CN116121317A - 一种稳定同位素15n标记l-异亮氨酸的制备方法 - Google Patents

一种稳定同位素15n标记l-异亮氨酸的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种稳定同位素15N标记L‑异亮氨酸的制备方法，包括：选取适用于15N标记的L‑异亮氨酸发酵生产的菌种，菌种包括短杆菌属及棒杆菌属的变异株；配置培养基，对L‑异亮氨酸发酵生产的菌种进行发酵培养；将含有15N标记L‑异亮氨酸的发酵液经离心后采用离子交换法提取分离，得到15N标记的L‑异亮氨酸产品和其他少量L‑丙氨酸‑15N、L‑缬氨酸‑15N、L‑赖氨酸‑15N2产品。与现有技术相比，本发明通过多添加生长因子等来改善发酵配方，促进微生物的生长和代谢，使同位素丰度得到控制，减少了丰度下降的风险，解决了15N的丰度下降问题；对提取分离采用氯化铵溶液梯度洗脱的精细化操作以提高产品得率并得到副产品，来共同提高稳定同位素15N的利用率。

Description

一种稳定同位素15N标记L-异亮氨酸的制备方法
技术领域
本发明涉及稳定同位素标记化合物的研究制备领域，尤其是涉及一种采用微生物发酵和后续分离提取法制备稳定同位素15N标记的L-异亮氨酸的方法。
背景技术
L-异亮氨酸是人体八大必需氨基酸之一，属于支链氨基酸，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中有特别重要的作用，在当今社会的应用越来越广泛，已被应用于医药、化妆品、食品和饲料等领域。而15N标记的L-异亮氨酸作为示踪剂被广泛用于生命科学、基因组学、蛋白质组学、代谢工程以及相关的氨基酸代谢机理研究等方面，有广阔的应用前景。
氨基酸的传统生产方法有提取法(蛋白质水解法)、有机合成法、酶法和发酵法等。从理论上说这些方法都可以用来制备稳定同位素标记的产品。但提取法常用于制备标记的复合氨基酸，如今由于受到原料限制已很少使用。采用有机合成法制备L-氨基酸若不是采用手性合成法得到的产品是DL消旋型的，还需要光学拆分才能得到L-型的产品，由于异亮氨酸具有2个不对称碳原子因而有4种旋光异构体而L型的产品只占了1/4，这就使15N稳定同位素的原料利用率大为降低，成本显著上升。酶法制备标记的L-氨基酸需要得到合适的稳定同位素标记的底物和可用的酶源，且标记底物又少又贵也不易得到。而微生物发酵法则在合适的氨基酸产生菌的存在下辅以良好的生产工艺便可得到稳定同位素标记的氨基酸，有一定的优越性。
同样对制备15N标记的L-异亮氨酸而言，采用微生物直接发酵的生产工艺是最绿色环保最优越的。微生物发酵法是工业上生产L-异亮氨酸的主要方法，关于发酵法生产L-异亮氨酸的研究报道很多，但在关于用生物合成法研究稳定同位素15N标记的L-异亮氨酸的生产领域中很少见有专利和文献报道。
由于种子、发酵配方中存在玉米浆等有机氮源，会稀释稳定同位素15N的丰度，如不加以优化控制，会使产品的同位素丰度大为降低而达不到产品的质量要求。
由于L-异亮氨酸是支链中性氨基酸，而发酵液中存在有不同的酸性、中性和碱性氨基酸，从分离的角度来说中性氨基酸是最难被分离出来的。L-异亮氨酸-15N发酵液中还存在同样是支链中性氨基酸的L-缬氨酸-15N，以及L-丙氨酸-15N等中性氨基酸、L-赖氨酸-15N2等碱性氨基酸。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种既解决15N丰度下降问题、又提高了产品得率及同位素利用率并能同时获得副产的其他15N标记氨基酸的制备方法，本发明采用微生物发酵法制备L-异亮氨酸-15N，通过对发酵液进行提取分离得到产品，上游对发酵工艺进行优化以控制产品的丰度下降，下游需对分离提取精细化操作以提高产品得率，来共同提高稳定同位素15N的利用率。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供了一种稳定同位素15N标记L-异亮氨酸的制备方法，包括以下步骤：
选取适用于15N标记的L-异亮氨酸发酵生产的菌种，所述菌种包括短杆菌属及棒杆菌属的变异株；
配置培养基，对L-异亮氨酸发酵生产的菌种进行发酵培养；
