CN116286492A

CN116286492A - 一株多粘类芽孢杆菌c2及其应用

Info

Publication number: CN116286492A
Application number: CN202310111607.6A
Authority: CN
Inventors: 汪城墙; 杜秉海; 李宁阳; 李祥; 刘凯; 苏晨; 陈康; 付全彬
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2023-02-10
Filing date: 2023-02-10
Publication date: 2023-06-23

Abstract

本发明公开了一株多粘类芽孢杆菌C2及其应用，属于微生物技术领域。该菌株已于2022年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为CGMCC No.26242。本发明多粘类芽孢杆菌C2具有产生铁载体、解钾、解磷和降解纤维素等作用，同时其在平板对峙实验中，对多种导致大蒜枯萎的病原真菌有显著拮抗作用，在不同土壤、不同栽培条件下对大蒜有促生效果，具有良好的实际应用价值。

Description

一株多粘类芽孢杆菌C2及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株多粘类芽孢杆菌C2及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

大蒜(Allium sativum)是药食同源的可口蔬菜，同时也具备重要的经济贡献价值，比如：出口创汇、医疗保健。大蒜主产区，由于常年连续种植造成土壤连作障碍严重，再加上农药化肥使用过量，大蒜抗逆性、抗病虫害能力下降，导致根腐病、死棵烂苗等问题严重，进而导致大蒜产量和品质的急剧下降；对当地生态环境也造成严重影响，同时还限制了当地经济发展，也降低了品牌价值地位。因此，面对绿色和可持续发展的农业发展规划，必须从农药化肥依赖型连续种植转移到辅助型种植；通过探索具有优良性状的有益微生物，研发新型绿色微生物肥料，可解决大蒜种植问题并实现绿色可持续发展。

多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)属于类芽孢杆菌属，是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，也是一类兼具生物防治和促生作用的植物根际有益微生物。目前已开展了多粘类芽孢杆菌的促生和防病研究，但是并未见具体对大蒜同时具有促生和防病作用的多粘类芽孢杆菌。因此，筛选能同时高效抑制大蒜多种病原菌和促进大蒜生长的多粘类芽孢杆菌具有重要价值。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一株多粘类芽孢杆菌C2及其应用，经试验证明，本发明提供的多粘类芽孢杆菌C2既能抑制多种有害镰刀菌又能促进大蒜生长。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

本发明的第一方面，提供一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)C2，该菌株已于2022年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCC No.26242。

本发明的第二方面，提供一种微生物菌剂，其特征在于，其含有上述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)C2及其发酵产物。

具体的，所述微生物菌剂为微生物接种剂。所述微生物菌剂是将多粘类芽孢杆菌C2接种于液体培养基中进行培养获得的。本发明微生物接种剂中含有能够产生铁载体和拮抗多种病原真菌，具备降解纤维素、解钾、解磷的多粘类芽孢杆菌C2，经盆栽和田间小区试验证明，可以显著促进大蒜生长，因此具有良好的实际应用价值。

本发明的第三方面，提供上述多粘类芽孢杆菌C2或微生物菌剂在如下a)-d)中任意一项或多项中的应用：

a)产铁载体、降解纤维素、解钾、解磷；

b)拮抗镰刀菌；

c)改善植物根际土壤营养环境；

d)促进植物生长。

具体的，所述镰刀菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)0C、5C和6B，轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)3C，以及层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)9D和11C。具体的，所述植物为大蒜。

具体的，所述改善植物根际土壤营养环境为上述多粘类芽孢杆菌C2和/或微生物菌剂在土壤中能够产生铁载体，具备降解纤维素、解钾、解磷能力，还能拮抗多种镰刀菌属病原菌，从而改善大蒜根际土壤营养环境和根际微生物区系。

本发明的第四方面，提供一种促进大蒜生长的方法，所述方法包括将上述多粘类芽孢杆菌C2和/或微生物菌剂作用于大蒜，实现对大蒜的促生。

具体的，所述作用为：在大蒜种瓣播种后，将上述多粘类芽孢杆菌C2和/或微生物菌剂施用于大蒜种瓣周围土壤。

与现有技术相比，本发明取得了以下有益效果：

本发明首次报道了一株能够产生铁载体和拮抗多种病原真菌，具备降解纤维素、解钾、解磷的多粘类芽孢杆菌C2，即一株既可以抑制多种有害镰刀菌又能促进大蒜生长的多粘类芽孢杆菌。经盆栽和田间小区试验证明，其可以显著促进大蒜生长，成功解决了大蒜连作障碍导致的枯萎病、死棵烂苗、土壤有害镰刀菌属丰度增高、有益菌丰度下降，且外源有益菌添加效果不明显的问题，因此具有良好的实际应用价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中多粘类芽孢杆菌C2的细胞镜检图；

