CN116120354A - 一种荧光开启型探针及其制备方法与应用 - Google Patents
一种荧光开启型探针及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及发光材料领域，公开了一种荧光开启型探针及其制备方法与应用。本发明提供的荧光开启型探针是一种具备四嗪结构的氟硼类化合物，氟硼类化合物凭借氟硼结构可发荧光，在氟硼化合物结构中特定位置与四嗪结构连接后，使得在未工作前，将氟硼结构的荧光淬灭，荧光探针工作时，可使四嗪结构破坏，实现荧光开启。本发明提供的荧光开启型探针不仅保留了四嗪结构原有的生物正交活性，同时具有分子量小、背景信号低、荧光激活灵敏高效等优势。
Description
技术领域
本发明涉及发光材料领域，尤其涉及一种荧光开启型探针及其制备方法与应用。
背景技术
用荧光探针标记生物活性物质可实现在活体状态下对生命活动和病理过程的实时可视化。
生物正交反应(biorthogonalreaction)是在生理条件下高效、特异性地发生的一类化学反应，与体内其它生化反应不发生相互干扰，因其生物兼容性好、特异性强、反应高效等特点吸引了化学生物学、医学影像学、药学等科学家的广泛关注，在化学生物学、蛋白质组学、基因工程等领域获得广泛应用。
1,2,4,5-四嗪类化合物凭借其良好的生物正交性能，现已广泛应用于荧光活性探针的构建。因此，本团队研究人员试图以四嗪结构为基础，构建一种具备良好生物正交性能的荧光探针。有机氟硼化合物作为常用的荧光染料结构具有斯托克斯位移大，量子产率高和化学稳定性强等特点，本团队研究人员通过不断筛选，将以四嗪为基础结构构建氟硼类化合物的荧光探针。目前对于该类探针的研究还未见报道。
基于此，为了提供一种新的荧光激活灵敏高效并具备良好生物正交性能的荧光探针，以实现在活体状态下对生命活动和病理过程的实时可视化，本研究团队研究开发了一种以四嗪为基础结构构建氟硼类化合物的荧光探针及其制备方法。
发明内容
为了解决上述荧光探针荧光激活灵敏高效且具备良好生物正交性能的技术问题，本发明的目的之一在于提供一种荧光开启型探针，本发明提供的荧光开启型探针是一种具备四嗪结构的氟硼类化合物，氟硼结构可发荧光，在氟硼化合物结构中特定位置与四嗪结构连接后，四嗪基团通过荧光共振能量转移将氟硼结构的荧光淬灭，荧光探针工作时，可使四嗪结构破坏，实现荧光开启。本发明提供的荧光开启型探针可以根据需要实现荧光的开启。
基于此，本发明的另一目的在于提供一种荧光开启型探针的制备方法，并给出所述荧光开启型探针的应用启示。
本发明的具体技术方案为：
一方面，本发明提供了一种荧光开启型探针，本发明提供的荧光开启型探针具有如式(1)所示的结构：
其中，R1为-H或-OMe；R2选自-CH3、
氟硼类化合物凭借氟硼结构可发荧光。本发明提供的荧光开启型探针，在氟硼化合物结构中特定位置与四嗪结构连接后，使得在未工作前，将氟硼结构的荧光淬灭，荧光探针工作时，可使四嗪结构破坏，实现荧光开启。本发明提供的荧光开启型探针可以根据现实需要在必要时实现荧光的开启。本研究团队以四嗪为基础结构制备得到的氟硼类化合物荧光探针，不仅保留了四嗪结构原有的生物正交活性，同时具有分子量小、背景信号低、荧光激活灵敏高效等优势。
作为本发明的优选，荧光开启型探针具有如式1a或1b或2a或2b所示的结构：
对1a、1b、2a、2b进行荧光开启后的荧光性质检测发现，1a开启后荧光增强倍数可达333倍，1b开启后荧光增强倍数可达347倍，2a开启后荧光增强倍数可达526倍，2b开启后荧光增强倍数可达582倍。
另一方面，本发明提供了一种上述荧光开启型探针的制备方法，该方法包括以下步骤：取四嗪酚类化合物溶于溶剂，加入乙酸、三氟化硼乙醚，搅拌反应，冷却析出固体得到所述荧光开启型探针。
具体地，所述四嗪酚类化合物具有如式(2)所示的结构：
作为优选，四嗪酚类化合物、乙酸、三氟化硼乙醚的摩尔比为2:25-30:4-6，作为优选，反应的溶剂为甲苯，反应的温度为60～70℃，时间为3～4h。
