CN116179392A - 枯草芽孢杆菌、用途、菌株的获得方法和菌剂的制备方法 - Google Patents

枯草芽孢杆菌、用途、菌株的获得方法和菌剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌，同时还涉及该枯草芽孢杆菌获取方法、含有该枯草芽孢杆菌的菌剂制备方法和应用，该枯草芽孢杆菌综合性能优异，一药同效，兼有防治植物真菌病害和细菌病害的功效，同时，其具备芽孢数量和产率高的优点，本申请根据该枯草芽孢杆菌菌株的特性，率先提出一种发酵培养基和发酵方法，该发酵培养基和发酵方法可以提高该枯草芽孢杆菌芽孢的产量和产率，以制备高效稳定的枯草芽孢杆菌产品。

Description

枯草芽孢杆菌、用途、菌株的获得方法和菌剂的制备方法
技术领域
本发明属于微生物培养和应用领域，尤其涉及一种在茶叶上分离得到的枯草芽孢杆菌。
背景技术
由于化学农药和化肥的大量长期使用，植物和微生物的生态环境发生了显著变化，农作物真菌和细菌病害常常混合发生，给病害防治带来巨大困难，农户不得不将杀真菌剂和杀细菌剂复配使用，进一步增加了农药残留和环境污染的风险。枯草芽孢杆菌是一种广泛应用的微生物源生物农药被提出，可以有效降低农药残留和环境污染的风险。
由于微生物在增殖生长过程中为适应环境进化的基因调控或表观遗传变异，使枯草芽孢杆菌菌株复杂多样，功能则从人体肠道和皮肤健康到促进植物生长和植物保护丰富多姿。
在植物保护领域，已经报道的枯草芽孢杆菌菌株有防治植物真菌病害的，也有防治植物细菌病害的，目前，没有发现同时兼有防治植物真菌病害和植物细菌病害的枯草芽孢杆菌菌株，因此，现有的枯草芽孢杆菌菌株制成的产品使用时受到的限制多，又不能与其它杀菌剂如杀细菌剂复配使用，使用效率低。所以筛选分离获得一株综合性能优异的枯草芽孢杆菌具有重要意义。
同时，微生物菌在发酵增殖过程中也有可能发生变异，这给微生物产品的规模化生产带来很大挑战，实时监控微生物发酵过程中的稳定性非常重要，对于枯草芽孢杆菌而言则是发酵生产的芽孢数量和产率，直接影响着枯草芽孢杆菌产品的质量。因此，研发一种适用于特殊枯草芽孢杆菌的发酵培养基和发酵方法，以提升芽孢数量和产率，具有重要价值。本申请新提出枯草芽孢杆菌发酵培养基和发酵方法可以有效提高该枯草芽孢杆菌芽孢的产量和产率，为菌剂的高质量生产提供重要保障。
发明内容
本发明是提供一种枯草芽孢杆菌TP-02-01(Bacillus subtilis TP-02-01)，同时还涉及该枯草芽孢杆菌获取方法、含有该枯草芽孢杆菌的菌剂制备方法和应用，该枯草芽孢杆菌通过定向培养基配方获得芽孢数量高且存活力强，用于植物真菌和细菌病害的防治效果更高。
本发明提供的技术方案是：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis TP-02-01)于2022年4月6日保藏在中国典型培养物保藏中，地址：中国武汉，保藏编号为CCTCC M 2022380，分类命名为枯草芽孢杆菌TP-02-01(Bacillus subtilisTP-02-01)。
一种枯草芽孢杆菌TP-02-01的应用，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TP-02-01的菌剂用于防治植物真菌和细菌病害，包括但不限于甜瓜白粉病，葡萄霜霉病，茶炭疽病，白术根腐病，三七根腐病，柑橘溃疡病，黄瓜细菌性角斑病，桃细菌性穿孔病，魔芋软腐病，茄子青枯病等。
一种枯草芽孢杆菌TP-02-01(Bacillus subtilis TP-02-01)的获得方法，包括以下步骤，
1)菌株分离筛选，从植物诱导抗性剂几丁聚糖喷雾处理的茶树上采集新叶于无菌袋中，用无菌刀片切取新叶组织，置于TP液体培养基中，在25-40℃摇瓶培养48小时后，将发酵液梯度稀释至105，取100μL稀释液均匀涂布于含有5％茶叶浸提液的PDA平板培养基上，静置5-10小时，以无菌棉签采集真菌孢子粉均匀抖落在平板培养基上，25-40℃下培养48小时，挑取产生显著抑菌圈的菌落，在TP固体培养基上划线纯化培养48小时，挑取单菌落采用平板对峙法进一步筛选出对植物病原真菌和细菌同时具有抑菌圈的菌株，在TP液体培养基中25-40℃下放大培养48小时，收取发酵液测试对植物真菌病害和细菌病害的防治效果，筛选得到防治真菌和细菌病害的微生物菌株；
2)菌种鉴定，从菌落形态、生理生化特征和16SrDNA分子生物学方法对菌株的种属信息进行鉴定，确认防治真菌和细菌病害的微生物菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis TP-02-01)，保藏编号为CCTCC M 2022380。
一种枯草芽孢杆菌TP-02-01(Bacillus subtilis TP-02-01)的发酵培养方法，包括以下步骤：
