CN116284316A - 一种针对原肌球蛋白受体激酶a的d5结构域的d-蛋白抑制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种针对原肌球蛋白受体激酶A的D5结构域的D‑蛋白抑制剂及其应用。所述D‑蛋白抑制剂具有SEQ ID No:1例示的氨基酸序列。所述D‑蛋白抑制剂可抵抗蛋白酶的降解，具有低免疫原性，可被开发为镇痛以及抗癌药物。

Description

一种针对原肌球蛋白受体激酶A的D5结构域的D-蛋白抑制剂 及其应用
技术领域
本申请属于生物药物领域，尤其涉及一种针对原肌球蛋白受体激酶A的D5结构域的D-蛋白抑制剂及其应用。
背景技术
蛋白多肽药物通常由L-氨基酸组成，相对于小分子药物通常具有更好的生物活性与靶标特异性。然而L-蛋白多肽药物在体内会产生一定免疫应答；同时，由于体内存在大量蛋白水解酶，L-蛋白多肽药物的半衰期通常较短。为克服这些问题，镜像蛋白多肽药物(由D-氨基酸组成的蛋白多肽)近期得到关注，已表现出令人振奋的优点：(1)免疫系统不识别D-氨基酸，因而镜像蛋白多肽药物的免疫原性低；(2)体内蛋白酶不能降解D-肽键，因而镜像蛋白多肽药物具有口服给药和长效治疗的潜力。
TrkA(原肌球蛋白受体激酶A)是位于细胞膜上的具有酪氨酸激酶活性的受体，其天然的配体为神经生长因子(NGF)。当NGF与TrkA胞外D5结构域结合后，TrkA会同源二聚化并诱导其胞内激酶结构域募集各种细胞质衔接子，从而激活PI3K-Akt(磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B)和ERK/p38-MAP激酶(胞外调节蛋白激酶/促分裂蛋白激酶p38亚型)信号通路，并最终促使细胞繁殖。然而，NGF过载，将持续激活下游信号通路，产生持续性痛觉，因此，NGF-TrkA通路是有效的镇痛靶点。此外，过度表达的TrkA广泛分布于多种癌症中，包括乳腺癌、肺癌、神经母细胞瘤和皮肤癌等。在20％的乳腺癌活检样中检测到TrkA的过度表达，过量的TrkA可以显著增强乳腺癌细胞的致瘤性质，因此，它也被认为是治疗乳腺癌的潜在理想靶标。
辉瑞和礼来公司最近推出的非阿片类止痛药tanezumab，可通过选择性结合和抑制神经生长因子NGF，有效缓解骨骼和关节的中度至重度慢性疼痛。然而，tanezumab是一种单克隆抗体，一般大体积的抗体分子组织渗透能力较弱。同时，L型蛋白抗体容易被蛋白酶降解，半衰期短。因此，TrkA的镜像蛋白多肽抑制剂的开发，将为治疗乳腺癌和慢性疼痛提供潜在的高活性和高稳定的候选药物。
发明内容
本发明的技术目的是提供一种针对原肌球蛋白受体激酶A的D5结构域的D-蛋白抑制剂。
本发明的另一技术目的是提供所述D-蛋白抑制剂的制备方法。
本发明的又一技术目的是提供所述D-蛋白抑制剂在生物制药中的用途。
一方面，本发明提供针对原肌球蛋白受体激酶A的D5结构域的D-蛋白抑制剂，其中，构成所述D-蛋白抑制剂的氨基酸除甘氨酸外均为D型氨基酸，所述D-蛋白抑制剂的氨基酸序列选自以下情形(1)-(4)：
(1)SEQ ID No:1所示的氨基酸序列；
(2)SEQ ID No:1所示的氨基酸序列中，选自第4，7，8，11，21，22，23，25，27，30，32，34，36，61，63，65位氨基酸中的任意1-10个氨基酸被各自的同类氨基酸取代或被删除所得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(3)SEQ ID No:1所示的氨基酸序列中，除第4，7，8，11，21，22，23，25，27，30，32，34，36，61，63，65位氨基酸以外的其他氨基酸中的任何一个或多个氨基酸被各自的同类氨基酸取代或被删除所得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(4)SEQ ID No:1所示的氨基酸序列经上述情形(2)中的取代或被删除与上述情形(3)中的取代或被删除的任意组合改变后所得到的具有相同功能的氨基酸序列，
其中，所述同类氨基酸是指被取代的氨基酸与取代的氨基酸按氨基酸侧链基团分类同属一类；