具体地，本发明给出了四嗪酚类化合物的制备方法。
当四嗪酚类化合物为：
时，四嗪酚类化合物的制备方法包括以下步骤：
S1：将乙腈与苯甲腈，或将乙腈与对甲氧基苯甲腈溶于溶剂，加入催化剂及水合肼，搅拌反应后，将反应液加入亚硝酸钠溶液中，加入盐酸调节pH，萃取，收集有机相干燥，纯化得到四嗪底物。所述四嗪底物为化合物(2)，其结构如式(2)所示。反应方程式如下：
其中，R1为-H或4-OMe。
作为优选，苯甲腈或对甲氧基苯甲腈、乙腈、三氟甲烷磺酸锌、水合肼、亚硝酸钠的物质的量之比为1:9.5～10.5:0.4～0.6:48～53:18～23。
作为优选，溶剂为二氧六环。溶剂的体积以溶于其中的物质的量计，优选地，溶剂的体积为0.8-1.2mL/mmol。
作为优选，用乙酸乙酯和水进行萃取。
作为优选，纯化方法为：用无水硫酸钠干燥、过滤、取滤液真空浓缩，经硅胶柱层析进一步纯化得到四嗪底物。硅胶柱层析所用的洗脱液为体积比为10:1的石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂。
S2：将四嗪底物(步骤S1制备得到的化合物(2))、碘苯二乙酸、醋酸钯溶于乙酸与乙酸酐混合溶剂中，搅拌反应后，萃取，收集有机相干燥，纯化得中间体。中间体为化合物(3)，其结构如式(3)所示，反应方程式如下：
作为优选，步骤S2中乙酸与乙酸酐混合溶剂中乙酸与乙酸酐的体积比为1:1。
作为优选，化合物(2)、碘苯二乙酸、醋酸钯的物质的量之比为1:1.5～2.5:0.05～0.1。
作为优选，溶剂的体积以溶于其中的物质的量计，溶剂的体积为0.5-2.5mL/mmol。
作为优选，所述萃取为用二氯甲烷和水以及二氯甲烷和饱和碳酸氢钠溶液各萃取2次。
作为优选，纯化方法为：用无水硫酸钠干燥、过滤、取滤液真空浓缩，经硅胶柱层析进一步纯化得到化合物(3)。硅胶柱层析所用的洗脱液为体积比为3:1的石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂。
S3：将中间体化合物(3)溶于甲醇、水、二氯甲烷的混合溶剂中，加入无水碳酸钠，并控制pH为碱性，反应，萃取，收集有机相，干燥，浓缩得到所述四嗪酚类化合物。反应方程式如下：
作为优选，步骤S3中混合溶剂中甲醇、水、二氯甲烷的的体积比为10:10:1。
作为优选，步骤S3中所述pH为10-12。
作为优选，用二氯甲烷和水进行萃取。
当四嗪酚类化合物为：
其中，R为
四嗪酚类化合物的制备方法包括以下步骤：
(1)制备
将甲氧基乙腈与苯甲腈溶于溶剂，加入催化剂及水合肼，搅拌反应后，将反应液加入亚硝酸钠溶液中，加入盐酸调节pH，萃取，收集有机相，纯化。反应方程式如下：
作为优选，步骤(1)中催化剂为三氟甲烷磺酸锌。苯甲腈、甲氧基乙腈、三氟甲烷磺酸锌、水合肼、亚硝酸钠的物质的量之比为1:2.5～3.5:0.4～0.6:48～53:18～23。
作为优选，溶剂为二氧六环。以溶于其中的物质的量计，溶剂的体积为0.5-2.5mL/mmol。
作为优选，盐酸调节pH至3-4。
作为优选，用乙酸乙酯和水进行萃取。
作为优选，纯化方法为：用无水硫酸钠干燥、过滤、取滤液真空浓缩，经硅胶柱层析进一步纯化。硅胶柱层析所用的洗脱液为体积比为4:1的石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂。
(2)制备
①将(1)中制备得到化合物溶于溶剂，冰水浴下加入三溴化硼反应后，加入甲醇淬灭，DCM萃取，收集有机相，旋蒸除去溶剂得中间体A。中间体A的结构如式(7)所示，反应方程式如下：
作为优选，(1)中制备得到化合物、三溴化硼的物质的量之比为1:4.5～5.5。
作为优选，溶剂为二氯甲烷。以溶于其中的四嗪底物的物质的量计，溶剂的体积为0.2-1.0mL/mmol。
②取中间体A、溴代丁二酰亚胺、三苯基膦溶于溶剂，搅拌反应，萃取，收集有机相，得中间体B。中间体B的结构如式(8)所示，反应方程式如下：