发酵培养结束后，将含有15N标记L-异亮氨酸的发酵液经离心后采用离子交换法提取分离，发酵液上柱后采用氯化铵溶液进行梯度洗脱得到15N标记的L-异亮氨酸的单斑洗脱液及其他少量L-丙氨酸-15N、L-缬氨酸-15N、L-赖氨酸-15N2的单斑洗脱液，分别浓缩后再上柱除盐氨水洗脱，洗脱液经真空浓缩赶氨、脱色，所得滤液再浓缩后用乙醇和水进行结晶，真空烘干，最终得到15N标记的L-异亮氨酸产品和其他少量L-丙氨酸-15N、L-缬氨酸-15N、L-赖氨酸-15N2产品。
进一步地，所述梯度洗脱时采用氯化铵溶液的浓度为0.02～0.50mol/L。
进一步地，所述氯化铵溶液的梯度数为4～8。
进一步地，所述真空烘干的温度为50℃～60℃。
进一步地，所述菌种选自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicium)ATCC21799，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)HL41，钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)AS1.998，天津短杆菌(Brevibacterium tientsienes)T6-13，北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)1.299中的一种。
进一步地，所述培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基、种子培养基、发酵培养基。
进一步地，所述发酵培养基中：
以葡萄糖为碳源，初始配方中葡萄糖浓度为8％～15％；
以铵盐为初始氮源，发酵中以尿素或氨水作为补充氮源；
以柠檬酸钠、生长因子生物素(VH)、盐酸硫胺(VB1)、泛酸钙(VB5)、维生素B12(VB12)作为代谢调节因子；
还添加有无机盐。
进一步地，所述铵盐选自硫酸铵、醋酸铵、硝酸铵、氯化铵中的一种或多种；
所述无机盐选自磷酸盐、镁盐、亚铁盐、锰盐中的一种或多种。
进一步地，所述的发酵培养基的配方(g/L)为：
葡萄糖100～150，硫酸铵20～40或醋酸铵25～45，玉米浆2mL～15mL，柠檬酸钠1～3，K2HPO4 1.0，MgSO4 0.25，FeSO4·7H2O 0.02，MnSO4·4H2O 0.02；
还包括VH 10～100μg/L，VB1 100～500μg/L，泛酸钙(VB5)1～5mg/L，维生素B12(VB12)1～8mg/L，CaCO3 40g/L；
培养基pH为7.0～7.2。
进一步地，所述发酵培养采用摇瓶发酵或发酵罐发酵；
所述摇瓶发酵过程为：
将菌体接种于活化培养基斜面或平板上，在28℃-32℃的培养箱中培养16～24小时，再将长好的菌体接一环于发酵培养基中，500mL三角瓶的装液量为20～30mL，摇床发酵控制条件为：发酵培养温度28℃～32℃，旋转式摇床转速180～240r/min，连续发酵60～72小时；
所述发酵罐发酵过程为：
将菌体接种于活化培养基斜面或平板上，在28℃～32℃的培养箱中培养16～24小时，再将长好的菌体接种于装有种子培养基的摇瓶中，于28℃～32℃摇床培养16～24小时，摇床转速180～220r/min，得到的种子培养液按体积比5％～10％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中进行培养，发酵罐控制条件为：将种子液接入5L自动控制发酵罐中，发酵温度28℃～32℃，初始pH6.8～7.2，通气量0.5～1.5VVM，罐压0.02～0.05Mpa，溶解氧1～90％，搅拌转速500r/min，通过流加15N标记的氨水或尿素溶液控制pH 6.9～7.2。
与现有技术相比，本发明具有以下技术优势：
1)本技术方案在制备的下游基于15N原料的昂贵旨在尽量提高分离得率并尽可能把副产品也分离得到，对提取分离采用氯化铵溶液梯度洗脱的精细化操作，比采用单一氯化铵浓度洗脱的分离得率高很多，使得L-异亮氨酸-15N的提取得率达到75％以上(而采用单一浓度洗脱得率约50％)，目的氨基酸L-异亮氨酸-15N单斑组分很多，与别的氨基酸组分交叉重叠少，既提高了产品得率又得到了副产品，大大提高了稳定同位素15N的利用率，降低了生产成本，使产品更有市场竞争力。
