CN116284273A - 一种盐单胞菌蛋白satp1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种盐单胞菌蛋白SATP1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还涉及了上述盐单胞菌蛋白SATP1在提高大肠杆菌耐盐碱特性中的应用。本发明分离鉴定的盐单胞菌蛋白SATP1是一种盐碱耐受蛋白，该蛋白的α螺旋二聚体结构形成亲水性离子转运通道，通过Na+/H+逆向转运提高菌体的耐盐碱特性，使大肠杆菌能够在高盐碱浓度的固体平板上生长；本发明提供了一种新的盐碱耐受蛋白，为盐碱地改良提供了新的材料支持。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一种盐单胞菌蛋白SATP1及其应用。
背景技术
我国的土地资源总量虽然在全球排名前列，但是盐碱地的面积居多。土壤盐渍化不仅给农业生产带来极大损失，同时也无法进行正常的人类活动，是当今世界解决土地退化的最大难题。通过最新的研究发现，由于温室效应导致全球气候变暖，大量的土地逐渐开始盐碱化，改善并合理开发利用盐碱地资源是农业可持续发展的迫切需要，也是响应节能减排综合工作以及“黑土地保护”政策的具体行动。
与普通菌株不同，耐盐碱菌株自身可调节内外渗透压，将多余的Na+排出胞外，能够在较高pH值和高Na+环境中稳定发挥功能，维持细胞内渗透压平衡，保持细胞的形态功能。基于盐碱耐受蛋白具有独特的耐盐特性，我们可从微生物的角度来解决土地盐碱化的问题，通过获得耐盐碱菌株中的耐盐基因为改造盐碱地提供帮助。
综上所述，想要解决土地盐碱化问题目前较好的办法就是培育耐盐的作物，通过组织培养或分子标记辅助选择将耐盐基因转化进入普通作物，从而获得耐盐转基因植物，这种方法不仅成效快、节约时间、减少成本，而且相比于利用其他化学方法来说，减少了土壤的二次破坏，是一个新的研究思路。因此，筛选盐碱耐受蛋白是从微生物的角度来解决土地盐碱化的有效途径。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种盐单胞菌蛋白SATP1，克服目前尚无有效的盐碱耐受蛋白的问题。
本发明的第二目的是提供上述盐单胞菌蛋白SATP1的用途。
本发明通过以下技术方案来实现：
一、一种盐单胞菌蛋白SATP1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
二、上述的盐单胞菌蛋白SATP1在提高大肠杆菌耐盐碱特性中的应用。
进一步的，所述的盐单胞菌蛋白SATP1通过行使Na+/H+逆向转运蛋白的功能提高大肠杆菌的耐盐碱特性。
进一步的，所述的盐单胞菌蛋白SATP1的α螺旋二聚体结构形成亲水性离子转运通道提高大肠杆菌的耐盐碱特性。
本发明包括以下步骤：
(1)通过构建基因文库以及采用缺陷型菌株进行的功能互补相结合的方法，在LBK固体培养基中加入0.2M NaCl，并以氨苄抗性作为筛选手段，获得含有耐盐碱基因的片段；
(2)利用生物信息学软件DNAMAN对获得的盐碱耐受基因片段进行分析，发现其中一个阅读框比对后α螺旋二聚体结构形成亲水性离子转运通道，命名为SATP1(SEQ IDNo.1)，构建含有该基因的原核表达载体；
(3)通过互补缺陷型菌株功能的方法，首先对其进行生理功能的鉴定；再通过AO荧光猝灭的检测手段，对SATP1蛋白功能进行活性鉴定。
采用上述技术方案的积极效果：本发明分离鉴定的盐单胞菌蛋白SATP1是一种盐碱耐受蛋白，该蛋白的α螺旋二聚体结构形成亲水性离子转运通道，通过Na+/H+逆向转运提高菌体的耐盐碱特性，使大肠杆菌能够在高盐碱浓度的固体平板上生长；本发明提供了一种新的盐碱耐受蛋白，为盐碱地改良提供了新的材料支持。
附图说明
图1为盐单胞菌蛋白SATP1提高大肠杆菌耐NaCl特性；
图2为盐单胞菌蛋白SATP1提高大肠杆菌耐LiCl特性；
图3为盐单胞菌蛋白SATP1提高大肠杆菌耐碱特性；
图4位盐单胞菌蛋白SATP1的反转膜活性示意图；
图5为盐单胞菌蛋白SATP1的跨膜结构模型；
图6位盐单胞菌蛋白SATP1的离子通道及关键氨基酸的示意图。
具体实施方式
本发明中生物材料的来源：
