CN116183336A - 微生物染色方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种微生物染色方法和装置，微生物染色方法包括以下步骤：在液体样本中加入缓冲液和磁性材料孵育；孵育结束后，使用磁铁分离，弃去上清液，加入无菌水重悬；将在重悬液放置在磁场环境下的载玻片上，进行染色；染色结束后，待载玻片自然晾干，取下载玻片离开磁场环境用于显微镜观察；实现上述微生物染色方法的微生物染色装置，包括载玻片、磁性底座和固定器；所述载玻片可拆卸地设置在磁性底座上，固定器将载玻片固定在磁性底座上；通过磁性材料与磁场的作用，避免在传统染色过程中，加热或离心等固定方式造成微生物损伤及染色、脱色和清洗过程中微生物损失，提高低浓度微生物样本的染色检出率，缩短显微镜检查时间。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检测领域，特别涉及通过磁场与磁性材料的相互作用将微生物样本富集、固定在载玻片上，实现微生物染色的微生物染色方法和装置。
背景技术
细菌感染是日益严重威胁全球人类健康的疾病，其发病率和死亡率均有上升，细菌感染主要包括尿路感染、菌血症和脑膜炎，控制细菌感染在临床上仍是一项具有挑战性的任务。准确和快速的细菌鉴定是控制细菌感染和及时采取治疗措施的关键。尽管培养是细菌感染的金标准，然而在大多数的医院中需要72个小时左右。且由于病患在医生经验性治疗阶段已经使用抗生素，导致培养结果呈阴性。
革兰氏染色作为首要的也是最常规的临床一线微生物分析方法，可以在很短的时间内提供给医生微生物的革兰氏阴阳性分类、形貌、大小等信息。医生再结合临床表现及经验，可以对所感染的病原微生物做出初步的判断，确定基本的用药方案。但革兰氏染色常常由于临床样本样本量少或是样本中所含病原微生物量少，导致检出率较低。再者，传统的革兰氏染色方法通过热固定将细菌固定在载玻片上，加热过程中可能导致细胞破裂，产生的碎片对病原微生物的显微镜观察带来极大的干扰。
目前，革兰氏染色仍是各类微生物实验室细菌分类的基本步骤。不管是临床微生物实验室还是工业微生物实验室，都无法避免常规的革兰氏染色。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种提供磁性材料的富集提高低浓度微生物样本染色检出的微生物染色方法和装置。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种微生物染色方法，该方法包括以下步骤：在液体样本中加入缓冲液和磁性材料孵育；孵育结束后，使用磁铁分离，弃去上清液，加入无菌水重悬；将在重悬液放置在磁场环境下的载玻片上，进行染色；染色结束后，待载玻片自然晾干，取下载玻片离开磁场环境，载玻片可使用显微镜观察。
所述磁性材料采用纳米磁性材料，具体可采用磁珠。磁珠可以与药物、蛋白质、酶、抗体或核酸结合，具有微生物结合能力。
进一步，在将重悬液放置在磁场作用下载玻片上之后，使用吸水纸将多余的水分吸走，吸水纸吸走水分后进行染色。
一种微生物染色装置，包括载玻片、磁性底座和固定器；所述载玻片可拆卸地设置在磁性底座上，磁性底座给载玻片提供磁场环境，固定器将载玻片固定在磁性底座上。
进一步，所述磁性底座呈板状，载玻片与磁性底座按两层堆叠，固定器将按层设置的载玻片与磁性底座固定；所述固定器呈U字型，U字型固定器的开口夹持载玻片与磁性底座。
进一步，所述U字型的固定器为两个，两个U字型的固定器在相对应的两侧分别夹持载玻片与磁性底座。
所述磁性底座可采用与载玻片相同宽度的尺寸，两个U字型的固定器在宽度方向上夹持载玻片与磁性底座；为进一步防止磁性底座与载玻片的相对滑动，两个固定器的U字型底部抵触载玻片与磁性底座宽度方向上的侧边
进一步，所述U字型的固定器使用硅胶材料制作。
进一步，所述磁性底座为磁铁。