所述相同功能是指经取代或被删除得到的氨基酸序列与未经取代或未被删除的氨基酸序列同样具有与TrkA D5结构域结合的功能。
对于氨基酸序列为SEQ ID No:1的D-蛋白抑制剂，其第4，7，8，11，21，22，23，25，27，30，32，34，36，61，63，65号氨基酸位于与TrkA D5结构域相互作用的界面上。
在具体实施方式中，被取代的氨基酸与取代的氨基酸均为含有带正电荷侧链的氨基酸、含有带负电荷侧链的氨基酸、含有极性未带电荷侧链的氨基酸、含有疏水性侧链的氨基酸、或含有芳香族侧链的氨基酸。
在具体实施方式中，所述D-蛋白抑制剂的二级结构包含α-螺旋和β-折叠。
在具体实施方式中，所述D-蛋白抑制剂具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。
在具体实施方式中，所述D-蛋白抑制剂的氨基酸序列为SEQ ID No:1的第4，7，8，11，21，22，23，25，27，30，32，34，36，61，63，65位氨基酸中的任意1-5个，例如1个、2个、3个、4个、或5个氨基酸被各自的同类氨基酸取代或被删除所得到的具有相同功能的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供一种氨基酸序列为SEQ ID No:1的D-蛋白抑制剂的合成方法，所述方法包括以下步骤：
1).通过固相多肽合成方法以肼树脂制备前体片段Thr1-Arg41(SEQ ID No:5)；
2).通过固相多肽合成方法以酰胺树脂制备酰胺末端肽片段Arg43-Gln65(SEQ IDNo:6)，该片段N端还连接半胱氨酸；
3).将步骤1)制备的前体片段Thr1-Arg41与4-巯基苯乙酸(MPAA)反应，制备Thr1-Arg41的MPAA硫酯肽片段；以及
4).通过一锅法将步骤3)得到的MPAA硫酯肽片段与步骤2)得到的酰胺末端肽片段Arg43-Gln65进行链接，然后脱硫即得所述D-蛋白抑制剂。
在具体实施方式中，在步骤3)中，将前体片段Thr1-Arg41溶解在盐酸胍溶液中，加入MPAA和戊二酮，将pH调节至2-2.5，在室温下反应，制备得到MPAA硫酯肽片段。
在具体实施方式中，在步骤4)中，将步骤3)得到的MPAA硫酯肽片段和步骤2)得到的酰胺末端肽片段溶解在盐酸胍中，将pH调节至6.3-6.5，室温反应过夜，然后用三(2-羧乙基)膦溶液稀释，加入叔丁基硫和2,2'-氮杂双(2-咪唑啉)二盐酸盐，将pH调节至7-7.2，在室温下反应，即得所述D-蛋白抑制剂。
又一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的上述针对原肌球蛋白受体激酶A的D5结构域的D-蛋白抑制剂，以及药学上可接受的载体。
另一方面，本发明提供上述针对原肌球蛋白受体激酶A的D5结构域的D-蛋白抑制剂或上述药物组合物在制备药物中的用途。
在具体实施方式中，所述药物为针对原肌球蛋白受体激酶A的D5结构域的抑制剂。
在具体实施方式中，所述药物为镇痛药物。
在具体实施方式中，所述镇痛药物以NGF-TrkA通路为镇痛靶点。
在具体实施方式中，所述药物为用于治疗癌症的药物，所述癌症包括但不限于乳腺癌、肺癌、神经母细胞瘤。
有益效果
本发明设计并合成了一种针对原肌球蛋白受体激酶A的D5结构域的D-蛋白抑制剂，其具有以下方面优势：
1.本申请的D-蛋白抑制剂为计算机从头设计生成的，是目前国际上首个针对TrkA的D5结构域而设计的D-型蛋白抑制剂。
2.相对于L型蛋白抗体，本申请的D-蛋白抑制剂可以抵抗蛋白酶的降解，从而延长半衰期。另外，由于免疫系统不识别D-氨基酸，因而，本申请的D-蛋白抑制剂还具有免疫原性低的特点。
3.由于本申请的D-蛋白抑制剂全序列为化学合成，因此其具备更高化学修饰灵活性。
