CN116217727A

CN116217727A - 靶向cd22的抗原结合片段和单链抗体及其应用

Info

Publication number: CN116217727A
Application number: CN202111478755.9A
Authority: CN
Inventors: 赵文旭; 幺瑞娜; 沈俊杰; 徐艳敏; 杨智; 洪娟
Original assignee: Chongqing Jingzhun Biological Industrial Technology Institute Co ltd; Chongqing Precision Biotech Co ltd
Current assignee: Chongqing Jingzhun Biological Industrial Technology Institute Co ltd; Chongqing Precision Biotech Co ltd
Priority date: 2021-12-06
Filing date: 2021-12-06
Publication date: 2023-06-06

Abstract

本发明属于细胞免疫工程技术领域，具体涉及一种全人源的靶向CD22的抗原结合片段和单链抗体及其应用。所述抗原结合片段和单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.1‑5任一所示；所述重链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.6‑10任一所示。本发明提供的单链抗体亲和力性能良好，均可在流式细胞检测中与CD22阳性细胞结合，分子互作研究中显示可与CD22抗原特异性结合，而且为天然全人源抗体来源，序列完全来自于人类抗体基因库，与鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体相较，其免疫原性大大降低，在临床应用上能够最大限度保证安全性。

Description

靶向CD22的抗原结合片段和单链抗体及其应用

技术领域

本发明属于细胞免疫工程技术领域，具体涉及一种全人源的靶向CD22的抗原结合片段和单链抗体及其应用。

背景技术

临床上常规的治疗肿瘤的方法，如手术，放疗，化疗等都具有特异性差、对正常组织危害大、常伴有复发风险等瓶颈，这些局限性促使了新的治疗手段的出现，肿瘤免疫疗法因其安全、有效、不良反应低等优点逐渐脱颖而出，成为继手术，放疗，化疗之外的第四种肿瘤治疗手段。

B细胞受体CD22又称sigle2、B淋巴细胞粘附分子(BL-CAM)、T细胞表面抗原Leu-14，会介导B细胞间的相互作用，并可能参与B细胞在淋巴组织中的定位，属于免疫球蛋白超家族和唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素家族的重要成员，其分子量约为140kDa，胞外域包含七个Ig域。目前，已报道的靶向CD22抗原的临床适应症有B-细胞淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、系统性红斑狼疮等。由于其限制性地表达于成熟B细胞并表达于大多数恶性B淋巴瘤细胞表面，使其成为了自身免疫疾病和B细胞恶性肿瘤治疗的热门靶点之一。

最早临床试验的抗CD22的人源化抗体Epratuzumab(目前处于临床3期)，通过抗体依赖的细胞毒性、CD22磷酸化和交联后的增殖抑制作用等，在治疗ALL病人中得到了广泛应用。Epratuzumab无论是单独作为裸抗体，还是与一种或多种其他疗法联合使用，已在多种造血系统癌症中显示出疗效，故抗体治疗在肿瘤治疗中发挥着重要的作用。治疗中使用的第一代单克隆抗体是鼠源单抗，但其会引起人体内的免疫反应，在体内被很快清除，给临床应用带来了一定的困难。

目前已经有靶向CD22抗原的单克隆抗体出现，但CD22含有7个不同的胞外域，不同表位有多样的临床前景，且目前针对于急性淋巴白血病的主要靶点是CD19，存在抗原丢失导致的复发、CAR-T的持久性差等风险，故仍需新的抗CD22抗体，与其他抗体或药物联合使用，寻找多维度治疗肿瘤的新方法。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在提供一种靶向CD22的抗原结合片段，所述抗原结合片段的可变区来源于人天然抗体展示文库，降低了免疫原性，提高了临床应用中的安全性。所述抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区；所述轻链可变区包含L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，所述重链可变区包含H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3；

所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3选自以下氨基酸序列组合中一种：

1)QSVSSNL、GAS、QQYHSWPPLT；

2)QSVSSTY、GAS、QQRSNWLT；

3)QTIDNY、AAS、QQSYSTPPMYT；

4)QSISSY、SAS、QQSFTTPFT；

5)QSISSY、AAS、QQYSSYPHT；

所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3选自以下氨基酸序列组合中一种：

1)GYTFTSYG、ISAYNGNT、ARDFQGIAVADLDY；

2)GYTFTSYY、INPSGGST、ARGVGSYAMDV；

3)GFKFDDYP、ISWDGKTT、AKDRSRTGWGYGGMDV；

4)GDSVSSNSAA、TYYRSKWYN、ARSVGIARWDV；

5)GDSVSSNSAA、TYYRSKWYN、ARATGTASGWFDP。

进一步，所述轻链可变区除了上述的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的高突变区外，还包括低突变区(也称骨架区或框架区)。

