CN116271228A - 一种交联胶原蛋白冻干组合物及其冻干工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种交联胶原蛋白冻干组合物及其冻干工艺，在配方方面采用安全性和助悬性更好的聚乙烯吡咯烷酮和磺丁基‑β‑环糊精进行替代，同时加入合适的分散剂，提高产品溶解性同时，解决因使用CMC带来的问题；在冻干工艺方面，通过对产品溶液中氧气含量进行控制，增加保温阶段，并优化退火工艺等手段，提升产品的稳定性。本发明中的组合物经所述冻干工艺制备出的成品，保证了胶联胶原蛋白在体外和体内的稳定性及生物学活性，可用于人体皮肤组织填充修复，包括去除皱纹和修复凹陷性疤痕等，具有良好的医疗应用价值。

Description

一种交联胶原蛋白冻干组合物及其冻干工艺
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种交联胶原蛋白冻干组合物及其冻干工艺。
背景技术
注射美容是在局部区域注射填充一些特定的物质，以达到美容效果，是一种常见的美容外科技术。注射胶原蛋白是目前市场上较为受欢迎的填充项目之一。然而，单纯的非胶联胶原蛋白降解周期较短，不能满足求美者的需求。而交联蛋白微粒又存在不易复溶、复溶后分散性差、容易聚集、沉淀等问题。同时，现有的交联蛋白注射产品在临床使用过程中还存在皮内注射时易堵针、注射后易出现皮下结节、注射时使用的针头较粗导致疼痛感强等现象。因此，制备胶联胶原蛋白产品时常采用羧甲基纤维素钠（CMC）作为助悬剂来改善上述弊端。但是，CMC并非人体内源性物质，其生物相容性不好，容易引起过敏。此外，以CMC作为助悬剂的填充类产品，一般需要很长时间的水化作用才能用于皮内注射，从而会给应用带来不便，容易在使用过程中染菌。另外，现有的交联蛋白注射产品制备常用磷酸盐缓冲体系作为蛋白类冻干保护剂，由于磷酸盐的晶体性质，导致交联蛋白冻干产品容易出现萎缩、塌陷、结壳、样品水分过高、稳定性差，复溶时出现蛋白沉淀等不良问题。
同时，胶联胶原蛋白的冻干工艺同样非常重要。现有的上市品种存在冻干样品在预冻阶段样品结晶等环节的控制不够精细，导致了冻干产品的质量不稳定。
因此，有必要研究并开发一种新型的助悬剂，用于制备胶联胶原蛋白产品，以解决目前存在的问题。并对胶联胶原蛋白的冻干工艺加以改进，以提高产品的稳定性。
发明内容
针对上述目前的胶联胶原蛋白产品在助悬剂和冻干工艺方面存在的一些问题，本发明提供一种交联胶原蛋白冻干组合物及其冻干工艺。具体技术方案如下：
首先，针对采用羧甲基纤维素钠（CMC）作为助悬剂存在的问题，本发明提供一种交联胶原蛋白冻干组合物，采用安全性和助悬性更好的聚乙烯吡咯烷酮和磺丁基-β-环糊精进行替代，同时加入合适的分散剂，提高产品溶解性同时，解决因使用CMC带来的问题。该交联胶原蛋白冻干组合物具体组分包括交联胶原蛋白，冻干保护剂、分散剂、助悬剂和pH调节剂，其中：
所述冻干保护剂为糖醇类或氨基酸类冻干保护剂；
所述分散剂为聚乙二醇15羟基硬脂酸酯、聚乙二醇300、聚乙二醇400、丙二醇、吐温80中的一种或多种；
所述助悬剂为聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、磺丁基-β-环糊精中的一种或多种；
所述pH调节剂选自盐酸、硫酸、乙酸、甲磺酸、苹果酸、马来酸、柠檬酸及其盐、磷酸及其盐、乳酸及其盐、酒石酸及其盐、琥珀酸及其盐的一种或多种；
各组分的含量为：
所述交联胶原蛋白的含量为1～20mg/ml；
所述冻干保护剂与交联胶原蛋白的质量比为0.1:1～2:1；
所述分散剂与交联胶原蛋白的质量比为0.01:1～0.5:1；
