WO2022071467A1 - 生細胞分離システム - Google Patents

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WO2022071467A1
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tissue
unit
shredded
impurities
living
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French (fr)
Inventor
枝莉 野口
匡記 松村
Original Assignee
テルモ株式会社
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
    • C12M45/02—Means for pre-treatment of biological substances by mechanical forces; Stirring; Trituration; Comminuting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0658—Skeletal muscle cells, e.g. myocytes, myotubes, myoblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation

Definitions

  • the present invention relates to a system for separating living cells from living tissue.
  • Non-Patent Document 1 fetal cardiomyocytes, skeletal myoblasts, mesenchymal stem cells, cardiac stem cells, ES cells, iPS cells, etc. for repairing myocardial tissue damaged by ischemic heart disease such as angina and myocardial infarction.
  • Non-Patent Document 2 a cell structure formed by using a scaffold and a sheet-shaped cell culture in which cells are formed in a sheet shape have been developed.
  • Non-Patent Document 2 For therapeutic application of sheet-shaped cell culture, use of cultured epidermal sheet for skin damage caused by burns, use of corneal epithelial sheet-shaped cell culture for corneal damage, oral mucosal sheet for endoscopic resection of esophageal cancer The use of cell culture is under study, and some of them are in the stage of clinical application.
  • the skeletal myoblasts used for such treatment are usually obtained by separating CD56-positive cells such as skeletal myoblasts from the skeletal muscle tissue to be transplanted, but are CD56-positive contained in the cells separated from the skeletal muscle tissue.
  • the skeletal muscle tissue is immersed in a proteolytic enzyme solution for a predetermined time, the enzyme treatment is performed, and the obtained enzyme treatment solution is discarded, and then the proteolytic enzyme solution is again used for a predetermined time.
  • Patent Document 1 A method of recovering cells contained in an enzyme-treated solution obtained by immersing and performing enzyme treatment is known (Patent Document 1).
  • skeletal muscle tissue is composed of muscle fibers, and the parenchyma of the muscle fibers is a multinucleated cell surrounded by a plasma membrane, whereas CD56-positive cells such as skeletal myoblasts, which are precursor cells thereof, are muscle fibers.
  • the present inventors have acquired information about the biological tissue during the shredding process and appropriately calculate the ratio of impurities to the biological tissue to obtain the living body. It was found that stable separation of living cells from the tissue of origin is possible. As a result of further research based on such findings, it was found that the ratio of impurities to the tissue derived from the living body can be calculated mechanically, and the whole work or a part thereof can be automated, and the present invention has been completed. ..
  • the present invention relates to the following.
  • a system for separating living cells from living tissue Shredded part that shreds biological tissue based on parameters
  • Measuring unit that acquires information about shredded living body-derived tissue From the information acquired by the measuring unit, the ratio of impurities to the shredded living body-derived tissue is calculated.
  • the system including an analysis unit for calculation.
  • [5] The system according to any one of [1] to [4], further comprising a stirring unit for stirring shredded biological tissue.
  • [6] The system according to any one of [1] to [5], further comprising a removing unit for removing impurities from shredded biological tissue based on information from the analysis unit.
  • the parameter includes at least one of the number of shredding, the shredding angle, the force applied to the shredding, and the shredding position.
  • the information about the biological tissue to be shredded includes at least one of the color of the impurity, the size of the impurity, and the force applied to the shredded tissue.
  • [9] The system according to any one of [1] to [8], wherein the living cell is a myoblast.
  • the operation of separating living cells from a living tissue can be easily, reliably and automatically performed, and not only can the variation in the number of recovered living cells among workers be eliminated, but also it is possible to eliminate the variation in the number of recovered living cells.
  • the labor of the worker can be significantly reduced.
  • FIG. 1 shows a flow chart in one embodiment of the system of the present invention.
  • FIG. 2 shows a flow chart in another aspect of the system of the present invention.
  • the present invention is derived from a living body that is shredded from a shredded portion that shreds a living body-derived tissue based on a parameter, a measuring unit that acquires information on the shredded living body-derived tissue, and information acquired by the measuring unit.
  • the present invention relates to a system for separating living cells from a living tissue having an analysis unit for calculating the ratio of impurities to the tissue.
  • the biological tissue is not particularly limited as long as it is derived from the living body, and for example, muscle tissue, adipose tissue, skin tissue, cartilage tissue, tendon tissue, ligament tissue, soft tissue, vascular tissue, brain tissue, and circulatory organ. It is a systematic tissue, a digestive system tissue, a metabolic system tissue, a lymphatic system tissue, a bone marrow tissue, blood, etc., preferably muscle tissue, adipose tissue, bone marrow tissue, blood, and more preferably skeletal muscle tissue.
  • the living cell in the present invention can include any living cell isolated from a living tissue.
  • myocardial cells fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocellular cells, pancreatic cells, renal cells, adrenal cells, root membrane cells, gingival cells, osteomyeltic cells, skin cells, synovial cells, cartilage cells, etc.