图2为本发明实施例1中多粘类芽孢杆菌C2的LB平板菌落图；

图3为本发明实施例1中多粘类芽孢杆菌C2的16S rDNA的进化树分析结果图；

图4为本发明实施例2中多粘类芽孢杆菌C2产铁载体能力图；

图5为本发明实施例2中多粘类芽孢杆菌C2解钾能力图；

图6为本发明实施例2中多粘类芽孢杆菌C2的解磷能力图；

图7为本发明实施例2中多粘类芽孢杆菌C2降解纤维素能力效果图；

图8为本发明实施例3中多粘类芽孢杆菌C2拮抗多种病原真菌效果图；

图9为本发明实施例4中在培养箱中用大蒜连作原土和灭菌连作土土进行多粘类芽孢杆菌C2盆栽实验中大蒜株高数据图；

图10为本发明实施例4中大蒜连作原土盆栽图；

图11为本发明实施例4中大蒜灭菌连作土盆栽图；

图12为本发明实施例5中CK与菌株C2处理后大蒜根苗图；

图13为本发明实施例5中CK与菌株C2处理后大蒜连作障碍土盆栽图；

图14为本发明实施例5中CK与菌株C2处理后大蒜株高统计图；

图15为本发明实施例5中CK与菌株C2处理后大蒜茎粗统计图；

图16为本发明实施例5中CK与菌株C2处理后大蒜重量统计图；

图17为本发明实施例6中CK与菌株C2处理后大蒜叶幅与株高统计图；

图18为本发明实施例6中CK与菌株C2处理后大蒜图；

图19为本发明实施例6中CK与菌株C2处理后大蒜鳞茎直径统计图；

图20为本发明实施例6中CK与菌株C2处理后大蒜总鲜重统计图。

具体实施方式

本发明的一个具体实施方式中，提供了一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)C2，该菌株已于2022年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为CGMCC No.26242。

在本发明中，通过测定该菌株的16S rDNA基因序列并通过形态特征及生理生化指标测定，最终确定该菌株属于多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。

本发明的又一个具体实施方式中，提供一种微生物菌剂，其含有上述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)C2及其发酵产物。

本发明的又一个具体实施方式中，所述微生物菌剂为微生物接种剂。

本发明的又一个具体实施方式中，所述微生物菌剂是将多粘类芽孢杆菌C2接种于液体培养基中进行培养获得的。具体的，所述液体培养基为LB培养基。更具体的，所述LB培养基组分为：酵母浸膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠1％，蒸馏水1000mL，pH 7.0。更具体的，培养条件为：在30～40℃，培养10～20h，转速：160-200rpm。进一步的，培养条件为：在37℃，培养12h，转速180rpm。

本发明的又一具体实施方式中，所述微生物菌剂还包括载体。所述载体为固体载体或液体载体。

本发明的又一具体实施方式中，所述固体载体为矿物材料、生物材料或高分子化合物；所述矿物材料为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石、草炭土和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述高分子化合物为聚乙烯醇和/或聚二醇。

本发明的又一具体实施方式中，所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂为癸烷和/或十二烷。

本发明的又一具体实施方式中，所述微生物菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

本发明的又一个具体实施方式中，提供了上述多粘类芽孢杆菌C2或微生物菌剂在如下a)-d)中任意一项或多项中的应用：

a)产铁载体、降解纤维素、解钾、解磷；

b)拮抗镰刀菌；

c)改善植物根际土壤营养环境；

d)促进植物生长。

本发明的又一个具体实施方式中，所述镰刀菌为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)0C、5C和6B，轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)3C，以及层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)9D和11C。

本发明的又一个具体实施方式中，所述植物为大蒜。

本发明的又一个具体实施方式中，提供了一种促进大蒜生长的方法，所述方法包括将上述多粘类芽孢杆菌C2和/或微生物菌剂作用于大蒜，实现对大蒜的防病促生。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1：菌株鉴定

从大蒜根际土筛选获得的一株拮抗病原真菌广，又具有促进大蒜生长的菌株，经16S rDNA以及生理生化指标鉴定，确定该菌株为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)。

如图1和2所示，所述多粘类芽孢杆菌C2的菌落及菌体特征为：在LB培养基上培养后观察，菌落呈现近圆形，表面扁平干燥，边缘不规则，有毛边刺状，乳白色，半透明。菌体呈杆状，产芽孢，产多糖，无刺激性气味，革兰氏阳性。

所述多粘类芽孢杆菌C2的生理生化特征为：菌株C2的ONPG呈阳性；吲哚产生呈阴性；可利用甘露醇，呈阳性；可利用木糖，呈阳性；可利用纤维二糖，呈阳性；可利用阿拉伯糖，呈阳性；可利用葡萄糖，呈阳性。