所述助悬剂与交联胶原蛋白的质量比为0.01:1～0.5:1；
所述pH调节剂的用量为调节后交联胶原蛋白溶液的pH值为4.0～7.0。
优选地，所述糖醇类冻干保护剂为甘露醇、葡萄糖、丙二醇、氨基丁三醇、海藻糖、葡聚糖、棉子糖、羟乙基淀粉、二乙醇胺中的一种或者几种；其与交联胶原蛋白的质量比优选为0.1:1～2:1；
优选地，所述氨基酸类冻干保护剂为甘氨酸，丙氨酸，L-半胱氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，赖氨酸的一种或者几种；其与交联胶原蛋白的质量比优选为0.01:1～1:1。
更优选地，所述糖醇类冻干保护剂为甘露醇、氨基丁三醇、海藻糖、葡聚糖中的一种或者几种；其与交联胶原蛋白的质量比进一步优选为0.05:1～0.15:1；
更优选地，所述氨基酸类冻干保护剂为甘氨酸，丙氨酸，L-半胱氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，赖氨酸的一种或者几种；其与交联胶原蛋白的质量比进一步优选为0.05:1～0.5:1。
优选地，所述分散剂为聚乙二醇15羟基硬脂酸酯；其与交联胶原蛋白的质量比优选为0.03:1～0.2:1。
优选地，所述助悬剂为聚乙烯吡咯烷酮K12和磺丁基-β-环糊精的组合；其与交联胶原蛋白的质量比优选为0.25:1～1:1。
优选地，所述pH调节剂优选为盐酸，其用量优选为调节后交联胶原蛋白溶液的pH值优选为4.5～6.5。
其次，针对目前的胶联胶原蛋白产品冻干工艺存在的质量不稳定的问题，本发明提供一种交联胶原蛋白冻干组合物的冻干工艺，通过对产品溶液中氧气含量进行控制，增加保温阶段，并优化退火工艺等手段，提升产品的稳定性。该冻干工艺具体包括如下步骤：
1）冻干前处理：在制备交联胶原蛋白溶液时在溶液底部充入氮气，控制制备的交联胶原蛋白溶液中溶氧量小于0.5PPM；
2）保温阶段：将制备好的交联胶原蛋白溶液罐装至西林瓶中，推入冻干机，缓慢降温至-5～-8℃，进行保温40～80min；然后开启真空泵，瞬间抽真空，使交联胶原蛋白溶液瞬时结晶成为固体结晶状；
3）预冻阶段：将真空度恢复至常压，并急速降温至-80～-50℃，进行预冻120～300min；
4）退火：将温度升高至-35～-15℃后，保持40～180min，进行退火；
5）升华干燥：退火结束后，再次升高温度至-25～-10℃，再次开启真空泵，控制真空度为0～15Pa，保持300～1500min，进行升华干燥；
6）解析干燥：继续升高温度至-20～10℃，保持真空度为0～15Pa，保持60～600min，进行解析干燥；
7）充氮：解析干燥结束后，打开氮气阀，充入氮气至平衡，随后抽取部分氮气使冻干机内的气压小于一个大气压后进行压盖，出箱，获得交联胶原蛋白冻干组合物成品。
前述的交联胶原蛋白冻干组合物的冻干工艺，各步骤中温度升降的时间（速度）控制为：
步骤2）中，降温时间控制为20～60min；
步骤3）中，降温时间控制为1min以内；
步骤4）中，升温时间控制为20～60min；
步骤5）中，升温时间控制为20～60min；
步骤6）中，升温时间控制为60～300min。
前述的交联胶原蛋白冻干组合物的冻干工艺，最终获得的交联胶原蛋白冻干组合物成品水分含量为0～1.0%（m/m），其顶空氧含量小于0.5%（v/v），存储条件为室温。
本发明的有益效果：
1）本发明首次在胶联胶原蛋白填充类产品中加入聚乙二醇15羟基硬脂酸酯，其本身具极强的增溶解分散能力，在本发明中可以快速分散交联胶原蛋白，保证冻干前和复溶后的制剂具有高度均一性，具有极高的安全性和生物相容性，并且可以在一定程度上提高交联胶原蛋白的稳定性。
