JP2019534707A - アルブミン及びその類似体の融合タンパク質を含有する組成物、前記組成物を製造及び使用するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年8月26日に出願された米国特許出願第15/249,346号の利益を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、ソマトスタチン又はその類似体若しくは誘導体、リンカー又はスペーサー、及びアルブミン又はその類似体若しくはバリアントを含む融合タンパク質に関連する。
SST;
L;及び
ALB、
ここで、
SSTはソマトスタチン、その類似体又は誘導体であり;
Lはスペーサー又はリンカーであり;及び
ALBはアルブミン、その類似体又はバリアントである。
SST-(L)x1-ALB (I);
ALB-(L)x1-SST (II);
[SST-(L)x1]y1-ALB (III);
ALB-[(L)x1-SST]y1 (IV);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2 (V);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB (VI);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB-[(L)x4-SST]y3 (VII);
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB (VIII);
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB (IX);及び
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB-[(L)x4-SST]y3 (X);
[式中、x1、x2、x3、x4、y1、y2又はy3は、独立的に0、又は1〜10若しくはより具体的には1〜5から選択される整数、又は1〜4の整数であり、ただし、少なくとも1つのLがアルブミン−ソマトスタチン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列中に存在する]。
SST;
L;及び
ALB、
ここで、
SSTはソマトスタチン又はその類似体若しくは誘導体であり;
Lはスペーサー又はリンカーであり;及び
ALBはアルブミン又はその類似体若しくはバリアントである。
SST-(L)x1-ALB (I);
ALB-(L)x1-SST (II);
[SST-(L)x1]y1-ALB (III);
ALB-[(L)x1-SST]y1 (IV);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2 (V);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB (VI);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB-[(L)x4-SST]y3 (VII);
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB (VIII);
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB (IX);及び
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB-[(L)x4-SST]y3 (X);
[式中、x1、x2、x3、x4、y1、y2又はy3の各々は、独立的に0、又は1〜10、若しくはより具体的には1〜5、若しくは1〜4から選択される整数であり、ただし、少なくとも1つのLが当該ポリペプチド中に存在する]。
SST;
L;及び
ALB、
ここで、SSTはソマトスタチン又はその類似体若しくは誘導体であり;
Lはスペーサー又はリンカーであり;及び
ALBはアルブミン又はその類似体若しくはバリアントである。
SST-(L)x1-ALB (I);
ALB-(L)x1-SST (II);
[SST-(L)x1]y1-ALB (III);
ALB-[(L)x1-SST]y1 (IV);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2 (V);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB (VI);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB-[(L)x4-SST]y3 (VII);
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB (VIII);
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB (IX);及び
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB-[(L)x4-SST]y3 (X);
[式中、
