CN116157508A - 活细胞分离系统 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供从来自生物体的组织中简便且稳定地分离各种活细胞的系统。通过提供用于从来自生物体的组织中分离活细胞的系统，从而解决了上述课题，所述系统具备：细切部，其基于参数对来自生物体的组织进行细切；测定部，其取得与被细切的来自生物体的组织有关的信息；和分析部，其根据由测定部取得的信息，算出杂质相对于被细切的来自生物体的组织而言的比例。

Description

活细胞分离系统

技术领域

本发明涉及用于从来自生物体的组织中分离活细胞的系统。

背景技术

近年来，为了修复损伤的组织等，进行了移植各种细胞的尝试。例如，为了修复因心绞痛、心肌梗塞等缺血性心脏病而损伤的心肌组织，尝试了利用胎儿心肌细胞、骨骼肌成肌细胞、间充质干细胞、心脏干细胞、ES细胞、iPS细胞等(非专利文献1)。

作为这样的尝试的一环，开发了：利用支架而形成的细胞结构物；将细胞形成为片状而得的片状细胞培养物(非专利文献2)。

关于片状细胞培养物在治疗中的应用，进行了下述研究：培养表皮片在由烧伤等引起的皮肤损伤中的利用、角膜上皮片状细胞培养物在角膜损伤中的利用、口腔黏膜片状细胞培养物在食道癌的内镜下的切除中的利用等，其中一部分已进入临床应用的阶段。

这样的治疗中使用的骨骼肌成肌细胞通常从要移植的对象的骨骼肌组织中分离骨骼肌成肌细胞等CD56阳性细胞而得到，作为使得从骨骼肌组织分离的细胞中包含的CD56阳性细胞的比例提高的策略，例如，已知下述方法等：将骨骼肌组织在蛋白质降解酶溶液中浸渍规定的时间来进行酶处理，将得到的酶处理液废弃后，再次在蛋白质降解酶溶液中浸渍规定的时间来进行酶处理，将得到的酶处理液中包含的细胞回收(专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2007-89442号公报

非专利文献1：Haraguchi等人,StemCells Transl Med.2012Feb；1(2):136-41

非专利文献2：Sawa等人,Surg Today.2012Jan；42(2):181-4

发明内容

发明所要解决的课题

如此，为了从来自生物体的组织中分离活细胞，设计了各种分离方法、分离条件。然而，构成各种生物体组织的细胞多种多样，其中干细胞、前体细胞在生物体组织中所占的比例低，很多存在于特殊的生态位(niche)中。例如，骨骼肌组织由肌纤维构成，肌纤维实质上是被质膜包围的多核细胞，但作为其前体细胞的骨骼肌成肌细胞等CD56阳性细胞仅局部存在于肌纤维的基底膜与质膜之间，因此为了从作为对象的骨骼肌组织中分离这些CD56阳性细胞，需要使肌纤维的基底膜的结合松弛，同时以不破坏CD56阳性细胞的程度将骨骼肌组织破碎。

迄今为止，CD56阳性细胞从骨骼肌组织的分离主要通过手工操作进行细切处理和酶解处理。通过细切处理来破坏肌纤维的操作复杂且需要较长时间，另外，由于辨别也依赖于操作者的直觉，因此操作者之间的回收活细胞数存在偏差。如此，尚未发现从各种来自生物体的组织中简便且稳定地分离各种活细胞的方法。

用于解决课题的手段

本申请的发明人为了解决上述的问题而进行了深入研究，结果发现，通过在细切处理中，取得关于来自生物体的组织的信息，并适当算出杂质相对于来自生物体的组织而言的比例，从而能够从来自生物体的组织中稳定地分离活细胞。然后，基于这样的见解进一步反复进行研究，结果发现，能够机械地算出杂质相对于来自生物体的组织而言的比例，能够使全部操作或其一部分自动化，从而完成了本发明。