2）本发明首次将填充类产品中的羧甲基纤维素钠（CMC）替换为安全性和助悬性更好的聚乙烯吡咯烷酮K12和磺丁基-β-环糊精。聚乙烯吡咯烷酮K12和磺丁基-β-环糊精的一起加入，带来了制剂形态上意想不到的有益成果。磺丁基-β-环糊精对于含氮化合物的特异性亲和力，可以有效保护胶原蛋白中活性氨基基团，还可以增强其机械强度。形成稳定的空间立体结构，使得交联胶原蛋白以固定的形态长时间稳定于整个溶液体系中，对于维持样品体内的稳定性也具有一定作用。而聚乙烯吡咯烷酮K12的长链的分子结构形式和亲水性可以和磺丁基-β-环糊精共同抑制交联胶原蛋白的聚集，在溶液助悬和结晶抑制方面发挥着重要的作用。
3）本发明中为了进一步提高制剂的有效期和运输便利性，将该制剂以冻干形式呈现。现有的上市填充类冻干品种，容易出现萎缩、塌陷、结壳、样品水分过高、稳定性差，复溶时出现蛋白沉淀等不良问题。这些问题均与制剂产品在冻干过程中的工艺不稳定有关。本发明对冻干工艺进行了明显的优化。在制备过程中，将溶液中的氧气用氮气除去后，检测了溶液中氧气含量，冻干过程中加入保温阶段、真空度在保温阶段的变化、退火工艺、冻干结束前样品充氮等工艺相结合，解决了制剂成品出现的上述的各种问题，同时样品的稳定性也得到很大程度上的提升。这种稳定性不但表现于本发明中的冻干组合物可以室温长期存储，并且动物皮下降解实验结果，也体现了更长时间的降解周期，说明本发明的组合物在动物体内也具有更好的稳定性。说明本发明中的组合物和冻干工艺对于交联胶原蛋白在体外和体内均具有明显促进其稳定性的作用。
4）本发明中使用的糖醇类冻干保护剂，小分子葡聚糖不但可以对交联胶原蛋白在冻干过程中进行保护，防止剧烈的温度变化引起交联胶原蛋白活性降低，保护制剂产品的有效性；又可在产品使用过程中，发挥一定的抗炎抗过敏的功效，进一步降低了填充类产品在使用过程中的过敏风险。
5）本发明的组合物制剂成品内毒素小于0.5EU/ml，冻干制剂成品水分仅为0～1.0%，进一步增加了该组合物的安全性。而获得的冻干制剂存储条件为室温，放置在西林瓶中后顶空氧低于0.5%，溶解氧小于0.5ppm，具备产业化和商业化的可行性。且本发明的组合物可用于人体皮肤组织填充修复，包括去除皱纹和修复凹陷性疤痕等，具有良好的医疗应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例2中处方1～8交联胶原蛋白组合物对HSF细胞生长的影响。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
本实施例是一种交联胶原蛋白冻干组合物及其冻干工艺，该交联胶原蛋白冻干组合物具体组分包括交联胶原蛋白，冻干保护剂、分散剂、助悬剂和pH调节剂，其中：所述冻干保护剂为糖醇类或氨基酸类冻干保护剂；所述分散剂为聚乙二醇15羟基硬脂酸酯、聚乙二醇300、聚乙二醇400、丙二醇、吐温80中的一种或多种；所述助悬剂为聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、磺丁基-β-环糊精中的一种或多种；所述pH调节剂选自盐酸、硫酸、乙酸、甲磺酸、苹果酸、马来酸、柠檬酸及其盐、磷酸及其盐、乳酸及其盐、酒石酸及其盐、琥珀酸及其盐的一种或多种。各组分的含量为：所述交联胶原蛋白的含量为1～20mg/ml；所述冻干保护剂与交联胶原蛋白的质量比为0.1:1～2:1；所述分散剂与交联胶原蛋白的质量比为0.01:1～0.5:1；所述助悬剂与交联胶原蛋白的质量比为0.01:1～0.5:1；所述pH调节剂调节后溶液的pH值为4.0～7.0。
