CN116239664A - 一种基于包涵体形式表达的釉原蛋白的制备方法及产品和应用 - Google Patents

一种基于包涵体形式表达的釉原蛋白的制备方法及产品和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于包涵体形式表达的釉原蛋白制备方法及产品和应用，所述制备方法包括如下步骤：(1)使含有釉原蛋白基因的重组质粒在外源表达系统中进行表达，获得以包涵体形式存在的重组釉原蛋白；(2)使用含浓度梯度尿素的溶解液依次梯度溶解步骤(1)中所述包涵体，离心，得上清液和沉淀；(3)混合步骤(2)中所述上清液与复性剂，过滤，滤液脱盐制得所述基于包涵体形式表达的釉原蛋白。本发明创造性地应用含梯度浓度尿素的溶解液分离纯化釉原蛋白，加入不同浓度梯度的尿素梯度溶解包涵体，制得的目标蛋白纯度高、活性强。此外，该制备工艺操作简单，适宜工业放大。

Description

一种基于包涵体形式表达的釉原蛋白的制备方法及产品和 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于包涵体形式表达的釉原蛋白的制备方法及产品和应用。
背景技术
蛋白纯化技术是生物研究领域的一项重要技术。蛋白质功能的研究离不开蛋白的分离纯化。蛋白纯化主要是利用不同蛋白质间的相似性与差异，去除非蛋白物质，分离目的蛋白。当前蛋白纯化比较成熟的层析技术包括亲和纯化技术、离子交换色谱和凝胶过滤色谱等，在蛋白质的工业化生产中，这些技术虽然适用面广，但是常面临研发周期长、工序复杂、人力和物力成本高等缺陷，需要投入大量的金钱、人力和时间，使得成本大幅度上升。
釉基质蛋白是牙齿发育到钟状期，由内釉上皮细胞分化而来的成釉细胞合成和分泌一系列细胞外基质蛋白。自1975年首次提出来自赫特威氏上皮根鞘的釉质相关蛋白可以诱导牙根部无细胞性牙骨质形成以后，体外实验和临床治疗广泛证实釉基质蛋白能有效促进牙周韧带、牙骨质、牙槽骨再生，形成类似正常的牙周组织的排列，达到真正的牙周再生。釉原蛋白(amelogenin，Am)是发育中釉基质蛋白最主要的成分，也是釉基质蛋白中促进牙周再生的主要活性成分。但Am的组成不是单一的，至少有9种成分，分子量范围5～27kDa。和一般的重组蛋白相比，重组釉原蛋白有更稳定空间结构和物理性质。
CN101565463A公开了一种重组人釉原蛋白及其制备方法。该发明的技术方案如下：一种重组人釉原蛋白，通过下列方法制得：a.克隆X染色体编码的人釉原蛋白成熟肽基因hAm；b.构建含有上述基因的重组原核表达质粒PGEX4T1－hAm；c.将步骤b获得的重组原核表达质粒PGEX4T1－hAm转化表达大肠杆菌菌株；d.诱导步骤c获得的克隆表达菌株表达融合蛋白GST－hAm；e.通过GST亲和层析纯化融合蛋白。该发明首次从人乳牙胚组织中克隆得到人釉原蛋白成熟肽的编码序列，并通过原核表达质粒在大肠杆菌中成功表达的融合蛋白，人工合成的重组人釉原蛋白可以通过GST亲和层析纯化获得，但需要进一步通过酶切步骤和纯化步骤去除GST蛋白标签。
CN103014050A公开了一种重组猪釉原蛋白，由全长猪釉原蛋白基因编码，制备方法为：合成全长猪釉原蛋白基因；构建含有上述基因的重组原核表达质粒PGEX4T1-pAm；将获得的重组原核表达质粒PGEX4T1-pAm转化至大肠杆菌菌株；诱导获得的重组菌株表达融合蛋白GST-pAm；切除获得的融合蛋白GST-pAm的GST标签蛋白，获得重组猪釉原蛋白pAm。首次合成全长猪釉原蛋白的编码序列，并通过原核表达质粒在大肠杆菌中成功表达了融合蛋白。该发明所得的克隆表达菌株可长期保存，并随时大量复制，能够较为方便快捷的大量人工合成重组猪釉原蛋白，也为将来釉原蛋白的批量化生产以及商品化提供了可能，但该方案与CN101565463A公开的釉原蛋白纯化方案比较类似，均需要通过酶切步骤和纯化步骤去除GST蛋白标签，暴露出釉原蛋白才能实现完整的生物学功能。
目前釉原蛋白的纯化面临研发周期长、工序复杂、人力和物力成本高等问题，因此如何利用釉原蛋白的特性，研发简便，高效的釉原蛋白纯化方法是非常有意义的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于包涵体形式表达的釉原蛋白制备方法及产品和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种基于包涵体形式表达的釉原蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)使含有釉原蛋白基因的重组质粒在外源表达系统中进行表达，获得以包涵体形式存在的重组釉原蛋白；
(2)使用含浓度梯度尿素的溶解液依次梯度溶解步骤(1)中所述包涵体，离心，得上清液和沉淀；
(3)混合步骤(2)中所述上清液与复性剂，过滤，滤液脱盐制得所述基于包涵体形式表达的釉原蛋白。
本发明创造性地应用含梯度浓度尿素的溶解液分离纯化釉原蛋白，其中尿素为比较强的变性剂，可以通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，使包涵体变成可溶解的蛋白质，加入不同浓度梯度的尿素梯度溶解包涵体，制得的目标蛋白纯度高、活性强。此外，该制备工艺操作简单，适宜工业放大。