2)本技术方案在上游采用的发酵工艺适合制备15N标记的L-异亮氨酸，在该工艺条件下15N标记的L-异亮氨酸的产酸率比采用全合成培养基的相应提高10％～50％，效果明显。通过控制碳源葡萄糖、无机氮源硫酸铵、醋酸铵、硝酸铵、氯化铵等以及降低有机氮源玉米浆等的添加量，添加柠檬酸钠、生物素(VH)、盐酸硫胺(VB1)、泛酸钙(VB5)以及维生素B12等物质，改善了发酵配方。既使同位素丰度得到了控制，减少了丰度下降的风险，又保证了产酸率，使同位素原料得到有效利用。
3)本发明可利用不同丰度规格的原料来制备不同规格的产品，满足各种丰度需求。
具体实施方式
本发明涉及一种稳定同位素15N标记的-L异亮氨酸的制备方法，该方法包括发酵菌种选取、发酵培养基配制、发酵工艺和分离提取精制等。与现有技术相比，本发明采用的生产工艺是适合15N标记的L-异亮氨酸制备的，利用微生物直接发酵法来生产，上游通过多添加生长因子等来改善发酵配方，促进微生物的生长和代谢，使同位素丰度得到控制，减少了丰度下降的风险，解决了15N的丰度下降问题，丰度下降<0.4％。下游对提取分离采用氯化铵溶液梯度洗脱的精细化操作以提高产品得率并得到副产品，来共同提高稳定同位素15N的利用率，降低了生产成本，可满足产品不同规格的市场需求。
具体地，本发明中适用于稳定同位素15N标记的L-异亮氨酸的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)发酵菌种的选取
生产L-异亮氨酸的菌株主要是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicium)，含其亚种乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)和黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，还有钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)和大肠杆菌(Escherichia coli)。谷氨酸棒杆菌具有无内毒素、代谢同工酶少，有利于解除反馈抑制或转录衰减以及关键代谢酶抗反馈抑制能力强等特点，使得该菌及其亚种如乳糖发酵短杆菌和黄色短杆菌等被研究得更多。
选取适用于15N标记的L-异亮氨酸发酵生产的菌种包括短杆菌属及棒杆菌属的变异株，具体如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicium)ATCC21799，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)HL41，钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS1.998,天津短杆菌(Brevibacterium tientsienes)T6-13，北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)1.299等。
(2)发酵培养基配方
以全合成培养基为基本培养基，添加少量有机氮源如玉米浆等，再辅以生长因子。以葡萄糖为碳源，初始配方中葡萄糖浓度为8％～15％；以硫酸铵、醋酸铵、硝酸铵、氯化铵等铵盐为初始氮源，发酵中可流加尿素或氨水以补充氮源，不添加或添加极少量的玉米浆、豆饼水解液、菌体水解液等有机氮源中的一种或多种。无机盐如磷酸盐、镁盐、亚铁盐、锰盐的添加量可随菌种不同而不同，另外添加代谢调节因子柠檬酸钠、生长因子生物素(VH)、盐酸硫胺(VB1)、泛酸钙(VB5)以及维生素B12(VB12)等。
(3)发酵工艺
采用摇瓶发酵或发酵罐发酵得到发酵液，工艺如下：
摇瓶发酵：将菌体接种于活化培养基斜面或平板上，在28℃-32℃的培养箱中培养16～24小时，再将长好的菌体接一环于发酵培养基中，500mL三角瓶的装液量为20～30mL。摇床发酵控制条件为：发酵培养温度28℃～32℃，旋转式摇床转速180～240r/min，连续发酵60～72小时。