4.TrkA是位于细胞膜上的具有酪氨酸激酶活性的受体，其天然的配体为神经生长因子(NGF)。当NGF与TrkA胞外D5结构域结合后，TrkA会同源二聚化并诱导其胞内激酶结构域募集各种细胞质衔接子，从而激活PI3K-Akt和ERK/p38 MAP激酶信号通路，并最终促使细胞繁殖。然而，NGF过载，将持续激活下游信号通路，产生持续性痛觉，因此，NGF-TrkA通路是有效的镇痛靶点。此外，过度表达的TrkA广泛分布于多种癌症中，包括乳腺癌、肺癌、神经母细胞瘤和皮肤癌等。在20％的乳腺癌活检样中检测到TrkA的过度表达，过量的TrkA可以显著增强乳腺癌细胞的致瘤性质，因此，它也被认为是治疗乳腺癌的潜在理想靶标。本申请经实验验证所述D-蛋白抑制剂与L-TrkAD5结构域具有很强的亲和力，因此其具有开发成用于治疗乳腺癌、肺癌、神经母细胞瘤等的药物以及镇痛药物的潜力。
附图说明
图1：本申请制备的D-蛋白抑制剂(D-7154)的化学合成过程示意图。
图2：D-7154的反相高效液相色谱图。
图3：D-7154的质谱图。
图4：D-7154复性FPLC色谱图(A)及SDS-PAGE照片(B)。
图5：D-7154的圆二色谱图。
图6：D-7154与L-TrkA的D5结构域的亲和力测定。
图7：D-7154的蛋白酶降解结果。
图8：D-7154对于NGF诱导的TF-1细胞增殖的影响。
具体实施方式
以下通过具体实施方式来详细阐释本申请的技术方案，然而，本领域的技术人员将了解本申请的保护范围并不限于此。
术语
在本申请中，D-蛋白抑制剂意指构成蛋白的除甘氨酸以外的所有氨基酸均为D构型。
在本申请中，“治疗有效量”是指当药物被给予人用于治疗疾病时，足以实现对该疾病控制的使用量。
制备例1.D-蛋白抑制剂的化学合成
实验所用Rink Amide AM树脂(载量为0.27mmol/g或0.55mmol/g采购自天津南开和成科技有限公司。实验所用的氨基酸衍生物购买江苏申琅生物科技有限公司(中国南通)。N,N-二甲基甲酰胺(DMF),三异丙基硅烷(TIPS),三氟乙酸(TFA)和硫代茴香醚购自J&KScientific Ltd.(北京)。N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)和2-肟氰乙酸乙酯(Oxyma)购自上海泰坦科技有限公司。1,2-乙二硫醇(EDT)购自TCI(Shanghai,China)Development Co.,Ltd.哌啶购自国药化学试剂有限公司，乙醚购自现代东方(北京)科技发展有限公司，乙腈购自Mallinckrodt Baker,Inc.。
反相高效液相色谱在岛津液相色谱仪上进行。A泵流动相为TFA0.1％乙腈，B泵流动相为TFA0.1％去离子水。
以下制备氨基酸序列为TEDEKIFRHLFEVLREVNPKRFMVFVLNGRVY VQIEGDDERARTASTWLKEWAKKQGIPLKVIIQ(SEQ ID No:1)的D-蛋白抑制剂(下文中称为：D-7154)，合成过程示意图见图1。
1.1用于化学合成D-7154的肽片段的合成
用于化学合成D-7154的肽片段采用标准Fmoc固相肽合成(Fmoc SPPS)制成，并由自由蓝(Liberty blue)微波肽合成器(CEM公司)自动合成。
以肼树脂制备MPAA(4-巯基苯基乙酸)硫酯末端肽前体片段(SEQ ID No:5，即Thr1-Arg41的前体肽段)，以酰胺树脂制备酰胺末端肽片段(SEQ ID No:6，即图1中Arg43-Gln65)。
上述肽片段的通用合成程序如下：首先，在DMF(N,N-dimethylformamide)中用10％哌啶和0.1M Oxyma(Ethyl cyanoglyoxylate-2-oxime)在90℃，1分钟下除去Fmoc保护基团。然后，用DMF洗涤树脂3次。将树脂(0.25mmol)、4当量带有Fmoc保护基团的氨基酸(0.2mM，5ml，溶解在DMF中)、4当量Oxyma(1mM，1ml，溶解在DMF中)、4当量DIC(0.5mM，2ml，溶解在DMF中)混合并在90℃的微波加热下偶联2分钟。DMF洗涤树脂3次，完成标准合成程序。在程序结束时，用TFA裂解液(TFA/TIPS/硫代苯甲醚/水/EDT＝82.5：5：5：5：2.5，体积比)切割3小时，将肽从树脂中切割出来。使用氮气将其浓缩。冰乙醚沉淀后离心并倒出上清液并重复3次。所得沉淀是粗肽，随后将用RP-HPLC(反相高效液相色谱)纯化以获得目标纯肽。