优选地，步骤(1)所述外源表达系统包括原核表达系统。
优选地，所述原核表达系统包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或乳酸杆菌。
优选地，所述釉原蛋白基因为人源、牛源、猪源或狗源种属的釉原蛋白基因。
优选地，步骤(2)所述溶解液的成分还包括Tris、TritonX-100、β-巯基乙醇或EDTA-2Na中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合包括Tris和TritonX-100的组合、TritonX-100和β-巯基乙醇的组合或β-巯基乙醇和EDTA-2Na的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明步骤(2)所述溶解液的成分还包括Tris、TritonX-100、β-巯基乙醇或EDTA-2Na中任意一种或至少两种的组合，其中Tris为碱性缓冲盐，可以帮助溶液pH维持在一定范围内，有助于蛋白质结构的稳定；TritonX-100是一种温和的表面活性剂，可以溶解细胞膜上的蛋白质，可以洗去包涵体内细胞脂质和膜蛋白，起到去杂蛋白的作用；β-巯基乙醇是一种强还原剂，可以打开包涵体中错配的二硫键，帮助包涵体复性过程中的正确结构的折叠，减少了复性过程中由于蛋白质错误折叠而引起的蛋白析出现象；EDTA-2Na是一种金属螯合剂，可以鳌合溶液中的金属离子，有效防止金属引起的氧化作用，是一种抗氧化作用增效剂，同时也可以抑制蛋白酶的活力和微生物的生长，有效缓解蛋白质的降解。TritonX-100配合具有浓度梯度的尿素可以有效溶解包涵体蛋白，洗去杂蛋白，制得的釉原蛋白纯度高。β-巯基乙醇和EDTA-2Na二者相辅相成，可协同增效，通过组分之间的在防止蛋白氧化方面的协同增效作用，纯化制得的釉原蛋白活性强，进一步地，更高活性的釉原蛋白具有更强的抗炎和修复作用。
优选地，步骤(2)所述包涵体与单次溶解使用的溶解液的质量体积比为1:(8-15)g/mL。
所述(8-15)中的具体数值可以选择8、9、10、11、12、13、14或15等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(2)所述溶解液中尿素浓度的梯度范围为2-6M。
所述2-6M中具体数值可以选择2M、3M、4M、5M或6M等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明所述尿素的浓度梯度为2-6M时制得的釉原蛋白具有更高的蛋白纯度和更强蛋白活性，进一步地具有更强的抗炎与修复作用。
优选地，步骤(2)所述依次梯度溶解为尿素浓度由低至高梯度依次溶解。
本发明所述的依次梯度溶解为尿素浓度由低至高梯度依次溶解时，所述目标蛋白可以充分地被分离纯化，从而制得更高纯度的目标蛋白。
优选地，步骤(2)所述尿素的初始浓度为2M。
本发明中尿素初始浓度为2M，当尿素的初始浓度选择2M以下时，目标蛋白溶解度低，分离纯化制得的釉原蛋白纯度低。
优选地，步骤(2)所述溶解时伴随震荡操作。
优选地，所述震荡的时间为1.5-3h。
所述1.5-3h中的具体数值可以选择1.5h、1.7h、1.9h、2.1h、2.3h、2.5h、2.7h、2.9h或3h等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(2)所述溶解前还包括洗涤操作。
优选地，所述洗涤使用的洗涤液成分包括Tris和/或TritonX-100。
本发明的分离纯化工艺中溶解前使用含Tris和/或TritonX-100的洗涤液洗涤沉淀，可以有效的去除培养基、杂蛋白等杂质，制得的目标蛋白纯度更高。
优选地，所述洗涤液的pH为7-10。
所述7-10中的具体数值可以选择7、7.3、7.6、7.9、8.2、8.5、8.8、9.1、9.4、9.7或10等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(2)梯度溶解进行2-5次。
所述2-5次中的具体数值可以选择2次、3次、4次或5次。
优选地，步骤(2)所述离心的转速为8000-15000rpm，离心的时间为15-45min。
所述8000-15000rpm中的具体数值可以选择8000rpm、9000rpm、10000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm或15000rpm等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述15-45min中的具体数值可以选择15min、20min、25min、30min、35min、40min或45min等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(3)所述混合的具体操作为：将上清液滴入复性剂。
优选地，步骤(3)所述复性剂包括Tris、NaCl、甘油和EDTA-2Na，还包括L-半胱氨酸。