  • stem cells eg, myoblasts (eg, skeletal myoblasts) (myosblasts include muscle satellite cells), mesenchymal stem cells (eg, bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, skin, hair roots, muscle tissue) , Endometrial, placenta, umbilical cord blood-derived, etc.), tissue stem cells such as heart stem cells, embryonic stem cells, etc.).
  • the living cell in the present invention may be a cell localized in direct contact with or adjacent to a plurality of membranes so as to be surrounded by the membranes among the plurality of membranes in contact with each other in a plane.
  • the living cells preferably include CD56-positive cells in skeletal muscle tissue such as skeletal myoblasts or mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue and peripheral blood.
  • the "impurity" refers to cells, tissues, etc. other than the target living cells. For example, when separating myoblasts from skeletal muscle tissue, white tissue (tendons, blood vessels, fat, etc.) and fibroblasts become impurities.
  • the biological tissue used in the present invention can be derived from any organism. Such organisms include, but are not limited to, for example, humans, non-human primates, rodents (mouse, rat, hamster, guinea pig, etc.), dogs, cats, pigs, horses, cows, goats, sheep and the like. ..
  • the living body-derived tissue used in the present invention is obtained by using autologous cells separated using the living body-derived tissue collected from the transplant target (recipient) itself. , Rejection can be avoided.
  • the "shredded portion” is a portion that shreds a living body-derived tissue based on a parameter.
  • the shredded portion is, for example, a robot having a blade-like tip that operates based on a parameter setting and shreds a living tissue. Parameters include, for example, the number of shreds, the shredding angle, the force applied to the shreds, and the shred position.
  • the biological tissue may be placed within a range that the tip portion of the shredded portion can reach, and may be placed in a commercially available cell culture container, for example, a petri dish, a tube, a flask, or the like.
  • the shredded portion can determine the shredded position by providing a sensor for grasping the tissue derived from the living body in the container, but the shredded portion can easily determine the shredded position.
  • the container containing the tissue of origin may be integrated with the shredded portion.
  • the "measurement unit" is a part for acquiring information on a living body-derived tissue that has been shredded.
  • Information on the biological tissue includes, for example, the color of the impurity, the size of the impurity, and the force applied to the shredding, and it is possible to obtain information suitable for calculating the ratio of the impurity to the biological tissue. ..
  • any known method can be used, and for example, an image analysis method, a force detection method, or the like can be used.
  • the acquired image is analyzed, the size and color of impurities in the image are measured, and the ratio of impurities in the tissue derived from the living body is calculated.
  • the size and color of impurities are extracted from an image acquired by a CCD camera or a device that combines a microscope and a CCD camera, and the ratio of impurities to a tissue derived from a living body is calculated.
  • the calculated ratio may be for the entire living body-derived tissue or a part thereof, for example, per unit area. Therefore, the image to be acquired may be the whole body-derived tissue or a part thereof.
  • the impurities are white tissue (tendons, blood vessels, fat, etc.).
  • the impurities are finely divided in the shredding process, but eventually remain in a form larger than the target living cell portion, so that the target living cell portion and the impurities are distinguished in the image. Therefore, it is possible to calculate the ratio of impurities to the tissue derived from the living body in the image analysis method.
  • the impurities are whiter in color than the target living cell portion, and the target living cell portion and the impurities can be distinguished in the image, so that the ratio of the impurities to the biological tissue can be calculated by the image analysis method. be.
  • the force detection method detects the force applied to the shredded portion when the shredded portion shreds the tissue derived from the living body.
  • the force applied to the shredded part differs between when chopping only the target living cell part of the living body-derived cell and when chopping the part containing impurities. Therefore, for example, using a pressure sensor attached to a shredded part or a device that combines a counter and a pressure sensor, what is the applied force itself or the force applied when shredding is repeated a certain number of times? By measuring the number of times, the ratio of impurities to the tissue derived from the living body is calculated. For example, when separating myoblasts from skeletal muscle tissue, the impurities are white tissue (tendons, blood vessels, fat, etc.).
  • the impurities become finer in the shredding process, but in the end, they remain larger than the target living cell portion, so that the impurities are shredded as compared with the case where the target living cell portion is shredded. Since the force applied to the part is large and it is possible to distinguish whether the part where the shredded part is shredded is the part of the target living cell or an impurity from the applied force, it is possible to distinguish between the impurities in the biological tissue in the force detection method. The ratio can be calculated.
  • the "analysis unit” is a part that receives information from the measurement unit and calculates the ratio of impurities to the shredded biological tissue.
  • the analysis unit may compare the calculated value of the ratio of impurities with a preset threshold value, and judge the separation state of the biological tissue based on the comparison result.
  • the separation is integrated inside the living body tissue by separating the target living cells from the living body-derived tissue which is a large mass and by applying a shredding treatment to the living body-derived tissue which is a large mass. It involves exposing the exposed impurities to the surface and removing the exposed impurities.
  • the analysis unit includes at least a processor that receives information from the measurement unit, calculates the ratio of impurities to the fragmented biological tissue from the information, and compares the calculated value with the threshold value to determine the separation state.
