CN116270592A - 一种新型抑制外泌体释放的药物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型抑制外泌体释放的药物及其用途，属于生物医药技术领域。具体公开了槲皮素或其药学上可接受的盐或包含所述槲皮素或其药学上可接受的盐的组合物可通过抑制热休克蛋白70/90作为抑制外泌体释放的药物，其具有治疗肾间质炎症和纤维化的用途。

Description

一种新型抑制外泌体释放的药物及其用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地，涉及槲皮素或者包含槲皮素的药物组合物作为一种新型抑制外泌体释放的药物及其在治疗肾间质炎症和纤维化疾病中的用途。

背景技术

槲皮素(Quercetin，Qu)是一种广泛存在于植物界的黄酮类化合物，其化学名为3,3’,4’,5,7-五羟基黄酮，多以苷的形式在植物界分布广泛，广泛存在于植物的花、叶、果实中。

外泌体（exosomes），是几乎所有细胞能够分泌的直径40-160nm的细胞外囊泡，通过携带丰富的蛋白质、miRNAs、长链非编码RNAs及mRNAs等生物活性分子物质来介导细胞间通讯（Science. 2020; 367(6478): eaau6977., NatRev Drug Discov. 2022 May;21(5):379-99.）。既往多项研究证实，损伤细胞释放的外泌体介导了多种疾病的发生发展。例如，缺氧损伤的肾小管上皮细胞源外泌体携带miR-23a激活肾间质巨噬细胞，促进肾间质炎症（Kidney Int. 2019;95:388-404.）；脂多糖损伤的肺组织释放的细胞外囊泡可招募骨髓来源中性粒细胞促进肺的炎症反应（J Extracell Vesicles. 2022;11(5):e12223）。随后，越来越多的研究者们开始探索使用外泌体抑制剂来治疗疾病，有研究显示，在急性肾损伤和慢性肾脏病小鼠模型中，抑制损伤肾脏的外泌体释放可以减轻肾脏纤维化（Kidney Int.2020;97:1181-95.），提示外泌体抑制剂可能是治疗肾间质纤维化的新方法。

因此，研究新型抑制外泌体释放的药物具有重要的意义，本发明提出了将槲皮素或者包含槲皮素的药物组合物作为一种新型抑制外泌体释放的药物及其在治疗肾间质炎症和纤维化疾病中的用途。

发明内容

本发明的目的在于发现一种新型抑制外泌体释放的药物，并提供其通过抑制外泌体释放减轻肾间质炎症和纤维化的应用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

槲皮素用于抑制外泌体释放的用途。

优选地，所述槲皮素或其药学上可接受的盐或包含所述槲皮素或其药学上可接受的盐的组合物用于制备抑制外泌体释放的药物。

优选地，所述槲皮素或其药学上可接受的盐或包含所述槲皮素或其药学上可接受的盐的组合物用于制备治疗个体的肾间质疾病的药物。

优选地，槲皮素或其药学上可接受的盐或包含所述槲皮素或其药学上可接受的盐的组合物在制备用于治疗个体的肾间质炎症和纤维化的药物中的用途。

优选地，所述槲皮素或其药学上可接受的盐和/或槲皮素或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体一起被制成药学上可接受的剂型，优选为注射剂、口服制剂。