所述轻链可变区的氨基酸序列包括如Sequence NO.1、Sequence NO.2、SequenceNO.3、Sequence NO.4或Sequence NO.5所示的序列或其功能性变体；其中所述轻链可变区的序列还包括与Sequence NO.1、Sequence NO.2、Sequence NO.3、Sequence NO.4或Sequence NO.5所示的序列的同一性为80％、90％、99％的序列，其不同序列主要位于所述低突变区。

进一步，同样的，所述重链可变区除了上述的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的高突变区外，还包括低突变区，所述重链可变区的氨基酸序列包括如Sequence NO.6、SequenceNO.7、Sequence NO.8、Sequence NO.9或Sequence NO.10所示的序列或其功能性变体；其中所述轻链可变区的序列还包括与Sequence NO.1、Sequence NO.2、Sequence NO.3、Sequence NO.4或Sequence NO.5所示的序列的同一性为80％、90％、99％的序列，其不同序列主要位于所述低突变区。

进一步，还提供一种靶向CD22的全长抗体，所述全长抗体包含前述的抗原结合片段，所述全长抗体可以通过常规的质粒构建表达获得。

本发明目的在于还提供一种靶向CD22的单链抗体，靶向肿瘤的单链抗体(ScFv)药物具有广阔的应用前景，ScFv作为靶向分子具有以下优点：分子量小，穿透性较强，能实现人源化，易对其进行改造，可大规模生产等，目前国内外已有多种ScFv药物并用于临床。该单链抗体可变区为人天然抗体来源，序列完全来自于人类抗体基因库，与鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体相较，其免疫原性大大降低，解决了在临床应用上安全性的问题。

所述单链抗体包含重链可变区和轻链可变区；所述轻链可变区包含L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，所述重链可变区包含H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3。

所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3选自以下氨基酸序列组合中一种：

1)QSVSSNL、GAS、QQYHSWPPLT；

2)QSVSSTY、GAS、QQRSNWLT；

3)QTIDNY、AAS、QQSYSTPPMYT；

4)QSISSY、SAS、QQSFTTPFT；

5)QSISSY、AAS、QQYSSYPHT；

所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3选自以下氨基酸序列组合中一种：

1)GYTFTSYG、ISAYNGNT、ARDFQGIAVADLDY；

2)GYTFTSYY、INPSGGST、ARGVGSYAMDV；

3)GFKFDDYP、ISWDGKTT、AKDRSRTGWGYGGMDV；

4)GDSVSSNSAA、TYYRSKWYN、ARSVGIARWDV；

5)GDSVSSNSAA、TYYRSKWYN、ARATGTASGWFDP。

进一步，所述轻链可变区除了上述的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的高突变区外，还包括低突变区，

所述轻链可变区的氨基酸序列包括如Sequence NO.1、Sequence NO.2、SequenceNO.3、Sequence NO.4或Sequence NO.5所示的序列或其功能性变；其中所述轻链可变区的序列还包括与Sequence NO.1、Sequence NO.2、Sequence NO.3、Sequence NO.4或SequenceNO.5所示的序列的同一性为80％、90％、99％的序列，其不同序列主要位于所述低突变区。

进一步，所述轻链可变区和重链可变区通过linker连接，所述link可选自任一可具有连接作用的多肽，优选为氨基酸序列如Sequence NO.11所示的多肽或其功能性变体。

在某些具体实施例中，所述单链抗体为以下轻链和重链组合中的一种：

1)轻链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.1，重链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.6所示；

2)轻链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.2，重链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.7所示；

3)轻链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.3，重链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.8所示；

4)轻链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.4，重链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.9所示；

5)轻链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.5，重链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.10所示。