发酵罐发酵：将菌体接种于活化培养基斜面或平板上，在28℃～32℃的培养箱中培养16～24小时，再将长好的菌体接种于装有种子培养基的摇瓶中，于28℃～32℃摇床培养16～24小时，摇床转速180～220r/min，得到的种子培养液按体积比5％～10％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中进行培养，发酵罐控制条件为：将种子液接入5L自动控制发酵罐(发酵液溶氧自动显示、温度和pH值自动控制)中，发酵温度28℃～32℃，初始pH6.8～7.2，通气量0.5～1.5VVM，罐压0.02～0.05Mpa，溶解氧1～90％，搅拌转速500r/min，通过流加15N标记的氨水或尿素溶液控制pH 6.9～7.2。发酵过程泡沫较多时,加入已灭菌的泡敌数滴即可迅速消泡，发酵时间52～72小时。
(4)分离提取
发酵培养结束后，将含有15N标记L-异亮氨酸的发酵液经离心后采用离子交换法提取分离，发酵液上柱后采用0.02～0.50mol/L的氯化铵溶液进行梯度洗脱得到15N标记的L-异亮氨酸的单斑洗脱液及其他少量L-丙氨酸-15N、L-缬氨酸-15N、L-赖氨酸-15N2的单斑洗脱液，分别浓缩后再上柱除盐氨水洗脱，洗脱液经真空浓缩赶氨、脱色，所得滤液再浓缩后用乙醇和水进行结晶，于50℃～60℃真空烘干，最终得到15N标记的L-异亮氨酸产品和其他少量L-丙氨酸-15N、L-缬氨酸-15N、L-赖氨酸-15N2产品。
步骤(2)中的培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基、种子培养基、发酵培养基。
斜面保藏培养基(g/L)为：蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 5.0，琼脂20，pH7.0～7.2。
斜面活化培养基(g/L)为：葡萄糖5.0，蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 5.0，琼脂20，pH7.0～7.2。
种子培养基(g/L)为：葡萄糖25，硫酸铵5或醋酸铵6，K2HPO4 1.0，MgSO40.25，玉米浆5～20，CaCO3 10，pH7.0～7.2。
发酵培养基配方(g/L)为：葡萄糖100～150，硫酸铵20～40或醋酸铵25～45，玉米浆2mL～15mL，柠檬酸钠1～3，K2HPO4 1.0，MgSO4 0.25，FeSO4·7H2O0.02，MnSO4·4H2O0.02，VH 10～100μg，VB1 100～500μg，泛酸钙(VB5)1～5mg/L，维生素B12(VB12)1～8mg/L，CaCO3 40，pH7.0～7.2。
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。本技术方案中如未明确说明的制备手段、材料、结构或组成配比等特征，均视为现有技术中公开的常见技术特征。
实施例中稳定同位素15N的丰度采用同位素专用质谱仪测定，产品的纯度采用HPLC法测定。
实施例1
以天津短杆菌(Brevibacterium tientsienes)T6-13为出发菌株，使用的培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基和丰度摇瓶发酵培养基。斜面保藏培养基、斜面活化培养基同常规普通发酵的，配方如下：
斜面保藏培养基(g/L)为：蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 5.0，琼脂20，pH7.0～7.2。
斜面活化培养基(g/L)为：葡萄糖5.0，蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 5.0，琼脂20,pH7.0～7.2。
以上培养基均用浓度为2mol/L的NaOH调节pH，121℃灭菌20分钟。
低丰度发酵培养基配方(g/L)如下：
葡萄糖150，氯化铵-15N(15N丰度10.15％)25，MgSO4 0.25，K2HPO4 1.0，生物素100μg/L，盐酸硫胺500μg/L，泛酸钙(VB5)3mg/L，维生素B12 5mg/L，玉米浆3mL/L，柠檬酸钠1.5，MnSO4.4H2O 0.02，FeSO4.7H2O 0.02，CaCO3 40。