  • a storage unit, a control unit, an input unit, and an output unit may be further included.
  • the storage unit is a unit for storing information from the measurement unit, calculated values, determination of the separated state, and the like, and includes various electronic storage media such as a semiconductor memory and a hard disk.
  • the control unit is a unit that sends a signal to a shredded unit or the like based on a calculated value or a determination of a separated state, and includes a signal generation circuit or the like.
  • the input unit is a part where an operator of the system of the present invention, another part of the system, or another system inputs information such as a threshold value as needed, and various input interfaces, for example, signals such as electricity and light. Includes means for receiving from other systems (electric wires, optical fibers, connectors, wireless communication devices, etc.), buttons, keyboards, touch panels, etc.
  • the output unit is a part that emits a predetermined signal based on the calculated value, determination of the separation state, etc., and is a means (electric wire, optical fiber) that receives signals such as electricity and light from various output interfaces, for example, electric and optical. , Connector, wireless communication device, etc.), monitor, printer, indicator light, buzzer, voice synthesizer, etc.
  • the input unit and the output unit may be integrated as an input / output interface including an input interface and an output interface, and a general-purpose computer may be used for this purpose.
  • the system of the present invention may further include a learning unit.
  • the "learning unit” is a portion for extracting excess or deficiency of parameters based on information from the analysis unit.
  • the learning unit recognizes that the parameters of the shredded portion and the separated state determined by the analysis unit, or the part recognized by the analysis unit as an impurity or not an impurity in the analysis process, or contains a large amount of impurities.
  • the excess or deficiency of the parameter is extracted by associating it with the output from the analysis unit for the part and so on.
  • the learning unit may further include a learning storage unit.
  • the learning storage unit is a unit that stores and stores the parameters of the shredded unit and the information from the analysis unit in the parameters, and includes various electronic storage media like the storage unit.
  • the learning unit may extract excess or deficiency of parameters with higher accuracy by referring to what is stored in the learning storage unit. Further, the learning unit may further include a learning input unit and a learning output unit.
  • the learning input unit is a part for inputting information that can enable more efficient and highly accurate learning by the operator of the system of the present invention, other parts of the system, or other systems as needed, such as a shredded environment.
  • the learning output unit is a portion that emits a predetermined signal based on the excess or deficiency of the extracted parameters.
  • the learning input unit and the learning output unit may include an interface similar to the input unit and the output unit, respectively.
  • the system of the present invention can further include an update unit.
  • the "update unit” is a portion that updates the parameters based on the excess or deficiency of the parameters extracted by the learning unit.
  • the update unit receives information from the learning unit, creates a new parameter that reflects the information, and updates the parameter of the shredded unit to that parameter.
  • the update unit may be provided with an output interface for outputting to the shredded portion, or may be integrated with the shredded portion.
  • the update section is integrated with the learning section, and instead of receiving information from the learning section, it goes through the creation of new parameters and the updating of the parameters of the shredded section based on the information from the analysis section. May be good.
  • the system of the present invention can further include a stirring unit.
  • the "stirring unit” is a portion that agitates the shredded biological tissue.
  • the stirring unit indicates a container containing a biological tissue from below, and even if the container is stirred by shaking or rotating, the tip of the robot is a rod or a spatula. It may be agitated by moving the tip portion thereof, or may be a combination thereof.
  • the stirring unit has a function of equalizing the shredded state of the living body-derived tissue, and by stirring the stirring unit, the separated state of impurities becomes the same in any part of the living body-derived tissue. Therefore, the measuring unit can acquire sufficient information to calculate the ratio of impurities to the shredded biological tissue by acquiring the information of a part of the biological tissue.
  • the system of the present invention may further include a removal section.
  • the "removal unit” is a portion that removes impurities from the shredded biological tissue based on the information from the analysis unit.
  • the removing unit is, for example, a robot having a needle or tweezers-shaped tip that removes impurities from a living tissue.
  • the removing unit removes impurities, for example, based on the output from the analysis unit for a portion recognized as an impurity or a portion recognized as containing a large amount of impurities in the analysis process.
  • the output may reach the removal unit via the output unit attached to the analysis unit.
  • the removal section may include an output interface that outputs to the shredding section so that it is further shredded after the removal operation.
  • each component constituting the system of the present invention can be arranged in various forms within a range in which a predetermined object can be achieved, and may be combined or integrated as necessary. can.
  • the separation of living cells from living tissue in the system of the present invention can be broadly divided into two stages.
  • the shredding process of the biological tissue is started, the biological tissue remains as a large mass and the impurities are not exposed on the surface.
  • the exposure of impurities to the surface increases as the shredding process progresses.
  • the removal of the recognized impurities is newly added.
  • the recognized impurities decrease as the shredding process and the removal of impurities proceed.
  • FIG. 1 shows a flow chart for separating living cells from a living body-derived tissue when the shredding process of the living body-derived tissue is started in one aspect of the system of the present invention.