进一步，还提供一种包含前任一所述的单链抗体的CAR结构，该CAR结构可以转染免疫细胞后制备成CAR-T细胞制备用于靶向治疗CD22靶点的肿瘤。所述CAR结构还包括铰链区、跨膜区、胞内信号区。所述铰链区序列可以来源于：IgG、CD8、CD7、CD4或其他同等功能蛋白分子；所述跨膜区可以来源于：CD8、CD28、CD3ε、CD4、CD16、CD137、CD80以及CD86或其他同等功能蛋白分子；所述胞内信号区可来源于：CD3、CD137、CD28、CD27、OX40、ICOS、GITR、CD2、CD40、PD-1、PD1L、B7-H3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、ICAM-1、CD7、NKG2C、CD83、CD86以及CD127其他同等功能蛋白分子。

进一步，所述CAR结构包含天然杀伤细胞受体(NKR)的一种或多种组分，因而形成NKR-CAR。NKR组分可以是来自以下任何天然杀伤细胞受体的跨膜结构域、铰链结构域或胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1和KIR3DP1；天然细胞毒性受体(NCR)，例如，NKp30、NKp44、NKp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族，例如，CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRA、BLAME和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如，CD16、和CD64；和Ly49受体，例如，LY49A、LY49C。所述的NKR-CAR分子可以与衔接分子或胞内信号结构域(例如，DAP12)相互作用进一步，还提供编码前述单链抗体的核酸序列，单链抗体包括轻链可变区和重链可变区，以及连接轻链可变区和重链可变区的linker，其中，编码所述轻链的核苷酸序列如Sequence NO.12、Sequence NO.13、Sequence NO.14、Sequence NO.15、或Sequence NO.16所示；编码所述重链的核苷酸序列如Sequence NO.17、Sequence NO.18、Sequence NO.19、Sequence NO.20或Sequence NO.21所示，编码kiner的核苷酸序列如22或23所示。

进一步，还提供一种包含前述的核酸序列的重组质粒，所述重组质粒还包括表达载体。表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体，RNA载体、质粒中的任一种。

在某些实施例中，所述慢病毒载体选自基本上由以下组成的群组：人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2(HIV-2)、维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus，VMV)病毒、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。

在某些实施例中，载体包含左(5')逆转录病毒LTR、Psi(Ψ)包装信号、中心多嘌呤段/DNA瓣(cPPT/FLAP)、逆转录病毒导出元件、可操作地连接到编码本文所涵盖的CAR的多核苷酸的启动子和右(3')逆转录病毒LTR。

在某些实施例中，CAR包含乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)或土拔鼠转录后调节元件(WPRE)以及优化的土拔鼠转录后调节元件(oPRE)。

在某些实施例中，所述5'LTR的启动子经异源启动子置换。

在某些实施例中，所述异源启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。

在某些实施例中，所述5'LTR或3'LTR是慢病毒LTR。

在某些实施例中，所述3'LTR是自我失活(SIN)LTR。

进一步，还提供一种免疫工程细胞，其包含前任意一项所述的抗体结合片段或者全长抗体。

进一步，所述免疫工程细胞是通过前任一所述的重组质粒转染免疫细胞得到，优选的，所述免疫细胞为T细胞、T细胞前体或NK细胞，所述免疫细胞优选为T细胞，剂提供一种提供一种CAR-T细胞或CAR-T细胞制品，。

在某些实施例中，所述细胞可以表达其它活性剂，例如，增强CAR表达细胞活性的活性剂。活性剂可以是阻断抑制性分子的活性剂。抑制性分子如PD1可以在一些实施方案中降低CAR表达细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT,LAIR1、CD160、2B4、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIG、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、TGFR(TGFRβ)和TGFRβ。所述抑制性分子的胞外结构域可以融合到跨膜结构域和胞内信号传导结构域，比如PD1 CAR。

进一步，还提供一种前述的抗原结合片段或前述的全长抗体或前述的单链抗体或前述的CAR结构或前述的核酸序列或前述的重组质粒或前述的免疫工程细胞在制备抗抗肿瘤/自身免疫性炎症药物中的应用。具体地，制备的抗肿瘤药物可应用于针对CD22靶点的血液或实体肿瘤的免疫治疗。

优选地，所述肿瘤/自身免疫性炎症为B-细胞淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、系统性红斑狼疮。