即，本发明涉及以下的内容。

[1]用于从来自生物体的组织中分离活细胞，其具备：

细切部，其基于参数对来自生物体的组织进行细切；

测定部，其取得与被细切的来自生物体的组织有关的信息；和

分析部，其根据由测定部取得的信息，算出杂质相对于被细切的来自生物体的组织而言的比例。

[2]如[1]所述的系统，其中，分析部还根据杂质的比例来判断分离状态。

[3]如[1]或[2]所述的系统，其还具备学习部，所述学习部基于来自分析部的信息来对参数的过与不足进行提取。

[4]如[1]～[3]中任一项所述的系统，其还具备更新部，所述更新部基于由学习部提取到的参数的过与不足来更新参数。

[5]如[1]～[4]中任一项所述的系统，其还具备搅拌部，所述搅拌部对经细切的来自生物体的组织进行搅拌。

[6]如[1]～[5]中任一项所述的系统，其还具备除去部，所述除去部基于来自分析部的信息，从经细切的来自生物体的组织中除去杂质。

[7]如[1]～[6]中任一项所述的系统，其中，参数包含细切次数、细切角度、施加于细切的力、及细切位置中的至少一者。

[8]如[1]～[7]中任一项所述的系统，其中，与被细切的来自生物体的组织有关的信息包含杂质的颜色、杂质的大小、及施加于细切的力中的至少一者。

[9]如[1]～[8]中任一项所述的系统，其中，活细胞为成肌细胞。

发明的效果

根据本发明的系统，能够简便·可靠且自动地进行从来自生物体的组织分离活细胞的操作，不仅能够将操作者之间的回收活细胞数的偏差消除，而且能够大幅削减操作者的劳动力。

附图说明

[图1]图1示出本发明的系统的一个方式的流程图。

[图2]图2示出本发明的系统的另一方式的流程图。

具体实施方式

本发明涉及用于从来自生物体的组织中分离活细胞的系统，所述系统具备：细切部，其基于参数对来自生物体的组织进行细切；测定部，其取得与被细切的来自生物体的组织有关的信息；和分析部，其根据由测定部取得的信息，算出杂质相对于被细切的来自生物体的组织而言的比例。

本发明中，来自生物体的组织只要来自生物体即可，没有特别限定，例如为肌肉组织、脂肪组织、皮肤组织、软骨组织、肌腱组织、韧带组织、间柔组织(日文：間柔組織)、血管组织、脑组织、循环系统组织、消化系统组织、代谢系统组织、淋巴系统组织、骨髓组织、血液等，优选为肌肉组织、脂肪组织、骨髓组织、血液，进一步优选为骨骼肌组织。

本发明中的活细胞可包含从来自生物体的组织中分离而得的任意活细胞。可以非限定性地举出心肌细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、胰腺细胞、肾细胞、肾上腺细胞、牙周膜细胞、牙龈细胞、骨膜细胞、皮肤细胞、滑膜细胞、软骨细胞等及干细胞(例如，成肌细胞(例如，骨骼肌成肌细胞)(成肌细胞包括肌卫星细胞)、间充质干细胞(例如，源自骨髓、脂肪组织、外周血、皮肤、发根、肌肉组织、子宫内膜、胎盘、脐带血的间充质干细胞等)、心脏干细胞等组织干细胞、胚胎干细胞等)。本发明中的活细胞可以是在呈平面接触的多个膜之间与多个膜直接接触或者以与多个膜相邻的方式被膜包围而局部存在的细胞。本发明中，活细胞可优选举出骨骼肌成肌细胞等骨骼肌组织中的CD56阳性细胞或者源自骨髓、脂肪组织、外周血的间充质干细胞。

本发明中，“杂质”是指目标活细胞以外的细胞、组织等。例如，在从骨骼肌组织中分离成肌细胞等的情况下，白色组织(肌腱、血管、脂肪等)、成纤维细胞成为杂质。

本发明中使用的来自生物体的组织可以来自任意的生物。该生物可没有限定地包含例如人类、非人类灵长类、啮齿类(小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等)、犬、猫、猪、马、牛、山羊、绵羊等。就本发明中使用的来自生物体的组织而言，在将从来自生物体的组织中分离的细胞用于移植的情况下，通过使用自体细胞，能够避免排斥反应，所述自体细胞是使用从移植对象(受体)自身采集的来自生物体的组织进行分离而得的。然而，也可以利用源自异种的细胞、源自同种异体的细胞，所述细胞是使用异种、或同种异体的来自生物体的组织进行分离而得的。

本发明中，“细切部”是指基于参数对来自生物体的组织进行细切的部分。细切部例如是前端为刀具状的、基于参数的设定进行动作、并对来自生物体的组织进行细切的机械手。作为参数，例如，可举出细切次数、细切角度、施加于细切的力、及细切位置。来自生物体的组织只要被置于细切部的前端部分所到达的范围内即可，可以放入市售的细胞培养用容器、例如培养皿、管、培养瓶等。另外，例如，细切部可通过具备用于掌握容器内的来自生物体的组织的传感器来确定细切位置，但供来自生物体的组织放入的容器也可以与细切部成为一体，以使细切部容易确定细切位置。