  • the shredded portion starts the shredding process according to the input parameter.
  • the measuring unit acquires information on the biological tissue to be shredded in the shredding process of the shredded portion, for example, the size of the impurity, the color of the impurity, the force applied to the shredded portion, and the like.
  • the analysis calculates the proportion of impurities in the shredded living body tissue from the information about those shredded living body tissues.
  • the analysis unit can determine that the separation in the present embodiment is completed when the ratio of impurities to the tissue derived from the living body exceeds a preset threshold value. When the separation is completed, the system of the present invention can output a separation completion signal and terminate the flow.
  • the analysis unit can output a signal to the shredded portion and further subdivide the biological tissue by the shredded portion. In this case, the analysis is performed.
  • the shredded parameters can be changed based on the information from the department. The parameter may be changed by the operator of the present invention inputting to the shredded portion.
  • the system of the present invention further includes a learning unit and an updating unit, in which signals are output from the analysis unit to the learning unit, parameters are changed in these units, and application (updated) to the shredded unit. ) May be performed.
  • FIG. 2 shows a flow chart for separating living cells from a living tissue when the living tissue is shredded to the extent that no large mass is observed in one aspect of the system of the present invention.
  • the shredded portion starts the shredding process according to the input parameter, and the measuring unit shreds the shredded portion.
  • Information about the shredded bio-derived tissue in the process such as the size of the impurities, the color of the impurities, the force exerted on the shredded parts, etc., is obtained, and the analysis unit is derived from those shredded living organisms. From the information about the tissue, the ratio of impurities to the shredded biological tissue is calculated.
  • the analysis unit can determine that the separation in the present embodiment is completed when the ratio of impurities to the tissue derived from the living body is lower than the preset threshold value.
  • the system of the present invention can output a separation completion signal and terminate the flow.
  • the analysis unit determines that the separation has not been completed, the analysis unit can output a signal to the removal unit and remove impurities in the biological tissue by the removal unit.
  • the removing section outputs a signal to the shredded section after removing the impurities, and the biological tissue from which the impurities have been removed can be further shredded in order to expose the impurities hidden in the tissue.