1)枯草芽孢杆菌TP-02-01，在TP固体培养基上于25-40℃下培养24-48h，挑取菌落接种到已灭菌的TP液体培养基三角瓶中，在25-40℃下培养24-48h，制得种子培养液；
2)按10％比例取步骤1所述的种子培养液接种到发酵罐在TP液体培养基中定向发酵培养，25-40℃下发酵培养48-72h，定向发酵培养过程中，采用拉曼特征光谱监控菌株发酵的稳定性；发酵液中枯草芽孢杆菌芽孢数量达到35亿个/ml以上，芽孢产率97％以上；
3)将发酵液制备成为枯草芽孢杆菌菌剂。
本发明中，进一步的说明，所述TP液体培养基的组成以g/L计由以下质量组分制成，葡萄糖3-5g，茶叶浸提液30-100ml，胰蛋白胨5-10g,酵母提取物5-10g，硫酸锰0.3g，氯化钠5-10g，pH调整到7.0±0.3；所述TP固体培养基的组成以g/L计由以下质量组分制成，葡萄糖3-5g，茶叶浸提液30-100ml，胰蛋白胨5-10g,酵母提取物5-10g，氯化钠5-10g，琼脂15g，pH调整到7.0±0.3。
本发明中，进一步的说明，所述枯草芽孢杆菌菌剂剂型包括但不限于水剂，微胶囊剂，可湿性粉剂或颗粒剂。
本发明中，进一步的说明，所述茶叶浸提液的主要成分包括但不限于，茶多酚16-25％，总儿茶素15-20％，游离氨基酸3-5％，L-茶氨酸1-2％。
本发明有益效果：
1、本发明首次从植物诱导抗性剂处理的新鲜茶叶中分离获得的具有同时防治植物真菌病害和细菌病害的枯草芽孢杆菌菌株，通过16SrDNA测序以及形态和生理生化特征分析，确定分离培养得到的枯草芽孢杆菌TP-02-01。
2、本发明的枯草芽孢杆菌TP-02-01根据分离获得场所的特点，将茶叶浸提液作为发酵培养基成分，发酵过程配以拉曼光谱实时监控，保证了发酵菌剂的可靠性和稳定性，发酵液中枯草芽孢杆菌芽孢数量达到35亿个/ml以上，芽孢产率97％以上。
3、本发明的枯草芽孢杆菌TP-02-01具有同时防治植物真菌和细菌病害的功效，一药多防，有助于减少了施药次数和用工强度。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌TP-02-01的菌落特征；
图2为枯草芽孢杆菌TP-02-01的芽孢特征；
图3为枯草芽孢杆菌TP-02-01的生理生化特点；
图4为枯草芽孢杆菌TP-02-01的拉曼特征光谱。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
实施例一
一种枯草芽孢杆菌，
所述枯草芽孢杆菌名为枯草芽孢杆菌TP-02-01(Bacillus subtilis TP-02-01)，
保藏单位：中国典型培养物保藏中心，
地址：中国武汉，
保藏编号：CCTCC M 2022380，
保藏时间：2022年4月6日。
一种枯草芽孢杆菌TP-02-01(Bacillus subtilis TP-02-01)的获得方法，
1)菌株分离筛选，从植物诱导抗性剂几丁聚糖喷雾处理的茶树上采集新叶于无菌袋中，用无菌刀片切取新叶组织，置于含有茶叶浸提液的TP液体培养基在30℃摇瓶培养48小时后，其中，所述茶叶浸提液的主要成分包括但不限于，茶多酚21％，总儿茶素17％，游离氨基酸3.5％，L-茶氨酸1.2％。
将发酵液稀释至105，取100μL稀释液均匀涂布于含有5％茶叶浸提液的PDA平板培养基上，静置5小时，以无菌棉签采集柑橘果实青霉菌孢子粉均匀抖落在平板培养基上，30℃下培养48小时，挑取产生显著抑菌圈的菌落，在TP培养基上划线纯化培养48小时，挑取单菌落采用对峙法进一步筛选出对模式植物病原真菌尖孢镰刀菌和细菌劳尔氏青枯菌同时具有抑菌圈的菌株，在TP液体培养基中30℃下培养48小时，盆栽测试发酵液对黄瓜镰刀菌枯萎病和辣椒青枯病的防治效果，筛选得到高效防治真菌和细菌病害的微生物菌株。
2)菌种鉴定，从菌落形态、生理生化特征和分子生物学方法对菌株的种属信息进行鉴定，确认高效防治真菌和细菌病害的微生物菌株为枯草芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC M2022380。
(1)菌株菌落形态特征
在LB养基上34℃培养48h后，菌落不规则，边缘不整齐，菌落平铺在平板上，中央有一个凸起，表面较干燥，无光泽，边缘不透明(如图1所示)。菌株细胞革兰氏染色镜检呈阳性，细胞杆状，有芽抱，芽孢椭圆形，中生或近中生，芽胞囊不明显膨大(如图2所示)。
(2)菌株生理生化特性如下表
项目 结果 项目 结果
厌氧生长 - V-P测定 +
硝酸盐还原 + 淀粉水解 +
明胶液化 + 柠檬酸盐利用 +
D-木糖产酸 + L-阿拉伯糖产酸 +
D-甘露醇产酸 + pH5.7生长 +
丙酸盐利用 - 7％氯化钠生长 +
(3)菌株分子生物学特征片段