本实施例中，所述糖醇类冻干保护剂优选为甘露醇、葡萄糖、丙二醇、氨基丁三醇、海藻糖、葡聚糖、棉子糖、羟乙基淀粉、二乙醇胺中的一种或者几种，更优选为甘露醇、氨基丁三醇、海藻糖、葡聚糖中的一种或者几种；其与交联胶原蛋白的质量比优选为0.1:1～2:1，更优选为0.05:1～0.15:1；所述氨基酸类冻干保护剂优选为甘氨酸，丙氨酸，L-半胱氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，赖氨酸的一种或者几种，更优选甘氨酸，丙氨酸，L-半胱氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，赖氨酸的一种或者几种；其与交联胶原蛋白的质量比优选为0.01:1～1:1，更优选为0.05:1～0.5:1；所述分散剂优选为聚乙二醇15羟基硬脂酸酯，其与交联胶原蛋白的质量比优选为0.03:1～0.2:1；所述助悬剂优选为聚乙烯吡咯烷酮K12和磺丁基-β-环糊精的组合；其与交联胶原蛋白的质量比优选为0.25:1～1:1；所述pH调节剂优选为盐酸，其用量优选为调节后交联胶原蛋白溶液的pH值优选为4.5～6.5。
本实施例所述交联胶原蛋白冻干组合物的冻干工艺，具体包括如下步骤：
1）冻干前处理：在制备交联胶原蛋白溶液时在溶液底部充入氮气，控制制备的交联胶原蛋白溶液中溶氧量小于0.5PPM；
2）保温阶段：将制备好的交联胶原蛋白溶液罐装至西林瓶中，推入冻干机，缓慢降温至-5～-8℃，进行保温40～80min；然后开启真空泵，瞬间抽真空，使交联胶原蛋白溶液瞬时结晶成为固体结晶状；
3）预冻阶段：将真空度恢复至常压，并急速降温至-80～-50℃，进行预冻120～300min；
4）退火：将温度升高至-35～-15℃后，保持40～180min，进行退火；
5）升华干燥：退火结束后，再次升高温度至-25～-10℃，再次开启真空泵，控制真空度为0～15Pa，保持300～1500min，进行升华干燥；
6）解析干燥：继续升高温度至-20～10℃，保持真空度为0～15Pa，保持60～600min，进行解析干燥；
7）充氮：解析干燥结束后，打开氮气阀，充入氮气至平衡，随后抽取部分氮气使冻干机内的气压小于一个大气压后进行压盖，出箱，获得交联胶原蛋白冻干组合物成品，其水分含量为0～1.0%，其顶空氧含量小于0.5%，存储条件为室温。
本实施例所述交联胶原蛋白冻干组合物的冻干工艺中各步骤中温度升降的时间（速度）控制为：步骤2）中，降温时间控制为20～60min；步骤3）中，降温时间控制为1min以内；步骤4）中，升温时间控制为20～60min；步骤5）中，升温时间控制为20～60min；步骤6）中，升温时间控制为60～300min。
实施例2
本实施例为考察实施例1中所述的交联胶原蛋白组合物，加入不同冻干保护剂（即不同糖醇类冻干保护剂和不同氨基酸冻干保护剂以及浓度）对制备的交联胶原蛋白活性的影响。本实施例中交联胶原蛋白为用于注射填充类的交联胶原蛋白颗粒，其用量为100mg；采用的冻干保护剂及用量如表1所示，采用的分散剂为聚乙二醇15羟基硬脂酸酯。用量15mg。采用的助悬剂为磺丁基-β-环糊精和聚乙烯吡咯烷酮K12，用量37.5m。采用的pH调节剂为盐酸，调至pH6.5，并加入注射用水配制成10ml的交联胶原蛋白溶液。同时采用磷酸缓冲盐作为冻干保护剂的处方进行对比。以各处方交联胶原蛋白组合物对HSF细胞生长的影响评价交联胶原蛋白的活性。
表1. 不同冻干保护剂及浓度处方
Figure SMS_1
制备工艺：按照上述配方，将各组分称量加水充分搅拌分散制备交联胶原蛋白溶液，盐酸调节pH至6.5，注射用水加至10ml；制备同时在容器下部充氮，赶走体系中的氧气，控制制备的交联胶原蛋白溶液中溶氧量小于0.5PPM，然后采用实施例1中所述的冻干工艺进行冻干，冻干工艺参数如表2所示，分装后冻干，分装为10瓶，每瓶体积1ml，共冻干制剂成品水分为0～1.0%。