  • the measuring unit obtains information on the shredded biological tissue
  • the analysis unit obtains information on the shredded biological tissue.
  • the ratio of impurities to the cut living tissue is recalculated, and the completion of separation is judged again. In this way, the removal of impurities and shredding can be repeated until the separation is complete.
  • the parameters of shredding can be changed based on the information from the analysis unit, and even if the change is input by the operator of the system of the present invention, the learning unit and the updating unit can be changed. It may be due to.

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Abstract

生体由来組織から様々な生細胞を簡便に安定して分離するシステムを提供することを目的とする。パラメータに基づき生体由来組織を細切する細切部、細切されている生体由来組織に関する情報を取得する測定部、測定部により取得された情報から、細切されている生体由来組織に対する不純物の割合を算出する解析部を備える生体由来組織から生細胞を分離するためのシステムを提供することにより、上記課題を解決した。

Description

生細胞分離システム
　本発明は、生体由来組織からの生細胞を分離するためのシステムに関する。
　近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の利用が試みられている（非特許文献１）。
　このような試みの一環として、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成したシート状細胞培養物が開発されてきた（非特許文献２）。
　シート状細胞培養物の治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮シート状細胞培養物の利用、食道がん内視鏡的切除に対する口腔粘膜シート状細胞培養物の利用などの検討が進められており、その一部は臨床応用の段階に入っている。
　このような治療に用いる骨格筋芽細胞は、通常移植する対象の骨格筋組織から骨格筋芽細胞などのＣＤ５６陽性細胞を分離して得るが、骨格筋組織から分離された細胞に含まれるＣＤ５６陽性細胞の割合を高める方策として、例えば、骨格筋組織をタンパク質分解酵素溶液に所定の時間浸漬して酵素処理を行って得られた酵素処理液を廃棄した後に、再度タンパク質分解酵素溶液に所定の時間浸漬して酵素処理を行って得られた酵素処理液に含まれる細胞を回収する方法などが知られている（特許文献１）。
特開２００７－８９４４２号公報
Haraguchi et al., Stem Cells Transl Med. 2012 Feb;1(2):136-41 Sawa et al., Surg Today. 2012 Jan;42(2):181-4
　このように生体由来組織から生細胞を分離するため、様々な分離方法や分離条件が考案されてきた。しかしながら、各種生体組織を構成する細胞は多様であり、なかでも幹細胞や前駆細胞は生体組織中に占める割合が低く、特殊なニッチに存在するものが多い。例えば、骨格筋組織は、筋線維から構成され、筋線維の実質は形質膜に囲まれた多核化細胞であるが、その前駆細胞である骨格筋芽細胞などのＣＤ５６陽性細胞は、筋線維の基底膜と形質膜との間にのみ局在するため、対象の骨格筋組織から、これらのＣＤ５６陽性細胞を分離するためには筋線維の基底膜の結合を緩めつつ、ＣＤ５６陽性細胞を破壊しない程度に骨格筋組織を破砕する必要がある。
　これまで骨格筋組織からのＣＤ５６陽性細胞の分離は、手作業による細切処理および酵素分解処理が主として行なわれてきた。細切処理により筋線維を破壊する作業は、煩雑かつ長時間を要し、また見極めも作業者の勘に依存することから作業者間での回収生細胞数にばらつきが存在していた。このように種々の生体由来組織から様々な生細胞を簡便に安定して分離する方法は未だ見出されていない。
　本発明者等は、上述した問題を解決するために鋭意検討した結果、細切処理中に、生体由来組織についての情報を取得し、生体由来組織に対する不純物の割合を適宜算出することで、生体由来組織からの生細胞の安定した分離が可能であることを見出した。そして、このような知見に基づきさらに研究を重ねた結果、生体由来組織に対する不純物の割合を機械的に算出することができ、作業全般もしくはその一部を自動化できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、以下に関する。
［１］生体由来組織から生細胞を分離するためのシステムであって、
　　パラメータに基づき生体由来組織を細切する細切部
　　細切されている生体由来組織に関する情報を取得する測定部
　　測定部により取得された情報から、細切されている生体由来組織に対する不純物の割合を算出する解析部
を備える前記システム。
［２］解析部が、さらに不純物の割合から分離状態を判断する、［１］に記載のシステム。
［３］解析部からの情報に基づき、パラメータの過不足を抽出する学習部をさらに備える、［１］または［２］に記載のシステム。
［４］学習部によって抽出されたパラメータの過不足に基づいてパラメータを更新する更新部をさらに備える、［１］～［３］のいずれか１つに記載のシステム。
［５］細切された生体由来組織を攪拌する攪拌部をさらに備える、［１］～［４］のいずれか１つに記載のシステム。
［６］解析部からの情報に基づき、細切された生体由来組織から不純物を除去する除去部をさらに備える、［１］～［５］のいずれか１つに記載のシステム。