所述多粘类芽孢杆菌C2的16S rDNA序列如下：

GCTATACTGCAGTCGAGCGGGGTTATGTAGAAGCTTGCTTCTAATAA

CCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCCACAAGAC

AGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAATACCCGATACATCCTTTTCCTG

CATGGGAGAAGGAGGAAAGNCGGAGCAATCTGTCACTTGTGGATGGGCC

TGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAANGGCCTACCAAGGCGACGAT

GCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACG

GCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCG

AAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGT

AAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGTCTTGTAGAGTAACTGCTACAAGA

GTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCG

CGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCG

CGCGCAGGCGGCTCTTTAAGTCTGGTGTTTAATCCCGAGGCTCAACTTCG

GGTCGCACTGGAAACTGGAGAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAA

TTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGG

CGAAGGCGACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGG

GGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAAT

GCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACATTAA

GCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTG

ACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACG

CGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGGTCTAGAGATAGG

CCTTTCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCT

CGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGC

TTAGTTGCCAGCAGGTCAAGCTGGGCACTCTAAGCAGACTGCCGGTGAC

AAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGAC

CTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGGTACAACGGGAAGCGAAGCCG

CGAGGTGGAGCCAATCCTAGAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGTAGGC

TGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCAT

GCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCAC

GAGAGTTTACAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGCAAGGAGCCAGC

CGCCGAAGG(SEQ ID NO.1)

实施例2：多粘类芽孢杆菌C2产铁载体、解钾、解磷、降解纤维素实验

检测多粘类芽孢杆菌C2产铁载体、解钾、解磷能力、降解纤维素能力，结果分别如图4、5、6、7所示，证明了多粘类芽孢杆菌C2具备产铁载体、解钾、解磷能力、降解纤维素能力。

实施例3：多粘类芽孢杆菌C2拮抗多种病原真菌实验

通过平板对峙实验，检测多粘类芽孢杆菌C2对从大蒜腐烂枯萎部位原位分离的病原真菌具有拮抗效果。如图8所示，其中，具体病原镰刀菌为尖孢镰刀菌0C、5C和6B，轮枝镰刀菌3C，以及层生镰刀菌9D和11C，与空白对照相比，抑菌率见下表1所示。

表1

由表1可知，菌株C2具有广谱的拮抗病原真菌效果。

实施例4：在光照培养箱中用大蒜连作土进行多粘类芽孢杆菌C2盆栽实验

1、菌悬液制备

将活化后的菌株C2在液体LB培养基中于28℃培养，并以150rpm的速度摇动至OD₆₀₀为1.5。通过以4000rpm离心10min从100mL液体培养基中收集菌体。弃去上清液，将菌株重新悬浮在50mL无菌水中备用。

2、大蒜种瓣处理

挑选饱满健康的大蒜种瓣(重量4.8～5.3g)，于太阳下暴晒2天，去除外皮(不能损伤蒜瓣)，先用75％的酒精处理5min，再用10％次氯酸钠处理3min，去离子水清洗三次。

3、盆栽土壤处理

从长期种植大蒜超过15年的大田取回的大蒜连作土壤，敲碎混匀后，阴凉处晾干，挑出蒜根和小石头，过筛备用。

无菌土灭菌处理：121℃，40min，重复两次湿热灭菌。

4、种植方式

微生物接种剂为菌株C2，种植前将盆(7cm×7cm×8cm)于121℃高压湿热灭菌40min。在每个盆中播种二颗种瓣，并将50mL菌悬液施用于大蒜种瓣周围土壤。发芽后7d每盆留一株。未接种菌株的大蒜种瓣作为对照。所有盆栽大蒜在长日照条件下(白天/夜晚：14h/10h，22℃/24℃)在生长室中生长4周。每个处理三次重复。最后取样3株大蒜苗用于测量株高等农艺性状。

5、结果与分析

通过在培养箱中用大蒜连作土进行菌株C2盆栽试验，对大蒜连作土进行两种处理，探索菌株C2对大蒜的直接和间接促生实验，25天后测量株高促生表型。如图9、10、11所示，菌株C2处理后，原土中大蒜株高提高了38.9％，灭菌土中大蒜株高提高了9.5％，不管是大蒜连作原土还是灭菌后的连作土中，菌株C2都增加了大蒜株高。菌株C2菌属能够通过分泌各种矿物质溶解酶，直接促进植物生长，也能通过多糖、铁载体等分泌物招募其他有益微生物群间接促进植物生长，进而佐证了以上实例结果。

实施例5：自然开放条件下，多粘类芽孢杆菌C2在连作障碍土中对大蒜的促生实验

1、菌悬液制备

将活化的菌株C2接种在30mL液体LB培养基中，于28℃震荡培养6-8h制备种子液，并以3％种子液接种量接种于150mL液体LB培养基中发酵备用。通过以4000rpm离心10min从100mL液体培养基中收集菌体。弃去上清液，将菌株的OD₆₀₀用无菌水稀释至0.1～0.2，然后将菌株的稀释悬浮液按照实验进行处理。