本发明步骤(3)所述复性剂包括Tris、NaCl、甘油和EDTA-2Na，还包括L-半胱氨酸，其中Tris为碱性pH缓冲溶液，可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成，同时碱性条件远离了釉原蛋白的等电点，可以增强釉原蛋白的溶解性；NaCl为一种常见的中性盐，一定浓度的盐可以增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，在蛋白质的周围形成一层水化膜，增强蛋白质的稳定性，并且能够使蛋白质在水溶液中的溶解度增大；甘油是一种常见的有机溶剂，可以通过水合作用稳定蛋白质的结构，同时甘油可以增加复性液的稠度，减少了蛋白质之间的相互碰撞，从而防止蛋白质过度聚集形成沉淀，提高了包涵体的复性效率；L-半胱氨酸是一种较小的氧化还原伴侣，可以促使不正确形成的二硫键的快速交换反应，从而提高正确配对的二硫键的产率，不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性，提高了包涵体复性过程中的产率；EDTA-2Na是一种金属螯合剂，除了抗氧化作用外，还可以抑制蛋白酶的活力和微生物的生长，有效缓解蛋白质的降解；本发明创造性地发现NaCl、甘油、EDTA-2Na与L-半胱氨酸相辅相成，协同增效，含有四种成分的复性剂在提高蛋白质纯度、增强蛋白质活性方面具有更优的效果。
优选地，步骤(3)所述复性剂的pH为7-9。
所述7-9中的具体数值可以选择7、7.2、7.4、7.6、7.8、8、8.2、8.4、8.6、8.8或9等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述将上清液滴入复性剂时伴随搅拌操作。
优选地，步骤(3)所述过滤时使用的滤膜孔径为0.45μm。
优选地，步骤(3)所述脱盐使用的脱盐柱为G25脱盐柱。
第二方面，本发明提供一种基于包涵体形式表达的釉原蛋白产品，所述釉原蛋白产品包括如第一方面所述的制备方法制得的釉原蛋白。
优选地，所述釉原蛋白产品还包括冻干保护剂。
优选地，所述冻干保护剂包括甘露糖醇、海藻糖、蔗糖或EDTA-2Na中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合包括甘露糖醇和海藻糖的组合、海藻糖和蔗糖的组合或蔗糖和EDTA-2Na的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的制备方法或如第二方面所述的釉原蛋白产品在制备口腔护理、口腔医疗或美容护肤产品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性地应用含梯度浓度尿素的溶解液分离纯化釉原蛋白，其中尿素为比较强的变性剂，可以通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，使包涵体变成可溶解的蛋白质，加入不同浓度梯度的尿素梯度溶解包涵体，制得的目标蛋白纯度高、活性强。此外，该制备工艺操作简单，适宜工业放大。
附图说明
图1为釉原蛋白产品外观图，左图为实施例1中未添加冻干保护剂的产品，右图为实施例1中添加冻干保护剂的釉原蛋白产品图。
图2为实施例1制得基于包涵体形式表达的釉原蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳蛋白胶图。
图3为测试例2中空白对照组(a)、阳性对照组(b)和实施例1组(c)对应的斑马鱼抗炎结果图。
图4为测试例3中空白对照组(a)阳性对照组(b)和实施例1组(c)对应的斑马鱼尾修复结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。各实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另有说明，本说明书中使用的全部专业术语和科学用语的含义均与本发明所属技术领域的技术人员一般理解的含义相同。但如有冲突，以包含定义的本说明书为准。
下述制备例、实施例、测试例中的大肠杆菌(BL21(DE3))为购自苏州泓迅生物科技股份有限公司的产品，消泡剂为购自广州叶知欣生物科技有限公司的产品，三卡因为购自上海麦克林生化科技有限公司产品。
制备例1
重组人釉原蛋白发酵菌株的制备
从NCBI数据库上搜索人源种属釉原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，表达载体选择大肠杆菌宿主适用的pET-28a载体，送至测序公司进行合成，制得重组人釉原蛋白表达载体。
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为：
MGTWILFACLLGAAFAMPLPPHPGHPGYINFSYEVLTPLKWYQSIRPPYPSYGYEPMGGWLHHQIIPVLSQQHPPTHTLQPHHHIPVVPAQQPVIPQQPMMPVPGQHSMTPIQHHQPNLPPPAQQPYQPQPVQPQPHQPMQPQPPVHPMQPLPPQPPLPPMFPMQPLPPMLPDLTLEAWPSTDKTKREEVD
