类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的精华液和面霜，并作为实验组1和实验组2；志愿者使用不含类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的精华液和面霜在另一侧脸颊作为对照组1和对照组2。志愿者于每日早晚各涂一次实验组和对照产品，使用周期为28天，在测试周期内不得使用其他化妆品。注意：精华和面霜两种样品测试间隔一个月。
使用皮肤水分测试仪Corneometer CM825于产品使用前第0天(0day)、产品使用7天后(7day)、产品使用14天后(14day)、产品使用28天后(28day)进行采集皮肤角质层水含量SCH数据，测试部位为脸颊，测量时探头在同一受测区域重复测量3次，取平均值。
测试参数SCH表示皮肤角质层含水量，数值越高，皮肤角质层含水量越高。
第N天的平均变化值：
其中：N为测试时间。
平均变化率：
其中：SCH为角质层含水量；
为第N天角质层含水量SCH的平均变化率，N为测试时间。
如图9及下表4为精华液的测试结果。
从上述测试结果可以看出，使用含有类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的精华液28天后，可有效提高皮肤角质层含水量，且变化率较对照组显著，说明本发明类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO具有良好的保湿效果。此外，可见在使用的第一周变化率最明显，说明含类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的精华液在使用一周后皮肤将会有明显保湿效果的提升，且在一个皮肤代谢周期(28天)内皮肤保湿性得到了持续提升。
如图10及下表5为面霜的测试结果。
从上述测试结果可以看出，使用含有类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的面霜28天后，可有效提高皮肤角质层含水量，且变化率较对照组显著，说明本发明类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO具有良好的保湿效果。此外，可见在使用的第一周变化率最明显，说明含该制剂的精华在使用一周后皮肤将会有明显保湿效果的提升，且在一个皮肤代谢周期(28天)内皮肤保湿性能持续提升。
经过2组实验，进一步充分证明了本申请类外泌体仿生制剂可有效提高皮肤角质层含水量，具有良好的保湿效果。
2、经皮水分流失实验。
2.1测试样品实验组：实验组3含有实施例1类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的精华液；实验组4含有实施例1类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的面霜。
测试样品实验组：对照组3：不含有实施例1类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的精华液；对照组4：不含有实施例1类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的面霜。
选择35名面部皱纹程度相近的志愿者，女性32名，男性3名，年龄18至60岁，平均年龄为35.26岁，进行人体功效测试。分别随机在每位志愿者的左脸颊或右脸颊中的一侧脸颊使用含有类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的精华液/面霜，并作为实验组3和实验组4；志愿者使用不含类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的精华液/面霜的在另一侧脸颊涂抹作为对照组3和4。志愿者于每日早晚各涂一次实验组和对照组产品，使用周期为28天，在测试周期内不得使用其他化妆品。注意：精华液和面霜两种样品测试间隔一个月。
使用表皮水分流失仪Vapometer分别于产品使用前第0天(0day)、产品使用7天后(7day)、产品使用14天后(14day)、产品使用28天后(28day)进行采集皮肤经皮水分流失TEWL数据，测试部位为脸颊，测量时探头在同一受测区域重复测量3次，取平均值。
第N天的平均变化值：
其中：N为测试时间；
平均变化率：
其中：
为第N天经皮水分散失TEWL的平均变化率，N为测试时间。
如图11及下表6为使用精华液后经皮水分散失检测结果。
从上述测试结果可以看出，使用含有类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的精华液28天后，可有效降低经皮水分散失，且变化率较对照组显著，说明本发明类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO具有良好的修护角质屏障的效果效果。同时使用的第一周变化率最明显，说明含类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的精华液在使用一周后具有明显修护皮肤角质层的效果，且在一个皮肤代谢周期(28天)内皮肤角质层修护效果持续改善。
如图12及下表7为使用面霜后经皮水分散失检测结果。