各々のx1、x2、x3、x4、y1、y2又はy3は、独立的に0又は1〜10から選択される整数であり、
ただし、少なくとも1つのLが融合タンパク質中に存在する]。
SST;
L;及び
ALB、
ここで、
SSTはソマトスタチン又はその類似体若しくは誘導体であり;
Lはスペーサー又はリンカーであり;
ALBはアルブミン又はその類似体若しくはバリアントである。
SST-(L)x1-ALB (I);
ALB-(L)x1-SST (II);
[SST-(L)x1]y1-ALB (III);
ALB-[(L)x1-SST]y1 (IV);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2 (V);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB (VI);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB-[(L)x4-SST]y3 (VII);
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB (VIII);
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB (IX);及び
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB-[(L)x4-SST]y3 (X);
[式中、
各々のx1、x2、x3、x4、y1、y2又はy3は、独立的に0、又は1〜10、1〜5、若しくは1〜4から選択される整数であり、ただし、少なくとも1つのLがアルブミン−ソマトスタチン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列中に存在する]。
(a)ヒトソマトスタチンペプチドをコードする配列の1個以上の隣接反復(adjacent repeat)を含むヌクレオチド配列を含む第1領域;
(b)ヒト血清アルブミン又はその断片をコードするヌクレオチド配列を含む第2領域;
(c)2〜100残基長のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むスペーサー領域;
であって、
スペーサー領域は、第1領域と第2領域との間に、又は第1領域と別の第1領域との間に存在し;
ヒトソマトスタチンペプチドをコードする配列の1個以上の隣接反復は、配列番号17若しくは18によりそれぞれ表されるSST-14若しくはSST-28、又はこれら2つの配列のいずれかに対し少なくとも85%の同一性を有する配列をコードし;又は
スペーサー配列は、配列番号31若しくはGGGGSにより、又は配列番号30 A(EAAAK)4Aにより表されるアミノ酸配列をコードする配列から成り;又は
領域(a)は、配列番号23及び24によりそれぞれ表されるSST-14若しくはSST-28、又はこれら2つの配列いずれかに対し少なくとも85%の同一性を有する配列の1個以上の隣接反復から成る、
ヌクレオチド配列を提供する。
(a)ソマトスタチンペプチド(ヒトソマトスタチンペプチドであっても良い)のポリペプチド配列を含む第1領域;
(b)血清アルブミン(ヒト血清アルブミンであっても良い)、又はその断片のポリペプチド配列を含む第2領域;
(c)2〜100残基長のポリペプチドを含むスペーサー領域。
本発明は、ソマトスタチン部分が、内在性ヒトSST-14又はSST-28(それぞれ配列番号23及び24)のヌクレオチド配列に対し少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチドによりコードされる、ポリペプチドコンストラクトを包含する。
本発明での使用のためのソマトスタチンは、任意のソマトスタチン、その類似体又は誘導体であり得る。それはヒトソマトスタチン、任意の他の単離されたソマトスタチン又は天然のソマトスタチンであり得る。SST部分は、オクトレオチド、ランレオチド、パシレオチド、セグリチド又はバプレオチド等の類似体であり得る。
本発明での使用のためのアルブミンは、任意のアルブミン、その類似体又はバリアントであり得る。アルブミンは、ヒト血清アルブミン、又は任意の他の単離された若しくは天然のアルブミンであり得る。
前述のように、スペーサー又はリンカーが本発明で使用され得る。スペーサー又はリンカーはソマトスタチン又はアルブミンと無関係で有り得る。
本発明の一実施形態は、ソマトスタチン−アルブミン融合タンパク質の調製のための方法を提供する。一実施形態では、本発明のソマトスタチン−アルブミン融合タンパク質は、コード遺伝子を含有するベクターを発現させ、ベクターを適切な宿主細胞に導入することにより調製される。例えば、融合タンパク質は、酵母等の宿主における適切なベクターの発現により得られる。一実施形態では、ピキアパストリス(Pichia pastoris)GS115が適切な発現宿主として使用され得、ベクターはpPIC9Kである。特に、CHO又はHEK293等の哺乳類細胞株が発現宿主として使用され得る。