进一步，还提供一种前述的抗原结合片段或前述的全长抗体或前述的单链抗体在制备检测试剂/检测试剂盒中的用途，该检测试剂或检测试剂盒可以高效精准识别CD22抗原。

本发明目的在于还提供一种前述的单链抗体的制备方法，该制备方法是通过噬菌体展示技术构建全人源的单链抗体库，相对于常规获得ScFv的方法，通过噬菌体展示技术构建全人源的单链抗体库，可以在较短时间内获得低免疫原性的治疗用全人源单链抗体。

目前有四种重组抗体平台用于产生用于治疗的人抗体：(1)小鼠单克隆抗体的“人源化”；(2)含人抗体基因的转基因小鼠免疫；(3)从大量的人类抗体库中进行体外筛选全人源抗体；(4)单个B细胞抗体制备技术。噬菌体展示技术是目前发展最为成熟的单抗药物制备技术。它由美国Missouri大学的George Smith于1985年提出，其基本原理是将外源DNA插入到丝状噬菌体的基因组DNA，与噬菌体的外壳蛋白融合表达，一起展示到噬菌体表面。通过适当方法的亲和淘选，富集携带某种具有特异亲和力片段的噬菌体，测序即可获得其基因序列。

在某些具体实施例中，为筛选到靶向CD22抗原的人源抗体，构建了全人源的单链抗体库，以正常人的PBMC为原材料，抽提总RNA反转录cDNA，扩增抗体可变区，通过连接肽(Linker)将重链可变区VH与轻链可变区VL连接起来，得到抗体序列，将其构建至噬菌粒载体，电转至展示菌株，构建抗体库，由CD22胞外段抗原对文库进行淘选，对筛选出的克隆进行鉴定，最终获得了多个对具有特异性结合CD22抗原的ScFv。

本发明中，术语“功能性变体”通常是指包括与其具有基本上相同的功能(例如，可以具备所述嵌合抗原受体的性质)，且与其具有至少85％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同的功能。

本发明有益效果在于

本发明提供的靶向CD22的单链抗体可变区为天然全人源抗体来源，序列完全来自于人类抗体基因库，与鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体相较，其免疫原性大大降低，在临床应用上能够最大限度保证安全性。

本发明提供的单链抗体可以特异性识别人CD22抗原，可应用于针对C22靶点的血液或实体肿瘤的免疫治疗。

本发明提供的单链抗体亲和力性能良好，均可在流式细胞检测中与CD22阳性细胞结合，分子互作研究中显示可与CD22抗原特异性结合，有潜在的临床诊断和治疗用途。

附图说明

图1为m971鼠源ScFv对K562细胞流式染色。

图2为m971鼠源ScFv对K562-CD22细胞流式染色。

图3为SK-01-A13对K562细胞流式染色。

图4为SK-01-A14对K562细胞流式染色。

图5为SK-03-B09对K562细胞流式染色。

图6为SK-04-B07对K562细胞流式染色。

图7为SK-04-E07对K562细胞流式染色。

图8为SK-01-A13对K562-CD22细胞流式染色。

图9为SK-01-A14对K562-CD22细胞流式染色。

图10为SK-03-B09对K562-CD22细胞流式染。

图11为SK-04-B07对K562-CD22细胞流式染色。

图12为SK-04-E07对K562-CD22细胞流式染色。

图13为m971与CD22抗原的结合动力学检测。

图14为SK-01-A13与CD22抗原的结合动力学检测。

图15为SK-03-B09与CD22抗原的结合动力学检测。

图16为SK-04-B07与CD22抗原的结合动力学检测。

图17为SK-04-E07与CD22抗原的结合动力学检测。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本发明实施例中，抗原淘选的具体实施过程如下：

(1)封闭：5％脱脂奶粉以PBS溶解，过滤后作为封闭液，以适量封闭液分别重悬噬菌体与CD22-proteinG偶联磁珠，滚转混匀；

(2)共孵育：将CD22-proteinG偶联磁珠置于磁力架，弃上清后以噬菌体将磁珠重悬，室温160rpm滚转共孵育1h；

(3)清洗：将磁珠噬菌体混合液置于磁力架，弃上清后加入适量体积0.1％Tween-80 PBST清洗液对磁珠进行清洗，根据不同的淘选轮数进行清洗次数的确定，；

(4)洗脱：将清洗后的磁珠置于磁力架，吸干上清，加入pH2.2 Gly-HCl 400μL，混匀后室温孵育后加入约20μL PH9.0 Tris-HCl调节pH，最终将混合物置于磁力架，将噬菌体上清转移至EP管完成一轮淘选；