从上述测试结果可以看出，使用含有类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的面霜28天后，可有效降低经皮水分散失，且变化率较对照组显著，说明本发明类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO具有良好的修护角质屏障的效果效果。同时使用的第一周变化率最明显，说明含类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的面霜在使用一周后具有明显修护皮肤角质层的效果，且在一个皮肤代谢周期(28天)内皮肤角质层修护效果持续改善。
通过上述含有类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的精华液和面霜的实验，可知加入类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO后使得精华液和面霜对于降低经皮水分散失具有了明显的效果，具有良好的修护角质屏障的作用。
3、紧致度和弹性实验。
3.1抗衰效果评价试验
3.1.1测试样品
实验组5：含实施例1类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的精华液；实验组6：含实施例1类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的面霜；对照组5：不含实施例1类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的精华液；对照组6：不含实施例1类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的面霜。
3.1.2测试方法
选择35名面部皱纹程度相近的志愿者，女性32名，男性3名，年龄18至60岁，平均年龄为35.26岁，进行人体功效测试。分别随机在每位志愿者的左脸颊或右脸颊中的一侧脸颊使用含有类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO精华液/面霜，并作为实验组5和实验组6；志愿者使用不含类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的精华液/面霜的另一侧脸颊作为对照组5和对照组6。志愿者于每日早晚各涂一次实验组和对照组产品，使用周期为28天，在测试周期内不得使用其他化妆品。注意：精华液和面霜两种样品测试间隔一个月。
然后，使用皮肤弹性仪Cutometer dual MPA580分别于产品使用前第0天(0day)、产品使用7天后(7day)、产品使用14天后(14day)、产品使用28天后(28day)进行采集皮肤紧致度R0和皮肤弹性R2数据，测试部位为脸颊，测量时探头在同一受测区域重复测量3次，取平均值。
测试参数R0表示皮肤紧致度(被吸进探头内的皮肤深度是通过一个非接触式的光学测试系统测得的，光的比率同被吸入皮肤的深度成正比)，R0越远离1，皮肤紧致度越好。
第N天的平均变化值：
其中：N为测试时间；
平均变化率：
其中：
为第N天紧致度R0的平均变化率，N为测试时间。
测试参数R2表示皮肤弹性(无负压时皮肤的回弹量Ua与有负压时的最大拉伸量Uf之比)，R2越接近1，皮肤的弹性越好。
第N天的平均变化值：
其中：N为测试时间；
平均变化率
其中：
为第N天弹性R2的平均变化率，N为测试时间。
如图13及下表8为精华液皮肤紧致度R0检测结果。
如图14及下表9为精华液皮肤弹性R2检测结果。
从上述实验结果可以看出，使用含有类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的精华液28天后，可有效提高皮肤紧致度和弹性，且比对比例效果显著，说明本发明类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO，各组份具有良好的协同作用，可更好的改善皮肤皱纹，延缓肌肤衰老，达到紧致肌肤抗衰的效果。同时使用的前两周皮肤弹性及紧致度持续增加，在第7天～14天变化率达到最大，说明在两周内使用含类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的面霜在使用两周内具有皮肤紧致度和弹性会有显著提高，该制剂具有良好的抗衰效果。
如图15及下表10为面霜皮肤紧致度R0检测结果。
如图16及下表11为面霜皮肤弹性R2检测结果。
从上述实验结果可以看出，使用含有类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO面霜基质28天后，可有效提高皮肤紧致度和弹性，且比对照组效果显著，说明本发明组合物各组分在合理添加量范围内，具有良好的协同效应，可更好的改善皮肤皱纹，延缓肌肤衰老，达到紧致肌肤抗衰的效果。同时，从变化率可知,前两周皮肤弹性及紧致度持续增加，在第7天～14天变化率达到最大，说明在两周内使用含有类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO的化妆品皮肤紧致度和弹性会有显著提高，该制剂具有良好的抗衰效果。
综上所述，组合制剂MO-LPO-EXO具有良好的保湿、修护、抗衰功效，可将其运用在水剂，霜剂等护肤品中。
Claims (10)
1.一种类外泌体仿生制剂，其特征在于，所述类外泌体仿生制剂包括多个类外泌体前体LPO-EXO；
所述类外泌体前体LPO-EXO包括：
仿生磷脂双分子壳体，所述仿生磷脂双分子壳体包括仿生磷脂双分子外壳体和仿生磷脂双分子内壳体，所述仿生磷脂双分子内壳体在内侧，仿生磷脂双分子外壳体在外侧；