优选地，所述槲皮素通过抑制热休克蛋白90/70以抑制外泌体的释放，通过如下技术路线证明：

（1）Hsp70/90促进了肾小管上皮细胞及巨噬细胞的外泌体释放；

（2）槲皮素抑制肾小管上皮细胞及巨噬细胞中Hsp70/90的表达；

（3）槲皮素通过抑制肾小管上皮细胞及巨噬细胞Hsp70/90的表达抑制外泌体的释放；

（4）槲皮素在体内抑制Hsp70/90的表达，并通过抑制外泌体的释放改善肾间质炎症及纤维化。。

其中，路线（1）、（2）、（3）中所述肾小管上皮细胞为永生化的小鼠肾小管上皮细胞系（TEC）；

其中，路线（1）、（2）、（3）中所述巨噬细胞为RAW 264.7鼠巨噬细胞系；

其中，路线（4）中所述槲皮素改善肾间质炎症是在单侧输尿管梗阻（UUO）模型和脂多糖（LPS）诱导的肾损伤模型中展开的；

其中，槲皮素改善肾间质纤维化是在UUO模型中验证的。

优选地，通过敲降或过表达mTEC及RAW 264.7的Hsp70/90证明，Hsp70/90介导外泌体的释放。

优选地，通过细胞实验和动物实验证明，槲皮素可在体内外抑制Hsp70/90的表达。

优选地，通过在LPS诱导的mTEC及RAW 264.7细胞损伤模型中过表达Hsp70/90，证实槲皮素可通过抑制Hsp70/90的表达减少外泌体的释放。

优选地，构建UUO模型和LPS模型，并通过灌胃给予治疗剂量的槲皮素，发现槲皮素可以抑制外泌体的释放并减轻肾间质炎症和纤维化。

3、有益效果

（1）目前能用于动物及细胞实验水平的外泌体抑制剂较少，鞘磷脂酶抑制剂GW4869是较为公认的，但GW4869尚无可应用于临床的依据，而本发明所创新应用的槲皮素存在于多种食物和中药中，可口服给药，安全性较好。

（2）鞘磷脂酶抑制剂GW4869价格高昂，本发明用价格低廉的槲皮素替代GW4869作为抑制外泌体释放作用的药物，能够有效降低使用成本。

（3）本发明证实槲皮素可通过抑制外泌体释放改善小鼠肾脏炎症及纤维化，基于该原理，可能在其他炎症性疾病，如急性呼吸窘迫综合征、炎症性肠病等中也具有很好的应用前景；此外，肿瘤释放的外泌体被认为是介导肿瘤转移的重要介质，该药亦可应用于抗肿瘤领域。

附图说明

图1为本发明中Hsp70/90促进TEC及巨噬细胞的外泌体释放[1]，其中：（A）透射电镜观察TEC释放的外泌体（TEC-exos）形态，标尺为50 nm；（B）TEC-exos的粒径分布图；（C）粒径分析仪（NTA）分析siRNA-Hsp70或siRNA-Hsp90转染LPS诱导的1×107 TEC的外泌体释放量；（D）质粒过表达Hsp70或Hsp90诱导的1×107 TEC的外泌体释放量；（E）透射电镜观察巨噬细胞RAW 264.7释放的外泌体（RAW-exos）形态，标尺为50 nm；（F）RAW-exos的粒径分布图；（G）NTA分析siRNA-Hsp70或siRNA-Hsp90转染LPS诱导的1×107 RAW 264.7的外泌体释放量；（H）质粒过表达Hsp70或Hsp90诱导的1×107 RAW 264.7的外泌体释放量。

图2为本发明中槲皮素抑制TEC及巨噬细胞中Hsp70/90的表达，其中：（A）qPCR检测TEC中Hsp70、Hsp90的mRNA水平；（B）Western blot 检测TEC中Hsp70、Hsp90的蛋白水平；（C）免疫荧光检测TEC中Hsp70、Hsp90的蛋白水平，标尺为50 μm；（D）qPCR检测RAW 264.7中Hsp70、Hsp90的mRNA水平；（E）Western blot 检测RAW 264.7中Hsp70、Hsp90的蛋白水平；（F）免疫荧光检测RAW 264.7中Hsp70、Hsp90的蛋白水平，标尺为50 μm。

图3为本发明中槲皮素通过抑制TEC及巨噬细胞Hsp70/90的表达抑制外泌体的释放，其中：（A）槲皮素对TEC细胞活性的影响；（B）NTA分析5,10,20 μmol/L槲皮素对LPS损伤的TEC释放外泌体的影响；（C）质粒过表达Hsp70或Hsp90对槲皮素、LPS共同干预的TEC的外泌体释放的影响；（D）槲皮素对RAW 264.7细胞活性的影响；（E）NTA分析5,10,20 μmol/L槲皮素对LPS损伤的RAW 264.7释放外泌体的影响；（F）质粒过表达Hsp70或Hsp90对槲皮素、LPS共同干预的RAW 264.7的外泌体释放的影响。

图4（a）、图4（b）为本发明中槲皮素在UUO模型中抑制Hsp70/90的表达，并通过抑制外泌体的释放改善肾间质炎症及纤维化，其中：（A）qPCR检测槲皮素对Hsp70、Hsp90的mRNA水平的影响；（B）Western blot检测Hsp70、Hsp90的蛋白水平；（C）免疫荧光检测肾组织中Hsp70、Hsp90的蛋白水平，标尺为50 μm；（D）槲皮素对100 mg肾组织中外泌体释放量的影响；（E）免疫荧光检测肾组织中外泌体标志物Alix、CD63的蛋白水平，标尺为50 μm；（F）Western blot检测肾组织中外泌体标志物Alix、Tsg101、CD63、CD9的蛋白水平；（G）PAS、Masson染色、巨噬细胞标志物F4/80的免疫组化检测分析槲皮素对肾间质炎症及纤维化的影响；（H）qPCR检测槲皮素对肾组织炎症因子IL-1β、TNF-α，纤维化指标collagen I、fibronectin的作用；（I）免疫荧光检测肾组织纤维化指标α-SMA的表达。