(5)富集：将噬菌体接入到TGI菌液中进行感染，37℃静止后离心，保留200μL培养基重悬沉淀，涂布于2YTAG板，30℃倒置过夜培养；

(6)洗板：将过夜培养的平板由培养基洗下菌斑，作为下一轮文库包装的种子菌液，具体过程与单链抗体文库制备时的过程一致。

本发明实施例中，ELISA检测的具体实施过程如下：

(1)包被：用50mM pH9.6的碳酸盐包被缓冲液稀释CD22抗原，100μL/孔加入至96孔板，封盖过夜；

(2)噬菌体样品的获得：将过夜培养的噬菌体单克隆重组菌液4℃8000rpm离心10min，取上清作为检测样品；

(3)封闭：抗原包被板在洗板机上以PBS洗板3次后每孔加入200μL 5％脱脂奶粉封闭液，37℃封闭2h；

(4)抗体孵育：洗板机PBS洗板3次后每孔加入100μL待检噬菌体单克隆重组菌液，37℃孵育1h；

(5)加二抗：洗板机PBS洗板3次，每孔加入1：5000Anti-M13-HRP二抗100μL，37℃孵育1h；

(6)显色：洗板机洗板6次，每孔加入TMB显色液100μL，室温避光放置25min显色；

(7)终止：每孔加入50μL 2M H₂SO₄终止反应；

(8)检测：将检测板置于酶标仪中检测OD450吸光度，高于阴性对照2.5倍的噬菌体克隆即为阳性克隆。

实施例1全人源单链抗体文库的构建

采用Ficoll分离液进行PBMC分离，将Ficoll分离液缓慢加入正常人血液使得Ficoll分离液与正常人血液保持清晰的分离界面。将装有所述血液和分离液的50mL离心管于15℃左右离心20min。离心之后，整个液面分为四层，上层为血浆混合物，下层为红细胞和粒细胞，中层为Ficoll液体，其中在上、中层交界处有以PBMC为主的白色云雾层狭窄带，即PBMC细胞层。用无菌巴氏吸管小心地吸去上层的血浆混合物，然后再用新的无菌巴氏吸管吸取PBMC，获得分离的PBMC。

通过常规方法提取总RNA并反转录成cDNA。再根据Sblattero,D.,Bradbury,A.,(1998)A definitive set of oligonucleotide primers for amplifying human Vregions.Immunotechnology 3,271-278文章中的方法进行引物设计，其中VL在前或后，VH在后或前，中间由柔性Linker进行连接，PCR得到抗体的重链可变区基因片段和轻链可变区基因片段，通过常规的重叠PCR的方法扩增得到ScFv核酸片段(PCR方法参考《分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(第三版)，美国，Joe Sambrook，DavidRussell.科学出版社)，将ScFv核酸片段与噬菌粒载体pComb3xss进行连接，通过电转仪将产物转化至TGI菌株中，得到全人源单链抗体库。

实施例2噬菌体展示全人源单链抗体文库制备

将文库菌液加入到新鲜的LB液体培养基中，进行复苏，培养至OD600≈0.5再以VCSM13:菌＝50:1的感染复数添加VSCM13辅助噬菌体，充分混匀，静置后在摇床中继续培养。将培养物离心弃上清，沉淀则以氨苄青霉素、卡那霉素双抗性SOB培养基重悬，培养过夜。菌液离心20min，收集上清并加入PEG 8000 2.5mmol/LNaCl溶液，冰上孵育1小时，再离心30min，将沉淀的噬菌体用PBS重悬并用滤膜过滤。

实施例3抗原淘选

将带有Fc标签的CD22蛋白与proteinG磁珠共孵育，制备为CD22-proteinG偶联磁珠，将偶联磁珠抽入到制备得到的全人源单链抗体文库噬菌体淘选中。经历3-4轮的共孵育、清洗和洗脱的淘选过程，即可富集得到针对抗原的特异性单克隆抗体。

实施例4阳性克隆的筛选

淘选结束后，挑取最终出库的单克隆菌斑进行ELISA检测筛选，得到与CD22抗原有结合的噬菌体克隆，淘选得到以下5株ScFv，均具备人CD22抗原的特异性结合能力。