蛋白活性检测：
1、准备处方1～处方8交联胶原蛋白组合物各1份，加入1mL注射用水复溶，获得浓度为10mg/ml的交联胶原蛋白溶液，备用；
2、MTT法检测细胞活性
从液氮中取出HSF细胞收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，37℃培养箱中孵育，24h后加入10μl准备的处方1～处方8交联胶原蛋白溶液，分别检测胶原蛋白组合物加入后24h和48h细胞的数量。每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h；终止培养，小心吸去孔内培养液；每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。设20%DMSO组为阴性对照组。
表2. 各处方交联胶原蛋白冻干工艺参数
Figure SMS_2
实验结果，如图1所示，相比于二甲基亚砜（DMSO）各处方均具有一定的保护作用，但对比于正常细胞组的OD值，可以看出采用糖醇类冻干保护剂和氨基酸冻干保护剂的效果均优于采用磷酸缓冲盐体系，其中小分子葡聚糖和L-半胱氨酸在保护蛋白活性方面优于其他蛋白保护剂，效果最为显著。
实施例3
本实施例为考察实施例1中所述的交联胶原蛋白组合物中加入不同分散剂对制备的交联胶原蛋白的分散速度的影响。本实施例用于考察的实验处方见表3中的处方9～13。本实施例中交联胶原蛋白用量为100mg，采用的冻干保护剂为小分子葡聚糖和L-半胱氨酸两种，其小分子葡聚糖用量为10mg，L-半胱氨酸用量为25mg，采用的分散剂用量为15mg，分散剂类型如表3所示，采用的助悬剂为磺丁基-β-环糊精和聚乙烯吡咯烷酮K12，用量各为37.5mg，采用的pH调节剂为盐酸，调至pH6.5。以不加入分散剂的对照处方1作为对比。
表3. 不同冻干溶液分散剂处方
Figure SMS_3
制备工艺：按照上述处方9～13，将各组分称量加水充分搅拌室温分散后，记录各个处方完全分散的时间。然后将各处方配制的交联胶原蛋白溶液分装成10瓶，每瓶体积1ml，按照实施例2所述的冻干工艺进行冻干。冻干后的样品继续考察分散时间。
考察过程如下：取各个处方下的冻干成品各两瓶，用注射器分别加入1ml的注射用水后，开始计时，观察样品加入水后的形态变化，样品开始自由分散，记录样品分散完全，形成均一的混悬液后，记录各个处方完全分散的时间。
表4. 不同冻干溶液分散剂处分散时间
Figure SMS_4
实验发现，各分散剂均有一定的分散效果，其中处方9和处方10的交联胶原蛋白溶液冻干前后分散速度均较快，其中处方9的分散时间相对最快，说明聚乙二醇15羟基硬脂酸酯对于样品溶液和冻干成品的复溶都具有优良的分散性。
实施例4
本实施例为了考察实施例1所述的交联胶原蛋白组合物加入所述的助悬剂后中间体（未冻干的成品的溶液））的稳定性，和用所述冻干工艺冻干成品的外观形态、复溶后再分散时间、复溶后溶液的质量指标进行考察。并与现有技术中的所用的羧甲基纤维素钠制备的成品进行质量方面的对比。实验处方见表5中的处方14～20和对照处方2。
表5. 不同冻干制剂助悬剂的处方
Figure SMS_5
实验（1）：中间体稳定性。将各个处方的中间体溶液考察沉降容积比，将混悬剂放于量筒中，混匀，测定混悬剂的总容积V0，静置一定时间后，观察沉降面不再改变时沉降物的容积Vu，其沉降容积比F为：F=(Vu/V0)×100%。实验结果如表6所示。
表6. 不同冻干助悬剂的中间体沉降容积比
Figure SMS_6