图5为本发明中槲皮素在LPS模型中抑制Hsp70/90的表达，并通过抑制外泌体的释放改善肾间质炎症，其中：（A）qPCR检测槲皮素对Hsp70、Hsp90的mRNA水平的影响；（B）Western blot检测Hsp70、Hsp90的蛋白水平；（C）免疫荧光检测肾组织中Hsp70、Hsp90的蛋白水平，标尺为50 μm；（D）槲皮素对100 mg肾组织中外泌体释放量的影响；（E）免疫荧光检测肾组织中外泌体标志物Alix、CD63的蛋白水平，标尺为50 μm；（F）Western blot检测肾组织中外泌体标志物Alix、Tsg101、CD63、CD9的蛋白水平；（G）血肌酐测定槲皮素对小鼠肾功能的作用；（H）巨噬细胞标志物F4/80的免疫组化检测分析槲皮素对肾间质炎症的影响；（I）qPCR检测槲皮素对肾组织炎症因子IL-1β、TNF-α的作用。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明提供的一种新型抑制外泌体释放的药物及其在治疗肾间质炎症和纤维化疾病中的用途进行详细描述。

同时，在这里做以说明的是，为了使实施例更加详尽，下面的实施例为最佳、优选实施例，对于一些公知技术本领域技术人员也可采用其他替代方式而进行实施；而且附图部分仅是为了更具体的描述实施例，而并不旨在对本发明进行具体的限定。

本发明涵盖任何在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。为了使公众对本发明有彻底的了解，在以下本发明优选实施例中详细说明了具体的细节，而对本领域技术人员来说没有这些细节的描述也可以完全理解本发明。另外，为了避免对本发明的实质造成不必要的混淆，并没有详细说明众所周知的方法、过程、流程等。

首先需要说明的是：

研究显示，热休克蛋白（Hsp）在外泌体的分泌中起着重要作用。Hsp90作为一种重要的分子伴侣蛋白，其主要功能是参与蛋白翻译后的正确折叠和加工，以维持机体稳定。其具有与细胞质膜相互作用从而使质膜发生变形的功能，进而促进多囊泡体与细胞质膜的融合而增加外泌体的释放（Mol Cell. 2018;71:689-702.e9.）；Hsp70也被证实可以参与外泌体的蛋白装配（Sci Adv.2022;8:eabm1140.）。槲皮素，作为一种广泛存在于植物的花、叶、果实中的天然黄酮类化合物，对Hsp70和Hsp90具有抑制作用（Oxid Med Cell Longev.2020;2020:3908641，Redox Biol. 2020;28:101337.）。本发明提出了其通过抑制Hsp70/90抑制外泌体释放的作用及减轻肾间质炎症和纤维化的应用，具体实施例内容如下。

实施例1：

槲皮素通过抑制Hsp70/90抑制外泌体的释放

1、Hsp70/90促进TEC及巨噬细胞的外泌体释放

（1）体外培养TEC及RAW 264.7巨噬细胞

采用含体积分数10%胎牛血清（美国Gbico）的DMEM/F12（美国Gbico）培养基培养TEC；采用含体积分数10%胎牛血清（美国Gbico）的RPMI 1640（美国Gbico）培养基培养RAW264.7巨噬细胞。

（2）TEC及RAW 264.7巨噬细胞外泌体的提取

为了获取TEC-exos，当细胞达到50%融合度时，无菌PBS洗2遍，采用DMEM/F12 +10%不含微囊泡的FBS培养细胞48 h，收集培养上清液；为了获取RAW-exos，当细胞达到50%融合度时，无菌PBS洗2遍，采用RPMI 1640 + 10%不含微囊泡的FBS培养细胞48 h，收集培养上清液；采用超速离心法提取外泌体：2 000 g离心20 min去除细胞碎片；13 500 g 离心30min去除微囊泡；200 000 g离心120 min得到的透明沉淀物即为外泌体，采用适量无菌PBS重悬外泌体，负80℃冻存。

（3）TEC-exos、RAW-exos的鉴定

通过透射电镜（TEM）观察外泌体的形态（如图1A、E所示）；

通过PMX纳米颗粒追踪分析仪（NTA）检测粒径分布，如图1B所示，TEC-exos的平均粒径是129 ± 12.05 nm；如图1F所示，RAW-exos的平均粒径是115.16 ± 12.19 nm；