将上述表达载体使用化学转化法转至大肠杆菌(BL21(DE3))菌株中，利用SDS-PAGE凝胶电泳筛选转化后平板菌落中的阳性克隆子，将筛选出的阳性克隆子转接至2mL LB培养基(按1:1000体积比加入50mg/mL卡那霉素)，37℃，220rpm培养12h，培养后的菌液使用体积分数为50％的甘油稀释1倍，分装到冻存管中，冻存在-80℃条件下，制得重组人釉原蛋白发酵菌株。
制备例2
重组人釉原蛋白发酵菌株发酵过程
将重组人釉原蛋白发酵菌株按1:1000体积比接种到50ml LB培养基(按1:1000体积比加入50mg/mL卡那霉素)中，在37℃、220rpm条件下培养4-6h，直至菌液OD600达到0.8，制得种子液。
将种子液按1:1000体积比接种到1000ml LB培养基(按1:1000体积比加入50mg/mL卡那霉素)中，在37℃、220rpm条件下培养12h，制得二级种子液。
将二级种子液按1:10的体积比接种至50L发酵罐中，发酵罐中含有20L发酵罐培养基(培养基按1:1000体积比加入50mg/mL卡那霉素)，用NaOH调节pH使其维持在7，发酵罐转速控制在500rpm，温度控制在37℃。上罐后每小时监控罐内发酵液的OD600数值和pH值，当发酵液OD600达到8时，按1:1000体积比加入1M IPTG诱导剂，继续培养6h，随后终止发酵，收集发酵液。
使用离心机在15000rpm条件下对发酵液进行离心，弃去上清液，称量发酵菌体重量，并将发酵菌体放置于-80℃冰箱冻存。
发酵罐培养基配方如下：胰蛋白胨23g/L、酵母粉23g/L、葡萄糖2g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁1g/L、氯化钙0.02g/L、氯化铵0.5g/L、磷酸二氢钠10mmol/L、消泡剂1％。
实施例1
本实施例提供一种釉原蛋白产品，其制备方法包括如下步骤：
(1)使用10份20mM pH为8.5的Tris缓冲液重悬制备例2制得的1份发酵菌体沉淀，使用高压均质机在800bar条件下将重悬液中菌体破碎三次，直至菌液澄清透明，并在镜检下观察确保菌体破碎完毕，随后将菌液在14000rpm条件下离心60min，收集固体沉淀物。
(2)按固体沉淀物:洗涤液(20mM Tris缓冲液，pH9.0+0.1％ Triton X-100)＝1:50(g/mL)的比例，加入洗涤液，震荡2h，在8000rpm 20℃的条件下离心30min，收集并称量震荡后的固体沉淀。重复该步骤1次。
(3)按步骤(2)中沉淀物:溶解液A＝1:10(g/mL)的比例，加入溶解液A(20mM pH为9.0的Tris缓冲液+2M尿素+1％ TritonX-100+1mMβ-巯基乙醇+0.1mM EDTA-2Na)，震荡2h后，14000rpm 20℃的条件下离心30min，收集上清液A和固体沉淀A。
按固体沉淀A:溶解液B＝1:10(g/mL)的比例，加入溶解液B(20mM pH为9.0的Tris缓冲液+4M尿素+1％ TritonX-100+1mMβ-巯基乙醇+0.1mM EDTA-2Na)，震荡2h。14000rpm20℃的条件下离心30min，收集上清液B和固体沉淀B。
按固体沉淀B:溶解液C＝1:10(g/mL)的比例，加入溶解液C(20mM pH为9.0的Tris缓冲液+6M尿素+1％ TritonX-100+1mMβ-巯基乙醇+0.1mM EDTA-2Na)，震荡2h，在14000rpm20℃的条件下离心30min，收集上清液C和固体沉淀C。
将上述的上清液A、B和C混合，并按1:100的体积比缓慢滴入冷冻至4℃的复性剂(复性剂含20mM Tris缓冲液、200mM NaCl、1mM L-半胱氨酸、0.1mM EDTA-2Na和体积分数为10％甘油，复性剂的pH调至8.0)中，边搅拌边滴入，直至液体均匀无明显变化。随后使用0.45μm滤膜过滤，并使用G25凝胶脱盐柱对滤液进行脱盐处理，制得基于包涵体形式表达的釉原蛋白。
(4)将48份甘露糖醇、12份海藻糖、12份蔗糖、0.02份EDTA-2Na混匀，制得冻干保护剂。
(5)将1份步骤(3)制得的基于包涵体形式表达的釉原蛋白与1份步骤(4)制得的冻干保护剂混匀，置于冻干机中真空冻干，制得釉原蛋白产品(产品外观见图1)。
实施例2
本实施例提供一种釉原蛋白产品，其制备方法包括如下步骤：
(1)使用10份20mM pH为8.5的Tris缓冲液重悬制备例2制得的1份发酵菌体沉淀，使用高压均质机在800bar条件下将重悬液中菌体破碎三次，直至菌液澄清透明，并在镜检下观察确保菌体破碎完毕，随后将菌液在12000rpm条件下离心60min，收集固体沉淀物。
(2)按固体沉淀物:洗涤液(20mM Tris缓冲液，pH 10.0+0.1％ Triton X-100)＝1:60(g/mL)的比例，加入洗涤液，震荡3h，在8000rpm 20℃的条件下离心25min，收集并称量震荡后的固体沉淀。重复该步骤1次。
(3)按步骤(2)中沉淀物:溶解液A＝1:8(g/mL)的比例，加入溶解液A(20mM pH为9.0的Tris缓冲液+2M尿素+1％ TritonX-100+1mMβ-巯基乙醇+0.1mM EDTA-2Na)，震荡3h后，8000rpm 20℃的条件下离心45min，收集上清液A和固体沉淀A。