作为优选，中间体A、溴代丁二酰亚胺、三苯基膦的物质的量之比为1:2.7～3.5:0.9～1.1。
作为优选，溶剂为二氯甲烷。以溶于其中的四嗪底物的物质的量计，溶剂的体积为0.5-2.0mL/mmol。
③取中间体B与亚磷酸三乙酯溶于溶剂，搅拌反应，萃取，收集有机相，纯化。反应方程式如下：
作为优选，步骤③中中间体B与亚磷酸三乙酯的物质的量之比为1:1.5～3。
作为优选，溶剂为二氯乙烷。以溶于其中的四嗪底物的物质的量计，溶剂的体积为0.5-1.5mL/mmol。
作为优选，用DCM与水进行萃取。
作为优选，纯化方法为：用无水硫酸钠干燥、过滤、取滤液旋蒸除去溶剂，然后用硅胶柱层析进一步纯化。硅胶柱层析所用的洗脱液为体积比为2:1的石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂。
(3)制备
将(2)中制备得到化合物与苯甲醛，或(2)中制备得到化合物与3-甲氧基-苯甲醛溶于溶剂，加入催化剂，搅拌反应后，萃取，收集有机相，纯化。反应方程式如下：
作为优选，步骤(1)中催化剂为DBU和溴化锂。(2)中制备得到化合物、R-CHO、DBU、溴化锂的物质的量之比为1:0.8～1.0:1.0～1.2:1.0～1.2。
作为优选，溶剂为四氢呋喃。以溶于其中的物质的量计，溶剂的体积为0.5-2.5mL/mmol。
作为优选，用乙酸乙酯和水进行萃取。
作为优选，纯化方法为：用无水硫酸钠干燥、过滤、取滤液真空浓缩，经硅胶柱层析进一步纯化。硅胶柱层析所用的洗脱液为体积比为20:1的石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂。
(4)制备
将(3)中制备得到化合物、碘苯二乙酸、醋酸钯溶于乙酸与乙酸酐混合溶剂，搅拌反应，萃取，收集有机相，纯化后溶于甲醇、水、二氯甲烷混合溶剂中，加入无水碳酸钠，并控制pH为碱性，反应，再次萃取，干燥，浓缩得到所述四嗪酚类化合物。反应方程式如下：
作为优选，步骤(4)中混合溶剂中乙酸与乙酸酐的体积比为1:1。(3)中制备得到化合物、碘苯二乙酸、醋酸钯的物质的量之比为1:1.5～2.5:0.05～0.1。
作为优选，纯化方法为：用无水硫酸钠干燥、过滤、取滤液真空浓缩，经硅胶柱层析进一步纯化。硅胶柱层析所用的洗脱液为体积比为5:1的石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂。
作为优选，步骤(4)中混合溶剂中甲醇、水、二氯甲烷的体积比为10:10:1。
作为优选，步骤(4)中控制pH为10-12。
作为优选，步骤(4)中所述萃取二氯甲烷和水以及二氯甲烷和饱和碳酸氢钠溶液各萃取2次；所述再次萃取为用二氯甲烷和水进行萃取。
为实现根据需要开启本发明提供探针的荧光发光，本发明提供了荧光开启型探针的开启方法及应用，例如，与亲二烯体的IEDDA反应可实现荧光的开启。具体地，可通过如下方法进行开启：
(1)亲二烯体开启荧光：将化合物1a,1b,2a,2b与1.2倍物质的量的亲二烯体(降冰片烯或反式环辛烯)溶解于无水甲醇中，并控制反应液中化合物1a,1b,2a,2b的浓度为0.1mmol/mL左右，于室温下搅拌12h直至反应完全，化合物1a,1b,2a,2b中的四嗪基团与烯烃双键发生逆电子需求的狄尔斯-阿尔德(IEDDA)反应得到化合物3a，3b，4a，4b，反应前四嗪基团可通过荧光共振能量转移(FRET)原理将氟硼结构的荧光淬灭，反应后由于四嗪结构被破坏，进而实现对化合物1a,1b,2a,2b的荧光开启。
(2)亲二烯体-紫杉醇开启荧光：将5-降冰片烯2-羧酸、紫杉醇、4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解于干燥的二氯甲烷中，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)，使5-降冰片烯2-羧酸的羧基与紫杉醇的二号位羟基发生缩合反应，反应液于室温下搅拌12h直至反应完全后，用二氯甲烷和水萃取，收集有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、取滤液真空浓缩，经硅胶柱层析纯化后，得化合物(14)。