结合TEM和NTA，证明TEC-exos、RAW-exos提取成功。

（4）siRNA敲降Hsp70/90抑制外泌体的分泌

采用脂质体3000（Invitrogen）将Hsp70/90的小干扰RNA（siRNA，GenePharma，中国）或对照RNA（NC siRNA）转染至TEC及RAW 264.7巨噬细胞中，用LPS干预转染细胞，结果显示，siRNA敲降Hsp70/90可抑制LPS诱导的外泌体释放（如图1C、1G所示）。

（5）质粒过表达Hsp70/90促进外泌体的分泌

采用脂质体3000（Invitrogen）将Hsp70/90质粒（GENECHEM，中国）或对照质粒（NC）转染至TEC及RAW 264.7巨噬细胞中，结果显示，质粒过表达Hsp70/90可促进两种细胞的外泌体释放（如图1D、1H所示）。

2、槲皮素抑制TEC及巨噬细胞中Hsp70/90的表达

（1）采用LPS（Sigma Aldrich, L2630）诱导TEC损伤模型，槲皮素（Sigma Aldrich）干预该损伤模型；采用qPCR检测Hsp70/90的mRNA水平，结果如图2A所示，槲皮素能降低LPS诱导的TEC中Hsp70/90水平升高；图2B和2C采用免疫荧光及Western blot检测发现，槲皮素能抑制Hsp70/90蛋白表达；

（2）采用LPS诱导RAW 264.7巨噬细胞损伤模型，槲皮素干预该损伤模型；采用qPCR检测Hsp70/90的mRNA水平，结果如图2D所示，槲皮素能降低LPS诱导的TEC中Hsp70/90水平升高；图2E和2F采用免疫荧光及Western blot检测发现，槲皮素能抑制Hsp70/90蛋白表达。

3、槲皮素通过抑制TEC及巨噬细胞Hsp70/90的表达抑制外泌体的释放

（1）采用Cell CountingKit-8（CCK-8）细胞计数试剂盒检测不同剂量槲皮素对于TEC及RAW 264.7巨噬细胞的活性影响。槲皮素的浓度梯度设置为：2.5/5/10/20/40/80 μmol/L，结果显示，2.5-20 μmol/L的槲皮素对于两种细胞均无毒性；故选择5/10/20 μmol/L三个浓度干预LPS诱导的细胞损伤模型；

（2）采用LPS损伤相同数量的TEC或RAW 264.7巨噬细胞，收集培养上清，提取外泌体后采用NTA计数发现，LPS可诱导两种细胞的外泌体释放明显增多，而槲皮素可剂量依赖性的抑制外泌体的释放（如图3B、3E所示）；

（3）如图3C、3F所示，质粒过表达Hsp70/90可部分抵消槲皮素对于外泌体释放的抑制作用，由此可见，槲皮素是通过抑制Hsp70/90起到抑制外泌体释放的作用的。

综上所述，本实施例结果说明，槲皮素可以抑制TEC及巨噬细胞的外泌体释放，且该作用是通过抑制Hsp70/90实现的。

实施例2：

槲皮素通过抑制外泌体释放改善UUO诱导的小鼠

肾间质炎症和纤维化

1、本实施例采用8-10周龄雄性C57BL/6小鼠行右侧输尿管结扎构建UUO小鼠模型，共构建16只；将其随机分为：UUO 7d组（n = 4）、UUO 7d + 槲皮素（Qct）组（n = 4）、UUO 14d组（n = 4）、UUO 14d + Qct组（n = 4）；同时设置假手术组（n = 8）；采用1%的二甲基亚砜（DMSO）溶解槲皮素，并以50 mg/kg的剂量每日灌胃；假手术组每日予1%的DMSO灌胃；分别在7d和14d处死小鼠，留取血液及肾组织。

2、采用qPCR检测各组模型的肾组织的Hsp70/90表达情况，结果如4A所示，UUO模型中Hsp70/90的mRNA水平升高，而槲皮素的干预下调了Hsp70/90的mRNA水平。

3、采用免疫荧光及Westernblot检测发现，槲皮素可抑制UUO7d、14d模型肾组织中Hsp70/90的蛋白表达，如图4B、4C所示；

4、采用同样的造模和分组方式，每组取100mg新鲜肾脏提取肾组织外泌体，提取方法：用眼科剪将100 mg肾皮质剪碎，在37℃条件下予IV胶原酶（Gibco, 17104-019）及胰蛋白酶（Gibco, 25200-056）摇动消化120 min；消化后的悬液采用超速离心法提取外泌体：2000 g离心20 min去除细胞碎片；13 500 g 离心30 min去除微囊泡；200 000 g离心120min得到的透明沉淀物即为外泌体，采用适量无菌PBS重悬外泌体，负80℃冻存。