以上发酵培养基用浓度为2mol/L的KOH调节pH至7.0～7.2，115℃灭菌15分钟，CaCO3分消。装液量为20mL/500mL三角瓶，共配制5瓶，计0.1L。
将菌体接种于活化培养基斜面上，在30℃的培养箱中培养22小时，将长好的菌体接种于装有发酵培养基的摇瓶中于摇床上进行培养，旋转式摇床转速200r/min，培养温度30℃，连续发酵70小时，产酸达15.2g/L。发酵培养结束后，将发酵液用浓度为2mol/L的HCl调节pH至2～3，于离心机上4000r/min离心20分钟，所得上清液上732H型树脂柱，经水洗及0.02、0.05、0.10、0.20、0.40mol/L的氯化铵梯度洗脱后，分离得到15N标记的L-异亮氨酸的单斑洗脱液，以及少量的L-丙氨酸-15N、L-缬氨酸-15N、L-赖氨酸-15N2的单斑洗脱液，分别经真空浓缩再上柱除盐后洗脱，洗脱液再赶氨、脱色，所得滤液再浓缩后用乙醇和水进行结晶，于50℃～60℃真空烘干，最终得到15N标记的L-异亮氨酸产品0.85克，L-丙氨酸-15N0.13克、L-缬氨酸-15N 0.11克、L-赖氨酸-15N2 0.18克，产品的15N丰度为10.12％，下降幅度较小，可以进行高丰度产品的制备。产品的纯度经HPLC检测大于98.5％。
实施例2
以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicium)ATCC21799为出发菌株，使用的培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基、丰度摇瓶发酵培养基。斜面保藏培养基、斜面活化培养基同常规普通发酵的，配方如下：
斜面保藏培养基(g/L)为：蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 5.0，琼脂20，pH7.0～7.2。
斜面活化培养基(g/L)为：葡萄糖5.0，蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 5.0，琼脂20,pH7.0～7.2。
以上培养基均用浓度为2mol/L的NaOH调节pH，121℃灭菌20分钟。
高丰度发酵培养基配方(g/L)如下：
葡萄糖120，醋酸铵-15N(15N丰度99.60％)35，MgSO4 0.25，K2HPO4 1.0，生物素80μg/L，盐酸硫胺200μg/L，泛酸钙(VB5)2mg/L，维生素B12 4mg/L，玉米浆2.0mL/L，柠檬酸钠2，MnSO4.4H2O 0.02，FeSO4.7H2O 0.02，CaCO340。
以上发酵培养基用浓度为2mol/L的KOH调节pH至7.0～7.2，115℃灭菌15分钟，CaCO3分消。装液量为25mL/500mL三角瓶，共配制40瓶计1.0L。
将菌体接种于活化培养基平板上，在29℃的培养箱中培养24小时，将长好的菌体接一环于装有发酵培养基的三角瓶中。摇床发酵控制条件为：发酵培养温度31℃，旋转式摇床转速220r/min，连续发酵72小时，产酸达16.3g/L。发酵培养结束后，将含有15N标记的L-异亮氨酸的发酵液用草酸调节pH至2～3，于离心机上4000r/min离心30分钟，所得上清液上732H型树脂柱，经水洗及0.05、0.10、0.20、0.30、0.40mol/L的氯化铵梯度洗脱后，分离得到大量15N标记的L-异亮氨酸的单斑洗脱液以及少量的L-丙氨酸-15N、L-缬氨酸-15N、L-赖氨酸-15N2的单斑洗脱液，分别经真空浓缩再上柱除盐后洗脱，洗脱液再赶氨、脱色，所得滤液再浓缩后用乙醇和水进行结晶，于50℃～60℃真空烘干，最终得到15N标记的L-异亮氨酸产品9.48克，L-丙氨酸-15N 1.19克、L-缬氨酸-15N 0.95克、L-赖氨酸-15N2 1.28克，产品的丰度经同位素质谱仪检测为：15N 99.23％。产品的纯度经HPLC检测大于98.5％。
实施例3
以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS1.998为出发菌株，使用的培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基、丰度种子培养基和丰度发酵培养基。斜面保藏培养基、斜面活化培养基同常规普通发酵的，配方如下：