本发明中，“测定部”是指用于取得与被细切的来自生物体的组织有关的信息的部分。作为与来自生物体的组织有关的信息，例如，可举出杂质的颜色、杂质的大小、及施加于细切的力，能够取得适合于算出杂质相对于来自生物体的组织而言的比例的信息。作为用于算出杂质相对于来自生物体的组织而言的比例的方法，可以利用已知的任意方法，例如，可以利用图像分析法、力检测法等。

图像分析法是对取得的图像进行分析而测定图像中的杂质的大小、颜色，算出来自生物体的组织中的杂质的比例。例如，从利用CCD相机、组合有显微镜和CCD相机的装置取得的图像中，提取杂质的大小、颜色，算出杂质相对于来自生物体的组织而言的比例。算出的比例可以是相对于来自生物体的组织整体的比例，也可以是其一部分、例如每单位面积的比例。因此，取得的图像可以是来自生物体的组织整体的图像，也可以是其一部分。

例如，在从骨骼肌组织中分离成肌细胞的情况下，杂质为白色组织(肌腱、血管、脂肪等)。在该方式中，杂质虽然在细切处理中变小，但最终以比目标活细胞的部分大的形式残留，因此在图像中，目标活细胞的部分与杂质能够区分开，因此能够利用图像分析法算出杂质相对于来自生物体的组织而言的比例。另外，与目标活细胞的部分相比，杂质的颜色更白，目标活细胞的部分与杂质能够在图像中区分开，因此能够利用图像分析法算出杂质相对于来自生物体的组织而言的比例。

力检测法是在细切部对来自生物体的组织进行细切时检测施加于细切部的力。对来自生物体的细胞的仅目标活细胞的部分进行细切时、与对混有杂质的部分进行细切时，施加于细切部的力是不同的。因此例如，使用安装于细切部的压力传感器、组合有计数器和压力传感器的装置等，对施加的力本身、反复进行一定次数细切时施加的力不同的细切有几次进行计测，由此算出杂质相对于来自生物体的组织而言的比例。例如，在使成肌细胞从骨骼肌组织中分离的情况下，杂质为白色组织(肌腱、血管、脂肪等)。在该方式中，杂质虽然在细切处理中变小，但最终以比目标活细胞的部分大的方式残留，因此与对目标活细胞的部分进行细切时相比，施加于细切部的力更大，根据施加的力，能够区分细切部所细切的部分是目标活细胞的部分还是杂质，因此能够利用力检测法算出杂质相对于来自生物体的组织而言的比例。

本发明中，“分析部”是指接收来自测定部的信息，算出杂质相对于被细切的来自生物体的组织而言的比例的部分。分析部也可以将算出的杂质的比例值与预先设定的阈值比较，根据该比较结果，对来自生物体的组织的分离状态进行判断。本发明中，分离包括：从作为大的块的来自生物体的组织中分离目标活细胞；对作为大的块的来自生物体的组织施加细切处理，由此使得在来自生物体的组织的内部成为一体的杂质在表面露出；及将露出的杂质除去。在与预先设定的阈值的比较中，包含下述情况：随着对残留大的块的来自生物体的组织进行细切，在表面露出的杂质增加，超出预先设定的阈值；或者，通过将杂质除去，算出的杂质的比例下降，低于预先设定的阈值。

分析部至少包含处理器，所述处理器接收来自测定部的信息，根据该信息算出杂质相对于被细切的来自生物体的组织而言的比例，并将算出的值与阈值进行比较来判断分离状态，可以还包含存储部、控制部、输入部及输出部。存储部是对来自测定部的信息、算出的值、分离状态的判断等进行保存的部分，包含各种电子存储介质、例如半导体存储器、硬盘等。控制部是基于算出的值或分离状态的判断来向细切部等发出信号的部分，包含信号产生电路等。输入部是本发明的系统的操作者、系统的其他部分或其他系统根据需要输入阈值等信息的部分，包含各种输入接口、例如从其他系统接收电、光等信号的机构(电线、光纤、连接器、无线通信装置等)、按钮、键盘、触摸面板等。输出部是基于算出的值、分离状态的判断等来发出规定信号的部分，包含各种输出接口、例如从其他系统接收电、光等信号的机构(电线、光纤、连接器、无线通信装置等)、监视器、打印机、显示灯、蜂鸣器、声音合成装置等。输入部与输出部可以作为包含输入接口和输出接口的输入输出接口而一体化，因此可以利用通用计算机。

