CN116173093B - 杜仲雄花提取物在制备抗肌肉衰老的食品或药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了杜仲雄花提取物在制备抗肌肉衰老的食品或药物中的应用，属于植物提取物技术领域。杜仲雄花提取物主要活性成分为环烯醚萜类，其组成包括桃叶珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸和车叶草苷。本发明首次报道杜仲雄花提取物及其含有的环烯醚萜类化合物具有线粒体自噬激活活性，通过有效刺激线粒体自噬而维持线粒体功能正常。该提取物具有较强的预防或缓解衰老相关肌肉功能减退能力，在食品、药品等领域中具有极大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取物技术领域，具体涉及含环烯醚萜类成分的杜仲雄花提取物在制备抗肌肉衰老的食品(包括宠物食品)或药物中的应用。
背景技术
骨骼肌是人体运动系统的动力，其衰老是机体衰老的重要标志。作为脊椎动物中最丰富的塑性器官，它在新陈代谢、运动、呼吸、保护、日常身体活动以及保持姿势、平衡方面发挥着重要作用。2016年肌肉减少症(特征是渐进性和全身性的骨骼肌质量和功能丧失)被正式确认为一种疾病，代码ICD-10-CM(M62.84)，引起了人们对这种年龄相关疾病的额外关注。其中衰老相关肌肉功能下降是肌肉减少症发生、发展的重要特征。
肌肉减少症，尤其是衰老相关的肌肉功能下降与骨骼肌的线粒体功能障碍密切相关。清除功能障碍线粒体以维持衰老过程中线粒体稳态主要通过线粒体特异性自噬方式，即线粒体自噬进行。但线粒体自噬活性在肌肉衰老过程中会降低。这些都表明了线粒体自噬对衰老过程中肌肉功能维持的重要性。近年来，研究表明，通过施用单一天然化合物(如尿石素A、亚精胺、番茄碱)来增强线粒体自噬，对老化的骨骼肌、心脏和神经元产生有益影响(Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C.elegans andincreases muscle function in rodents,Nat Med 2016；22:879-88.Mitophagyinhibits amyloid-βand tau pathology and reverses cognitive deficits in modelsof Alzheimer’s disease,Nat Neurosci 2019；22:401-12.Cardioprotection andlifespan extension by the natural polyamine spermidine,Nat Med 2016；22:1428-38.Tomatidine enhances lifespan and healthspan in C.elegans through mitophagyinduction via the SKN-1/Nrf2 pathway,Sci.Rep 2017；7:46208.)。这些研究表明线粒体自噬增强剂可能为预防和缓解衰老肌肉功能减退提供新的选择。
天然产物尤其植物化学素是线粒体自噬调节和抗肌肉衰老活性化合物的潜在来源。近年来，食用花卉成为食物资源消费和植源性天然产物开发的新趋势之一。突出的是，食用花卉资源具有潜在的延缓衰老及其相关疾病价值。作为我国卫生部批准的一种新食品原料，杜仲雄花(male flowers of Eucommia ulmoides Oliver)具有降血脂、抗肥胖、抗氧化、抗疲劳等生理活性。作为杜仲雄花主要的功能活性成分，环烯醚萜类化合物在传统中药中分布广泛，包括杜仲科、茜草科等植物，具有抗炎、抗肥胖、抗菌、抗肿瘤、神经保护等药理作用，也是中药中重要的一类质控成分。但是，杜仲雄花及其功能活性成分对肌肉衰老及其相关功能减退的预防和缓解作用未见报道。