斜面保藏培养基(g/L)为：蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 5.0，琼脂20，pH7.0～7.2。
斜面活化培养基(g/L)为：葡萄糖5.0，蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 5.0，琼脂20,pH7.0～7.2。
以上培养基均用浓度为2mol/L的NaOH调节pH，121℃灭菌20分钟。
种子培养基(g/L)为：葡萄糖25，硫酸铵-15N2(15N丰度98.90％)5，K2HPO41.0，MgSO40.25，玉米浆5～20，CaCO3 10，pH7.0～7.2，115℃15min灭菌。
高丰度发酵培养基配方(g/L)如下：
葡萄糖125，硫酸铵-15N2(15N丰度98.90％)30，MgSO4 0.25，K2HPO4 1.0，生物素100μg/L，盐酸硫胺200μg/L，泛酸钙(VB5)1mg/L，维生素B12 2mg/L玉米浆2.5mL/L，柠檬酸钠1，MnSO4·4H2O 0.02，FeSO4·7H2O 0.02，共配制2.5L。以上发酵培养基用浓度为2mol/L的KOH调节pH至7.0，115℃发酵罐在线灭菌。
发酵罐发酵：将菌体接种于活化培养基平板上，31℃培养20小时，再将长好的菌体接种于装有种子培养基的摇瓶中，于31℃摇床培养18小时，摇床转速220r/min，得到的种子培养液按体积比8％的接种量接入装有高丰度发酵培养基的5L自动控制发酵罐中进行培养，发酵罐控制条件为：发酵温度28℃～32℃，初始pH7.0，通气量0.5～1.5VVM，罐压0.02～0.05Mpa，溶解氧20～40％，搅拌转速500r/min，通过流加15N标记的氨水或尿素溶液控制pH6.9～7.2。发酵过程泡沫较多时,加入已灭菌的泡敌数滴即可迅速消泡，连续发酵64小时，产酸达17.1g/L。发酵培养结束后，将含有15N标记的L-异亮氨酸的发酵液用浓度为2mol/L的HCl调节pH至2～3，于离心机上4000r/min离心30分钟，所得上清液上732H型树脂柱，经水洗及0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mol/L的氯化铵梯度洗脱后，分离得到大量15N标记的L-异亮氨酸的单斑洗脱液以及少量的L-丙氨酸-15N、L-缬氨酸-15N、L-赖氨酸-15N2的单斑洗脱液，再分别经真空浓缩后上柱除盐氨水洗脱，洗脱液再赶氨、脱色，所得滤液再浓缩后用乙醇和水进行结晶，于50℃～60℃真空烘干，最终得到15N标记的L-异亮氨酸产品27.63克，L-丙氨酸-15N 3.86克、L-缬氨酸-15N 2.49克、L-赖氨酸-15N2 3.30克，产品的丰度经同位素质谱仪检测为：15N98.66％。产品的纯度经HPLC检测大于98.5％。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种稳定同位素15N标记L-异亮氨酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
选取适用于15N标记的L-异亮氨酸发酵生产的菌种，所述菌种包括短杆菌属及棒杆菌属的变异株；
配置培养基，对L-异亮氨酸发酵生产的菌种进行发酵培养；
发酵培养结束后，将含有15N标记L-异亮氨酸的发酵液经离心后采用离子交换法提取分离，发酵液上柱后采用氯化铵溶液进行梯度洗脱得到15N标记的L-异亮氨酸的单斑洗脱液及其他少量L-丙氨酸-15N、L-缬氨酸-15N、L-赖氨酸-15N2的单斑洗脱液，分别浓缩后再上柱除盐氨水洗脱，洗脱液经真空浓缩赶氨、脱色，所得滤液再浓缩后用乙醇和水进行结晶，真空烘干，最终得到15N标记的L-异亮氨酸产品和其他少量L-丙氨酸-15N、L-缬氨酸-15N、L-赖氨酸-15N2产品。
2.根据权利要求1所述的一种稳定同位素15N标记L-异亮氨酸的制备方法，其特征在于，所述梯度洗脱时采用氯化铵溶液的浓度为0.02～0.50mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种稳定同位素15N标记L-异亮氨酸的制备方法，其特征在于，所述氯化铵溶液的梯度数为4～8。