本发明的系统可以还具备学习部。本发明中，“学习部”是指基于来自分析部的信息来对参数的过与不足进行提取的部分。学习部通过将细切部的参数与下述来自分析部的输出建立关联来对参数的过与不足进行提取，所述来自分析部的输出是：分析部所判断的分离状态；或者，分析部在其分析过程中识别为杂质的部分或识别为不是杂质的部分、或者识别为包含大量杂质的部分等的输出。例如，就学习部而言，在开始对来自生物体的组织进行细切、来自生物体的组织仍然以大的块的形式残留时，对于识别为没有杂质或者不包含大量杂质的部分，由于杂质没有出现于表面，因此能够判断为细切次数不足。另外，在分析部识别为仅在来自生物体的组织的一部分中存在杂质的情况下，能够判断为对该部分以外的位置进行细切。

学习部可以还包含学习存储部。学习存储部是将细切部的参数、和该参数中的来自分析部的信息进行累积并保存的部分，与存储部同样地包括各种电子存储介质。学习部可以参考保存于学习存储部中的内容来以更高的精度对参数的过与不足进行提取。另外，学习部可以还包含学习输入部、学习输出部。学习输入部是本发明的系统的操作者、系统的其他部分或其他系统根据需要输入细切环境等可实现更高效、高精度的学习的信息的部分，学习输出部是基于提取的参数的过与不足来发出规定信号的部分。学习输入部、学习输出部分别可包含与输入部、输出部同样的接口。

本发明的系统可以还具备更新部。本发明中，“更新部”是指基于由学习部提取到的参数的过与不足来更新参数的部分。更新部接收来自学习部的信息，生成反映该信息的新的参数，将细切部的参数更新为该参数。更新部可以具备用于向细切部输出的输出接口，或者也可以与细切部一体化。或者，更新部可以与学习部一体化，不接收来自学习部的信息而是基于来自分析部的信息，通过新型参数的生成、细切部的参数的更新来进行。

本发明的系统可以还具备搅拌部。本发明中，“搅拌部”是指对经细切的来自生物体的组织进行搅拌的部分。搅拌部例如可以是从下方对装入有来自生物体的组织的容器作出指示，通过将容器振荡、旋转等来进行搅拌的部件，也可以是前端为棒状或刮刀状的机械手，其通过使其前端部分活动从而进行搅拌，或者也可以为它们组合而成的部件。搅拌部具有使来自生物体的组织的细切状态变得均匀化的功能，通过搅拌部进行搅拌，在来自生物体的组织的任意部分中，杂质的分离状态均变得均等。因此，测定部通过取得来自生物体的组织的一部分的信息，能够取得足以算出杂质相对于被细切的来自生物体的组织而言的比例的信息。

本发明的系统可以还具备除去部。本发明中，“除去部”是指基于来自分析部的信息，从经细切的来自生物体的组织中除去杂质的部分。除去部例如是前端成为针、镊子状的、从来自生物体的组织中除去杂质的机械手。除去部例如基于下述来自分析部的输出来将杂质除去，所述来自分析部的输出是关于分析部在其分析过程中识别为杂质的部分、或者识别为包含大量杂质的部分等的输出。输出可以经由分析部所附带的输出部而到达除去部。一个方式中，除去部可以包含以在除去操作后进一步进行细切的方式向细切部输出的、输出接口。

如上所述，构成本发明的系统的各构成要素可以在能够实现规定目的的范围内以各种方式配置，也可以根据需要进行组合、或一体化。

以下，参照附图更详细地说明本发明的系统，但这些是示出本发明的特定具体例，本发明不限于此。

一个方式中，本发明的系统中的、活细胞从来自生物体的组织的分离可大致分为两个阶段。在开始来自生物体的组织的细切处理时，来自生物体的组织以大的块的形式残留，杂质没有在表面露出。该阶段中，随着细切处理进行，杂质在表面的露出逐渐增加。接着，当来自生物体的组织被细切至观察不到大的块的程度时，新增加将识别到的杂质除去的操作。该阶段中，随着细切处理、杂质的除去进行，识别到的杂质减少。