［７］パラメータが、細切回数、細切角度、細切にかける力、および細切位置の少なくとも１つを含む、［１］～［６］のいずれか１つに記載のシステム。
［８］細切されている生体由来組織に関する情報が、不純物の色、不純物の大きさ、および細切にかかる力の少なくとも１つを含む、［１］～［７］のいずれか１つに記載のシステム。
［９］生細胞が、筋芽細胞である、［１］～［８］のいずれか１つに記載のシステム。
　本発明のシステムによれば、生体由来組織から生細胞の分離操作を、簡便・確実かつ自動的に行うことができ、作業者間における回収生細胞数のばらつきをなくすことができるばかりでなく、作業者の労力を大幅に削減することができる。
図１は、本発明のシステムの一態様におけるフロー図を示す。 図２は、本発明のシステムの別の一態様におけるフロー図を示す。
　本発明は、パラメータに基づき生体由来組織を細切する細切部、細切されている生体由来組織に関する情報を取得する測定部、測定部により取得された情報から、細切されている生体由来組織に対する不純物の割合を算出する解析部、を備える生体由来組織から生細胞を分離するためのシステムに関する。
　本発明において、生体由来組織は、生体由来であれば特に限定されず、例えば筋組織、脂肪組織、皮膚組織、軟骨組織、腱組織、靭帯組織、間柔組織、血管組織、脳組織、循環器系組織、消化器系組織、代謝系組織、リンパ系組織、骨髄組織、血液などであり、好ましくは筋組織、脂肪組織、骨髄組織、血液であり、さらに好ましくは骨格筋組織である。
　本発明における生細胞とは、生体由来組織から分離された任意の生細胞を含むことができる。非限定的に、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞などおよび幹細胞（例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞）（筋芽細胞は、筋衛星細胞を含む）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞など）が挙げられる。本発明における生細胞は平面で接触する複数の膜の間において複数の膜と直接接触または複数の膜に隣接するようにして膜に取り囲まれるようにして局在する細胞であってよい。本発明において生細胞は、好ましくは骨格筋芽細胞などの骨格筋組織中のＣＤ５６陽性細胞または骨髄、脂肪組織、末梢血由来の間葉系幹細胞が挙げられる。
　本発明において、「不純物」とは、目的としている生細胞以外の細胞、組織等をいう。例えば、骨格筋組織から筋芽細胞などを分離する場合には、白色組織（腱、血管、脂肪等）や線維芽細胞が不純物となる。
　本発明に用いる生体由来組織は、任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどが含まれる。本発明で用いる生体由来組織は、生体由来組織から分離した細胞を移植に用いる場合には、移植対象（レシピエント）自身から採取された生体由来組織を用いて分離された自家細胞を用いることにより、拒絶反応を回避することができる。しかしながら、異種や同種非自己の生体由来組織を用いて分離された異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。
　本発明において、「細切部」とは、パラメータに基づき生体由来組織を細切する部分である。細切部は、例えば、先端が刃物状になっている、パラメータの設定に基づいて動作し、生体由来組織を細切するロボットである。パラメータとしては、例えば、細切回数、細切角度、細切にかける力、および細切位置が挙げられる。生体由来組織は、細切部の先端部分が到達する範囲に置かれていればよく、市販の細胞培養用容器、例えば、シャーレ、チューブ、フラスコ等に入れられていてもよい。また、例えば、細切部は、容器内の生体由来組織を把握するためのセンサーを備えることにより、細切位置を決定し得るが、細切部が細切位置を決定しやすいように、生体由来組織を入れる容器は細切部と一体となっていてもよい。
　本発明において、「測定部」とは、細切されている生体由来組織に関する情報を取得するための部分である。生体由来組織に関する情報としては、例えば、不純物の色、不純物の大きさ、および細切にかかる力が挙げられ、生体由来組織に対する不純物の割合を算出するために適したものを取得することができる。生体由来組織に対する不純物の割合を算出するための方法としては、既知の任意の方法を利用することができ、例えば、画像解析法、力検知法等が利用できる。
　画像解析法は、取得した画像を解析して画像中の不純物の大きさや色を測定し、生体由来組織における不純物の割合を算出する。例えば、ＣＣＤカメラや、顕微鏡とＣＣＤカメラを組み合わせた装置で取得した画像から、不純物の大きさや色を抽出し、生体由来組織に対する不純物の割合を算出する。算出する割合は、生体由来組織全体に対するものであっても、その一部分、例えば単位面積当たりのものであってもよい。したがって、取得する画像は、生体由来組織全体のものであってもその一部分であってもよい。
　例えば、骨格筋組織から筋芽細胞を分離させる場合においては、不純物は白色組織（腱、血管、脂肪等）である。かかる態様において、不純物は細切処理において細かくはなるが、最終的には目的の生細胞の部分よりも大きい形で残るものであることから、画像において目的の生細胞の部分と不純物とが区別でき得るため、画像解析法において生体由来組織に対する不純物の割合が算出可能である。また、不純物は、目的の生細胞の部分と比べて色が白く、目的の生細胞の部分と不純物とが画像において区別でき得るため、画像解析法において生体由来組織に対する不純物の割合を算出可能である。
　力検知法は、細切部が生体由来組織を細切する際に、細切部にかかる力を検出する。生体由来細胞の目的の生細胞のみの部分を細切するときと、不純物が混ざっている部分を細切するときでは細切部にかかる力は異なる。したがって、例えば、細切部に取り付けられた圧力センサーや、計数器と圧力センサーを組み合わせた装置などを用いて、かかる力そのものや、一定回数細切を繰り返した際にかかる力が異なるものが何回あったかを計測することで、生体由来組織に対する不純物の割合を算出する。例えば、骨格筋組織から筋芽細胞を分離させる場合においては、不純物は白色組織（腱、血管、脂肪等）である。かかる態様において、不純物は細切処理において細かくなるが、最終的には目的の生細胞の部分よりも大きく残るものであることから、目的の生細胞の部分を細切する際に比べて細切部にかかる力が大きく、かかる力から細切部が細切している部分が目的の生細胞の部分であるか不純物であるかが区別でき得るため、力検知法において生体由来組織に対する不純物の割合を算出可能である。