1.2MPAA(4-Mercaptophenylacetic acid)硫酯末端肽片段合成
将上面制备的MPAA硫酯末端肽前体片段(10mg/ml)溶解在6M盐酸胍溶液(pH＝2.3)中，加入10当量MPAA和5当量戊二酮，将pH调节至2-2.5，在室温下反应2小时，制备得到MPAA硫酯末端肽片段(即图1中的1)。
1.3一锅法链接及脱硫
将上述制备好的MPAA硫酯末端肽片段(1mM)和酰胺末端肽片段(1.1mM)溶解在6M盐酸胍(GdmCl)(pH＝7)中，将pH调节至6.3-6.5，室温反应过夜。然后用300mM TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶液(pH＝7)稀释3倍，加入10％(体积/体积)tBuSH(叔丁基硫醇)和40当量VA044(2,2'-氮杂双(2-咪唑啉)二盐酸盐)，将pH调节至7-7.2，在室温下反应3小时，得到D-7154(对应图1和2中的“3”)粗肽。反应示意图请参见图1。
1.4反相高效液相色谱纯化
使用反相高效液相色谱对制得的D-7154粗肽进行纯化：
将粗肽溶于含0.1％ TFA和50％乙腈的去离子水中，用0.22μm过滤器过滤得到纯化的溶液。使用反相高效液相色谱(岛津液相色谱仪)进行纯化：A泵流动相为TFA0.1％乙腈，B泵流动相为TFA0.1％去离子水。将纯化的溶液冻干，得到D-7154纯肽粉。图2显示了反相高效液相色谱图，以及图3显示了高效液相色谱纯化后的D-7154质谱图。
1.5.D-7154的复性(renaturation)纯化
前文化学合成后的D-7154产品处于变性状态，需要复性并纯化。
将上一步得到的D-7154纯肽粉直接溶解于一定体积的25mM Tris-HCl 6M Gdn-HCl(盐酸胍)pH 7.4中，加入相同体积的2M ARG-HCl((S)-2-氨基-5-胍基戊烷酸盐酸盐)使得蛋白终浓度为0.1mg/ml，透析至20mM HEPES 1M NaCl pH 7.0缓冲液中，4℃12-16h后取出，离心取上清，浓缩至1-2ml后使用分子筛缓冲液(20mM HEPES,1M NaCl，pH 7.0)进行分子筛(Superdex 75Increase 10/300GL column)纯化，由此得到最终的D-7154(图4A)。
根据D-7154FPLC的出峰体积，在15-19.5ml洗脱体积之间，每0.5ml体积进行取样，进行SDS-PAGE鉴定。使用15％聚丙烯酰胺浓度的分离胶进行电泳，180V，40分钟。结果见图4B，图中显示，每个组分都呈现出单一条带，无杂带，达到电泳纯级别，收集相应组分用于后续实验。
对比制备例1.L-7154的制备
L-7154氨基酸序列同D-7154，不同之处在于构成其的氨基酸均为L构型，其核苷酸序列为：ACCGAAGACGAAAAGATTTTCCGTCACCTGTTC GAAGTTCTGCGCGAAGTTAACCCGAAACGCTTTATGGTTTTCGTTCTGAACGGTCGTGTTTACGTGCAGATCGAGGGTGACGATGAACGTGCGCGTACCGCGTCTACCTGGCTGAAAGAATGGGCGAAAAAACAGGGTATCCCGCTCAAAGTTATCATCCAG(SEQ ID No:2)。
L-7154的制备方法为大肠杆菌中的蛋白表达，表达载体为pET28b(购买于苏州金唯智生物科技有限公司)。为便于后续使用His-tag对蛋白进行提取，在实际操作中，L-7154的编码序列前还会加入His-tag和TEV酶切位点，其氨基酸序列为GSSHHHHHHSSGENLYFQGS(SEQ ID No:3)，对应的DNA编码序列为GGCAGCAGCCATCATCATCATCATCATAGCAGCGGCGAAAACCTGTATTTTCAAGGCAGC(SEQ ID No:4)。