按固体沉淀A:溶解液B＝1:8(g/mL)的比例，加入溶解液B(20mM pH为9.0的Tris缓冲液+4M尿素+1％ TritonX-100+1mMβ-巯基乙醇+0.1mM EDTA-2Na)，震荡1.5h。8000rpm 20℃的条件下离心45min，收集上清液B和固体沉淀B。
将上述的上清液A和B混合，并按1:100的体积比缓慢滴入冷冻至4℃的复性剂(复性剂含20mM Tris缓冲液、200mM NaCl、1mM L-半胱氨酸、0.1mM EDTA-2Na和体积分数为10％甘油，复性剂的pH调至9.0)中，边搅拌边滴入，直至液体均匀无明显变化。随后使用0.45μm滤膜过滤，并使用G25凝胶脱盐柱对滤液进行脱盐处理，制得基于包涵体形式表达的釉原蛋白。
(4)将40份甘露糖醇、15份海藻糖、5份蔗糖、0.02份EDTA-2Na混匀，制得冻干保护剂。
(5)将1份步骤(3)制得的基于包涵体形式表达的釉原蛋白与1份步骤(4)制得的冻干保护剂混匀，置于冻干机中真空冻干，制得釉原蛋白产品。
实施例3
本实施例提供一种釉原蛋白产品，其制备方法包括如下步骤：
(1)使用10份20mM pH为8.5的Tris缓冲液重悬制备例2制得的1份发酵菌体沉淀，使用高压均质机在800bar条件下将重悬液中菌体破碎三次，直至菌液澄清透明，并在镜检下观察确保菌体破碎完毕，随后将菌液在13000rpm条件下离心50min，收集固体沉淀物。
(2)按固体沉淀物:洗涤液(20mM Tris缓冲液，pH 7.0+0.1％ Triton X-100)＝1:40(g/mL)的比例，加入洗涤液，震荡2.5h，在8000rpm 20℃的条件下离心35min，收集并称量震荡后的固体沉淀。重复该步骤1次。
(3)按步骤(2)中沉淀物:溶解液A＝1:15(g/mL)的比例，加入溶解液A(20mM pH为9.0的Tris缓冲液+2M尿素+1％ TritonX-100+1mMβ-巯基乙醇+0.1mM EDTA-2Na)，震荡1.5h后，15000rpm 20℃的条件下离心15min，收集上清液A和固体沉淀A。
按固体沉淀A:溶解液B＝1:15(g/mL)的比例，加入溶解液B(20mM pH为9.0的Tris缓冲液+3M尿素+1％ TritonX-100+1mMβ-巯基乙醇+0.1mM EDTA-2Na)，震荡3h。15000rpm20℃的条件下离心15min，收集上清液B和固体沉淀B。
按固体沉淀B:溶解液C＝1:15(g/mL)的比例，加入溶解液C(20mM pH为9.0的Tris缓冲液+4M尿素+1％ TritonX-100+1mMβ-巯基乙醇+0.1mM EDTA-2Na)，震荡1.5h，在15000rpm 20℃的条件下离心15min，收集上清液C和固体沉淀C。
按固体沉淀C:溶解液D＝1:15(g/mL)的比例，加入溶解液D(20mM pH为9.0的Tris缓冲液+5M尿素+1％ TritonX-100+1mMβ-巯基乙醇+0.1mM EDTA-2Na)，震荡3h，15000rpm20℃的条件下离心15min，收集上清液D和固体沉淀D。
按固体沉淀D:溶解液E＝1:15(g/mL)的比例，加入溶解液E(20mM pH为9.0的Tris缓冲液+6M尿素+1％ TritonX-100+1mMβ-巯基乙醇+0.1mM EDTA-2Na)，震荡3h，15000rpm20℃的条件下离心15min，收集上清液E和固体沉淀E。
将上述的上清液A、B、C、D和E混合，并按1:100的体积比缓慢滴入冷冻至4℃的复性剂(复性剂含20mM Tris缓冲液、200mM NaCl、1mM L-半胱氨酸、0.1mM EDTA-2Na和体积分数为10％甘油，复性剂的pH调至7.0)中，边搅拌边滴入，直至液体均匀无明显变化。随后使用0.45μm滤膜过滤，并使用G25凝胶脱盐柱对滤液进行脱盐处理，制得基于包涵体形式表达的釉原蛋白。
(4)将50份甘露糖醇、5份海藻糖、12份蔗糖、0.01份EDTA-2Na混匀，制得冻干保护剂。
(5)将1份步骤(3)制得的基于包涵体形式表达的釉原蛋白与1份步骤(4)制得的冻干保护剂混匀，置于冻干机中真空冻干，制得釉原蛋白产品。
实施例4
本实施例提供一种釉原蛋白产品，其制备方法与实施例1的区别仅在于在步骤(3)收集上清液C和固体沉淀C后，增加一次溶解过程：按固体沉淀C:溶解液D＝1:10(g/mL)的比例，加入溶解液D(20mM pH为9.0的Tris缓冲液+8M尿素+1％ TritonX-100+1mMβ-巯基乙醇+0.1mM EDTA-2Na)，震荡2h，14000rpm 20℃的条件下离心30min，收集上清液D和固体沉淀D，混合上清液A、B、C和D后滴入复性剂，其余均与实施例1相同。
实施例5
本实施例提供一种釉原蛋白产品，其制备方法与实施例1的区别仅在于将步骤(3)中2M尿素替换为1M尿素，其余均与实施例1相同。
实施例6
本实施例提供一种釉原蛋白产品，其制备方法与实施例1的区别仅在于溶解液的成分中不含TritonX-100，并将TritonX-100的质量份数分配至尿素，其余均与实施例1相同。
实施例7
本实施例提供一种釉原蛋白产品，其制备方法与实施例1的区别仅在于溶解液的成分中不含β-巯基乙醇，并将β-巯基乙醇的质量份数分配至EDTA-2Na，其余均与实施例1相同。
实施例8