本发明的有益效果：本发明提供一种微生物染色方法，与磁性材料相互作用的微生物在外加磁场的作用下固定在载玻片表面，避免了传统微生物染色过程中，染色、脱色和清洗过程中微生物的损失提高染色检出率，避免了传统染色过程中加热或离心等方式固定微生物对微生物造成的损伤，通过磁性材料的富集，可以提高低浓度微生物样本的染色检出率；且在显微镜下，磁性材料与背景色差明显，实验者可依据磁性材料的分布快速定位目标微生物所在的位置，缩短显微镜检查时间。
进一步的，使用吸水纸吸干水分，能够降低在染色过程中与磁性材料作用的微生物的损耗，进一步提升微生物的检出率。
微生物染色装置的磁性底座能够提供稳定的磁场，确保与微生物作用的磁珠受到磁场的作用检出液体样本中的微生物，实现低浓度微生物样本的检出。
进一步的，两个U字型固定器能够进一步确保载玻片与磁性底座的固定，同时还可放置载玻片与磁性底座的相对滑动。
C字型的固定器与本发明的U字型固定器，以及U字型固定器两边长度不一致均属于等同技术方案。
进一步的，硅胶材料具有弹性，能够保证将载玻片固定在磁性底座上，且硅胶材料还具有防滑的作用，避免载玻片与磁性底座的滑动。
进一步的，磁铁简单易获得，成本低且磁场稳定。
附图说明
图1是微生物染色装置的一种实施方式的立体图；
图2是图1中微生物染色装置的正视图；
图3是分别采用传统的革兰氏染色法和采用本发明微生物染色方法从脑脊液中富集表皮葡萄球菌的染色镜检图；
图4是分别采用传统的革兰氏染色法和采用本发明微生物染色方法从玻璃体中富集表皮葡萄球菌的染色镜检图；
图5是分别采用传统的革兰氏染色法和采用本发明微生物染色方法从自来水中富集肺炎克雷伯氏菌的染色镜检图；
图6是分别采用传统的革兰氏染色法和采用本发明微生物染色方法从超纯水中富集肺炎克雷伯氏菌的染色镜检图；
图7是采用本发明微生物染色方法对脑脊液中不同浓度表皮葡萄球菌的染色镜检图；
图8是采用本发明微生物染色方法对脑脊液中不同浓度头状葡萄球菌的染色镜检图；
图9是采用本发明微生物染色方法对脑脊液中不同浓度溶血葡萄球菌的染色镜检图；
图10是采用本发明微生物染色方法对脑脊液中不同浓度肺炎克雷伯氏菌的染色镜检图；
图11是采用本发明微生物染色方法对脑脊液中不同浓度大肠杆菌的染色镜检图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明的微生物染色方法是通过磁性物质与微生物作用，以及磁性物质在磁场中作用实现的。具体来说，该微生物染色方法，已革兰氏染色法为例，包括如下步骤：
(1)将在液体样本中加入缓冲液和磁性材料孵育；具体实施时，取液体样于离心管中，先后加入缓冲液和磁性材料，在离心环境下下孵育20min。
(2)孵育结束后，使用磁铁分离，弃去上清液，加入无菌水重悬；
(3)取重悬液放置在磁场作用下载玻片1上；即将载玻片1、磁性底座2和固定器3按照图1、图2安装好，将提取的重悬液放置于载玻片1上。
(4)向载玻片1上滴加几滴结晶紫溶液，结晶紫溶液覆盖肉眼可见的磁珠即可，反应1min后，用去离子水快速冲洗载玻片上染料。
(5)向载玻片1上滴加几滴革兰氏碘液，革兰氏碘液覆盖肉眼可见的磁珠即可，反应1min后，用去离子水快速冲洗载玻片上染料。
(6)向载玻片1上滴加95％的乙醇水溶液并立刻倾倒除去乙醇水溶液，重复三次。
(7)用去离子水快速冲洗载玻片1上的染料。
(8)向载玻片1上滴加几滴番红染色液，番红染色液覆盖肉眼可见的磁珠即可，反应1min后，用去离子水快速冲洗载玻片上染料，染色结束。
(9)待载玻片1自然晾干，取下载玻片1离开磁场环境，载玻片1可使用显微镜观察，具体使用光学显微镜，在镜头放大1000倍的视场下观察微生物的颜色和形态。
本发明用于实现上述微生物染色方法的微生物染色装置如图1和图2所示，微生物染色装置，其特征在于，包括载玻片1、磁性底座2和固定器3；所述载玻片1可拆卸地设置在磁性底座2上，磁性底座2给载玻片1提供磁场环境，固定器3将载玻片1固定在磁性底座2上。
微生物染色装置在使用时，将载玻片1安装在磁性底座2上，磁性底座2带有磁场，固定器3将载玻片1固定在磁性底座2上。采用本装置进行染色，在制片、染色阶段，保持载玻片1在磁性底座2上，染色结束后，拆除固定器3，分离载玻片1和磁性底座2，取出载玻片1用于显微镜观察。