5、采用NTA检测相同质量（100 mg）各组肾皮质释放的外泌体数量，结果如图4D所示，UUO 7d、14d模型组的外泌体释放增加，而槲皮素可以减少外泌体释放。

6、图4E免疫荧光显示，UUO模型肾组织中外泌体标志物Alix、CD63的表达也因槲皮素的干预而减少。

7、如图4F所示，外泌体标志物Alix、Tsg101、CD63、CD9的Western blot蛋白检测发现，UUO模型肾组织的外泌体标志物明显升高，而这种升高可被槲皮素所抑制。

8、进一步的，肾组织PAS、MASSON染色及巨噬细胞标志物F4/80的免疫组化结果显示，槲皮素可减轻UUO模型的小管损伤、间质炎症及纤维化，如图4G所示。

9、如图4H所示，采用qPCR检测各组炎症因子IL-1β、TNF-α，纤维化指标collagenI、fibronectin的mRNA水平，结果显示槲皮素可减轻UUO模型的肾脏炎症及纤维化。

10、纤维化指标α-SMA的免疫荧光显示，槲皮素可减轻UUO模型的肾间质纤维化水平，如图4I所示。

综上所述，本实施例结果说明，槲皮素在UUO小鼠模型中抑制Hsp70/90的表达，并通过抑制外泌体的释放改善肾间质炎症及纤维化。

实施例3：

槲皮素通过抑制外泌体释放改善LPS诱导的小鼠肾脏炎症

1、本实施例采用8-10周龄雄性C57BL/6小鼠进行实验，腹腔注射200μg LPS（1mg/ml 溶于无菌PBS中），随机分为：LPS组（n = 6）、LPS + Qct组（n = 6）；对照组（n = 6）予腹腔注射200 μL无菌PBS；LPS + Qct组每日予50 mg/kg的槲皮素灌胃；对照组及LPS组每日予1%的DMSO灌胃；3d时处死小鼠，留取血液及肾组织。

2、采用qPCR检测各组模型的肾组织的Hsp70/90表达情况，结果如5A所示，LPS模型肾组织中Hsp70/90的mRNA水平升高，而槲皮素的干预下调了Hsp70/90的mRNA水平。

3、采用免疫荧光及Westernblot检测发现，槲皮素可抑制LPS模型肾组织中Hsp70/90的蛋白表达（如图5B、5C所示）；

4、采用NTA检测相同质量（100 mg）各组肾皮质释放的外泌体数量，结果如图5D所示，LPS模型组的外泌体释放增加，而槲皮素可以减少外泌体释放。

5、图5E中免疫荧光显示，LPS模型肾组织中外泌体标志物Alix、CD63的表达也因槲皮素的干预而减少。

6、如图5F所示，外泌体标志物Alix、Tsg101、CD63、CD9的Western blot蛋白检测发现，LPS模型肾组织的外泌体标志物明显升高，而这种升高可被槲皮素所抑制。

7、用3000 rpm离心小鼠血液，取血清行肌酐检测结果显示，槲皮素可改善LPS导致的肾功能恶化（如图5G所示）。

8、肾组织巨噬细胞标志物F4/80的免疫组化结果显示，槲皮素可减轻LPS模型肾间质的巨噬细胞浸润（如图5H所示）。

9、如图5I所示，采用qPCR检测各组炎症因子IL-1β、TNF-α的mRNA水平，结果显示槲皮素可减轻LPS模型的肾脏炎症。

综上所述，本实施例结果说明，槲皮素在LPS小鼠模型中抑制Hsp70/90的表达，并通过抑制外泌体的释放改善肾脏炎症。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种新型抑制外泌体释放的药物，其特征在于，槲皮素作为一种新型抑制外泌体释放的药物。

2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述槲皮素通过抑制热休克蛋白70/90以抑制外泌体的释放。

3.权利要求1或2所述的药物的用途，其特征在于，槲皮素或其药学上可接受的盐和/或槲皮素或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体一起被制成药学上可接受的剂型的用途，优选为注射剂、口服制剂。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述槲皮素或其药学上可接受的盐和/或槲皮素或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体一起制成的药学上可接受的剂型通过抑制外泌体释放，治疗肾间质炎症和纤维化。

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