囊内物，所述囊内物包括水溶性活性物质和油溶性活性物质，所述水溶性活性物质，设置在仿生磷脂双分子外壳体和仿生磷脂双分子内壳体之间的第一空间内，以及仿生磷脂双分子内壳体内部的第二空间内；所述油溶性活性物质被包裹在仿生磷脂双分子外壳体内部的第三空间内和仿生磷脂双分子内壳体内部的第四空间内。
2.根据权利要求1所述的类外泌体仿生制剂，其特征在于，所述油溶性活性物质以重量份计包括：氢化卵磷脂1.8-2.5份、生育酚乙酸酯0.2-0.3份、神经酰胺0.3-0.5份和角鲨烷2-3份。
3.根据权利要求1所述的类外泌体仿生制剂，其特征在于，所述水溶性活性物质以重量份计包括，纯水78.8-89份、甘油2-5份、羟基苯乙酮0.4-0.6份、色氨酸0.5-1.5份、吡咯烷酮羧酸2-3.5份、水解透明质酸钠0.3-1份、水解肌动蛋白0.2-0.5份、水解胶原蛋白0.2-0.5份、β-烟酰胺单核苷酸0.2-0.5份、聚脱氧核糖核苷酸0.5-1.2份和1,2己二醇0.4-0.6份。
4.根据权利要求1至3中任一所述的类外泌体仿生制剂，其特征在于，所述类外泌体仿生制剂表面为向外突出的软毛刺结构。
5.根据权利要求4所述的类外泌体仿生制剂，其特征在于，所述类外泌体仿生制剂还包括金粉。
6.一种制备权利要求1-5所述类外泌体仿生制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤，
(1)将纯水78.8-89份、甘油2-5份、羟基苯乙酮0.4-0.6份混合形成A相，将A相加入70℃水相锅加热搅拌，转速30r/min，溶解充分，保温15min后降温至35℃备用；
(2)将B相物质色氨酸0.5-1.5份、吡咯烷酮羧酸2-3.5份、水解透明质酸钠0.3-1份、水解肌动蛋白0.2-0.5份、水解胶原蛋白0.2-0.5份、β-烟酰胺单核苷酸0.2-0.5份、聚脱氧核糖核苷酸0.5-1.2份和1,2己二醇0.4-0.6份，逐一加入A相中，搅拌转速30r/min，搅拌时间30min，搅拌均匀形成水相混合物备用；
(3)将氢化卵磷脂1.8-2.5份、生育酚乙酸酯0.2-0.3份、神经酰胺0.3-0.5份、角鲨烷2-3份混合后形成C相，将C相加入上述混合物中，搅拌转速40r/min，均质40HZ，均值时间5min，初步形成乳化体系备用；
(4)将得到的流体再利用微射流均质机设置压力1000-1200bar，温度30～35℃下进行高压均质处理，得到类外泌体前体LPO-EXO；
(5)将琼脂糖0.5-0.8份和金粉0.5-1份加入乳化锅中，45r/min边搅拌边加热至75～80℃，并保温5分钟之后，降温至40-45℃后保温，加入类外泌体前体LPO-EXO100份，10r/min搅拌至均匀得到水相混合物；
(6)在油相锅内加入椰油醇-辛酸酯/癸酸酯TO100份、聚酰胺-81.485-2.475份、季戊四醇四(双-叔丁基羟基氢化肉桂酸)酯0.015-0.025份混合加热溶解形成油相混合物；
(7)将油相混合物转入冷却降温设备，控制温度在5-10℃左右，油相搅拌速度保持在20-30r/min；
(8)将水相混合物通过0.5-3mm疏水性滤网加入油相混合物中，重量比，水相混合物：油相混合物＝1:0.5～1:1，保持油相搅拌速率不变，温度控制在5-10℃，颗粒硬化后继续搅拌1小时封存，得到类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO。
7.根据权利要求6所述的制备类外泌体仿生制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤，
(1)将纯水83.9份、甘油3份、羟基苯乙酮0.5份混合形成A相，将A相加入70℃水相锅加热搅拌，转速30r/min，溶解充分，保温15min后降温至35℃备用；
(2)将B相物质色氨酸1份、吡咯烷酮羧酸3份、水解透明质酸钠0.3份、水解肌动蛋白0.3份、水解胶原蛋白0.5份、β-烟酰胺单核苷酸0.3份、聚脱氧核糖核苷酸1份和1,2己二醇0.5份，逐一加入A相中，搅拌转速30r/min，搅拌时间30min，搅拌均匀形成水相混合物备用；
(3)将氢化卵磷脂2份、生育酚乙酸酯0.2份、神经酰胺0.5份、角鲨烷3份混合后形成C相，将C相加入上述混合物中，搅拌转速40r/min，均质40HZ，均值时间5min，初步形成乳化体系备用；
(4)将得到的流体再利用微射流均质机设置压力1000-1200bar，温度30～35℃下进行高压均质处理，得到类外泌体前体LPO-EXO；
(5)将琼脂糖0.7份和金粉0.8份加入乳化锅中，45r/min边搅拌边加热至75～80℃，并保温5分钟之后，降温至40-45℃后保温，加入类外泌体前体LPO-EXOTO100份，10r/min搅拌至均匀得到水相混合物；
(6)在油相锅内加入椰油醇-辛酸酯/癸酸酯TO100份、聚酰胺-82.475份、季戊四醇四(双-叔丁基羟基氢化肉桂酸)酯0.025份混合加热溶解形成油相混合物；
(7)将油相混合物转入冷却降温设备，控制温度在10℃左右，油相搅拌速度保持在30r/min；
(8)将水相混合物通过0.5-3mm疏水性滤网加入油相混合物中，重量比，水相混合物：油相混合物＝1:0.5，保持油相搅拌速率不变，温度控制在8℃，颗粒硬化后继续搅拌1小时封存，得到类外泌体仿生制剂MO-LPO-EXO。
8.根据权利要求5所述制备类外泌体仿生制剂的方法，其特征在于，所述金粉用于着色。
9.根据权利1-5中任一所述类外泌体仿生制剂，其特征在于，所述类外泌体仿生制剂用于精华液。
10.根据权利1-5中任一所述类外泌体仿生制剂，其特征在于，类外泌体仿生制剂用于面霜、面膜、眼霜、洁面乳或爽肤水。
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