SK-03-B09/D-2-13:轻链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.1，所述重链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.6所示；

SK-01-A13/E-6-85/D-3-368：轻链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.2，重链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.7所示；

SK-01-A14/E-1-29：轻链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.3，重链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.8所示；

SK-04-E07/E-1-35：轻链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.4，重链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.9所示；

SK-04-B07：轻链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.5，重链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.10所示。

实施例5ScFv的表达与纯化

将阳性噬菌体克隆的pComb3xss质粒与100μL感受态Rosetta gami(DE3)细菌混匀并冰浴，42℃热激，冰浴后涂布至含有氨苄抗性的LB平板上，置于37℃恒温培养箱中过夜培养；挑取形成的单克隆菌斑置于4ml的LB培养基中，摇床培养后将菌液转接培养基，培养，待菌液OD达到0.5-1.0时加入IPTG并调整终浓度，诱导表达12h。离心收集菌体并加入PBS重悬沉淀，超声破碎，裂解液12000rpm 4℃离心，弃去沉淀，收集上清进行蛋白纯化。

菌液裂解上清0.22μm过滤，以等体积PBS稀释后以GE Ni Sepharose excel纯化柱富集ScFv，5倍柱体积PBS流洗后以5倍柱体积的含30mM咪唑PBS溶液流洗去除杂质，含500mM咪唑的PBS溶液洗脱蛋白，收集洗胶液以3KDa的超滤管浓缩，GE HiLoad Superdex 16/600200pg分子排阻色谱柱上样，PBS流洗并收集紫外吸收峰，SDS-PAGE鉴定ScFv纯化效果后进行流式染色特异性检测。

实施例6流式染色能力鉴定

将K562、K562-CD22细胞各自分装至1.5mL Ep管，每管1×10⁶个细胞作为靶细胞，均在1000g离心5min后弃尽上清，分别以50μL 30μg/mLm971/SK-01-A13/SK-01-014/SK-03-B09/SK-04-B07/SK-04-E07 ScFv溶液重悬并4℃避光孵育。30min后加入PBS重悬细胞，1000g洗涤5min，弃尽上清，加入检测用Anti-His-647荧光二抗并重悬细胞后，4℃避光孵育；以1mL PBS重悬并1000g 5min洗涤细胞两次，弃尽上清并以200μL PBS重悬。所有细胞管上机检测流式染色阳性率及平均荧光强度(MFI)，对比m971染色组与淘选得到抗CD22 ScFv染色组的染色结果，以评估ScFv的流式染色特异性。m971 ScFv对K562的染色结果结果如图1所示，m971 ScFv对K562-CD22细胞的染色结果如图2所示，淘选得到CD22特异性ScFv对K562细胞的染色结果如图3、图4、图5、图6及图7所示，对K562-CD22的染色结果如图8、图9、图10、图11及图12所示。

实施例7抗原抗体结合的动力学参数检测

SA/HIS1K生物传感器在分析缓冲液中baseline1 60s，在ScFv溶液中loading120s进行配体蛋白固化，转入分析缓冲液中baseline2 120s，转入梯度稀释的分析物(CD22单价抗原)溶液中association 120s，最后在分析缓冲液中dissociation 300s。通过对响应值R的变化判断是否存在特异性结合，一般而言，扣平Reference后的最大响应值Rmax大于0.05nm且存在浓度依赖与解离现象时即可以为存在特异性结合。通过Fortebio OctetK2仪器自带的Data Analysis分析软件可以给出结合-解离曲线代表的动力学参数，如结合常数(Kon)、解离常数(Kdis)以及平衡解离常数(KD)。其中Kon的单位是1/Ms，用以表述抗原与抗体结合的速率，Kon越高，抗体与抗原结合形成复合物的速度越快；Kdis的单位是1/s，用以表述抗原与抗体解离速率，Kdis越高，抗原-抗体复合物解离的速度越快；KD为Kdis与Kon的比值，用以综合描述抗原抗体结合的难易程度，KD越小，通常认为抗体亲和力越高。m971 ScFv与CD22抗原的结合动力学如图13所示，动力学参数参数如下表1所示；淘选得到CD22特异性ScFv与CD22抗原的结合动力学如图14、图15、图16、图17所示，其动力学参数如下表2、表3、表4、表5所示。