本实施例提供一种釉原蛋白产品，其制备方法与实施例1的区别仅在于溶解液的成分中不含EDTA-2Na，并将EDTA-2Na的质量份数分配至β-巯基乙醇，其余均与实施例1相同。
实施例9
本实施例提供一种釉原蛋白产品，其制备方法与实施例1的区别仅在于复性剂成分中不含L-半胱氨酸，并将L-半胱氨酸的质量份数按比例分配至NaCl、甘油、EDTA-2Na，其余均与实施例1相同。
实施例10
本实施例提供一种釉原蛋白产品，其制备方法与实施例1的区别仅在于复性剂成分中不含NaCl、甘油、EDTA-2Na，并将NaCl、甘油、EDTA-2Na的质量份数全部分配至L-半胱氨酸，其余均与实施例1相同。
对比例1
本对比例提供一种釉原蛋白产品，其制备方法与实施例1的区别仅在于将溶解液的成分中不含尿素，并将尿素的质量份数分配至TritonX-100，其余均与实施例1相同。
对比例2
本对比例提供一种釉原蛋白产品，其制备方法与实施例1的区别仅在于溶解液溶解过程不使用梯度尿素溶液处理，仅使用单一浓度为2M的尿素溶液处理，即将实施例1中的步骤(3)中的具体操作步骤替换为：按步骤(2)中沉淀物:溶解液A＝1:10(g/mL)的比例，加入溶解液A(20mM pH为9.0的Tris缓冲液+2M尿素+1％ TritonX-100+1mMβ-巯基乙醇+0.1mMEDTA-2Na)，震荡2h后，14000rpm 20℃的条件下离心30min，收集上清液A和固体沉淀A。
将上述的上清液A，按1:100的体积比缓慢滴入冷冻至4℃的复性剂(复性剂含20mMTris缓冲液、200mM NaCl、1mM L-半胱氨酸、0.1mM EDTA-2Na和体积分数为10％甘油，复性剂的pH调至8.0)中，边搅拌边滴入，直至液体均匀无明显变化。随后使用0.45μm滤膜过滤，并使用G25凝胶脱盐柱对滤液进行脱盐处理，制得基于包涵体形式表达的釉原蛋白。其余均与实施例1相同。
对比例3
本对比例提供一种釉原蛋白产品，其制备方法与实施例1的区别仅在于溶解液溶解过程不使用梯度尿素溶液处理，仅使用单一浓度为4M的尿素溶液处理，即将实施例1中的步骤(3)中的具体操作步骤替换为：按步骤(2)中沉淀物:溶解液A＝1:10(g/mL)的比例，加入溶解液A(20mM pH为9.0的Tris缓冲液+4M尿素+1％ TritonX-100+1mMβ-巯基乙醇+0.1mMEDTA-2Na)，震荡2h后，14000rpm 20℃的条件下离心30min，收集上清液A和固体沉淀A。
将上述的上清液A，按1:100的体积比缓慢滴入冷冻至4℃的复性剂(复性剂含20mMTris缓冲液、200mM NaCl、1mM L-半胱氨酸、0.1mM EDTA-2Na和体积分数为10％甘油，复性剂的pH调至8.0)中，边搅拌边滴入，直至液体均匀无明显变化。随后使用0.45μm滤膜过滤，并使用G25凝胶脱盐柱对滤液进行脱盐处理，制得基于包涵体形式表达的釉原蛋白。其余均与实施例1相同。
对比例4
本对比例提供一种釉原蛋白产品，其制备方法与实施例1的区别仅在于溶解液溶解过程不使用梯度尿素溶液处理，仅使用单一浓度为6M的尿素溶液处理，即将实施例1中的步骤(3)中的具体操作步骤替换为：按步骤(2)中沉淀物:溶解液A＝1:10(g/mL)的比例，加入溶解液A(20mM pH为9.0的Tris缓冲液+6M尿素+1％ TritonX-100+1mMβ-巯基乙醇+0.1mMEDTA-2Na)，震荡2h后，14000rpm 20℃的条件下离心30min，收集上清液A和固体沉淀A。
将上述的上清液A，按1:100的体积比缓慢滴入冷冻至4℃的复性剂(复性剂含20mMTris缓冲液、200mM NaCl、1mM L-半胱氨酸、0.1mM EDTA-2Na和体积分数为10％甘油，复性剂的pH调至8.0)中，边搅拌边滴入，直至液体均匀无明显变化。随后使用0.45μm滤膜过滤，并使用G25凝胶脱盐柱对滤液进行脱盐处理，制得基于包涵体形式表达的釉原蛋白。其余均与实施例1相同。
测试例1
对各实施例1-10或对比例1-4制得的基于包涵体形式表达的釉原蛋白的纯度进行评价，取各实施例及对比例步骤(3)制得的基于包涵体形式表达的釉原蛋白，使用SDS-PAGE电泳进行蛋白分离，随后使用灰度扫描法对蛋白胶进行扫描，釉原蛋白占整个泳道的比例即为釉原蛋白的纯度，图2为实施例1制得釉原蛋白的SDS-PAGE电泳蛋白胶图，图中包括两个泳道，左侧为实施例1样品泳道，右侧为蛋白Maker泳道，Maker泳道的自上而下的顺序为150kDa、100kDa、70kDa、50kDa、40kDa、35kDa、25kDa、20kDa、15kDa。
表1
组别 蛋白纯度(％)
实施例1 92.32
实施例2 90.46
实施例3 87.92
实施例4 70.35
实施例5 72.52
实施例6 67.45
实施例7 80.35
实施例8 76.58
实施例9 74.87
实施例10 72.59
对比例1 4.65
对比例2 57.85
对比例3 59.54
对比例4 62.56