本発明の融合タンパク質は、ソマトスタチンが使用されることが当該技術分野において既知である状態を処置するために使用され得る。従って、本発明はまた、単離及び精製された任意の先行する段落に記載のアルブミン−ソマトスタチン融合タンパク質を投与することにより、ヒト対象において癌を治療する方法であって、前記癌は、例えば、乳癌、大腸癌、肝臓癌、肺癌、内分泌癌、神経内分泌癌、膵臓癌及び前立腺癌から選択される、ソマトスタチン治療に反応を示すことが知られている任意の癌である、方法を包含する。
<実施例1−1:組み換え遺伝子の合成>
表5に列挙した融合タンパク質に対応する8個のコンストラクトを調製した。最初に、各融合タンパク質をコードする遺伝子配列をde novo合成し、次にpcDNA3.1ベクターに挿入した。
Maxi-prep又はMega-prepを用いて〜20mgの各DNAを生成した。
(A)懸濁細胞法
FreeStyle(商標)293-F細胞をフラスコ中に0.55〜0.6×106細胞/mLで播種した。約24時間後、細胞を1.1〜1.2×106細胞/mLで振とうフラスコ中に播種した。FreeStyle培地において500μgDNA/80mLでDNAを調製した。FreeStyle培地において、80mLあたり1.8mL PEIでポリエチレンイミン(PEI)を調製した。DNAをFreeStyle培地中に混合し、有効量のPEIをDNA溶液に添加し、当該混合物をボルテックスし室温で約15分間インキュベートし、DNA-PEI複合体を形成した。80mLのインキュベートしたDNA-PEI複合体を細胞培養物に添加した。約3時間後、TCイーストレート養分(TC Yeastolate feed、BD)を最終濃度が培養物1リットルあたり4gとなるよう添加した。約7〜8日後、遠心分離により当該培地を回収した。
トランスフェクションの約24時間前、HEK293細胞をフラスコ内に播種して、50〜90%のコンフルエンシーにし、完全培地を添加した。約24時間後、細胞を洗浄後、基礎培地を添加した。
回収した培地を、精製方法(連続クロマトグラフィー又は手作業によるバッチ精製)に応じて特定の体積までTFFシステム(Millipore)により濃縮した。
SST-HSA融合タンパク質はすべて、高収率の可溶形態で発現された。リンカーの長さ又は性質はタンパク質の収率及び融合タンパク質の溶解度に影響し得る。融合タンパク質コンストラクトがより長く、より複雑になるにつれて生産収率は僅かに減少することが、結果により示された。しかし、すべてのコンストラクトが、拡大生産(scale up production)のための収率を示した。
このアッセイは、ヒトソマトスタチンsst2受容体に対する[125I]ソマトスタチンの結合を測定する。標準的な方法を用い、改変HEPES(modified HEPES)pH7.4バッファーにおいて膜を調製するために、ヒトソマトスタチンsst2受容体をコードするプラスミドで安定的にトランスフェクトしたCHO-K1細胞を使用する。25℃で240分間、0.1mg分の膜を0.03nMの[125I]ソマトスタチンと共にインキュベートし、融合タンパク質を調べる。1μMソマトスタチンの存在下で非特異的結合を推定する。膜を濾過し3回洗浄し、フィルターを計数して特異的に結合した[125I]ソマトスタチンを判定する。
CHO-K1細胞において発現されるヒト組み換えソマトスタチンsst2a受容体を使用した。試験化合物及び/又はビヒクルを37℃で20分間、インキュベーションバッファー中で、前記細胞(2 × 105 細胞/mL)と共にインキュベートした。10nMのオクトレオチド応答と比較した、試験化合物により誘導される50%以上のcAMPの減少により、sst2a受容体アゴニスト活性が示された。
ラット血漿におけるSST融合タンパク質の安定性の改善をELISAを用いて証明した。試験結果により、ラット血漿中37℃でインキュベートすると、33分未満の半減期を示す遊離SSTとは対照的に、SST融合タンパク質(配列番号1)は5.5時間の分解半減期を見せることが示された(表4)。
500pg/mLの遊離SST又は750ng/mLのSST融合タンパク質(配列番号1)を1分、2分、5分、20分、60分、80分、100分、120分、150分及び180分間、ラットのプール血漿中でインキュベートした。各時点の血液試料はトリプリケートでインキュベートした。すべての血液試料を10分間5500rpmで遠心分離し、分析のための血漿試料を得た。バックグラウンド測定のためにラットのプール血漿をブランクとして用いた。すべての試料はデュプリケートで分析した。
(1)遊離SSTスタンダードの調製
標準曲線を以下の手順により作成した。遊離SSTのストック(1 mg/mL)を希釈バッファーで連続的に希釈して5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078及び0.039 ng/mL溶液を作製することにより、デュプリケートの標準点を調製した。
標準曲線を以下の手順により作成した。SST融合タンパク質のストック(2.42 mg/mL)を希釈バッファーで連続的に希釈して225、112.5、56.2、28.1、14.1、7.03、3.51及び1.76 ng/mL溶液を作製することにより、デュプリケートの標準点を調製した。
1)分析前、すべてのキットの構成品を室温(20〜25℃)で維持した。