　本発明において、「解析部」とは、測定部からの情報を受け取り、細切されている生体由来組織に対する不純物の割合を算出する部分である。解析部は、算出した不純物の割合の値をあらかじめ設定された閾値と比較し、その比較結果によって生体由来組織の分離状態について判断してもよい。本発明において分離は、大きな塊である生体由来組織から、目的の生細胞を分離すること、大きな塊である生体由来組織に、細切処理を加えることによって、生体由来組織の内部において一体となっている不純物を表面に露出すること、および露出された不純物を除去することを含む。あらかじめ設定された閾値との比較には、大きな塊を残した生体由来組織を細切するにつれて、表面に露出する不純物が増加していき、あらかじめ設定された閾値を上回ること、または不純物を除去することで、算出された不純物の割合が低下していき、あらかじめ設定された閾値を下回ることを含む。
　解析部は、測定部からの情報を受け取り、その情報から細切されている生体由来組織に対する不純物の割合を算出し、算出された値と閾値を比較して分離状態を判断するプロセッサを少なくとも含むが、記憶部、制御部、入力部および出力部をさらに含んでもよい。記憶部は、測定部からの情報、算出された値、分離状態の判断等を保存する部分であり、種々の電子記憶媒体、例えば、半導体メモリ、ハードディスク等を含む。制御部は、算出された値または分離状態の判断に基づき細切部等に信号を送る部分であり、信号発生回路等を含む。入力部は、本発明のシステムの操作者、システムの他の部分または他のシステムが必要に応じて閾値等の情報を入力する部分であり、種々の入力インターフェース、例えば、電気や光等の信号を他のシステムから受け取る手段（電線、光ファイバー、コネクタ、無線通信装置等）、ボタン、キーボード、タッチパネル等を含む。出力部は、算出された値、分離状態の判断等に基づき、所定の信号を発する部分であり、種々の出力インターフェース、例えば、電気や光等の信号を他のシステムから受け取る手段（電線、光ファイバー、コネクタ、無線通信装置等）、モニタ、プリンタ、表示灯、ブザー、音声合成装置等を含む。入力部と出力部は、入力インターフェースと出力インターフェースを含む、入出力インターフェースとして一体化してもよく、このために汎用コンピュータを利用してもよい。
　本発明のシステムは、さらに学習部を備えることができる。本発明において、「学習部」とは、解析部からの情報に基づき、パラメータの過不足を抽出する部分である。学習部は、細切部のパラメータと、解析部が判断した分離状態、または解析部がその解析過程において、不純物であると認識した部分もしくは不純物でないと認識した部分、または不純物を多く含むと認識した部分等についての解析部からの出力とを関連づけることにより、パラメータの過不足を抽出する。例えば、学習部は、生体由来組織を細切し始め、いまだ生体由来組織が大きな塊として残っているときには、不純物がない、または不純物を多く含まないと認識した部分について、不純物が表面に出ていないため細切回数が不足していると判断することができる。また、解析部が生体由来組織の一部分のみに不純物があると認識した場合に、その部分以外の位置を細切するように判断することができる。
　学習部は、学習記憶部をさらに含んでいてもよい。学習記憶部は、細切部のパラメータと、そのパラメータにおける解析部からの情報を蓄積して保存する部分であり、記憶部と同様に種々の電子記憶媒体を含む。学習部は、学習記憶部に保存されたものを参照して、より高い精度でパラメータの過不足を抽出してもよい。また、学習部は、学習入力部、学習出力部をさらに含んでもよい。学習入力部は、本発明のシステムの操作者、システムの他の部分または他のシステムが必要に応じて細切環境等より効率的、高精度な学習を可能にし得る情報を入力する部分であり、学習出力部は、抽出されたパラメータの過不足に基づき、所定の信号を発する部分である。学習入力部、学習出力部は、夫々、入力部、出力部と同様のインターフェースを含み得る。
　本発明のシステムは、さらに更新部を備えることができる。本発明において、「更新部」とは、学習部によって抽出されたパラメータの過不足に基づいてパラメータを更新する部分である。更新部は、学習部からの情報を受け取って、その情報を反映させた新たなパラメータを作成し、そのパラメータに細切部のパラメータを更新する。更新部は、細切部に出力するための出力インターフェースを備えていてもよく、または細切部と一体化していてもよい。または、更新部は、学習部と一体化しており、学習部からの情報を受け取ってではなく、解析部からの情報に基づき、新規パラメータの作成、細切部のパラメータの更新まで通して行ってもよい。
　本発明のシステムは、さらに攪拌部を備えることができる。本発明において、「攪拌部」とは、細切された生体由来組織を攪拌する部分である。攪拌部は、例えば、生体由来組織が入れられた容器を下から指示しており、容器を振盪、回転等することにより攪拌するものであっても、先端が棒またはへら状になっているロボットであって、その先端部分を動かすことによって攪拌するものであってもよく、またはそれらを組み合わせたものであってもよい。攪拌部は、生体由来組織の細切状態を均一化する機能を有しており、攪拌部が攪拌することによって、生体由来組織のいずれの部分においても不純物の分離状態は等しくなる。したがって、測定部は、生体由来組織の一部分の情報を取得することで、細切されている生体由来組織に対する不純物の割合を算出するのに十分な情報を取得できる。
　本発明のシステムは、さらに除去部を備えることができる。本発明において、「除去部」とは、解析部からの情報に基づき、細切された生体由来組織から不純物を除去する部分である。除去部は、例えば、先端が針やピンセット状になっている、生体由来組織から不純物を除去するロボットである。除去部は、例えば、解析部がその解析過程において、不純物であると認識した部分、または不純物を多く含むと認識した部分等についての解析部からの出力に基づき、不純物を除去する。出力は、解析部に付随する出力部を介して除去部に到達してもよい。一態様において、除去部は、除去作業後にさらに細切するように細切部に出力する、出力インターフェースを含んでいてもよい。
　以上のように、本発明のシステムを構成する各構成要素は、所定の目的を達成することができる範囲で様々な様式で配置することができ、必要に応じて組み合わせたり、一体化することもできる。
　以下に、本発明のシステムを図面を参照してより詳細に説明するが、これは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれに限定されるものではない。