由表1数据可知，实施例4在纯化釉原蛋白时使用的溶解液的尿素浓度超过6M，其釉原蛋白的纯度低于实施例1，表明过高的尿素浓度会造成纯化产物中含有较多的杂蛋白；实施例6与对比例1的溶解液分别不含TritonX-100和尿素，其釉原蛋白的纯度低于实施例1，表明TritonX-100和尿素可以协同增效，在充分溶解釉原蛋白的同时保证釉原蛋白的纯度。实施例9复性剂中不含L-半胱氨酸，实施例10的复性剂中不含NaCl、甘油、EDTA-2Na，其釉原蛋白的纯度低于实施例1，表明L-半胱氨酸可以与NaCl、甘油、EDTA-2Na相互配合，在提高釉原蛋白纯化产品纯度方面具有协同增效的作用。实施例5与实施例1相比，其溶解液初始尿素浓度为1M，低于实施例1的2M，其蛋白纯度低于实施例1，表明尿素初始浓度为2M时，有利于提升釉原蛋白的纯度。对比例2-4分别使用单一浓度的尿素溶解液，并未进行浓度梯度溶解，其蛋白纯度低于实施例1，表明本发明使用尿素浓度梯度的溶解液制得的釉原蛋白纯度更高。
测试例2
对实施例和对比例制得所述基于包涵体形式表达的釉原蛋白的抗炎作用进行评价，具体方法为：
(1)挑选发育正常的发育受精后3天的斑马鱼，并随机分配到96孔板中，每孔5枚，每组设置3个复孔。分为空白对照组、炎症模型组、实验组和阳性对照组。分别向空白对照组以及炎症模型组中每孔加入200μL斑马鱼培养水(5mM NaCl，0.17mM KCl，0.33mM CaCl2，0.33mM MgSO4·7H2O)，阳性对照组中每孔加入200μL的0.03g/L地塞米松溶液，其余组别每孔中加入200uL各实施例和对比例制备的0.03g/L的受试物溶液，盖上培养板面板，在28.5℃生化培养箱中孵育60min。受试物和阳性对照物均采用斑马鱼培养水配置。
(2)除去96孔板中的溶液，空白对照组中加入200μL的斑马鱼培养水，炎症模型组中加入200μL的20μM的硫酸铜溶液，阳性对照组中加入200μL硫酸铜和地塞米松的混合溶液，实验组中加入200μL硫酸铜和受试物溶液的混合液，盖上培养面板，在28.5℃生化培养箱中孵育15min。前述混合溶液中硫酸铜浓度为20μM，受试物和地塞米松浓度均为0.03g/L，溶剂为斑马鱼培养水。
(3)孵育结束后，将各组斑马鱼用0.0002g/mL三卡因麻醉后，置于载玻片上，固定斑马鱼于侧面体位，在荧光显微镜下观察并拍照。
(4)拍照结束后，采用图像处理软件Image Pro Plus对各组斑马鱼中性细胞迁移至侧线的数量进行统计，计算炎症细胞抑制率。
利用硫酸铜特异的损伤斑马鱼测线附近的神经丘，引起中性粒细胞从血管中游出，向神经丘部位聚集的现象，可通过定量观察中线附近的中性粒细胞数量(图3)，计算炎症细胞抑制率，炎症细胞抑制率(％)＝(炎症模型组中性粒细胞迁移个数-各实验组中性粒细胞迁移个数)/炎症模型组中性粒细胞迁移个数×100％。
表2
组别 炎症细胞抑制率(％)
实施例1 30
实施例2 29
实施例3 28
实施例4 18
实施例5 20
实施例6 16
实施例7 23
实施例8 21
实施例9 20
实施例10 19
对比例1 0
对比例2 9
对比例3 9
对比例4 10
阳性对照组 30
由表2数据可知，实施例4在纯化釉原蛋白时使用的溶解液的尿素浓度超过6M，其炎症细胞抑制率低于实施例1，表明过高的尿素会造成纯化产物中含有较多的杂蛋白，进而影响釉原蛋白产品的抗炎活性；
实施例6与对比例1的溶解液分别不含TritonX-100和尿素，其炎症细胞抑制率低于实施例1，表明TritonX-100和尿素可以协同增效，不仅可以提高釉原蛋白的纯度还可以提高釉原蛋白的抗炎活性。
实施例7、8的溶解液成分中分别含有β-巯基乙醇和EDTA-2Na中的一种，二者炎症细胞抑制率均低于实施例1，表明β-巯基乙醇和EDTA-2Na二者共同作用，在溶解处理时可以有效保证釉原蛋白的活性，使制得的釉原蛋白产品具有更强的抗炎活性。
实施例9复性剂中不含L-半胱氨酸，实施例10的复性剂中不含NaCl、甘油、EDTA-2Na，其炎症细胞抑制率均低于实施例1，表明L-半胱氨酸可以与NaCl、甘油、EDTA-2Na协同增效，制得的釉原蛋白产品具有更强的抗炎活性。
实施例5与实施例1相比，其溶解液初始尿素浓度为1M，其炎症细胞抑制率低于实施例1，表明尿素初始浓度为2M时，有利于提升釉原蛋白的活性。
对比例2-4分别使用单一浓度的尿素溶解液，并未进行浓度梯度溶解，其炎症细胞抑制率均低于实施例1，表明本发明使用尿素浓度梯度的溶解液制得的釉原蛋白纯度和活性均更高。
测试例3
对实施例和对比例制得所述基于包涵体形式表达的釉原蛋白的修复作用进行评价，具体方法为：
(1)随机挑选正常发育的受精后3天的野生斑马鱼，采用0.0002g/mL三卡因麻醉后，切去尾鳍，置于28.5℃生化培养箱孵育2h，体视显微镜下拍照记录，随后将斑马鱼转移到96孔板中，每孔1尾，一组8孔。分为实验组、空白对照组和阳性对照组。
每孔加入受试物200μL。实验组分别加入各实施例和对比例制得的釉原蛋白产品，釉原蛋白产品为用斑马鱼培养水(5mM NaCl，0.17mM KCl，0.33mM CaCl2，0.33mM MgSO4·7H2O)配置为浓度为0.006g/L的釉原蛋白溶液，空白对照组加入斑马鱼培养水；阳性对照组加入0.006g/L的熟地黄溶液(斑马鱼培养水做溶剂)。
(2)置于28.5℃生化培养箱孵育72h，体视显微镜下拍照记录(图4)，并用Image J图像分析软件对斑马鱼尾鳍生长后面积进行统计。
(3)通过计算阳性对照组和实验组尾鳍再生面积计算产品的修复效果，斑马鱼尾鳍修复促进率(％)＝(各实验组尾鳍增长面积-空白对照组尾鳍增长面积)/空白对照组尾鳍增长面积×100％。