1、所用的盐单胞菌YH-I于本实验室自主分离到的盐碱耐受菌种，已发表文章：盐单胞菌YH-I中MFS超家族转运蛋白基因的克隆、生物信息学分析及其功能初步验证，中国生物制品学杂志，2018，31(5)：473-478，484。作者：王艳红，刘艳双，石德喜，朱保国，吕保磊，付诗雨，徐苗，王伟，殷奎德。
2、所用的大肠杆菌E.coli KNabc由东北农业大学生命科学学院提供；该菌株已经公开在专利号CN201810765939.5，专利名称“喜盐芽胞杆菌钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlT及鉴定”，专利权人：东北农业大学，发明人：姜巨全、孟琳、王艳红、徐桐、张正来、刘贺男、张伟，申请日：20180712，授权公告日：20200424。
3、pUC18载体购自Solarbio公司；
4、含有SATP1基因的原核表达载体委托普健生物(武汉)科技有限公司(AtaGenix)合成。
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的范围。
实施例1
本实施例说明KNabc/pUC18-SATP1的获得。
1、将pUC18载体酶切并去磷酸化检测自连，胶回收后-20℃备用；
2、SATP1蛋白的编码基因扩增
以在含有0.2M NaCl的LBK固体培养基上生长的菌落KNabc/pUC-yj-1培养后提取的质粒为模板，用primer 5.0进行引物的设计，F：5'-catatggctagcgttagcatgctgc-3'(下划线为NdeI位点，SEQ ID No.2)和R：5'-ggatccttactgcagggtggtgcgcatg-3'(下划线为BamHI位点，SEQ ID No.3)，扩增目的基因，反应体系见表1，然后胶回收，将回收产物与准备好的pUC18载体连接，经过T4 DNA Ligase在4℃，连接时间48h后化学转化到KNabc感受态细胞中，涂布在事先准备好的含有0.2M NaCl的LBK/Amp50固体平板上，然后碱裂解法提取质粒并进行鉴定，同时将带有pUC18质粒也化学转化至KNabc感受态细胞作为负对照KNabc/pUC18，将二者分别在不同盐离子浓度的LBK/Amp50培养基上37℃，140rpm/min的胁迫条件下进行培养16-18h，分光光度计测定吸光度值。
表1PCR体系
3、制备化学感受态细胞
(1)从-80℃超低温冰箱取出保存的大肠杆菌(KNabc)菌株，于LBK固体培养基上划板，封口膜封口，从过夜培养的平板中挑选一个单菌落，接种于液体试管中，160rpm/min下培养12-14h；
(2)取适量的菌液1％接种量加入到100mL LBK培养基，37℃振荡培养3-5h使OD600约0.4-0.5后，将液体培养基预冷30min，此过程需时不时摇动一下菌液以保证菌液充分预冷；
(3)将冷却完毕的菌液装到50mL冰上冷却的离心管，4℃、5000rpm/min离心10min，弃去上清，并尽量除尽残液，以下过程需无菌操作；
(4)每管中加入10mL低温冷却的0.1moL/L的CaCl2溶液，重悬沉淀物，切勿剧烈震荡，再低温冷却30min；
(5)4℃环境下5000rpm/min离心10min，再次除去上清；
(6)取含有0.1moL/L CaCl2的15％的甘油混匀菌液，并分装到低温冷却的1.5mL离心管，每管100μL，4℃放置24-48h内使用，不影响效果，也可-80℃冰箱中保存备用。
4、化学转化方法
(1)取出化学感受态大肠杆菌(KNabc)，并放于冰上融化；
(2)将5-10μL相应质粒DNA加入到100μL化学感受态细胞中(加入的质粒体积不能超过感受态细胞体积的1/10)；
(3)混匀加入质粒的细菌，冰上放置30min；
(4)将样品置于42℃环境热激90s再快速放于冰中10min；
(5)加800μL在37℃环境预热的无抗LBK液体培养基，37℃，180rpm/min培养1h；
(6)制备含0.2M NaCl和AMP抗性的LBK固体培养基；
(7)收集培养好的菌体，弃上清，加入100μL新鲜的LBK液体培养基重悬菌体；
(8)将重悬的菌液全部涂布步骤(6)制备的固体平板，正置37℃培养箱30min后，倒置过夜培养，次日观察实验结果，挑取阳性克隆，提取质粒并送去测序。阳性克隆说明连接成功，得到KNabc/pUC18-SATP1。