发明内容
本发明的目的在于挖掘杜仲雄花在预防和缓解骨骼肌衰老功效方面的新功能，并对杜仲雄花中的有效成分进行提取，以填补目前杜仲雄花提取物在上述功效和功效成分的研究空缺。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明利用秀丽隐杆线虫对30种国内常见食用花卉进行筛选发现，杜仲雄花提取物有效延长了线虫健康寿命，尤其是改善了年龄相关的肌肉功能下降。利用高分辨质谱定性、定量分析表明，上述杜仲雄花提取物中主要抗衰老活性成分为环烯醚萜类，包括车叶草苷、桃叶珊瑚苷、京尼平苷和京尼平苷酸。利用体外人源mt-Keima HEK 293T细胞，发现这些环烯醚萜类具有线粒体自噬激活活性。进一步地，在哺乳动物模型上明确了杜仲雄花提取物对衰老相关肌肉功能减退的预防和缓解作用。
因此，本发明提供了杜仲雄花提取物在制备预防或缓解衰老相关肌肉功能减退的食品或药物中的应用，所述杜仲雄花提取物中活性成分包括环烯醚萜类化合物。
所述食品包括人类食品和宠物食品。
所述杜仲雄花提取物为利用有机溶剂水溶液或纯水溶液对杜仲雄花进行浸提后获得的主要活性成分为环烯醚萜类的提取物。具体的，浸提温度为20～65℃。
进一步的，所述环烯醚萜类化合物包括桃叶珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸、车叶草苷中的一种或多种。
所述预防或缓解衰老相关肌肉功能减退包括改善骨骼肌质量、骨骼肌力量、线粒体功能和机体运动能力。本发明通过线虫和小鼠体内实验对杜仲雄花提取物进行功效研究，该提取物能够改善骨骼肌质量、力量、线粒体功能和机体运动能力等，表明其具有预防或缓解衰老相关肌肉功能减退等抗肌肉衰老功效。
所述衰老相关肌肉功能减退与骨骼肌的线粒体功能障碍密切相关，相关疾病包括肌肉减少症。
进一步的，所述杜仲雄花提取物通过激活肌肉细胞线粒体自噬活性、促进ATP的合成和/或维持线粒体形态的正常来改善线粒体功能以延缓肌肉功能减退。杜仲雄花提取物通过改善骨骼肌的线粒体功能以延缓肌肉衰老。
本发明对杜仲雄花中线粒体自噬活性成分进行鉴定，明确杜仲雄花提取物中的主要线粒体自噬增强活性成分为环烯醚萜类，包括车叶草苷、桃叶珊瑚苷、京尼平苷和京尼平苷酸。为了保证提取物中含有上述活性成分，本发明以杜仲雄花环烯醚萜成分易溶于水的性质为指导对提取方法进行具体规定。
所述杜仲雄花提取物的制备方法包括以下步骤：
(1)将杜仲雄花干制品按照1g：20mL～60mL的料液比加入到体积比为0％～90％的有机溶剂水溶液中，于20～65℃条件下浸提，分离得到萃取液；
(2)去除萃取液中有机溶剂，再加水充分复溶后分离得到提取液，干燥后制得杜仲雄花提取物。
所述杜仲雄花指杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)雄株树花蕊。
本发明采用的原料为杜仲雄花干制品，指新鲜杜仲雄花或普通晒干杜仲雄花经干燥至水分含量不超过10％的一类原料。原料可进行粉碎预处理，也可不经过粉碎预处理。优选的，对杜仲雄花干制品进行粉碎，有利于活性物质的溶出。
步骤(1)中，通过控制料液比、提取温度以及原料含水量，综合实现较高的提取率。
优选的，所述杜仲雄花干制品的含水量≤10％，料液比为1g：40mL。
本发明采用的提取剂可以为含有剂溶剂的水溶液，也可以为纯水。优选的，所述有机溶剂为乙醇、甲醇或正丁醇，有机溶剂水溶液的体积比浓度为65％～80％。