菌株特定基因片段进行PCR扩增(引物27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R:5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)，回收扩增产物测序，
其16S rDNA序列结果如下：
GCAAGTCGAG CGGACAGATG GGAGCTTGCT CCCTGATGTT AGCGGCGGAC GGGTGAGTAACACGTGGGTA ACCTGCCTGT AAGACTGGGA TAACTCCGGG AAACCGGGGC TAATACCGGA TGGTTGTTTGAACCGCATGG TTCAGACATA AAAGGTGGCT TCGGCTACCA CTTACAGATG GACCCGCGGC GCATTAGCTAGTTGGTGAGG TAACGGCTCA CCAAGGCGAC GATGCGTAGC CGACCTGAGA GGGTGATCGG CCACACTGGGACTGAGACAC GGCCCAGACT CCTACGGGAG GCAGCAGTAG GGAATCTTCC GCAATGGACG AAAGTCTGACGGAGCAACGC CGCGTGAGTG ATGAAGGTTT TCGGATCGTA AAGCTCTGTT GTTAGGGAAG AACAAGTGCCGTTCAAATAG GGCGGCACCT TGACGGTACC TAACCAGAAA GCCACGGCTA ACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTA GGTGGCAAGC GTTGTCCGGA ATTATTGGGC GTAAAGGGCT CGCAGGCGGT TTCTTAAGTCTGATGTGAAA GCCCCCGGCT CAACCGGGGA GGGTCATTGG AAACTGGGGA ACTTGAGTGC AGAAGAGGAGAGTGGAATTC CACGTGTAGC GGTGAAATGC GTAGAGATGT GGAGGAACAC CAGTGGCGAA GGCGACTCTCTGGTCTGTAA CTGACGCTGA GGAGCGAAAG CGTGGGGAGC GAACAGGATT AGATACCCTG GTAGTCCACGCCGTAAACGA TGAGTGCTAA GTGTTAGGGG GTTTCCGCCC CTTAGTGCTG CAGCTAACGC ATTAAGCACTCCGCCTGGGG AGTACGGTCG CAAGACTGAA ACTCAAAGGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA GCGGTGGAGCATGTGGTTTA ATTCGAAGCA ACGCGAAGAA CCTTACCAGG TCTTGACATC CTCTGACAAT CCTAGAGATAGGACGTCCCC TTCGGGGGCA GAGTGACAGG TGGTGCATGG TTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGGGTTAAGTCCC GCAACGAGCG CAACCCTTGA TCTTAGTTGC CAGCATTCAG TTGGGCACTC TAAGGTGACTGCCGGTGACA AACCGGAGGA AGGTGGGGAT GACGTCAAAT CATCATGCCC CTTATGACCT GGGCTACACACGTGCTACAA TGGACAGAAC AAAGGGCAGC GAAACCGCGA GGTTAAGCCA ATCCCACAAA TCTGTTCTCAGTTCGGATCG CAGTCTGCAA CTCGACTGCG TGAAGCTGGA ATCGCTACTA ATCGCGGATC AGCATGCCGCGGTGAATACG TTCCCGGGCC TTGTACACAC CGCCCGTCAC ACCACGAGAG TTTGTAACAC CCGAAGTCGGTGAGGTAACC TTT
序列与GenBank数据库中已登录序列进行同源性比较，该菌株的16S rDNA序列与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)标准菌株DSM 10的同源性达99.64％。确定得到的菌株为枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌TP-02-01(Bacillus subtilis TP-02-01)
实施例二
一种枯草芽孢杆菌TP-02-01(Bacillus subtilis TP-02-01)的发酵培养方法，