2)50μL/ウェルのスタンダード、試料、又は陽性対照溶液をキットに添加した。そして、ブランクウェルを除く各ウェルに25μL/ウェルの一次抗体を添加した。最後に、ブランクウェルを除く各ウェルに25μL/ウェルのビオチン化ペプチドを添加した。免疫プレートを、300〜400rpmで振とうしながら、室温で2時間インキュベートした。ウェルを空にし、300μLの洗浄液で3回洗浄した。最後の洗浄後、吸収性のティッシュ上でストリップをタップすることによりウェルを空にした。
3)ウェルの中身を捨て、各ウェルを300μLの1x EIAアッセイバッファーで洗浄し、バッファーを捨てプレートを反転しふき取り乾燥させた。これを4回繰り返す。
4)100μLのSA-HRP溶液を各ウェルに添加する。免疫プレートを300〜400rpmで振とうしながら室温で1時間インキュベートする。
5)上記工程3に記載したように、1x EIAアッセイバッファーで4回、免疫プレートを洗浄及びふき取り乾燥させる。
6)100μLのTMB基質溶液を各ウェルに添加する。光から保護するために、免疫プレートにカバーを掛ける。免疫プレートを、300〜400rpmで振とうしながら、室温で1時間インキュベートする。
7)100μLの2N HClを各ウェルに添加し反応を停止させる。ウェル内の色は青色から黄色に変化するはずである。色の変化が均一であるように見えなければ、プレートを優しくタップして完全な攪拌を確実にする。20分以内に次の工程に進む。
8)免疫プレートをプレートリーダーに取り込む。450nmでの吸光度O.D.を読み取る。
SST及びSST融合タンパク質(配列番号1)を、それぞれ3及び5匹のSprague Dawley雄ラットに、尾静脈注射により、それぞれ0.02及び27.1mg/kgの用量で投与し、それぞれSST及びSST融合タンパク質の薬物動態プロファイル及びパラメーターを測定した(表8及び表9)。注射の前、水を自由に飲める状態で当該動物を一晩断食させ、その後、ネガティブな臨床徴候は観察されなかった。SSTを投与したラット各々において、SSTは急速な薬物動態プロファイルを示し(図1)、T1/2の計算値は3.5分だった(表4)。SST融合タンパク質を投与したラット各々において、SST融合タンパク質は2相の薬物動態プロファイルを示し(図2)、平均のα相(0〜0.5時間)のT1/2及びβ相(0.75〜4時間)のT1/2は、それぞれ1.01時間及び6.14時間と計算された(表4)。SST融合タンパク質の半減期の計算値は、遊離SSTの血漿T1/2の計算値(3.5分)、及び報告されたラットにおける遊離SSTの血漿T1/2(<1分;参考文献#1)よりも顕著に長かった(表4)。この一連の結果により、SST融合タンパク質はin vivoで顕著にSSTの安定性を改善し半減期を延長させることが示された。
所定の時点でラットを手で押さえ、EDTA-K2チューブに頸静脈により約300μLの血液試料を集めた後、4℃かつ1500gで10分間遠心分離して血漿試料を得た。
(1)遊離SSTスタンダードの調製
標準曲線を以下の手順により作成した。遊離SSTのストック(1 mg/mL)を希釈バッファーで連続的に希釈して5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078及び0.039 ng/mL溶液を作製することにより、デュプリケートの標準点を調製した。
標準曲線を以下の手順により作成した。SST融合タンパク質(2.42 mg/mL)をラットの血漿プールで連続的に希釈して225、112.5、56.2、28.1、14.1、7.03、3.51及び1.76 ng/mL溶液を作製することにより、デュプリケートの標準点を調製した。
実施例5−3に記載のように、ELISAアッセイを行った。
Claims (21)
- 以下を含む融合タンパク質:
SST;
L;及び
ALB
であって、
ここで、SSTはソマトスタチン、その類似体又は誘導体であり;
Lはスペーサー又はリンカーであり;及び
ALBはアルブミン、その類似体又はバリアントである、融合タンパク質。 - 以下から成る群から選択される、請求項1に記載の融合タンパク質:
SST-(L)x1-ALB (I);
ALB-(L)x1-SST (II);
[SST-(L)x1]y1-ALB (III);
ALB-[(L)x1-SST]y1 (IV);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2 (V);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB (VI);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB-[(L)x4-SST]y3 (VII);
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB (VIII);
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB (IX);及び
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB-[(L)x4-SST]y3 (X);
[式中、
x1、x2、x3、x4、y1、y2又はy3は、独立的に0又は1〜10から選択される整数であり、