作为一种具体的实施方式，所述磁性底座2呈板状，载玻片1与磁性底座2按两层堆叠，固定器3将按层设置的载玻片1与磁性底座2固定；所述固定器3呈U字型，U字型固定器3的开口夹持载玻片1与磁性底座2。
微生物染色装置在使用时，板状磁性底座2易于获得，且板状磁性底座2可与载玻片1分两层堆叠在一起，U字型的固定器3开口能够夹持层状设置的载玻片1和磁性底座2。作为一种具体的实施方式，磁性底座2采用磁铁；固定器3采用硅胶材料制作，固定器3还可采用具有一定刚性的骨架制作U字型，在U字型骨架外包裹硅胶材料。固定器3的数量为两个，两个固定器3分别在载玻片1和磁性底座2复合层的两侧相对设置。
实施例1
使用图1、图2的微生物染色装置，按照微生物染色方法对脑脊液样本进行染色，并在染色后使用光学显微镜在1000倍放大倍率下对表皮葡萄球菌的染色结果进行观察。
具体的，取1mL脑脊液液体样本于离心管中，先后分别加入1mL Tris-HCl缓冲液(Ca2+，pH＝7.4)和1μL MBL磁珠，1000rpm下孵育20min；孵育结束后，使用磁铁分离，将上清液弃去后，再加入50μL无菌水重悬；取50μL重悬液于新型微生物染色装置的载玻片上，并按前述步骤中的步骤(4)、(5)、(6)、(7)、(8)进行染色。染色结束，待载玻片自然晾干后，在光学显微镜在镜头放大1000倍的情况下，直观地观察细菌的颜色和形态。
观察结果如图3中B视图所示。作为对比，图3中A视图为采用传统革兰氏染色法在相同条件下的观察结果。根据图3所示结果，表皮葡萄球菌在显微镜视野下为紫色球状，磁性材料呈黄褐色的球状，且两种染色方法得出的染色镜检结果是一致。本发明微生物染色法未对目标菌造成形态或染色结果上的影响，磁性材料的使用未对目标菌的显微镜观察产生干扰，并且能引导操作者在磁性材料周围快速找到目标菌。
实施例2
将实施例1中的脑脊液样本替换为玻璃体样本，使用微生物染色装置，按照微生物染色方法对玻璃体样本进行染色，并在染色后使用光学显微镜在1000倍放大倍率下对表皮葡萄球菌的染色结果进行观察。观察结果如图4中B视图所示。
作为对比，图4中A视图为采用传统革兰氏染色法在相同条件下的观察结果。表皮葡萄球菌在显微镜视野下为紫色球状，磁性材料呈黄褐色的球状，且两种染色方法得出的染色镜检结果是一致。
实施例3
将实施例1中的脑脊液样本替换为自来水样本，使用微生物染色装置，按照微生物染色方法对自来水样本进行染色，并在染色后使用光学显微镜在1000倍放大倍率下对肺炎克雷伯氏菌的染色结果进行观察。观察结果如图5中B视图所示。
作为对比，图5中A视图为传统革兰氏染色法的镜检结果图。根据图5所示结果，肺炎克雷伯氏菌在显微镜视野下为粉红色杆状，磁性材料呈黄褐色的球状，且两种染色方法得出的染色镜检结果是一致。本发明微生物染色法未对目标菌造成形态或染色结果上的影响，磁性材料的使用未对目标菌的显微镜观察产生干扰，并且能引导操作者在磁性材料周围快速找到目标菌。
实施例4
将实施例1中的脑脊液样本替换为超纯水样本，使用微生物染色装置，按照微生物染色方法对超纯水样本进行染色，并在染色后使用光学显微镜在1000倍放大倍率下对肺炎克雷伯氏菌的染色结果进行观察。观察结果如图6中B视图所示。
作为对比，图6中A视图为传统革兰氏染色法的镜检结果图。根据图6所示结果，肺炎克雷伯氏菌在显微镜视野下为紫色球状，磁性材料呈黄褐色的球状，且两种染色方法得出的染色镜检结果是一致。
实施例5
使用微生物染色装置，按照微生物染色方法对不同浓度的脑脊液样本进行染色，并对不同浓度下的表皮葡萄球菌的染色结果进行观察。