优选的，浸提的温度为45～60℃，浸提的时间为20～30h。
优选的，浸提过程中结合超声处理，超声条件为：超声频率200～500kHz，超声强度5～15W/cm2，时间为1.5～3.0h，超声结束后静置。
步骤(2)中，利用减压蒸发去除有机溶剂，得到浓缩液，加入浓缩萃取液体积的5～15倍水充分复溶后，过滤分离得到提取液，再经冷冻干燥后得到杜仲雄花提取物。
由上述方法制备得到的杜仲雄花提取物的活性成分以车叶草苷、桃叶珊瑚苷、京尼平苷和京尼平苷酸为主。其中车叶草苷的重量含量为0.05％～5.0％；桃叶珊瑚苷的重量含量为0.05％～10.0％；京尼平苷的重量含量为0.1％～5.0％；京尼平苷酸的重量含量为0.1％～10.0％。考虑到杜仲雄花提取物及其主要活性成分环烯醚萜类化合物具有预防和缓解衰老相关肌肉功能障碍等抗肌肉衰老功效，因此可用于制备相关的食品和药品。
所述食品为具有预防或缓解衰老相关肌肉功能减退功效的功能性食品或饮品。将所述杜仲雄花提取物或其主要活性成分配以食品上可接受的辅料或辅助性成分制备成功能性食品或饮品。
所述药品为具有预防或缓解衰老相关肌肉功能减退功效的药物制剂。将所述杜仲雄花提取物或其主要活性成分配以药品上可接受的辅料或辅助性成分制备成药物制剂。所述制剂可以为片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液或缓释剂等。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明首次报道杜仲雄花提取物及其含有的车叶草苷、桃叶珊瑚苷、京尼平苷和京尼平苷酸具有线粒体自噬激活活性，这些成分能有效刺激线粒体自噬而维持线粒体功能正常。该提取物具有较强的预防或缓解衰老相关肌肉功能减退能力，在人类食品、宠物食品、药品等领域中具有极大的应用前景。
(2)通过本发明技术实现了杜仲雄花中延缓肌肉衰老功效成分的有效提取，严格控制原料含水量以及浸提条件以提高提取物得率，进一步的，在浓缩萃取液后，增加复溶工艺有助于水溶性的杜仲雄花环烯醚萜成分溶解，增加其含量，得到的杜仲雄花提取物质量好、品质稳定，并且工艺操作简便，对生产设备要求较低，利于产业化发展。
附图说明
图1为实施例1中杜仲雄花提取物总离子流图，其中A为阴离子模式，B为阳离子模式。
图2为提取物中车叶草苷的二级质谱图，其中A为阴离子模式，B为为阳离子模式。
图3为提取物中桃叶珊瑚苷的阴离子模式下二级质谱图。
图4为提取物中京尼平苷的阳离子模式下二级质谱图。
图5为提取物中京尼平苷酸的二级质谱图，其中A为阴离子模式，B为阳离子模式。
图6为提取物中环烯醚萜类成分定量谱图，1-桃叶珊瑚苷，2-京尼平苷，3-京尼平苷酸，4-车叶草苷。其中A为标准品溶液，B为提取物样品溶液。
图7为提取物中环烯醚萜类成分的结构式。
图8为杜仲雄花提取物组和载体组饲喂线虫1,5,9天后运动状态变化图，其中Vehicle表示载体组，EUFE表示杜仲雄花提取物组，下同。
图9为杜仲雄花提取物组和载体组饲喂线虫1,5,9天后运动平均速率变化图。
图10为杜仲雄花提取物组和载体组饲喂线虫1和5天后体壁肌纤维形态变化图。
图11为杜仲雄花提取物组和载体组饲喂线虫9天后肌肉线粒体形态变化图。
图12为杜仲雄花提取物组、载体组、阳性对照组饲喂线虫1天肌肉线粒体自噬活性变化图。
图13为车叶草苷体外激活线粒体自噬图。
图14为杜仲雄花环烯醚萜类成分线粒体自噬激活活性比较图，其中，Asp-车叶草苷，Auc-桃叶珊瑚苷，Gen-京尼平苷，Gen a-京尼平苷酸。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例中采用的原料杜仲雄花购自湖南张家界，统一经40℃烘制24h以上。