　一態様において、本発明のシステムにおける、生体由来組織からの生細胞の分離は、大きく二段階に分けられる。生体由来組織の細切処理を開始し始めたときは、生体由来組織は大きな塊として残っており、不純物は表面に露出していない。この段階においては、細切処理が進むにつれて、不純物の表面への露出が増えていく。次いで、大きな塊が認められないくらいに生体由来組織が細切されたときは、認識された不純物を除去することが新たに加わる。この段階においては、細切処理、不純物の除去が進むにつれて、認識される不純物は減少していく。
　図１は、本発明のシステムの一態様における、生体由来組織の細切処理を開始し始めたときの、生体由来組織から生細胞を分離するフロー図を示す。本態様においては、システムは、分離の開始指示を受けると、細切部が入力されているパラメータに従って細切処理を開始する。測定部は、細切部の細切処理における、細切されている生体由来組織に関する情報、例えば、不純物の大きさ、不純物の色、細切部にかかる力などを取得する。解析は、それらの細切されている生体由来組織に関する情報から、細切されている生体由来組織に対する不純物の割合を算出する。細切処理が十分に行われると、生体由来組織から大きな塊は認められなくなり、その内側に存在していた不純物も表面に露出していくために、生体由来組織に対する不純物の割合は増加していく。生体由来組織に大きな塊が残っている場合は、生体由来組織に対する不純物の割合はいまだに低く、さらに細切処理を加えることによって、生体由来組織において大きな塊が認められなくなり、生体由来組織に対する不純物の割合は増加する。本発明の一態様において、解析部は、生体由来組織に対する不純物の割合が、あらかじめ設定された閾値を上回ると、本態様における分離が完了した判断することができる。本発明のシステムは分離が完了すると、分離完了信号を出力し、フローを終了させることができる。解析部が分離が完了していないと判断した場合、解析部は、細切部へと信号を出力し、細切部により生体由来組織をさらに細切することができるが、この場合に、解析部からの情報に基づいて、細切のパラメータを変更することができる。パラメータの変更は、本発明の操作者が細切部に入力することによって行われてもよい。一態様において、本発明のシステムは、学習部および更新部をさらに備えており、解析部から学習部へと信号が出力され、これらの部分においてパラメータの変更、および細切部への適用（更新）が行われてもよい。
　図２は、本発明のシステムの一態様における、大きな塊が認められないくらいに生体由来組織が細切されたときの、生体由来組織から生細胞を分離するフロー図を示す。本態様においても図１におけるフローと同様に、システムは、分離の開始指示を受けると、細切部が入力されているパラメータに従って細切処理を開始し、測定部は、細切部の細切処理における、細切されている生体由来組織に関する情報、例えば、不純物の大きさ、不純物の色、細切部にかかる力などを取得し、および解析部は、それらの細切されている生体由来組織に関する情報から、細切されている生体由来組織に対する不純物の割合を算出する。本発明の一態様において、解析部は、生体由来組織に対する不純物の割合が、あらかじめ設定された閾値を下回ると、本態様における分離が完了した判断することができる。本発明のシステムは分離が完了すると、分離完了信号を出力し、フローを終了させることができる。解析部が分離が完了していないと判断した場合、解析部は、除去部へと信号を出力し、除去部による生体由来組織における不純物の除去を行うことができる。除去部は、不純物の除去後に細切部へと信号を出力し、不純物を除去した生体由来組織を、組織内に隠れた不純物を露出させるために、さらに細切することができる。さらなる細切に供された生体由来組織について、測定部は、細切されている生体由来組織に関する情報を取得し、および解析部は、それらの細切されている生体由来組織に関する情報から、細切されている生体由来組織に対する不純物の割合を算出し直し、再度分離の完了を判断する。このようにして、分離が完了するまで、不純物の除去と細切を繰り返すことができる。また、本態様においても、解析部からの情報に基づいて、細切のパラメータを変更することができ、かかる変更は、本発明のシステムの操作者による入力であっても、学習部および更新部によるものであってもよい。
　以上、本発明のシステムの一態様を説明したが、上記以外の様々な態様が可能であることを理解されたい。したがって、上記の態様を、本発明の思想を逸脱しない範囲で改変した種々の態様もまた本発明の範囲に包含され、かかる改変は当業者にとって理解可能である。

Claims (9)

  1. 　生体由来組織から生細胞を分離するためのシステムであって、
    　　パラメータに基づき生体由来組織を細切する細切部
    　　細切されている生体由来組織に関する情報を取得する測定部
    　　測定部により取得された情報から、細切されている生体由来組織に対する不純物の割合を算出する解析部
    を備える前記システム。
  2. 　解析部が、さらに不純物の割合から分離状態を判断する、請求項１に記載のシステム。
  3. 　解析部からの情報に基づき、パラメータの過不足を抽出する学習部をさらに備える、請求項１または２に記載のシステム。
  4. 　学習部によって抽出されたパラメータの過不足に基づいてパラメータを更新する更新部をさらに備える、請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。
  5. 　細切された生体由来組織を攪拌する攪拌部をさらに備える、請求項１～４のいずれか一項に記載のシステム。
  6. 　解析部からの情報に基づき、細切された生体由来組織から不純物を除去する除去部をさらに備える、請求項１～５のいずれか一項に記載のシステム。
  7. 　パラメータが、細切回数、細切角度、細切にかける力、および細切位置の少なくとも１つを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のシステム。
  8. 　細切されている生体由来組織に関する情報が、不純物の色、不純物の大きさ、および細切にかかる力の少なくとも１つを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のシステム。
  9. 　生細胞が、筋芽細胞である、請求項１～８のいずれか一項に記載のシステム。
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