ただし、少なくとも1つのLがアルブミン−ソマトスタチン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列中に存在する]。 - SSTが天然に存在する又は合成により製造される、請求項1に記載の融合タンパク質。
- SSTが、配列番号17若しくは18によりそれぞれ表されるSST-14若しくはSST-28をコードする配列、又はこれらの配列のいずれかに対し少なくとも85%の同一性を有する配列の、1個以上のタンデム反復を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- SSTがSST-14又はSST-28である、請求項1に記載の融合タンパク質。
- Lが、フレキシブルな若しくはαへリックス構造を有するポリペプチドリンカー又はスペーサーである、請求項1に記載の融合タンパク質。
- Lが、2〜100アミノ酸を有するポリペプチドである、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記ポリペプチドが少なくとも1つの、GGGGS、A(EAAAK)4A、(AP)n、(G)8、(G)5、又はそれらの任意の組み合わせを含み、nは10〜34から選択される整数である、請求項6に記載の融合タンパク質。
- ALBが哺乳類血清アルブミンである、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 哺乳類血清アルブミンが、配列番号25、又は配列番号25に対し少なくとも85%の配列同一性を有する配列である、請求項1に記載の融合タンパク質。
- x1、x2、x3、x4は、それぞれ独立に1〜5から選択される整数である、請求項2に記載の融合タンパク質。
- y1、y2、y3は、それぞれ独立に1〜5から選択される整数である、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 以下を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列:
SST;
L;及び
ALB、
であって、
SSTはソマトスタチン又はその類似体若しくは誘導体であり;
Lはスペーサー又はリンカーであり;及び
ALBはアルブミン又はその類似体若しくはバリアントである、ヌクレオチド配列。 - 以下から成る群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項13に記載のヌクレオチド配列:
SST-(L)x1-ALB (I);
ALB-(L)x1-SST (II);
[SST-(L)x1]y1-ALB (III);
ALB-[(L)x1-SST]y1 (IV);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2 (V);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB (VI);
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB-[(L)x4-SST]y3 (VII);
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB (VIII);
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB (IX);及び
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB-[(L)x4-SST]y3 (X);
[式中、
x1、x2、x3、x4、y1、y2又はy3の各々は、独立的に0、又は1〜10から選択される整数であり、
ただし、少なくとも1つのLが当該ポリペプチド中に存在する]。 - SSTが、配列番号17若しくは18によりそれぞれ表されるSST-14若しくはSST-28をコードする配列、又は配列番号17若しくは18に対し少なくとも85%の同一性を有する配列の、1個以上のタンデム反復を含む、前記ポリペプチド配列をコードする、請求項13に記載のヌクレオチド配列。
- 請求項1に記載の融合タンパク質を含むアルブミン−ソマトスタチン融合タンパク質を発現するプラスミドコンストラクト。
- 請求項16に記載のプラスミドコンストラクトで形質転換された細菌宿主細胞。
- 単離及び精製される、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 請求項1に記載の融合タンパク質を含む有効量の医薬組成物を投与することにより、ヒト対象において、内分泌物放出の疾患又は障害を治療する方法であって、前記内分泌物放出の疾患又は障害はソマトスタチンの投与に反応を示す状態である、方法。
- 前記状態が、乳癌、大腸癌、肝臓癌、内分泌癌、神経内分泌癌、膵臓癌、前立腺癌、脳癌及び肺癌から成る群から選択される癌である、請求項19に記載の方法。
- 前記癌が、ソマトスタチン受容体のタイプ1、2、3、4又は5を発現する、請求項20に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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