取枯草芽孢杆菌TP-02-01菌株，在TP固体培养基上30℃培养48h，挑取菌落接种到已灭菌的TP液体培养基三角瓶中，在30℃下摇瓶培养24h，制得种子培养液；拉曼检测菌株细胞特征后，无菌抽取种子培养液70ml接种到10L发酵罐在TP液体培养基中发酵培养，30℃下发酵培养48h；拉曼检测菌株细胞特征后，无菌转移培养液7L接种到100L发酵罐在TP液体培养基中定向发酵培养，30℃下发酵培养72h，定向发酵培养过程中，采用拉曼特征光谱监控菌株发酵的稳定性，发酵液中枯草芽孢杆菌芽孢数量达到35亿个/ml以上，芽孢产率97％以上。发酵完成检测合格后，将发酵液造粒制备成为枯草芽孢杆菌微胶囊菌剂。
TP液体培养基的组成以g/L计由以下质量组分制成，葡萄糖5g，茶叶浸提液50ml，胰蛋白胨5g,酵母提取物10g，硫酸锰0.3g，氯化钠5g，pH7.1；
TP固体培养基的组成以g/L计由以下质量组分制成，葡萄糖5g，茶叶浸提液30ml，胰蛋白胨5g,酵母提取物10g，氯化钠5g，琼脂15g，pH6.9。
进一步的，上述茶叶浸提液的主要成分包括但不限于，茶多酚16-25％，总儿茶素15-20％，游离氨基酸3-5％，L-茶氨酸1-2％。
实施例三
枯草芽孢杆菌应用植物真菌和细菌病害包括但不限于甜瓜白粉病，葡萄霜霉病，茶炭疽病，白术根腐病，三七根腐病，柑橘溃疡病，黄瓜细菌性角斑病，桃细菌性穿孔病，魔芋软腐病，茄子青枯病等。
具体对比实验例一：
枯草芽孢杆菌TP-02-01(1亿CFU/克)防治白术根腐病(病原菌为尖孢镰刀菌或腐霉菌)
供试药剂：枯草芽孢杆菌TP-02-01(1亿CFU/克)微胶囊粒剂；
对照药剂：枯草芽孢杆菌(100芽孢/克)可湿性粉剂(市场购买的其它枯草芽孢杆菌产品)；
使用方法：灌根；
作物品种：白术；
种植情况：每亩种植3000株，不使用其他化学农药；
枯草芽孢杆菌TP-02-01(1亿CFU/克)防治白术根腐病对比
Figure SMS_1
划分小区：每个小区面积15平米，各处理随机区排列组合，重复4次，共计20个试验处理小区。
各处理施药的重量如下表
Figure SMS_2
Figure SMS_3
施药时间和次数，间隔10天一次，一共2次。
气温，平均气温23℃。
每小区随机5点取样，每点调查6株，以株为单位调查总株数、各级病株数量。
分级方法：
0级：植株茎基部和主根均无病斑；
1级：茎基部和主根上有少量病斑；
3级：茎基部或主根上病斑较多，病斑面积占茎和根总面积的四分之一到二分之一；
5级：茎基部和主根上病斑较多且大，病斑面积占茎基部和根总面积的二分之一到四分之三；
7级：茎基部或主根上病斑连片，形成绕茎现象，但根系并未死亡；
9级：根系坏死，植株地上部萎焉或者死亡。
药效计算：
病情指数＝〔∑(各级病株数×相对级数值)/调查总株数×9〕×100
防治效果(％)＝〔(CK-PT)/CK〕×100
其中：CK为空白对照区病情指数；
PT为药剂处理区病情指数；
枯草芽孢杆菌TP-02-01(1亿CFU/克)防治白术根腐病结果如下表：
Figure SMS_4
Figure SMS_5
结论：本发明菌株枯草芽孢杆菌TP-02-01有效成分含量1亿CFU/克防治白术根腐病与含量100亿/克的对比枯草芽孢杆菌药剂，同样稀释800倍，虽然本发明菌株的有效成分含量少了100倍，但防治白术根腐病的效果并无显著差异，本发明菌株有更强的防治根腐病的功效。
具体对比实验例二
枯草芽孢杆菌TP-02-01(1亿CFU/克)防治黄瓜细菌性角斑病(病原菌丁香假单胞菌Pseodomonas syringae)
供试药剂：枯草芽孢杆菌TP-02-01(1亿CFU/克)微胶囊粒剂；
对照药剂：枯草芽孢杆菌(10亿个/克)可湿性粉剂(市场购买的其它枯草芽孢杆菌产品)；
作物品种：黄瓜；
实验设计
Figure SMS_6
施药时间：于黄瓜细菌性角斑病发病初期；
施药方式：采用植株茎叶均匀喷雾施药；
调查方法：每个小区对角线五点取样，每点3株，调查全部叶片，以每片病斑面积占整个叶片面积百分率分级；
分级方法：
0级：无病斑；
1级：病斑面积占整个叶片面积的5％以下；
3级：病斑面积占整个叶片面积的6％-10％；
5级：病斑面积占整个叶片面积的11％-20％；
7级：病斑面积占整个叶片面积的21％-50％；；
9级：病斑面积占整个叶片面积的51％以上；。
药效计算：
病情指数＝〔∑(各级病株数×相对级数值)/调查总株数×9〕×100
防治效果(％)＝〔1-(CK0×PT1)/(CK1×PT0)〕×100
其中：CK0、CK1分别为空白对照区施药前、后的病情指数；
PT0、PT1分别为药剂处理区施药前、后的病情指数。
枯草芽孢杆菌TP-02-01(1亿CFU/克)微胶囊粒剂防治黄瓜细菌性角斑病效果如下表
Figure SMS_7
结论：本发明菌株枯草芽孢杆菌TP-02-01有效成分含量1亿CFU/克防治黄瓜细菌性角斑病与含量10亿个/克的防治细菌病害的对比枯草芽孢杆菌药剂比较，同等用量下，虽然本发明菌株的有效成分含量更少，但防治黄瓜细菌性角斑病的效果并无显著差异，本发明菌株有更强的防治细菌病害的功效。