表达菌株为Lemo(DE3)，使用LB培养基和0.2mM IPTG为诱导剂，于18℃过夜表达，将表达后的菌液进行离心，弃掉上清，菌体沉淀重悬至缓冲液中。每升菌体收集至30ml TBS缓冲液1(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH 8.0)中，使用超声破碎进行裂解，裂解后的混合液13000rpm离心后，取上清过1ml Ni Sepharose 6Fast Flow树脂(Cytiva LifeSciences)，树脂使用50ml缓冲液2(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,40mM咪唑，pH 8.0)进行洗涤，再用5ml缓冲液3(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,300mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱，洗脱液浓缩至1ml后，使用分子筛缓冲液(50mM HEPES,pH 7.0,150mM NaCl)进行分子筛蛋白提纯(Superdex 75Increase10/300GL column，Cytiva Life Sciences)，得到L-7154。
测试例1：D-7154的圆二色谱(CD)
将上述制备的L-7154和D-7154调整其浓度为0.3mg/ml后用于CD测定。实验仪器为Chirascan V100圆二色光谱仪(Applied Photophysics)。检测波长范围是260-180nm，变温范围是25-95℃，升温步长为2℃，最后再从95℃直接回到25℃。结果表明，D-7154与L-7154呈现出镜像状态，且D-7154在特定波长处(208-222nm)形成了与L-7154同类的特征峰信号，这表明D-7154形成了α-螺旋和β-折叠的二级结构，且在95℃条件下依然维持其二级结构，表明该蛋白热稳定性较好(图5)。
测试例2：D-7154与L-TrkA的亲和力测定(OCTET)
将复性纯化后的D-7154稀释至不同浓度，使用OCTET用于进行亲和力测定，结果表明D-蛋白抑制剂能够和L-TrkA的D5结构域结合，且亲和力KD为15.1nM(图6)。
测试例3：D-7154抗蛋白酶降解能力鉴定
本实验使用胰蛋白酶(trypsin，Genom)和胃蛋白酶(pepsin，Aladin)对L-和D-7154进行降解：将蛋白酶与目标蛋白进行混合，trypsin终浓度为2.2mg/ml，反应缓冲液为含0.02％ EDTA的Hank's平衡盐溶液；pepsin终浓度为0.22mg/ml，反应缓冲液为0.1MGlycine,pH 2.5；L-和D-7154终浓度为0.2mg/ml，37℃孵育6和20h。完成后SDS-PAGE进行鉴定。
结果表明，L型蛋白几乎全部降解，而D-7154具有很强的抗降解能力，几乎没有降解，为延长药物半衰期提供依据(图7)。
测试例4：D-7154功能活性鉴定
D-7154与TrkA D5结构域的结合位点，与其天然配体NGF的结合位点有很大的交集，因此若D-1754可与TrkA D5结构域结合，则可以抑制NGF引起的细胞增殖，基于此原理进行本实验。
将TF-1细胞接种于96孔板中，每孔3000个细胞，基础培养基为含2％FBS的1640培养基。将细胞与不同浓度的NGF(0，100ng/ml)和D-7154(0，0.5，1，2.5，5μM)进行孵育，37℃，5％ CO2，48h。细胞增殖效果通过检测ATP水平(ApoSENSORTMCell Viability Assay Kit(BioVision))进行评估。
结果表明，在不加入NGF时，D-7154对细胞的增殖没有影响，表明D-7154对该细胞没有毒性作用；针对NGF引发的细胞增殖，D-7154具有明显的抑制作用(图8)。因此，针对NGF过载引起的持续性痛觉，D-7154具有潜在的镇痛效果。
另外，过度表达的TrkA广泛分布于多种癌症中，包括乳腺癌、肺癌、神经母细胞瘤和皮肤癌等。在20％的乳腺癌活检样中检测到TrkA的过度表达，过量的TrkA可以显著增强乳腺癌细胞的致瘤性质，所以本申请的D-7154在癌症治疗方面也具有潜在应用。

Claims (10)