实验（1）结果显示：采用聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、磺丁基-β-环糊精中的一种或多种作为替代，制备的交联胶原蛋白溶液中间体分散后稳定性相对于使用羧甲基纤维素钠作为助悬剂的对照处方2效果均明显具有更好的稳定性。相对而言，采用聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、磺丁基-β-环糊精中的两种组合比单独使用效果好；其中，处方18中采用磺丁基-β-环糊精和聚乙烯吡咯烷酮K12两者组合作为助悬剂的溶液分散后稳定性最好。
实验（2）：冻干成品稳定性（最终组合物）。按照表5处方，将各组分称量加水充分搅拌分散后，盐酸调节pH至6.5，注射用水加至10000mL；然后分装，每瓶体积1ml，按照实施例2所述的冻干工艺进行冻干。成品进行外观形态、复溶再分散时间、复溶后溶液的质量指标进行考察。考察结果见表7。
表7. 不同冻干制剂助悬剂的处方成品制剂考察
Figure SMS_7
结果显示：采用聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、磺丁基-β-环糊精中的一种或多种作为助悬剂的冻干成品明显优于对照处方2效果，采用两种组合比单独使用效果好，采用磺丁基-β-环糊精和聚乙烯吡咯烷酮K12两者组合的效果最好。
实验（3）：本实施例同时也考察该交联胶原蛋白组合物按照加入所述的助悬剂，并用所属的冻干工艺制备的成品的加速稳定性情况。主要考察的外观形态、复溶后再分散时间、复溶后溶液的质量指标进行考察。将各处方制备的冻干成品于温度40℃±2℃，相对湿度75%±5%的条件下放置6个月，然后观察测试并记录结果。实验结果见表8。
表8. 不同冻干制剂助悬剂的处方成品制剂加速稳定性考察
Figure SMS_8
结果再次显示，采用聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、磺丁基-β-环糊精中的一种或多种作为助悬剂的冻干成品明显优于对照处方2效果，采用两种组合比单独使用效果好，采用磺丁基-β-环糊精和聚乙烯吡咯烷酮K12两者组合的效果优于其他处方和对照处方，说明磺丁基-β-环糊精和聚乙烯吡咯烷酮K12可以明显提高成品的质量性能。
实施例5
本实施例为了考察所述的交联胶原蛋白冻干工艺，对比现有冻干技术常用的冻干工艺对于冻干成品的外观形态、复溶后再分散时间、复溶后溶液的质量指标进行考察。本实施例采用实施例4中的处方18和对照处方2，分别采用实施例1所述的冻干工艺和现有的常用冻干工艺进行冻干，获得四个样品，并对该四个样品进行制剂形态、复溶后再分散时间、复溶后溶液的质量指标进行考察。
实施例1所述的冻干工艺参数按照实施例2中的表2所示的参数进行，现有的常用冻干工艺参数如表9所示。各实验组，除了配方、及冻干参数的不同，其余条件均一致。各冻干成品的质量指标结果如表10所示。
表9. 对比冻干工艺（现有技术常用工艺）
Figure SMS_9
表10. 两种不同冻干工艺制备的处方成品质量对比情况
Figure SMS_10
结果显示：1）相同处方，本发明冻干工艺制备的样品在制剂形态上及分散情况相较于对比冻干工艺的样品均有显著的提升。2）不同处方，使用本发明冻干工艺进行制备的样品，在制剂形态和重新分散情况相似，但是在复溶时间和复溶后沉降容积比方面，本发明中冻干组合物具有明显优于对比冻干工艺的样品。说明：本发明配方及经过优化的冻干工艺制备的样品在外观和各项质量指标方面相较于现有配方及工艺均具有明显的优越性。
实施例6
本实施例通过单次静脉或腹腔给予小鼠样品复溶后溶液来评价其潜在的急性全身毒性。
试验过程：