定量分析和活性例中采用的杜仲雄花环烯醚萜单体成分车叶草苷(CAS：14259-45-1)、桃叶珊瑚苷(CAS：479-98-1)、京尼平苷(CAS：24512-63-8)和京尼平苷酸(CAS：27741-01-1)购自成都植标化纯生物技术有限公司，纯度均≥98％。
实施例1
1、杜仲雄花提取物的制备
制备方法：将1kg干燥的水分含量≤10％(按照GB 5009.3-2016直接干燥法进行测定，若不符合水分含量要求则继续40℃烘制干燥)的杜仲雄花花蕊按1g：40mL料液比，加入80％(v/v)的乙醇水溶液，控制温度为45℃，于超声频率400kHz，超声强度10W/cm2，进行浸提2h以充分萃取并静置24h。
通过离心将萃取液与沉淀物分离。通过减压蒸发回收乙醇，得到浓缩液。再加入浓缩液体积的10倍水后，搅拌充分进行复溶，通过离心将提取液与不溶物分离，提取液经冷冻干燥后即得到杜仲雄花提取物。
2、对所得提取物进行定性、定量分析
1)提取物的定性分析—UPLC-QE高分辨质谱
通过UPLC-QE高分辨质谱仪对提取物进行成分定性分析。测定条件为ACQUITY BEHC18柱(2.1mm×100mm，1.7μm，Waters)用于UPLC分析，柱温为40℃，流速为0.4mL/min，流动相为0.1％甲酸水溶液(A)和0.1％甲酸-乙腈溶液(B)。流动相的梯度程序如下：0min(A:B＝95:5)、3min(A:B＝75:25)、4min(A:B＝35:65)和10min(A:B＝35:65)。进样量为10μL。QE在正负离子模式下工作。操作参数设定为：锥电压30v，毛细管电压2kv，源温度100℃。在95～1400的质荷比(m/z)范围内记录数据，扫描时间为0.25s，扫描间隔为0.02s，持续10min。在此基础上，结合质谱数据库Compound DiscovererTM检索匹配和文献查询，确定可能的成分。
2)提取物中环烯醚萜成分的定量分析—UPLC-PDA色谱
通过配备PDA检测器二等HPLC色谱仪对提取物进行环烯醚萜成分定量分析。测定条件为进样量为10μL，反相ODS-2Hypersil C18柱(4.6nm×250nm，5μm，Thermo FisherScientific)用于HPLC分析，柱温为30℃，流速为1mL/min，流动相为0.5％磷酸水溶液(A)和甲醇(B)。流动相梯度程序如下：0min(A:B＝95:5)、30min(A:B＝85:15)和55min(A:B＝70:30)。
使用UHPLC-QE-MS在阴、阳离子模式下对杜仲雄花上述提取物进行了定性分析，图1为相应的总离子流图。其中杜仲雄花环烯醚萜共鉴定出四种，包括车叶草苷、桃叶珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸，它们的二级质谱图分别为图2-5。其中桃叶珊瑚苷特征性二级质谱碎片只在阴离子模式下鉴定出(图3)，京尼平苷特征性二级质谱碎片只在阳离子模式下鉴定出(图4)。进一步的，通过HPLC对这四种环烯醚萜成分进行了定量分析。标准溶液和提取物样品溶液的HPLC色谱图分别如图6A和6B所示。需要强调的是，桃叶珊瑚苷在236nm处几乎没有吸收，而206nm是对其定量的合适的紫外吸收设置条件。结果表明，京尼平苷酸含量最高，为6.39±0.33％，桃叶珊瑚苷含量为6.05±0.22％，京尼平苷含量为1.85±0.16％，车叶草苷含量最低，为0.56±0.01％。上述四种环烯醚萜类成分的结构式如图7所示。
活性检测例1