实施例2
本实施例说明SATP1蛋白提高大肠杆菌的耐盐碱特性。
将实施例1得到E coli KNabc/pUC18-SATP1菌株，和带有pUC18质粒的负对照Ecoli KNabc/pUC18分别在LBK胁迫培养基进行培养。
由图1可知当NaCl浓度为0.15M时KNabc/pUC18基本停止生长，而KNabc/pUC18-SATP1还能继续正常生长。可见SATP1蛋白可以使缺陷菌株E.coli KNabc恢复耐盐能力，甚至可以耐受0.3M的NaCl，因此SATP1蛋白有耐Na+胁迫功能。
由图2可知当LiCl浓度为5mM时，KNabc/pUC18基本停止生长，而KNabc/pUC18-SATP1还能继续正常生长。可见SATP1蛋白可以使缺陷菌株E.coli KNabc恢复耐锂能力，甚至可以耐受40mM的LiCl，因此SATP1蛋白有耐Li+胁迫功能。
由图3可知当pH为7.5-8时，KNabc/pUC18生长下降明显，而KNabc/pUC18-SATP1还能继续正常生长。可见SATP1蛋白可以使缺陷菌株E.coli KNabc恢复耐碱能力，因此SATP1蛋白有耐碱胁迫功能。
实施例3
本实施例说明SATP1蛋白的Na+/H+逆向转运活性测试。
Na+/H+逆向转运活性通过反转膜微囊和吖啶橙荧光猝灭法进行鉴定。将E coliKNabc/pUC18-SATP1和对照菌E coli KNabc/pUC18分别通过法式高压细胞破碎法制备反转膜微囊，细胞施加1500p.s.i.的压力，然后瞬间释放压力，由于压力由外及内，细胞膜破碎形成的微囊膜的方向与原始细胞膜的恰好相反，形成反转膜微囊。
以H+结合的吖啶橙作为荧光指示剂，监控反转膜微囊外部H+的变化情况，当向反应体系中加入NADH以启动呼吸链，由呼吸的作用导致H+向反转膜内部运输，从而产生荧光猝灭，猝灭稳定后再加Na+，如果蛋白具有Na+/H+逆向转运活性，就会使H+向反转膜外部运输，从而使产生猝灭恢复。荧光猝灭恢复程度与荧光猝灭程度的比值即为Na+/H+逆向转运活性。
钠氢转运活性结果见图4。从结果可知，在荧光信号逐渐下降趋于平稳后，分别加入NaCl、LiCl和KCl后，含有SATP1蛋白的反转膜的荧光信号均体现出现上升趋势，说明产生了Na+/H+逆向转运；而对照反转膜的荧光信号没有上升趋势，说明SATP1蛋白的出现加强了大肠杆菌细胞膜的Na+/H+逆向转运活性。
实施例4
本实施例说明SATP1蛋白的Na+/H+逆向转运模型。
通过Alpha fold 2对SATP1蛋白进行结构模型建模。通过Pymol结构分析软件对Na+/H+转运通道进行分析。
SATP1蛋白形成同源2聚体的复合体结构，俯视图如图5所示，以多条α螺旋围绕中心形成空腔，具备离子通道的结构特征。进而通过氨基酸位点分析，如图6所示，发现各个单体的第9位组氨酸和第48位天冬氨酸在中心区域形成空间上的接近，具备Na+/H+转运的活性中心。
本发明分离鉴定的盐单胞菌蛋白SATP1是一种盐碱耐受蛋白，该蛋白的α螺旋二聚体结构形成亲水性离子转运通道，通过Na+/H+逆向转运提高菌体的耐盐碱特性，使大肠杆菌能够在高盐碱浓度的固体平板上生长；本发明提供了一种新的盐碱耐受蛋白，为盐碱地改良提供了新的材料支持。
Claims (4)
1.一种盐单胞菌蛋白SATP1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的盐单胞菌蛋白SATP1在提高大肠杆菌耐盐碱特性中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的盐单胞菌蛋白SATP1通过行使Na+/H+逆向转运蛋白的功能提高大肠杆菌的耐盐碱特性。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的盐单胞菌蛋白SATP1的α螺旋二聚体结构形成亲水性离子转运通道提高大肠杆菌的耐盐碱特性。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102382180A (zh) * | 2011-11-17 | 2012-03-21 | 中国农业大学 | Na+/H+逆向转运蛋白Nha-K1及其编码基因与应用 |