采用处方18的冻干组合物作为实验样品，直接使用生理盐水或者注射用水复溶。
选取10只雄性成年小鼠，随机分为2组，每组5只。第1～2组动物单次经动物腹腔给予相应其阴性对照液（SC）及样品原液，给药容积为50 mL/kg。各组动物体重和给药量见表11。注射完毕后，观察动物反应并于给药后4h、24h、48h和72h观察和记录试验组和对照组动物的临床表现，实验结果见表12。
表11. 动物体重和给药
Figure SMS_11
表12. 临床观察结果
Figure SMS_12
由以上实验结果可知，在本次试验条件下，该交联胶原蛋白冻干组合物对于小鼠没有急性全身毒性，说明该组合物具有安全性。
实施例7
本实施例主要考察不同配方中交联胶原蛋白在动物皮下的降解情况。
实验目的：以小鼠为试验对象，进行皮下交联胶原蛋白降解试验研究，对比不同冻干工艺和不同处方的样品在小鼠皮下的降解情况。
实验样品：采用实施例5中处方18和对照处方2，分别采用实施例1所述的冻干工艺和现有的常用冻干工艺进行冻干制备的四个样品，作为动物皮下交联胶原蛋白降解实验样品，同时准备生理盐水作为空白对照组。
实验动物：健康小鼠60只。
实验方法：将60只小鼠随机分为5组，每组12只，第一组注射处方18+本发明冻干工艺样品溶液，第二组注射处方18+对比冻干工艺样品溶液，第三组注射对照处方2+本发明冻干工艺样品溶液，第四组注射对照处方2+对比冻干工艺样品溶液，第五组注射生理盐水。每一组小鼠再平均分为注射后1月检测组（4只）、注射后3月检测组（4只），注射后6月检测组（4只）。每组小鼠在皮下注射后，在实验检测点处死实验小鼠。分别取小鼠注射部位面积为1cm*1cm的皮肤组织，加入缓冲液后，制成匀浆，加入胰酶。离心取上清液。然后采用人Ⅲ型胶原α1（COL3A1）酶联免疫试剂盒（CUSABIO，产品编号：CSB-E13446h）测定，各实验组胶原蛋白残留含量。结果见表13。
表13. 胶原蛋白残留含量结果
Figure SMS_13
结果显示：1）相同处方不同冻干工艺制备的组合物，在动物体内降解程度具有明显差距，采用本发明中冻干工艺制备的组合物在动物皮下的稳定性具有明显的改善作用。2）不同处方使用本发明冻干工艺制备的组合物在小鼠体内的降解周期明显长于对照冻干工艺制备的组合物，说明本发明中组合物中使用的冻干辅料对于样品在动物皮下的降解周期的延长，发挥着重要的作用。且本发明中冻干组合物不管采取哪种冻干方式，在动物体内降解周期明显都长于现有技术的冻干组合物。结论：本发明中交联胶原蛋白中各种辅料的加入和创新的冻干工艺可以有效延缓交联胶原蛋白在体内的降解时间，相对于现有技术而言具有显著的进步。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非只包含一个的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种交联胶原蛋白冻干组合物，包括交联胶原蛋白，冻干保护剂、分散剂、助悬剂和pH调节剂，其特征在于：其中：
所述冻干保护剂为糖醇类或氨基酸类冻干保护剂；
所述分散剂为聚乙二醇15羟基硬脂酸酯、聚乙二醇300、聚乙二醇400、丙二醇、吐温80中的一种或多种；
所述助悬剂为聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、磺丁基-β-环糊精中的一种或多种；
所述pH调节剂选自盐酸、硫酸、乙酸、甲磺酸、苹果酸、马来酸、柠檬酸及其盐、磷酸及其盐、乳酸及其盐、酒石酸及其盐、琥珀酸及其盐的一种或多种；
各组分的含量为：
所述交联胶原蛋白的含量为1～20mg/ml；
所述冻干保护剂与交联胶原蛋白的质量比为0.1:1～2:1；