通过模式生物秀丽隐杆线虫饲喂100μg/mL实施例1中杜仲雄花提取物(缩写为EUFE)，和载体(水)对照比较自然衰老情况下(1，5，9天)线虫运动能力和体壁肌纤维形态变化。具体方法如下：
1、运动能力：线虫在转移前，人为记录线虫的运动状态如下：自主移动，记为A，仅在被触摸后移动，记为C，A和C之间的状态，记为B。然后将属于A状态的线虫挑到空白板上并进行视频拍摄。使用WormLab分析平均移动速度。对于每个实验，每组至少包含30条蠕虫。通过结合这两个指标更准确地描述线虫运动能力。
结果如图8、9所示，与载体相比，EUFE处理9天后，更多的线虫群体(A状态)能够自主移动，并且它们的平均移动速度明显更快。
2、体壁肌纤维形态：线虫RW1596株系在明场(BF)和GFP通道(激发和发射波长分别为488nm和510～540nm)下进行体壁肌纤维形态观察用载体或100μg/mL EUFE预处理蠕虫1天和5天，使用含有5mM左旋咪唑的M9缓冲液对不同组别线虫进行麻醉，并将其放置在薄载玻片上1％琼脂糖胶上。使用配备40x水浸物镜的Zeiss LSM 880共聚焦显微镜分别拍摄线虫头部、中间和尾部。
结果如图10所示，对于体壁肌纤维形态，第1天两组线虫的头、中、尾部体壁肌纤维组织完整，排列有序。然而，到第5天，如红色箭头所示，载体组的线虫在头部、中部和尾部均出现明显的断裂、缺失或排列紊乱。相比之下，EUFE处理组线虫的肌肉形态保持相对良好的状态。
活性检测例2
杜仲雄花提取物饲喂对线虫体壁肌细胞中线粒体健康和线粒体自噬活性影响研究。具体方法如下：
1、线粒体形态：野生型线虫用载体或EUFE处理9天。收集和清洁后，制备透射电镜样品。使用2.5％戊二醛过夜固定线虫。固定后，用0.1M，pH 7.4磷酸盐缓冲液冲洗样品，用1％四氧化锇后固定1～2h，再用缓冲液冲洗。然后用乙醇系列梯度浓度和丙酮脱水，浸入丙酮和Spurr包埋剂的混合物中，然后嵌入100％Spurr包埋剂中过夜。在70℃下固化36小时。用超薄切片机进行超薄切片(70～90nm)并转移到200目铜网格上。网格用柠檬酸铅和乙酸双氧铀(50％(v/v)乙醇中的饱和溶液)染色。切片由日立H-7650透射电镜观察。
结果如图11所示，载体组线虫生长9天后，它们的肌肉线粒体外膜出现缺陷，线粒体脊出现减少和模糊。相反，EUFE处理很好地保持了线粒体形态。
2、线粒体自噬活性：线虫IR1511株系用于线粒体自噬检测，这株系在体壁肌肉中表达GFP标记的DCT-1和DsRed标记的LGG-1。GFP和DsRed的共定位表明线粒体与溶酶体的融合，即线粒体自噬的发生。DsRed用561nm激光激发。载体和EUFE的处理时间均为1天，CCCP(羰基氰酯-3-氯苯基腙)是一种线粒体自噬诱导剂作为阳性对照。使用配备83x油浸物镜的Zeiss LSM 880共聚焦显微镜进行拍摄。
通过使用IR1511株系，如图12所示，与线粒体自噬诱导剂CCCP一致地，EUFE处理1天增加了线虫体壁肌肉中LGG-1的表达。更重要的是，EUFE增加了LGG-1与DCT-1的共定位，表明增强线粒体自噬活性。DCT-1(NIX/BNIP3L同源物)位于线粒体外膜，是线粒体自噬的关键调节因子。
活性检测例3
杜仲雄花环烯醚萜类成分包括车叶草苷、桃叶珊瑚苷、京尼平苷和京尼平苷酸体外激活线粒体自噬活性研究。具体方法如下：