本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 成都特普生物科技股份有限公司
<120> 枯草芽孢杆菌、用途、菌株的获得方法和菌剂的制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1403
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa 60
cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga 120
tggttgtttg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg 180
gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc 240
cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300
gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360
atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtgcc gttcaaatag 420
ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480
gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt 540
ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga 600
acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 660
ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag 720
cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 780
gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 840
agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900
atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat 960
cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020
ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080
cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140
gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac 1200
aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg 1260
cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctacta atcgcggatc agcatgccgc 1320
ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac 1380
ccgaagtcgg tgaggtaacc ttt 1403

Claims (8)

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，
所述枯草芽孢杆菌，保藏在中国典型培养物保藏中心；
地址：中国武汉；
保藏编号为CCTCC M 2022380；
分类命名为枯草芽孢杆菌TP-02-01(Bacillus subtilisTP-02-01)；
保藏时间：2022年4月6日。
2.一种枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌TP-02-01(Bacillussubtilis TP-02-01)的菌剂用于防治植物真菌和细菌病害。
3.一种枯草芽孢杆菌TP-02-01(Bacillus subtilis TP-02-01)的获得方法，其特征在于，
1)菌株分离筛选，从植物诱导抗性剂几丁聚糖喷雾处理的茶树上采集新叶于无菌袋中，用无菌刀片切取新叶组织，置于TP液体培养基中，在25-40℃摇瓶培养48小时后，将发酵液梯度稀释至105，取100μL稀释液均匀涂布于含有5％茶叶浸提液的PDA平板培养基上，静置5-10小时，以无菌棉签采集真菌孢子粉均匀抖落在平板培养基上，25-40℃下培养48小时，挑取产生显著抑菌圈的菌落，在TP固体培养基上划线纯化培养48小时，挑取单菌落采用平板对峙法进一步筛选出对植物病原真菌和细菌同时具有抑菌圈的菌株，在TP液体培养基中25-40℃下放大培养48小时，收取发酵液测试对植物真菌病害和细菌病害的防治效果，筛选得到防治真菌和细菌病害的微生物菌株；
2)菌种鉴定，从菌落形态、生理生化特征和分子生物学方法对菌株的种属信息进行鉴定，确认防治真菌和细菌病害的微生物菌株为枯草芽孢杆菌TP-02-01(Bacillus subtilisTP-02-01)，保藏编号为CCTCC M 2022380。
4.一种枯草芽孢杆菌TP-02-01(Bacillus subtilis TP-02-01)的发酵培养方法，其特征在于，
1)取权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，在TP固体培养基上于25-40℃下培养24-48h，挑取菌落接种到已灭菌的TP液体培养基三角瓶中，在25-40℃下培养24-48h，制得种子培养液；
2)按10％比例取步骤1所述的种子培养液接种到发酵罐在TP液体培养基中定向发酵培养，25-40℃下发酵培养48-72h，定向发酵培养过程中，采用拉曼特征光谱监控菌株发酵的稳定性；
3)将发酵液制备成为枯草芽孢杆菌菌剂。
5.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述植物真菌和细菌病害包括但不限于甜瓜白粉病，葡萄霜霉病，茶炭疽病，白术根腐病，三七根腐病，柑橘溃疡病，黄瓜细菌性角斑病，桃细菌性穿孔病，魔芋软腐病，茄子青枯病。
6.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌的获得方法，其特征在于：所述TP液体培养基的组成以g/L计由以下质量组分制成，葡萄糖3-5g，茶叶浸提液30-100ml，胰蛋白胨5-10g,酵母提取物5-10g，硫酸锰0.2-0.5g，氯化钠5-10g，pH调整到7.0+0.3；所述TP固体培养基的组成以g/L计由以下质量组分制成，葡萄糖3-5g，茶叶浸提液30-100ml，胰蛋白胨5-10g,酵母提取物5-10g，氯化钠5-10g，琼脂15g，pH调整到7.0+0.3。
7.根据权利要求4所述的发酵培养方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌菌剂剂型包括但不限于水剂，微胶囊剂，可湿性粉剂或颗粒剂。
8.根据权利要求6所述的发酵培养方法，其特征在于：所述茶叶浸提液的主要成分包括但不限于，茶多酚16-25％，总儿茶素15-20％，游离氨基酸3-5％，L-茶氨酸1-2％。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110172428A (zh) * 2019-06-11 2019-08-27 山东碧蓝生物科技有限公司 一种具有抗病及提高果实品质的枯草芽孢杆菌及其应用
CN110520519A (zh) * 2015-09-02 2019-11-29 拜生百嘉有限责任公司 细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种bs89作为提高植物生产力和防止植物疾病的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110520519A (zh) * 2015-09-02 2019-11-29 拜生百嘉有限责任公司 细菌菌株解淀粉芽孢杆菌植生亚种bs89作为提高植物生产力和防止植物疾病的方法
CN110172428A (zh) * 2019-06-11 2019-08-27 山东碧蓝生物科技有限公司 一种具有抗病及提高果实品质的枯草芽孢杆菌及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ASAKA, MASASHI, ET AL.: "An increase in antibacterial activity of green tea infusion by heat-treatment", NIPPON SHOKUKIN KAGAKU KOGAKU KAISHI, vol. 47, no. 9, 31 December 2000 (2000-12-31) *

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