所述分散剂与交联胶原蛋白的质量比为0.01:1～0.5:1；
所述助悬剂与交联胶原蛋白的质量比为0.01:1～0.5:1；
所述pH调节剂的用量为调节后交联胶原蛋白溶液的pH值为4.0～7.0。
2.根据权利要求1所述的交联胶原蛋白冻干组合物，其特征在于：
所述糖醇类冻干保护剂为甘露醇、葡萄糖、丙二醇、氨基丁三醇、海藻糖、葡聚糖、棉子糖、羟乙基淀粉、二乙醇胺中的一种或者几种；其与交联胶原蛋白的质量比为0.1:1～2:1；
所述氨基酸类冻干保护剂为甘氨酸，丙氨酸，L-半胱氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，赖氨酸的一种或者几种；其与交联胶原蛋白的质量比为0.01:1～1:1。
3.根据权利要求2所述的交联胶原蛋白冻干组合物，其特征在于：
所述糖醇类冻干保护剂为甘露醇、氨基丁三醇、海藻糖、葡聚糖中的一种或者几种；其与交联胶原蛋白的质量比为0.05:1～0.15:1；
所述氨基酸类冻干保护剂为甘氨酸，丙氨酸，L-半胱氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，赖氨酸的一种或者几种；其与交联胶原蛋白的质量比为0.05:1～0.5:1。
4.根据权利要求1所述的交联胶原蛋白冻干组合物，其特征在于：所述分散剂为聚乙二醇15羟基硬脂酸酯。
5.根据权利要求1所述的交联胶原蛋白冻干组合物，其特征在于：所述分散剂与交联胶原蛋白的质量比为0.03:1～0.2:1。
6.根据权利要求1所述的交联胶原蛋白冻干组合物，其特征在于：所述助悬剂为聚乙烯吡咯烷酮K12和磺丁基-β-环糊精的组合。
7.根据权利要求6所述的交联胶原蛋白冻干组合物，其特征在于：所述助悬剂与交联胶原蛋白的质量比为0.25:1～1:1。
8.一种用于制备权利要求1-7任意一项所述的交联胶原蛋白冻干组合物的冻干工艺，其特征在于：包括如下步骤：
1）冻干前处理：在制备交联胶原蛋白溶液时在溶液底部充入氮气，控制制备的交联胶原蛋白溶液中溶氧量小于0.5PPM；
2）保温阶段：将制备好的交联胶原蛋白溶液罐装至西林瓶中，推入冻干机，缓慢降温至-5～-8℃，进行保温40～80min；然后开启真空泵，瞬间抽真空，使交联胶原蛋白溶液瞬时结晶成为固体结晶状；
3）预冻阶段：将真空度恢复至常压，并急速降温至-80～-50℃，进行预冻120～300min；
4）退火：将温度升高至-35～-15℃后，保持40～180min，进行退火；
5）升华干燥：退火结束后，再次升高温度至-25～-10℃，再次开启真空泵，控制真空度为0～15Pa，保持300～1500min，进行升华干燥；
6）解析干燥：继续升高温度至-20～10℃，保持真空度为0～15Pa，保持60～600min，进行解析干燥；
7）充氮：解析干燥结束后，打开氮气阀，充入氮气至平衡，随后抽取部分氮气使冻干机内的气压小于一个大气压后进行压盖，出箱，获得交联胶原蛋白冻干组合物成品。
9.根据权利要求8所述的交联胶原蛋白冻干组合物的冻干工艺，其特征在于：各步骤中温度升降的时间控制为：
步骤2）中，降温时间控制为20～60min；
步骤3）中，降温时间控制为1min以内；
步骤4）中，升温时间控制为20～60min；
步骤5）中，升温时间控制为20～60min；
步骤6）中，升温时间控制为60～300min。
10.根据权利要求8所述的交联胶原蛋白冻干组合物的冻干工艺，其特征在于：步骤7）中，获得的交联胶原蛋白冻干组合物成品水分含量质量百分比为0～1.0%，其顶空氧含量体积百分比为小于0.5%，存储条件为室温。
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