按正常细胞培养、传代方式培养293T细胞，于24孔板接种，每孔接种0.5mL，细胞密度为5×104cell/mL，共计接入2.5×104cell，接板前把离心管里的细胞吹打均匀，以保证开始和最后的细胞密度一致，静置5～10分钟后，轻轻放置培养箱中。隔夜后，移走原完全培养基，每孔加入含有1.5×105TU慢病毒完全培养基溶液0.3mL，37℃培育8h后每孔补200μL完全培养基。转染24h后更换培养基至细胞密度达到80-90％后消化传代到T25瓶中。长满后用荧光显微镜观察转染效率。使用含0.5μg/mL嘌呤霉素盐酸盐溶液的完全培养基筛选转染成功的细胞，并用0.25μg/mL进行维持，即获得mt-Keima细胞。
共聚焦皿每皿接种1mL，细胞密度为2×105cell/mL，静置5～10min后，轻轻放置培养箱中。待细胞长至30～40％给药。用10μM不同杜仲雄花环烯醚萜单体成分或10μM CCCP处理mt-Keima细胞6h后，换成新鲜完全培养基后直接进行活细胞共聚焦观察。共聚焦参数：激发波长分别为440nm和596nm，发射波长为620nm，40X水镜观察。
结果如图13和图14所示，CCCP阳性药物处理显著引起293T细胞线粒体自噬的发生。杜仲雄花中以车叶草苷为代表单体成分同样也具有线粒体自噬激活活性。且通过平均荧光密度比值比较，同浓度下车叶草苷效果优于其他三种单体成分。结合杜雄雄花提取物可能通过线粒体自噬活性激活改善线粒体功能以延缓肌肉衰老，因此上述具有线粒体自噬激活活性的环烯醚萜类成分是杜仲雄花提取物发挥预防或缓解肌肉衰老功效的主要活性成分。
活性检测例4
杜仲雄花提取物饲喂18月龄ICR老年小鼠延缓其肌肉功能减退活性研究。具体方法如下：
购买自华东师范大学动物研究中心的18月龄ICR雄性老年小鼠单笼饲养和5～6月龄BALB/c雄性年轻小鼠合笼饲养在无特定病原体的浙江中医药动物房中。在此期间，小鼠可以自由进食和饮水。动物房的暗/光循环为12小时，温度和湿度分别保持在23±2℃和50％±5％。本实验中的所有程序和方案均经浙江中医药大学动物伦理委员会标准批准。
小鼠适应两周后，将小鼠分为以下五组，包括年轻小鼠组、对照老年组、杜仲雄花提取物低、中、高处理组(分别灌胃给药，25,50，100mg/kg/d)，每组小鼠8只。其中，年轻小鼠组和对照组用等体积生理盐水灌胃。除年轻小鼠组饲喂正常标准饲料外，其余四组小鼠饲喂42％高脂饲料。
1)骨骼肌质量：干预各组小鼠3个月后，经处死小鼠，小心切除各组小鼠左后肢四块肌肉，包括腓肠肌(GA)、比目鱼肌(SOL)、胫骨前肌(TA)和趾长伸肌(EDL)，分别进行称重。
2)前肢握力：干预过程中，每月训练小鼠抓住水平放置的抓力计单杠，并轻轻向后拉，直到它们无法抵抗拉力并释放单杠。力由测力计记录。
3)力竭跑步时间：训练小鼠在跑步机上以10m/min的速度和0°进行自适应跑步两天。第三天，进行了详尽的跑步测试。以5m/min开始，坡度角为0°，然后速度和坡度角每5min增加5m和5°，直至分别达到20m/min和14°。当小鼠超过20秒没有返回轨道并且表现出对外部刺激的反应明显减弱时，记录详尽的跑步时间。
结果见表1-3。
表1杜仲雄花提取物对自然衰老小鼠骨骼肌质量的变化影响(n＝8)
注：*表示为老年对照组与年轻组比较，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001；
#表示为实施例1低、中、高剂量组与老年对照组比较，#代表P<0.05，##代表P<0.01，###代表P<0.001；
下同。
表2杜仲雄花提取物对自然衰老小鼠前肢握力的变化影响(n＝8)
表3杜仲雄花提取物对自然衰老小鼠力竭跑步时间的变化影响(n＝8)