4.根据权利要求1所述的一种稳定同位素15N标记L-异亮氨酸的制备方法，其特征在于，所述真空烘干的温度为50℃～60℃。
5.根据权利要求1所述的一种稳定同位素15N标记L-异亮氨酸的制备方法，其特征在于，所述菌种选自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicium)ATCC21799，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)HL41，钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS1.998，天津短杆菌(Brevibacterium tientsienes)T6-13，北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)1.299中的一种。
6.根据权利要求1所述的一种稳定同位素15N标记L-异亮氨酸的制备方法，其特征在于，所述培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基、种子培养基、发酵培养基。
7.根据权利要求1所述的一种稳定同位素15N标记L-异亮氨酸的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基中：
以葡萄糖为碳源，初始配方中葡萄糖浓度为8％～15％；
以铵盐为初始氮源，发酵中以尿素或氨水作为补充氮源；
以柠檬酸钠、生长因子生物素(VH)、盐酸硫胺(VB1)、泛酸钙(VB5)、维生素B12(VB12)作为代谢调节因子；
还添加有无机盐。
8.根据权利要求7所述的一种稳定同位素15N标记L-异亮氨酸的制备方法，其特征在于，所述铵盐选自硫酸铵、醋酸铵、硝酸铵、氯化铵中的一种或多种；
所述无机盐选自磷酸盐、镁盐、亚铁盐、锰盐中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的一种稳定同位素15N标记L-异亮氨酸的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基的配方(g/L)为：
葡萄糖100～150，硫酸铵20～40或醋酸铵25～45，玉米浆2mL～15mL，柠檬酸钠1～3，K2HPO4 1.0，MgSO4 0.25，FeSO4·7H2O 0.02，MnSO4·4H2O 0.02；
还包括：VH 10～100μg/L，VB1 100～500μg/L，泛酸钙(VB5)1～5mg/L，维生素B12(VB12)1～8mg/L，CaCO3 40g/L；
培养基pH为7.0～7.2。
10.根据权利要求8所述的一种稳定同位素15N标记L-异亮氨酸的制备方法，其特征在于，所述发酵培养采用摇瓶发酵或发酵罐发酵；
所述摇瓶发酵过程为：
将菌体接种于活化培养基斜面或平板上，在28℃-32℃的培养箱中培养16～24小时，再将长好的菌体接一环于发酵培养基中，500mL三角瓶的装液量为20～30mL，摇床发酵控制条件为：发酵培养温度28℃～32℃，旋转式摇床转速180～240r/min，连续发酵60～72小时；
所述发酵罐发酵过程为：
将菌体接种于活化培养基斜面或平板上，在28℃～32℃的培养箱中培养16～24小时，再将长好的菌体接种于装有种子培养基的摇瓶中，于28℃～32℃摇床培养16～24小时，摇床转速180～220r/min，得到的种子培养液按体积比5％～10％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中进行培养，发酵罐控制条件为：将种子液接入5L自动控制发酵罐中，发酵温度28℃～32℃，初始pH6.8～7.2，通气量0.5～1.5VVM，罐压0.02～0.05Mpa，溶解氧1～90％，搅拌转速500r/min，通过流加15N标记的氨水或尿素溶液控制pH 6.9～7.2。
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