CN116287073A - 一种自体胶原及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及胶原制备技术领域，具体而言，涉及一种自体胶原及其制备方法。该方法采用生物技术手段将来源于动物组织的原料制备为胶原。动物组织可来源于海洋生物和哺乳动物，包括来自自体或异体的人体组织。动物组织为采用合法手段获取的真皮组织、瘢痕组织或软骨组织。采用本发明的上述制备方法得到的胶原，该胶原具有低免疫原性，塑型性好，在体内维持时间持久等优点，可用于真皮组织中层至深层注射，并可作为进行面部轮廓修正、皮肤表面的皱纹填充及凹陷性瘢痕填充修复的材料或药物使用。

Description

一种自体胶原及其制备方法

技术领域

本发明涉及胶原制备技术领域，具体而言，涉及一种自体胶原及其制备方法。

背景技术

胶原蛋白存在于机体的各个器官内，尤其在皮肤组织中分布广泛，是皮肤的功能和形态维持的重要结构。随着年龄的增大，胶原蛋白逐渐流失，出现面部凹陷和皱纹的加重。基于形态修正和抗衰老的需求，市面上逐渐出现了很多种填充物，但是，大多数填充物因为存在的风险及注射后出现的并发症逐渐被淘汰。

现有技术中，为了降低风险，往往采用一系列的复杂制备过程，这样会导致胶原产品的成本过高。目前市售的胶原蛋白类的产品较少，性能和质量难以满足市场的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种自体胶原及其制备方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供一种自体胶原的制备方法，采用液态胶原制备溶液将来源于自体组织制备为所述自体胶原。

进一步，所述自体组织为采用合法手段获取的真皮组织、瘢痕组织或软骨组织。

进一步，包括以下步骤：

S1、对自体组织进行前处理；

S2、制胶：将进行前处理后的所述自体组织与C溶液混合并静置，直至溶液分层，得到位于下层的胶原；所述C溶液为液态胶原制备溶液，所述C溶液含有胃蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液或胰酶溶液。

S3、混合：将所述胶原与D溶液混合，得到所述自体胶原；所述D溶液含有氢氧化钠和氯化钠。

进一步，所述C溶液的成分和各成分的浓度为，0.1％-5.0％胃蛋白酶、0.1％-5.0％柠檬酸、0.7％-3.0％氯化钠，余量为水。

进一步，所述C溶液的pH值为1.0-4.5。

进一步，所述步骤S2中，所述自体组织的质量与所述C溶液体积的体积比为1：10-50；所述自体组织与所述C溶液混合后静置或振荡的方式时间为2ˉ72小时，温度为10ˉ40℃。

进一步，所述步骤S3中，所述D溶液的成分和各成分的浓度为，1-5％氢氧化钠、0.7％-3.0％氯化钠，余量为水。

进一步，所述步骤S1包括杂质处理和清洗的步骤。

进一步，所述步骤S3完成后，还包括步骤S4；

所述步骤S4为，将所述胶原进行除菌处理，所述除菌处理的方式为微孔过滤除菌、湿热除菌、辐射除菌、过氧化氢等离子灭菌。

本发明还提供一种自体胶原，采用如上述的制备方法制备而成，所述自体胶原为胶原溶液或冻干粉体。

本发明的有益效果为：

(1)本发明的自体胶原制备方法，以自体组织为原料，采用简单的制备方法即可得到自体注射性胶原产品，能够满足当前市面上对于胶原蛋白类产品的高端需求；

(2)本发明的自体胶原制备方法，成本低、操作简便，适合推广；

(3)本发明的自体胶原，具有低免疫原性，塑型性好，在体内维持时间持久等优点；

(4)本发明的自体胶原，可用于真皮组织中层至深层注射，并可作为进行面部轮廓修正、皮肤表面的皱纹填充及凹陷性瘢痕填充修复的材料或药物使用。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明的自体胶原的制备方法，将来源于自体组织的原料与液态胶原制备溶液混合并反应，得到自体胶原。本发明的自体胶原，采用如上述的制备方法制备而成。

采用本发明的上述制备方法得到的自体胶原，可以使用自体组织作为原料进行制备，该自体胶原具有低免疫原性，塑型性好，在体内维持时间持久等优点，可用于真皮组织中层至深层注射，并可作为进行面部轮廓修正、皮肤表面的皱纹填充及凹陷性瘢痕填充修复的材料或药物使用。

本发明的自体组织为采用合法手段获取的真皮组织、瘢痕或软骨组织。

本发明的自体胶原的主要成分包括多类型胶原、糖类、脂类、无机盐、水份等。

本发明的制备方法具体包括以下步骤：

S1、杂质处理：

杂质处理的步骤中，先对原料进行处理，再进行杂质处理，杂质处理后再进行清洗的步骤。

(1)原料进行原料处理：将真皮组织分割成规定5毫米以下尺寸，用制药用水或生理盐水冲洗至表面无污渍，将水滤干。

本步骤中，制药用水优选为纯化水、注射用水，也可以采用0.9％的氯化钠生理盐水。

(2)杂质处理的具体步骤为：采用处理溶液浸泡自体真皮组织，时间为2-72小时，采用振荡的方式，真皮组织与A溶液比例为(5-40)ml：1g，优选为20ml：1g。进行振荡时，温度范为为20-40℃，优选为25℃。