取1mL的脑脊液样本于离心管中，将细菌悬浮在脑脊液样本中，分别配制成101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL的模拟病患的样本液，各取10μL样本液于离心管中，先后分别加入25μL Tris-HCl缓冲液(Ca2+，pH＝7.4)和1μL MBL磁珠，1000rpm下孵育20min，孵育结束后，使用磁铁分离，将上清液弃去后，再加入50μL无菌水重悬。取50μL重悬液于该装置的载玻片上，并按前述步骤中的步骤(4)、(5)、(6)、(7)、(8)进行染色。染色结束，待载玻片自然晾干后，在光学显微镜在镜头放大1000倍的情况下，直观地观察细菌的颜色和形态。
图7所示结果中A-H视图依次分别对应101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL浓度下，采用本发明微生物染色方法观察到的表皮葡萄球菌染色结果。图7在不同浓度下二体样本下均观察到表皮葡萄球菌，说明本发明微生物染色方法不受样本中微生物含量的影响。
实施例6
与实施例5相同条件对不同浓度下的头状葡萄球菌的染色结果进行观察。
图8所示结果中A-H视图依次分别对应101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL浓度下，采用本发明微生物染色方法观察到的头状葡萄球菌染色结果。
实施例7
与实施例5相同条件对不同浓度下的溶血葡萄球菌的染色结果进行观察。
图9所示结果中A-H视图依次分别对应101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL浓度下，采用本发明微生物染色方法观察到的溶血葡萄球菌染色结果。
实施例8
与实施例5相同条件对不同浓度下的肺炎克雷伯氏菌的染色结果进行观察。
图10所示结果中A-H视图依次分别对应101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL浓度下，采用本发明微生物染色方法观察到的肺炎克雷伯氏菌染色结果。
实施例9
与实施例5相同条件，对不同浓度下的大肠杆菌的染色结果进行观察。
图11所示结果中A-H视图依次分别对应101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL浓度下，采用本发明微生物染色方法观察到的大肠杆菌染色结果。
实施例10
分别采用传统革兰氏染色法、细胞离心染色法和本发明微生物染色法(革兰氏染色为例)对临床细菌性脑膜炎患者脑脊液样本进行染色并观察，得到结果如表1所示。
表1
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种微生物染色方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
在液体样本中加入缓冲液和磁性材料孵育；
孵育结束后，使用磁铁分离，弃去上清液，加入无菌水重悬；
将在重悬液放置在磁场环境下的载玻片上，进行染色；
染色结束后，待载玻片自然晾干，取下载玻片离开磁场环境，载玻片可使用显微镜观察。
2.根据权利要求1所述的微生物染色方法，其特征在于，在将在重悬液放置在磁场作用下载玻片上之后，使用吸水纸将多余的水分吸走，吸水纸吸走水分后进行染色。
3.根据权利要求1或2所述的一种微生物染色装置，其特征在于，包括载玻片、磁性底座和固定器；
所述载玻片可拆卸地设置在磁性底座上，磁性底座给载玻片提供磁场环境，固定器将载玻片固定在磁性底座上。
4.根据权利要求3所述的微生物染色装置，其特征在于，所述磁性底座呈板状，载玻片与磁性底座按两层堆叠，固定器将按层设置的载玻片与磁性底座固定；
所述固定器呈U字型，U字型固定器的开口夹持载玻片与磁性底座。
5.根据权利要求4所述的微生物染色装置，其特征在于，所述U字型的固定器为两个，两个U字型的固定器在相对应的两侧分别夹持载玻片与磁性底座。
6.根据权利要求4所述的微生物染色装置，其特征在于，所述U字型的固定器使用硅胶材料制作。
7.根据权利要求4所述的微生物染色装置，其特征在于，所述磁性底座为磁铁。
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