表1 m971与CD22抗原的结合动力学参数

表2 SK-01-A13与CD22抗原的结合动力学参数

表3 SK-03-B09与CD22抗原的结合动力学参数

表4 SK-04-B07与CD22抗原的结合动力学参数

表5 SK-04-E07与CD22抗原的结合动力学参数

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 重庆精准生物技术有限公司，重庆精准生物产业技术研究院有限公司

<120> 靶向CD22的抗原结合片段和单链抗体及其应用

<130> 2021-9-2

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Trp Pro Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Val

35 40 45

Ile Phe Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Thr Ile Asn Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 3

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Thr Ile Asp Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Val Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro

85 90 95

Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Thr Leu His Gly Glu Leu Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Asn Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Thr Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg

100 105

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro His

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 6

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Phe Gln Gly Ile Ala Val Ala Asp Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 7

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Gly Ser Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Pro Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Lys Thr Thr Tyr Ile Gly Asp Ser Leu

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asn Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Ile Asn Asn Leu Arg Ser Glu Asp Gly Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Ser Arg Thr Gly Trp Gly Tyr Gly Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala

50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn

65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Leu

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Gly Ile Ala Arg Trp Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala

50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn

65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Thr Gly Thr Ala Ser Gly Trp Phe Asp Pro

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gly Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser

1 5 10 15

Thr Lys Gly

<210> 12

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaaacgacac tcacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120

ggccaggctc ccagactcct catctatggt gcatccacca gggccactgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggaccgag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240

gaggattttg caatttatta ctgtcagcag tatcatagct ggcctcccct cactttcggc 300

ggagggacca agctggagat caaacgt 327

<210> 13

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaaacgacac tcacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcacctact tagcctggta tcagcagaaa 120

cctggccagg ctcccaggct cgtcatcttc ggtgcatcca acagggccac tggcatccca 180

gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcattc tcaccatcaa cagactggag 240

cctgaagact ttgcaattta ttactgtcag cagcgtagca actggctcac tttcggcgga 300

gggaccaagc tggaactcaa acgt 324

<210> 14

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60

atcacctgcc ggacaagtca gaccattgac aactatttaa attggtatca ggtgaaatca 120

gggaaggccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctcctat gtacactttt 300

ggccagggga caaagctgga aattaaaggt 330

<210> 15

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctgagctcct gatctattct gcgtccactt tgcacggtga actcccatca 180

agattcagtg gcagtggatc tgggacagac ttcaatttga ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ttgtcaacag agtttcacta ccccattcac tttcggccct 300

gggaccaaag tggatatcaa acgt 324

<210> 16

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcagtctca ccatcaacag cctgcagcct 240

gaagattttg ctacttatta ctgccaacag tatagtagtt acccgcacac tttcggcgga 300

gggacaaagc tggaaattaa aggt 324

<210> 17

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

caggtccagc tggtacagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180

gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240

atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagacttc 300

cagggtatag cagtggctga tcttgactac tggggccagg gaaccctggt cacagtctcc 360

tca 363

<210> 18

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60

tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggagtt 300

ggtagctacg ctatggacgt ctggggccaa gggacaacgg tcaccgtctc ctca 354

<210> 19

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggs gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt taagtttgat gattatccca tgcactgggt ccgacaacct 120

ccggggaggg gtctggagtg ggtctccctt atcagttggg atggtaaaac tacatatatt 180

ggagactctc tgaagggtcg attcaccgtc tccagagaca acaataaaaa ctccctatat 240

ctggaaatca acaatctgag aagtgaggac ggcgccttgt attattgtgc aaaggatcga 300

agtcgcactg gctggggtta tggaggcatg gacgtctggg gccgagggac aatggtcacc 360

gtctcttca 369

<210> 20

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gaggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60

acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120

cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180

aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240

cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctctgta ttattgtgca 300

agatcggtcg gtatagcccg ttgggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 21

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60

acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120

cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180

aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240

cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300

agagccacgg gtacggcgtc gggctggttc gacccctggg gccagggaac cctggtcacc 360

gtctcctca 369

<210> 22

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggcagcacaa gcggaagcgg caaaccagga agcggagaag gaagcaccaa ggga 54