其中，A溶液是一种可去除脂肪、杂蛋白、细菌内毒素碱性溶液，优选为浓度再0.1％-5％的氢氧化钠溶液。也可采用过氧乙酸、乙醇、吐温80、磷酸三丁脂、Triton X-100、次氯酸钠进行清洗，或可采用电离辐射的方式进行病毒灭活。

本步骤中，在进行病毒灭活时，具体每间隔0.5-4小时进行换液，优选每小时进行一次换液。

(3)、清洗：采用B溶液清洗经过杂质处理后的真皮组织，清洗的温度为10-40℃，优选温度为25℃，B溶液与真皮组织的比例为(20-40)ml：1g，优选为30ml：1g。

具体的清洗方式采用振荡或超声的方式，共清洗2—10次，优选为6次。每次清洗进行依次换液，每次清洗的时间为10—30分钟，优选为10分钟。

清洗完毕后，溶液的pH值应在6-8之间。

S2、制胶：将进行前处理后的自体组织与液态胶原制备溶液混合并静置，直至溶液分层，得到位于下层的胶原。

液态胶原制备溶液为C溶液，C溶液中含有胃蛋白酶、胰蛋白酶或胰酶。

优选的，C溶液中的各成分和浓度为，胃蛋白酶的浓度为0.1％-5.0％，磷酸盐的浓度为0.1％-5.0％，氯化钠的浓度为0.7％-3.0％。

优选的，C溶液的pH值为1.0-4.5。进一步优选的，胃蛋白酶溶液中，胃蛋白酶的浓度为2.0％，磷酸盐溶液的浓度为2.0％，氯化钠的浓度为1.5％。上述胃蛋白酶溶液中，磷酸盐溶液也可以采用柠檬酸溶液、碳酸盐缓冲液、盐酸溶液、醋酸盐缓冲液等溶液代替。

针对本步骤的混合和静置或振荡，混合后可以采用静置、振荡或超声；混合时的环境温度为10-40℃之间，优选温度为37℃，本步骤的静置、振荡或超声为2-72小时，优选为36小时。自体组织和溶液C的混合比例为1g：(10-20)ml之间，实际优选的比例范围为1g：20ml。

S3、混合：将胶原与D溶液混合，得到自体胶原。D溶液是含有氢氧化钠和氯化钠的溶液。

步骤S2结束后，取一定量的下层淡黄色的胶原，与D溶液混合。其中，D溶液的成分包括氢氧化钠、氯化钠和水；其中，氢氧化钠的浓度为1-5％、氯化钠的浓度为0.7％-3.0％。优选的，D溶液中，氢氧化钠的浓度为1％，氯化钠的浓度为1.5％。

将D溶液与下层的自体胶原混合后，混合溶液的pH为6.0-8.0之间。混合溶液中，胶原的质量百分数为1％-10％，优选的，胶原的质量百分数为2.0-5.0％之间。

S4、除菌：

对步骤S4得到的混合溶液进行除菌处理，具体的处理方式可以采用微孔过滤器除菌、湿热灭菌或辐射灭菌的方式。

当采用微孔过滤器除菌时，具体采用0.45um的微孔过滤器进行。

当采用湿热灭菌时，温度为115℃-126℃，灭菌时间为15min-40min。

当采用辐射灭菌时，可采用的辐射剂量范围为15kGy-28kG之间。

以下通过具体的实施例对本发明进行说明。

以下实施例对本发明的自体胶原分别进行物理性能、化学性能和生物性能进行检测。各实施例检测的具体对象是采用本发明的上述制备方法制备自体胶原，采用的原料是猪的真皮组织。将制备得到的胶原储存于常温、阴凉处，贮存时间为1个月。

实施例1

对储存后的自体胶原进行物理性能检测。物理性能检测的具体项目和检测结果如下：

1)外观测定：在照度为1000lx-1500lx下检查，任意旋转，以水平方向观察，应为白色、乳白色或微黄色粘稠状液体，无肉眼可见的异物。

2)渗透压：直接取样，按照《中国药典》2020年版第四部0632渗透压摩尔浓度测定法进行测定，结果应在230-360mOmmol/kg之间。

实施例2

对储存后的自体胶原进行化学性能检测。化学性能检测的具体项目包括胶原蛋白含量、杂蛋白含量、脂肪含量、酸碱度、细菌内毒素、无菌。具体检测标准如下：

1)胶原蛋白含量：按照《YY 0954-2015无源外科植入物Ⅰ型胶原蛋白植入剂》附录A的A.2方法二天狼星红染色法进行测试，结果含量应为标识含量的±5％。经检测，本实施例的测试结果为3.68％，符合上述标准。