| CN102492026A (zh) * | 2011-11-17 | 2012-06-13 | 中国农业大学 | Na+/H+逆向转运蛋白Nha-K2及其编码基因与应用 |
| CN103087164A (zh) * | 2011-10-31 | 2013-05-08 | 中国科学院微生物研究所 | 钠氢泵蛋白及其编码基因和它们的应用 |
| CN107641629A (zh) * | 2017-08-23 | 2018-01-30 | 东北农业大学 | 一种安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd及其鉴定方法 |
| CN108486132A (zh) * | 2018-01-05 | 2018-09-04 | 东北农业大学 | 一种安达喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因ump及其鉴定方法 |
| CN109055397A (zh) * | 2017-08-23 | 2018-12-21 | 东北农业大学 | 喜盐芽胞杆菌钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlT及鉴定 |
| CN109880834A (zh) * | 2018-08-30 | 2019-06-14 | 东北农业大学 | 一种喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB及其鉴定方法 |
-
2022
- 2022-11-25 CN CN202211491357.5A patent/CN116284273A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103087164A (zh) * | 2011-10-31 | 2013-05-08 | 中国科学院微生物研究所 | 钠氢泵蛋白及其编码基因和它们的应用 |
| CN102382180A (zh) * | 2011-11-17 | 2012-03-21 | 中国农业大学 | Na+/H+逆向转运蛋白Nha-K1及其编码基因与应用 |
| CN102492026A (zh) * | 2011-11-17 | 2012-06-13 | 中国农业大学 | Na+/H+逆向转运蛋白Nha-K2及其编码基因与应用 |
| CN107641629A (zh) * | 2017-08-23 | 2018-01-30 | 东北农业大学 | 一种安达喜盐芽孢杆菌耐盐碱基因rdd及其鉴定方法 |
| CN109055397A (zh) * | 2017-08-23 | 2018-12-21 | 东北农业大学 | 喜盐芽胞杆菌钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlT及鉴定 |
| CN108486132A (zh) * | 2018-01-05 | 2018-09-04 | 东北农业大学 | 一种安达喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因ump及其鉴定方法 |
| CN109880834A (zh) * | 2018-08-30 | 2019-06-14 | 东北农业大学 | 一种喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB及其鉴定方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 王艳红;尹圣祥;王吉宏;王于;乔志刚;纪思雨;贾桂燕;: "盐单胞菌YH-I中MFS超家族转运蛋白基因的克隆、生物信息学分析及其功能初步验证", 中国生物制品学杂志, no. 05, 14 May 2018 (2018-05-14) * |
| 贾桂燕等: "盐单胞菌DSM 16354T中新型耐盐基因的克隆及解析", 中国生物工程杂志, vol. 42, no. 3, 25 March 2022 (2022-03-25), pages 27 - 37 * |
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