CN116183899B - 一种吖啶酯标记抗体保存液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫检测领域，具体涉及到了一种吖啶酯标记抗体保存液的制备方法。本发明通过对吖啶酯标记抗体保存液的组分进行改良，从而实现了增加吖啶酯标记抗体在储存条件中的稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，具体涉及到了一种吖啶酯标记抗体的保存液的制备方法。
背景技术
化学发光技术是近二、三十年来发展起来的一种测定方式。该技术的原理是利用化学反应释放的自由能激发中间体(常用碱性磷酸酶-金刚烷胺、辣根过氧化酶-鲁米诺衍生物、辣根过氧化酶-鲁米诺衍生物、吖啶酯等），使其从激发态回到基态。当中间体从激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而进行定量分析。化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发光，避免了荧光分析中激发光杂散光的影响从而提高了灵敏度，并且避免了放射分析造成的环境污染和健康危害，是一种非常优秀的定量分析方法。
作为新型标记物的吖啶酯与传统的发光标记物相比，有着很多的优点。1.吖啶酯发光系统简单，不需要催化剂。在碱性条件下，吖啶酯分子受到过氧化氢攻击可生成二氧乙烷，二氧乙烷不稳定而分解为CO2和电子激发态的N-甲基吖啶酮，当其回到基态时发出波长为430nm的光，不需要催化剂，发光系统简单。2.吖啶酯发光效率高且强度大。吖啶酯化学发光为闪光型，在化学发光免疫分析领域与其它技术相比具有优势，吖啶酯化学发光在加入启动剂0.4s后发射光强度达到最大，半衰期为0.9s，2s内发光基本结束，可以实现快速检测，吖啶酯具有较高的量子产率，其化学发光效率较高，通常是鲁米诺的五倍或五倍以上。3.吖啶酯发光体系的干扰因素少，本底极低，信噪比很高。吖啶酯类化合物从发光的机理来说的特点是发光反应中在形成电子激发态中间体之前，联结于吖啶环上的不发光的取代基部分从吖啶环上脱离开来，即未发光部分与发光部分分离，因而其发光效率基本不受取代基结构的影响。此外，吖啶酯分子量小，易与蛋白质通过化学键牢固联结(即为标记)，对联结后的抗体构象影响小(进而保证了其在后续免疫检测中保持良好的反应性)，且联结物的稳定性好。
虽然吖啶酯有着诸多的优点，但是标记吖啶酯的抗体却是价格昂贵，在吖啶酯化学发光的研发过程中，会存在吖啶酯标记抗体液的结合率降低，也伴随着发光值的降低，使得测出的结果不再准确，主要原因就是因为在吖啶酯标记抗体不稳定。因此，本发明提供一种添加了吖啶酯标记抗体类似物的保存液，能够显著增加吖啶酯标记抗体在保存条件下的稳定性，从而能大幅延长保存时间。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下。
提供一种吖啶酯标记的抗体保存液的制备方法，其步骤如下。
a）在50ml锥形瓶中加入20ml碳酸盐缓冲液；
b）在锥形瓶中分别加入小鼠免疫球蛋白与N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液；
c）放入合适的转子在磁力搅拌器上避光反应3h；
d)再加入2mL 1M甘氨酸，搅拌0.5小时；
e)将上述液体转入透析袋，用2L 0.02M PBS于4℃透析24小时以上，换液两次，制备得到N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-小鼠免疫球蛋白复合物；
f)将透析后的复合物溶液转入锥形瓶中，加入多糖、蛋白保护剂，用PBS缓冲液定容至1L。
优选的，小鼠免疫球蛋白是来源于没有经过免疫的健康、正常的昆明小鼠的血清。
优选的，小鼠免疫球蛋白的纯度为85-95%。
优选的，多糖选自海藻糖，蔗糖，乳糖的一种或多种。
优选的，多糖在保存液中的质量浓度为1-5g/L。
优选的，蛋白保护剂选自1-2g/L的甘露醇，2-6g/L的牛血清白蛋白，1-2g/mL的PEG6000中的一种或多种。
优选的，加入小鼠免疫球蛋白的量为50-200mg。
优选的，N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液的浓度为1-2mg/ml。
优选的，N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液与连接液的体积比（V/V）为1: (5-8）。
相比较与现有技术，本发明提供的吖啶酯标记抗体保存液能够大幅增加标记抗体组分的保存稳定性，从而大大增加吖啶酯标记抗体的保存时间，在成本控制与质量控制方面都有明显的进步。
附图说明
图1.N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-小鼠免疫球蛋白合成图。
图2.稳定性加速实验第七天使用不同缓冲液发光值结果对比图，图中选取浓度梯度的最高点进行比较。
具体实施方式
为进一步说明本发明所采用的技术手段以及其效果，以下结合实施例与附图对本发明进行进一步的说明，除有特殊定义外，以下实施例中所使用的技术术语与本发明所属领域技术人员的普遍理解的含义相同。以下实施例中所使用的试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂。此处所描述的具体实施方式仅用于解释本发明，二并非对本发明的限定。
实施例1
N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-小鼠免疫球蛋白复合物的制备：a）在50ml锥形瓶中加入20ml的连接液（0.2M 碳酸盐缓冲液），b）在玻璃管中分别加入50mg纯度为95%的小鼠免疫球蛋白与4ml 2mg/ml的N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯，c）放入合适的转子在磁力搅拌器上避光反应3h，d)再加入2mL 1M 甘氨酸终止反应，搅拌0.5小时，e)将上述液体转入透析袋，用2L 0.02M PBS于4℃透析24小时以上，换液两次。将透析后的复合物溶液转入锥形瓶中，加入3g海藻糖、1g甘露醇、6g牛血清白蛋白、1g PEG6000，用PBS缓冲液定容至1L。