表3
Figure BDA0004108338100000221
Figure BDA0004108338100000231
由表3数据可知，实施例4在纯化釉原蛋白时使用的溶解液的尿素浓度超过6M，其斑马鱼尾修复促进率低于实施例1，表明过高的尿素会造成纯化产物中含有较多的杂蛋白，进而影响釉原蛋白产品的修复活性；
实施例6与对比例1的溶解液分别不含TritonX-100和尿素，其斑马鱼尾修复促进率低于实施例1，表明TritonX-100和尿素可以协同增效，不仅可以提高釉原蛋白的纯度还可以提高釉原蛋白的修复活性。
实施例7、8的溶解液成分中分别含有β-巯基乙醇和EDTA-2Na中的一种，二者斑马鱼尾修复促进率均低于实施例1，表明β-巯基乙醇和EDTA-2Na二者共同作用，在溶解处理时可以有效保证釉原蛋白的活性，使制得的釉原蛋白产品具有更强的修复活性。
实施例9复性剂中不含L-半胱氨酸，实施例10的复性剂中不含NaCl、甘油、EDTA-2Na，其斑马鱼尾修复促进率均低于实施例1，表明L-半胱氨酸可以与NaCl、甘油、EDTA-2Na协同增效，制得的釉原蛋白产品具有更强的修复活性。
实施例5与实施例1相比，其溶解液初始尿素浓度为1M，其釉原蛋白修复促进率低于实施例1，表明尿素初始浓度为2M时，有利于提升釉原蛋白的抗炎活性和修复活性。
对比例2-4分别使用单一浓度的尿素溶解液，并未进行浓度梯度溶解，其釉原蛋白修复促进率均低于实施例1，表明本发明使用尿素浓度梯度的溶解液纯化蛋白制得的釉原蛋白修复活性更高。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的方法工艺，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种基于包涵体形式表达的釉原蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)使含有釉原蛋白基因的重组质粒在外源表达系统中进行表达，获得以包涵体形式存在的重组釉原蛋白；
(2)使用含浓度梯度尿素的溶解液依次梯度溶解步骤(1)中所述包涵体，离心，得上清液和沉淀；
(3)混合步骤(2)中所述上清液与复性剂，过滤，滤液脱盐制得所述基于包涵体形式表达的釉原蛋白。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述外源表达系统包括原核表达系统；
优选地，所述原核表达系统包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或乳酸杆菌；
优选地，所述釉原蛋白基因为人源、牛源、猪源或狗源种属的釉原蛋白基因。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述溶解液的成分还包括Tris、TritonX-100、β-巯基乙醇或EDTA-2Na中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(2)所述包涵体与单次溶解使用的溶解液的质量体积比为1:(8-15)g/mL；
优选地，步骤(2)所述溶解液中尿素浓度的梯度范围为2-6M；
优选地，步骤(2)所述依次梯度溶解为尿素浓度由低至高梯度依次溶解；
优选地，步骤(2)所述尿素的初始浓度为2M；
优选地，步骤(2)所述溶解时伴随震荡操作；
优选地，所述震荡的时间为1.5-3h；
优选地，步骤(2)所述溶解前还包括洗涤操作；
优选地，所述洗涤使用的洗涤液成分包括Tris和/或TritonX-100；
优选地，所述洗涤液的pH为7-10。
4.如权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述梯度进行的次数为2-5次；
优选地，步骤(2)所述离心的转速为8000-15000rpm，离心的时间为15-45min。
5.如权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述混合的具体操作为：将上清液滴入复性剂；
优选地，步骤(3)所述复性剂包括Tris、NaCl、甘油和EDTA-2Na，还包括L-半胱氨酸；
优选地，步骤(3)所述复性剂的pH为7-9；
优选地，所述将上清液滴入复性剂时伴随搅拌操作。
6.如权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述过滤时使用的滤膜孔径为0.45μm。
7.如权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述脱盐使用的脱盐柱为G25脱盐柱。
8.一种基于包涵体形式表达的釉原蛋白产品，其特征在于，所述釉原蛋白产品包括如权利要求1-7中任一项所述的制备方法制得的釉原蛋白。
9.如权利要求8所述的釉原蛋白产品，其特征在于，所述的釉原蛋白产品还包括冻干保护剂。
10.如权利要求1-7中任一项所述的制备方法或如权利要求8或9所述的釉原蛋白产品在制备口腔护理、口腔医疗或美容护肤产品中的应用。
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