2、大蒜种瓣处理

挑选饱满健康的大蒜种瓣(重量4.8～5.3g)，于太阳下暴晒2d，去除外皮(不能损伤蒜瓣)，先用75％的酒精处理5min，再用10％次氯酸钠处理3min，去离子水清洗三次。

3、盆栽土壤处理

从长期种植大蒜超过15年的大田中取回的连作障碍土壤，敲碎混匀后，阴凉处晾干，挑出蒜根和小石头，过筛备用。

4、种植方式

微生物接种剂为菌株C2，种植前将盆(9cm×9cm×8cm)于121℃高压湿热灭菌40min。在每个盆中播种二颗种瓣，并将70mL菌悬液施用于大蒜种瓣周围土壤，未接种菌株的大蒜种瓣作为对照植物。所有盆栽大蒜在自然开放条件下生长4周。每个处理有三次重复。最后取样3株大蒜苗用于测量株高等农艺性状。

5、结果与分析

通过前期培养箱实验验证后，进一步在自然开放条件下进行菌株C2在连作障碍土中对大蒜的促生实验，探索菌株C2对大蒜的促生效果，25天后测量株高促生表型。如图12、13、14、15、16所示，在进一步扩大环境干扰的自然条件下，菌株C2处理后，大蒜根系总长度提高了21％、株高提高了17.5％、茎粗提高了1.6％、整株鲜重提高了13.1％、地上干重提高了35.8％、地上鲜重提高了6.4％，促进了大蒜株高、茎粗、干重和鲜重。

实施例6：自然开放条件下，多粘类芽孢杆菌C2在非障碍土中对大蒜的促生小区试验

1、田间试验的实验设计

田间试验在山东农业大学泮河校区田间试验站进行。本实施例使用山东金乡紫皮大蒜。大蒜种植在一个3*15m的地块中，6个小区(含微生物接种剂菌株C2和对照CK共2个处理，每个处理重复3次)被随机安排在完整地块中。在每个小区内，将24粒大蒜种瓣播种成6行4列，行内间隔20cm，行间间隔20cm种植。在成熟阶段收获了大蒜植物，用于测量生物量、养分含量和大蒜产量。大蒜生长期间不施肥，除了接种微生物接种剂菌株C2外，田间灌溉管理和害虫防治均遵循当地做法。

2、结果与分析

通过自然开放条件下，菌株C2在非障碍土中对大蒜的促生小区试验，探索菌株C2对大蒜的促生效果，45天后测量株高、鲜重、干重等促生表型。如图17、18、19、20所示，在进一步扩大环境干扰的自然条件下，菌株C2处理后，叶幅提高了19.9％、株高提高了14.5％、鳞茎直径提高了24.5％、总鲜重提高了39.7％，促进了大蒜株高、茎粗、干重和鲜重。

综上，本发明筛选获得的多粘类芽孢杆菌C2具有产生铁载体、解钾、解磷和降解纤维素等作用，同时本发明筛选的菌株在平板对峙实验中，对多种导致大蒜枯萎的病原真菌有显著拮抗作用，在不同土壤、不同培养条件下对大蒜有防病促生效果。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)C2，该菌株已于2022年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为CGMCC No.26242。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，其含有权利要求1所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)C2及其发酵产物。

3.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为微生物接种剂。

4.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂是将多粘类芽孢杆菌C2接种于液体培养基中进行培养获得的。

5.如权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于，所述液体培养基为LB培养基；

优选的，所述LB培养基组分为：酵母浸膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠1％，蒸馏水1000mL，pH 7.0。

6.如权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于，培养条件为：在30～40℃，培养10～20h，转速：160-200rpm；

优选的，培养条件为：在37℃，培养12h，转速180rpm。

7.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂还包括载体；优选的，所述载体为固体载体或液体载体；

优选的，所述微生物菌剂的剂型为液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

8.权利要求1所述多粘类芽孢杆菌C2或权利要求2-7任一项所述微生物菌剂在如下a)-d)中任意一项或多项中的应用：

a)产铁载体、降解纤维素、解钾、解磷；

b)拮抗镰刀菌；

c)改善植物根际土壤营养环境；

d)促进植物生长。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述镰刀菌为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)0C、5C和6B，轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)3C，以及层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)9D和11C；

所述植物为大蒜。

10.一种促进大蒜生长的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1所述多粘类芽孢杆菌C2和/或权利要求2-7任一项所述微生物菌剂作用于大蒜，实现对大蒜的促生；

优选的，所述作用为：在大蒜种瓣播种后，将权利要求1所述多粘类芽孢杆菌C2和/或权利要求2-7任一项所述微生物菌剂施用于大蒜种瓣周围土壤。