图1示出本发明的系统的一个方式中的、在开始来自生物体的组织的细切处理时的、从来自生物体的组织中分离活细胞的流程图。本方式中，系统接到分离的开始指示时，细切部按照所输入的参数开始细切处理。测定部取得细切部的细切处理中的、与被细切的来自生物体的组织有关的信息、例如杂质的大小、杂质的颜色、施加于细切部的力等。就分析而言，根据这些与被细切的来自生物体的组织有关的信息，算出杂质相对于被细切的来自生物体的组织而言的比例。若细切处理充分进行，则从来自生物体的组织中观察不到大的块，存在于其内侧的杂质也在表面露出，因此杂质相对于来自生物体的组织而言的比例增加。在来自生物体的组织中残留大的块的情况下，杂质相对于来自生物体的组织而言的比例尚低，通过进一步施加细切处理，在来自生物体的组织中观察不到大的块，杂质相对于来自生物体的组织而言的比例增加。本发明的一个方式中，在杂质相对于来自生物体的组织而言的比例超出预先设定的阈值时，分析部能够判断本方式中的分离已完成。就本发明的系统而言，分离完成时，能够输出分离完成信号，使流程结束。在分析部判断为分离未完成的情况下，分析部能够向细切部输出信号，通过细切部对来自生物体的组织进一步进行细切，该情况下，可以基于来自分析部的信息来变更细切的参数。参数的变更可以通过本发明的操作者向细切部输入来进行。一个方式中，本发明的系统可以还具备学习部及更新部，从分析部向学习部输出信号，在这些部分中进行参数的变更、及向细切部的应用(更新)。

图2示出本发明的系统的一个方式中的、来自生物体的组织被细切至观察不到大的块的程度时的、从来自生物体的组织中分离活细胞的流程图。本方式中，也与图1中的流程同样地，系统接到分离的开始指示时，细切部按照所输入的参数开始细切处理，测定部取得细切部的细切处理中的、与被细切的来自生物体的组织有关的信息、例如杂质的大小、杂质的颜色、施加于细切部的力等，及分析部根据这些与被细切的来自生物体的组织有关的信息，算出杂质相对于被细切的来自生物体的组织而言的比例。本发明的一个方式中，当杂质相对于来自生物体的组织而言的比例低于预先设定的阈值时，分析部可以判断为本方式中的分离已完成。就本发明的系统而言，分离完成时，能够输出分离完成信号，使流程结束。在分析部判断为分离未完成的情况下，分析部能够向除去部输出信号，利用除去部进行来自生物体的组织中的杂质的除去。除去部可以在除去杂质后向细切部输出信号，对除去了杂质的来自生物体的组织进一步进行细切，以使隐藏在组织内的杂质露出。关于供于进一步的细切的来自生物体的组织，测定部取得与被细切的来自生物体的组织有关的信息，及分析部根据这些与被细切的来自生物体的组织有关的信息，重新算出杂质相对于被细切的来自生物体的组织而言的比例，再次判断分离的完成。通过这样的方式，能够反复进行杂质的除去和细切，直至分离完成。另外，本方式中，也可以基于来自分析部的信息而变更细切的参数，该变更可以由本发明系统的操作者输入，也可以基于学习部及更新部进行。

以上，对本发明的系统的一个方式进行了说明，但应当理解，也可以为上述以外的各种方式。因此，在不脱离本发明思想的范围内对上述方式进行改变而成的各种方式也包括在本发明的范围内，本领域技术人员可以理解这样的改变。

Claims (9)

1.用于从来自生物体的组织中分离活细胞的系统，其具备：

细切部，其基于参数对来自生物体的组织进行细切；

测定部，其取得与被细切的来自生物体的组织有关的信息；和

分析部，其根据由测定部取得的信息，算出杂质相对于被细切的来自生物体的组织而言的比例。

2.如权利要求1所述的系统，其中，分析部还根据杂质的比例来判断分离状态。

3.如权利要求1或2所述的系统，其还具备学习部，所述学习部基于来自分析部的信息对参数的过与不足进行提取。

4.如权利要求1～3中任一项所述的系统，其还具备更新部，所述更新部基于由学习部提取到的参数的过与不足来更新参数。

5.如权利要求1～4中任一项所述的系统，其还具备搅拌部，所述搅拌部对经细切的来自生物体的组织进行搅拌。

6.如权利要求1～5中任一项所述的系统，其还具备除去部，所述除去部基于来自分析部的信息，从经细切的来自生物体的组织中除去杂质。

7.如权利要求1～6中任一项所述的系统，其中，参数包含细切次数、细切角度、施加于细切的力、及细切位置中的至少一者。

8.如权利要求1～7中任一项所述的系统，其中，与被细切的来自生物体的组织有关的信息包含杂质的颜色、杂质的大小、及施加于细切的力中的至少一者。

9.如权利要求1～8中任一项所述的系统，其中，活细胞为成肌细胞。

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