如表1所示，比目鱼肌(SOL)和趾长伸肌(EDL)受衰老和高脂饮食影响变化较小，而腓肠肌(GA)和胫骨前肌(TA)受衰老和高脂饮食影响变化较大。老年小鼠呈现了质量减少的趋势。实施例1的杜仲雄花提取物干预预防了上述肌肉类型质量的减少，并且呈现剂量依赖性。如表2和表3所示，除了骨骼肌质量外，骨骼肌功能随着衰老也出现了下降，具体表现为衰老小鼠高脂饮食干预三个月后，前肢握力和力竭跑步时间出现明显的下降。而低、中、高剂量的实施例1杜仲雄花提取物干预均能预防骨骼肌上述功能的下降。因此，杜仲雄花提取物具有预防衰老相关肌肉功能减退的功效。
活性检测例5
杜仲雄花提取物饲喂18月龄ICR老年小鼠对其肌肉ATP含量影响研究。具体方法如下：
采用碧云天公司生产的ATP检测试剂盒进行ATP含量的检测。按照每20mg胫骨前肌(TA)组织加入约100～200μL裂解液，然后用进行匀浆。充分匀浆以确保组织被完全裂解。裂解后4℃，12000g离心5min，取上清，用于后续的测定。标准曲线测定的准备：冰浴上融解待用试剂，把ATP标准溶液用ATP检测裂解液稀释成适当的浓度梯度。具体的浓度需根据组织样品中ATP的浓度而定。ATP检测工作液的配制：按照每个样品或标准品需100μL ATP检测工作液的比例配制适当量ATP检测工作液。把待用试剂在冰浴上融解。取适量的ATP检测试剂，按照1:9的比例用稀释液稀释上述检测试剂。加100μL ATP检测工作液到检测管内。室温放置3～5min，以使本底性的ATP全部被消耗掉，从而降低本底。在检测管内加上20μL样品或标准品，迅速用枪(微量移液器)混匀，至少间隔2秒后，用化学发光仪测定RLU值。根据标准曲线换算相应ATP含量。结果见表4。
表4杜仲雄花提取物对自然衰老小鼠胫骨前肌中ATP含量变化影响(n＝8)
注：*表示为老年对照组与年轻组比较，***代表P<0.001；
#表示为实施例1低、中、高剂量组与老年对照组比较，###代表P<0.001。
线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所，为细胞的活动提供了化学能量。骨骼肌中ATP的含量一定程度上反映了该组织中线粒体功能正常水平。如表4所示，老年小鼠经衰老和高脂饮食影响，胫骨前肌中ATP含量减少，而杜仲雄花提取物干预有效预防了ATP的减少，表明杜仲雄花提取物能有效预防衰老过程中骨骼肌线粒体功能的下降。
活性检测例6
杜仲雄花提取物饲喂d-半乳糖诱导的5～6月龄ICR衰老小鼠缓解其肌肉功能减退活性研究。具体方法如下：
购买自华东师范大学动物研究中心的5～6月龄ICR雄性年轻小鼠饲养在无特定病原体的浙江中医药动物房中。在此期间，小鼠可以自由进食和饮水。动物房的暗/光循环为12小时，温度和湿度分别保持在23±2℃和50％±5％。本实验中的所有程序和方案均经浙江中医药大学动物伦理委员会标准批准。
小鼠适应两周后，将小鼠分为以下五组，包括对照组、模型组、经造模后杜仲雄花提取物低、中、高干预组(分别灌胃给药，25，50，100mg/kg/d)，每组小鼠8只。其中，对照组用等体积生理盐水灌胃。所有小鼠饲喂标准饲料。造模方法为进行d-半乳糖诱导衰老造模，给予d-半乳糖(60mg/kg体重/天，腹膜内0.5mL)1.5个月。杜仲雄花提取物干预上述衰老小鼠模型3个月后，进行活性检测例4和5各指标的测定。结果见表5-8。
表5杜仲雄花提取物对d-半乳糖诱导的衰老小鼠骨骼肌质量的变化影响(n＝8)
注：*表示为老年对照组与年轻组比较，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001；
#表示为实施例1低、中、高剂量组与老年对照组比较，#代表P<0.05，##代表P<0.01，###代表P<0.001；
下同。
表6杜仲雄花提取物对d-半乳糖诱导的衰老小鼠前肢握力的变化影响(n＝8)
表7杜仲雄花提取物对d-半乳糖诱导的衰老小鼠力竭跑步时间的变化影响(n＝8)