2)脂肪含量测试：按照《GB 5009.6-2016食品安全国家标准食品中脂肪的测定》第一法索氏抽提法进行试验，结果脂肪含量应限定在4.0％以内。

3)酸碱度：按照《中国药典》2020年版第四部0631pH值测定法进行测试，结果胶原溶液的pH应为6.0-8.0。

4)细菌内毒素：按照《中国药典》2020年版第四部1143鲎试剂法进行测试，结果小于20EU/件，符合标准。

5)无菌检查：按照《中国药典》2020年版第四部1101无菌检查法中的直接接种法进行检查，结果应无菌生长。

实施例3

对储存后的自体胶原进行生物学测试。检测项目包括：热原反应、细胞毒性、迟发型超敏反应、皮内反应、急性全身毒性、Ames试验、小鼠淋巴瘤细胞突变试验、染色体畸变、植入、亚慢性毒性。

1)热原反应

按0.2g样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水。按GB/T 14233.2 -2005规定的方法进行，经检测，该自体胶原产品无热原反应。

2)细胞毒性

按0.2g样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，24±2hr制备试验液，浸提介质：含血清的MEM培养基。取试验液按照GB/T16886.5-2003中规定的试验方法进行试验，结果产品的细胞毒性反应不大于1级。

3)迟发型超敏反应

按0.2g样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。按照GB/T 16886.10-2005第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验方法规定进行试验，结果产品无迟发型超敏反应。

4)皮内反应

按0.2g样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。按照GB/T 16886.10-2005第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验试验方法规定进行试验，结果：试验样品与溶剂对照平均记分之差小于1.0。

5)急性全身毒性

按0.2g样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。取试验液按照GB/T16886.11-2011规定的试验方法进行试验，结果：产品无急性全身毒性反应。

6)Ames试验

按0.2g样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和DMSO。按GB/T16886.3 -2008规定的方法进行，结果：产品的Ames试验为阴性。

7)小鼠淋巴瘤细胞突变试验

按0.2g样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和DMSO。按GB/T16886.3 -2008规定的方法进行，结果：产品的小鼠淋巴瘤细胞突变试验为阴性结果

8)染色体畸变试验

按0.2g样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和DMSO，按GB/T16886.3 -2008规定的方法进行，结果：产品的染色体畸变试验为阴性。

9)植入

按GB/T16886.6-1997规定的方法进行，结果：皮下植入1周：样品周围可见嗜中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞浸润，应无囊腔形成；肌肉植入4周：样品周围可见少量巨噬细胞和淋巴细胞，胶原纤维和纤维母细胞增生，有纤维囊腔形成；肌肉植入12周：样品周围可见少量淋巴细胞、胶原纤维、纤维囊腔较致密规整。

10)亚慢性毒性

按GB/T 16886.11规定的方法进行，结果：对“注射用胶原”的亚慢毒性进行评价，无亚慢性毒性反应。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种自体胶原的制备方法，其特征在于，采用液态胶原制备溶液将来源于自体组织制备为所述自体胶原。

2.根据权利要求1所述一种自体胶原的制备方法，其特征在于，所述自体组织为采用合法手段获取的真皮组织、瘢痕组织或软骨组织。

3.根据权利要求1或2所述一种自体胶原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、对自体组织进行前处理；

S2、制胶：将进行前处理后的所述自体组织与C溶液混合并静置，直至溶液分层，得到位于下层的胶原；所述C溶液为液态胶原制备溶液，所述C溶液含有胃蛋白酶、胰蛋白酶或胰酶；

S3、混合：将所述胶原与D溶液混合，得到所述自体胶原；所述D溶液含有氢氧化钠和氯化钠。

4.根据权利要求3所述一种自体胶原的制备方法，其特征在于，所述C溶液的成分和各成分的浓度为，0.1％-5.0％胃蛋白酶、0.1％-5.0％柠檬酸、0.7％-3.0％氯化钠，余量为水。

5.根据权利要求4所述一种自体胶原的制备方法，其特征在于，所述C溶液的pH值为1.0-4.5。

6.根据权利要求5所述一种自体胶原的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述自体组织的质量与所述C溶液体积的体积比为1：10-50；所述自体组织与所述C溶液混合后静置或振荡的方式时间为2ˉ72小时，温度为10ˉ40℃。

7.根据权利要求3所述一种自体胶原的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述D溶液的成分和各成分的浓度为，1-5％氢氧化钠、0.7％-3.0％氯化钠，余量为水。

8.根据权利要求3所述一种自体胶原的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括杂质处理和清洗的步骤。

9.根据权利要求3所述一种自体胶原的制备方法，其特征在于，所述步骤S3完成后，还包括步骤S4；

所述步骤S4为，将所述胶原进行除菌处理，所述除菌处理的方式为微孔过滤除菌、湿热除菌、辐射除菌、过氧化氢等离子灭菌。

10.一种自体胶原，其特征在于，采用如权利要求1-9任意一项所述的制备方法制备而成，所述自体胶原为胶原溶液或冻干粉体。