用普通的吖啶酯标记抗体保存液（购买自武汉德晟）与本发明所述的保存液分别将制备好的吖啶酯标记的抗SCCA抗体稀释到工作浓度，利用配套磁微粒法学发光试剂盒的其他组分进行稳定性加速实验，具体实验方案为将利用不同吖啶酯标记抗体保存液稀释的吖啶酯标记的SCCA抗体放入37℃的环境中，对放置0、3、7、14天的吖啶酯标记抗体进行化学发光实验，通过相对发光值（RLU）间接反映不同保存液对吖啶酯标记抗体的影响，特别说明的是，实施例中所呈现的发光值（RLU）是三次重复测试的平均值。
下表为对一系列SCCA抗原进行浓度梯度检测的结果。
表1.购买的保存液配制的吖啶酯标记抗体的实验结果
表2.本实施例所述的保存液配制的吖啶酯标记抗体的实验结果。
对比表1与表2实验结果可以看出，在0天的时候，两种保存液所配置的吖啶酯标记抗体液进行实验得到的实验结果几乎没有差别，但是随着37℃处理时间的增加，利用本发明所配置的吖啶酯标记抗体进行实验结果的发光值要明显高于普通保存液配制的吖啶酯标记抗体液，从而能够说明本发明所述的吖啶酯标记抗体保存液能够大幅增加吖啶酯标记抗体的稳定性，从而能够增加标记抗体的保存时间。
实施例2
N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-小鼠免疫球蛋白复合物的制备：a）在50ml锥形瓶中加入20ml的连接液（碳酸盐缓冲液），b）在玻璃管中分别加入100mg纯度为95%的小鼠免疫球蛋白与4ml 2mg/ml的N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯，c）放入合适的转子在磁力搅拌器上避光反应3h，d)再加入2mL 1M 甘氨酸终止反应，搅拌0.5小时，e)将上述液体转入透析袋，用2L 0.02M PBS于4℃透析24小时以上，换液两次。将透析后的复合物溶液转入锥形瓶中，加入3g海藻糖、1g甘露醇、6g牛血清白蛋白、1g PEG6000，用PBS缓冲液定容至1L。
表3.本实施例所述的保存液配制的吖啶酯标记抗体的实验结果
对比表1与表3实验结果可以看出，在0天的时候，两种保存液所配置的吖啶酯标记抗体液进行实验得到的实验结果几乎没有差别，但是随着37℃处理时间的增加，利用本发明所配置的吖啶酯标记抗体进行实验结果的发光值要明显高于普通保存液配制的吖啶酯标记抗体液，从而能够说明本发明所述的吖啶酯标记抗体保存液能够大幅增加吖啶酯标记抗体的稳定性，从而能够增加标记抗体的保存时间。
实施例3
N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-小鼠免疫球蛋白复合物的制备：a）在50ml锥形瓶中加入20ml的连接液（碳酸盐缓冲液），b）在玻璃管中分别加入200mg纯度为95%的小鼠免疫球蛋白与4ml 2mg/ml的N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯，c）放入合适的转子在磁力搅拌器上避光反应3h，d)再加入2mL 1M 甘氨酸终止反应，搅拌0.5小时，e)将上述液体转入透析袋，用2L 0.02M PBS于4℃透析24小时以上，换液两次。将透析后的复合物溶液转入锥形瓶中，加入3g海藻糖、1g甘露醇、6g牛血清白蛋白、1g PEG6000，用PBS缓冲液定容至1L。
表4.本实施例所述的保存液配制的吖啶酯标记抗体的实验结果
对比表1与表4实验结果可以看出，在0天的时候，两种保存液所配置的吖啶酯标记抗体液进行实验得到的实验结果几乎没有差别，但是随着37℃处理时间的增加，利用本发明所配置的吖啶酯标记抗体进行实验结果的发光值要明显高于普通保存液配制的吖啶酯标记抗体液，从而能够说明本发明所述的吖啶酯标记抗体保存液能够大幅增加吖啶酯标记抗体的稳定性，从而能够增加标记抗体的保存时间。
Claims (4)
1.一种提高吖啶酯标记的抗体稳定性的保存液的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
a）在 50ml 锥形瓶中加入 20ml 碳酸盐缓冲液；
b）在锥形瓶中分别加入小鼠免疫球蛋白与 N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液；
c）放入合适的转子在磁力搅拌器上避光反应3h；
d)再加入 2mL 1M 甘氨酸，搅拌 0.5 小时；e)将上述液体转入透析袋，用 2L 0.02MPBS 于 4℃透析 24 小时以上，换液两次，制备得到 N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-小鼠免疫球蛋白复合物；
f)将透析后的复合物溶液转入锥形瓶中，加入多糖、蛋白保护剂，用 PBS 缓冲液定容至 1L；所述多糖选自质量浓度为 1-5g/L 的海藻糖、蔗糖、乳糖的一种或多种；所述蛋白保护剂选自 1-2g/L 的甘露醇，2-6g/L 的牛血清白蛋白，1-2g/mL 的 PEG6000 中的一种或多种；所述的加入小鼠免疫球蛋白的量为 50-200mg；所述的N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液的浓度为 1-2mg/ml，且N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液与连接液的体积比（V/V）为 1: (5-8）。
2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，小鼠免疫球蛋白是来源于没有经过免疫的健康、正常的昆明小鼠的血清。
3.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，小鼠免疫球蛋白的纯度为 85-95%。
4.一种包含权利要求 1-3 任一项所述的方法制备的保存液的磁微粒化学发光检测试剂盒。
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