表8杜仲雄花提取物对d-半乳糖诱导的衰老小鼠胫骨前肌中ATP含量变化影响(n＝8)
实验数据表5～8显示，d-半乳糖诱导的骨骼肌质量减少主要体现在腓肠肌(GA)、胫骨前肌(TA)、比目鱼肌(SOL)上，其中比目鱼肌质量减少与自然衰老情况下有所不同。实施例1制备的杜仲雄花提取物能有效减少腓肠肌(GA)、胫骨前肌(TA)、比目鱼肌(SOL)的损失。对于骨骼肌功能，杜仲雄花提取物低、中、高剂量干预能改善d-半乳糖诱导的前肢握力和力竭跑步时间的降低。同样地，杜仲雄花提取物低、中、高剂量干预改善了d-半乳糖诱导的小鼠胫骨前肌中ATP含量的下降。因此，杜仲雄花提取物具有缓解衰老相关肌肉功能减退的功效。
应用例1固体饮料制备
杜仲雄花提取物34.9％(实施例1所制)，木糖醇40％，低聚果糖5％，菊粉5％，麦芽糊精15％，柠檬酸0.1％。
其制备方法按照如上配方，依次进行如下步骤：
(1)按照上述配方比例称重、混料并均匀搅拌，干燥至水分含量≤5％，得到杜仲雄花提取物固体饮料制品。其余物料均为市售的质量合格产品。
(2)将搅拌均匀的物料定量包装后进行微波杀菌。其中微波杀菌频率为2000MHz，杀菌过程中饮料的温度控制在65℃，杀菌时间根据饮品流量及微波功率而定，灭菌后饮品菌落总数和酵母菌含量均不超过国标规定。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联系到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (2)
1.杜仲雄花提取物在制备预防或缓解衰老相关肌肉减少症的药物中的应用，其特征在于，所述杜仲雄花提取物的制备方法包括以下步骤：
(1)将杜仲雄花干制品按照1 g：40 mL的料液比加入到体积比浓度为80%的乙醇水溶液中，于45℃条件下浸提，浸提过程中结合超声处理，超声条件为：超声频率400 kHz，超声强度10 W/cm2，时间为2 h，超声结束后静置24 h，分离得到萃取液；
(2)去除萃取液中有机溶剂，再加水充分复溶后分离得到提取液，干燥后制得杜仲雄花提取物；
杜仲雄花提取物中活性成分包括环烯醚萜类化合物，所述环烯醚萜类化合物包括桃叶珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸、车叶草苷。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述杜仲雄花干制品的含水量≤10%。
Priority Applications (2)
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| CN202210883992.1A CN116173093B (zh) | 2022-07-26 | 2022-07-26 | 杜仲雄花提取物在制备抗肌肉衰老的食品或药物中的应用 |
| PCT/CN2023/098531 WO2024021876A1 (zh) | 2022-07-26 | 2023-06-06 | 杜仲雄花提取物在制备抗肌肉衰老的食品或药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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| 杜仲雄花主要形态及活性成分多样性研究;杜庆鑫;《中国优秀硕士论文全文数据库（电子期刊）》(第第02期期);正文第7页 * |
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