<210> 23

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ggaagcacca gcggcagcgg aaagcctggc agcggcgagg gcagcacaaa agga 54

Claims

1.靶向CD22的抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区；所述轻链可变区包含L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，所述重链可变区包含H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3；

所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3选自以下氨基酸序列组合中一种：

1)QSVSSNL、GAS、QQYHSWPPLT；

2)QSVSSTY、GAS、QQRSNWLT；

3)QTIDNY、AAS、QQSYSTPPMYT；

4)QSISSY、SAS、QQSFTTPFT；

5)QSISSY、AAS、QQYSSYPHT；

所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3选自以下氨基酸序列组合中一种：

1)GYTFTSYG、ISAYNGNT、ARDFQGIAVADLDY；

2)GYTFTSYY、INPSGGST、ARGVGSYAMDV；

3)GFKFDDYP、ISWDGKTT、AKDRSRTGWGYGGMDV；

4)GDSVSSNSAA、TYYRSKWYN、ARSVGIARWDV；

5)GDSVSSNSAA、TYYRSKWYN、ARATGTASGWFDP。

2.靶向CD22的全长抗体，其特征在于，所述全长抗体包含权利要求1所述的抗原结合片段。

3.靶向CD22的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体包含重链可变区和轻链可变区；所述轻链可变区包含L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，所述重链可变区包含H-CDR1、H-CDR2和H-CDR；所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3选自以下氨基酸序列组合中一种：

1)QSVSSNL、GAS、QQYHSWPPLT；

2)QSVSSTY、GAS、QQRSNWLT；

3)QTIDNY、AAS、QQSYSTPPMYT；

4)QSISSY、SAS、QQSFTTPFT；

5)QSISSY、AAS、QQYSSYPHT；

所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR选自以下氨基酸序列组合中一种：

1)GYTFTSYG、ISAYNGNT、ARDFQGIAVADLDY；

2)GYTFTSYY、INPSGGST、ARGVGSYAMDV；

3)GFKFDDYP、ISWDGKTT、AKDRSRTGWGYGGMDV；

4)GDSVSSNSAA、TYYRSKWYN、ARSVGIARWDV；

5)GDSVSSNSAA、TYYRSKWYN、ARATGTASGWFDP。

4.根据权利要求3所述的单链抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.1、Sequence NO.2、Sequence NO.3、Sequence NO.4或Sequence NO.5所示或其功能性变体；所述重链可变区的氨基酸序列如Sequence NO.6、Sequence NO.7、SequenceNO.8、Sequence NO.9或Sequence NO.10所示或其功能性变体。

5.根据权利要求3或4所述的单链抗体，所述轻链可变区和重链可变区通过linker连接，所述link的氨基酸序列如Sequence NO.11所示或其功能性变体。

6.CAR结构，其特征在于，包含权利要求3-5任一所述的单链抗体。

7.核酸序列，其特征在于，包含编码权利要求3-5任一所述的单链抗体的核苷酸序列，编码所述轻链的核苷酸序列如Sequence NO.12、Sequence NO.13、Sequence NO.14、Sequence NO.15、或Sequence NO.16所示；编码所述重链的核苷酸序列如Sequence NO.17、Sequence NO.18、Sequence NO.19、Sequence NO.20或Sequence NO.21所示。

8.重组质粒，其特征在于，包含权利要求7所述的核酸序列和表达载体。

9.免疫工程细胞，其特征在于，所述免疫工程细胞是通过权利要求8所述的重组质粒转染免疫细胞得到，优选的，所述免疫细胞为T细胞、T细胞前体或NK细胞。

10.免疫工程细胞，其特征在于，所述免疫工程细胞包含权利要求1-5任意一项所述的抗体结合片段或者全长抗体。

11.权利要求1所述的抗原结合片段或权利要求2所述的全长抗体或权利要求3-5任一所述的单链抗体或权利要求6所述的CAR结构或权利要求7所述的核酸序列或权利要求8所述的重组质粒或权利要求9或10所述的免疫工程细胞在制备抗肿瘤/自身免疫性炎症药物中的应用；优选的，所述肿瘤/自身免疫性炎症为B-细胞淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、系统性红斑狼疮。

12.权利要求1所述的抗原结合片段或权利要求2所述的全长抗体或权利要求3-5任一所述的单链抗体在制备检测试剂/检测试剂盒中的用途。