1.针对原肌球蛋白受体激酶A的D5结构域的D-蛋白抑制剂，其中，构成所述D-蛋白抑制剂的氨基酸除甘氨酸外均为D型氨基酸，所述D-蛋白抑制剂的氨基酸序列选自以下情形(1)-(4)：
(1)SEQ ID No:1所示的氨基酸序列；
(2)SEQ ID No:1所示的氨基酸序列中，选自第4，7，8，11，21，22，23，25，27，30，32，34，36，61，63，65位氨基酸中的任意1-10个氨基酸被各自的同类氨基酸取代或被删除所得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(3)SEQ ID No:1所示的氨基酸序列中，除第4，7，8，11，21，22，23，25，27，30，32，34，36，61，63，65位氨基酸以外的其他氨基酸中的任何一个或多个氨基酸被各自的同类氨基酸取代或被删除所得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(4)SEQ ID No:1所示的氨基酸序列经上述情形(2)中的取代或被删除与上述情形(3)中的取代或被删除的任意组合改变后所得到的具有相同功能的氨基酸序列，
其中，所述同类氨基酸是指被取代的氨基酸与取代的氨基酸按氨基酸侧链基团分类同属一类；
所述相同功能是指经取代或被删除得到的氨基酸序列与未经取代或未被删除的氨基酸序列同样具有与TrkAD5结构域结合的功能。
2.根据权利要求1所述的D-蛋白抑制剂，其中，所述D-蛋白抑制剂的二级结构包含α-螺旋和β-折叠。
3.根据权利要求1所述的D-蛋白抑制剂，其中，所述D-蛋白抑制剂具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的D-蛋白抑制剂，其中，所述D-蛋白抑制剂的氨基酸序列为SEQID No:1的第4，7，8，11，21，22，23，25，27，30，32，34，36，61，63，65位氨基酸中的任意1-5个被各自的同类氨基酸取代或被删除所得到的具有相同功能的氨基酸序列。
5.一种氨基酸序列为SEQ ID No:1的D-蛋白抑制剂的合成方法，所述方法包括以下步骤：
1).通过固相多肽合成方法以肼树脂制备SEQ ID No:5所示的前体片段Thr1-Arg41；
2).通过固相多肽合成方法以酰胺树脂制备SEQ ID No:6所示的酰胺末端肽片段Arg43-Gln65，该片段N端还连接半胱氨酸；
3).将步骤1)制备的前体片段Thr1-Arg41与4-巯基苯乙酸(MPAA)反应，制备Thr1-Arg41的MPAA硫酯肽片段；
4).通过一锅法将步骤3)得到的MPAA硫酯肽片段与步骤2)得到的酰胺末端肽片段Arg43-Gln65进行链接，然后脱硫即得所述D-蛋白抑制剂。
6.根据权利要求5所述的方法，
其中，在步骤3)中，将前体片段Thr1-Arg41溶解在盐酸胍溶液中，加入MPAA和戊二酮，将pH调节至2-2.5，在室温下反应，制备得到MPAA硫酯肽片段，和/或
在步骤4)中，将步骤3)得到的MPAA硫酯肽片段和步骤2)得到的酰胺末端肽片段溶解在盐酸胍中，将pH调节至6.3-6.5，室温反应过夜，然后用三(2-羧乙基)膦溶液稀释，加入叔丁基硫和2,2'-氮杂双(2-咪唑啉)二盐酸盐，将pH调节至7-7.2，在室温下反应，即得所述D-蛋白抑制剂。
7.一种药物组合物，其包含治疗有效量的如权利要求1至4中任一项所述的针对原肌球蛋白受体激酶A的D5结构域的D-蛋白抑制剂，以及药学上可接受的载体。
8.如权利要求1至4中任一项所述的针对原肌球蛋白受体激酶A的D5结构域的D-蛋白抑制剂或如权利要求7所述的药物组合物在制备药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其中，所述药物为针对原肌球蛋白受体激酶A的D5结构域的抑制剂。
10.根据权利要求8所述的用途，其中，所述药物为镇痛药物或治疗癌症的药物，优选地，所述镇痛药物以NGF-TrkA通路为镇痛靶点，以及所述癌症选自乳腺癌、肺癌和神经母细胞瘤。
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