(3)开启荧光细胞成像：将(3-氨基丙基)三苯基膦、(E)-环辛-2-烯-1-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(TCO-NHS ester)溶解于无水甲醇中，再加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，反应液于室温下搅拌4h直至反应完全后，用二氯甲烷和水萃取，收集有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、取滤液真空浓缩，经硅胶柱层析纯化后，得化合物(15)。
化合物(15)与探针1a,1b,2a,2b进行IEDDA反应实现荧光开启，用于细胞成像。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
(1)本发明提供探针具有荧光开启的性质，通过其与亲二烯体的IEDDA反应可在现实需要时实现荧光的开启。
(2)本发明提供探针在荧光开启后发出的荧光强度大，具有大斯托克斯位移，检测过程中可以避免背景光的干扰。
(3)本发明提供探针可用于细胞成像，利用其良好的生物正交性能，可以免去洗涤步骤。
(4)本发明提供探针的荧光开启产物的光稳定性和化学稳定性强。
附图说明
图1为本发明实施例2中制备荧光开启型探针2a的核磁谱图；
图2为本发明中实施例4检测化合物2a与化合物4a在PBS缓冲液中的荧光发射光谱对比图；
图3为本发明中实施例5化合物2a与降冰片烯-紫杉醇反应的药物成像图；
图4为本发明中实施例6化合物2a与反式环辛烯-三苯基膦反应的线粒体靶向共定位成像图；
图5为本发明中实施例10检测化合物1a与化合物3a在PBS缓冲液中的荧光发射光谱对比图；
图6为本发明中实施例14检测化合物1b与化合物3b在PBS缓冲液中的荧光发射光谱对比图；
图7为本发明中实施例18检测化合物2b与化合物4b在PBS缓冲液中的荧光发射光谱对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
对以下实施例1-17进行说明，见表1。
表1
实施例1制备四嗪酚类化合物
1.在500mL圆底烧瓶中，称取苯乙腈(2.4mL，24mmol)与甲氧基乙腈(5.6mL，72mmol)溶解于10mL干燥的二氧六环(Dioxane)中，加入三氟甲烷磺酸锌(4.32g，12mmol)后，缓慢滴加60mL 80％水合肼，反应液于65℃下搅拌18h后，在冰浴下将反应液倒入含亚硝酸钠(33.6g，480mmol)的饱和水溶液中，缓慢滴加盐酸(12M)至溶液pH＝4，用100mL乙酸乙酯和50mL水萃取，收集有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、取滤液真空浓缩，经硅胶柱层析纯化后(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)，得化合物(6)共610mg，性状为粉色固体，收率12.6％。
取化合物(6)进行核磁检测，结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.68–8.59(m,2H),7.68–7.58(m,3H),5.11(s,2H),3.65(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ166.19,165.05,132.97,131.54,129.31,128.28,72.21,59.66.
2.在150mL圆底烧瓶中，称取化合物(6)(606mg，3mmol)溶解于10mL干燥的二氯甲烷中，冰水浴下将三溴化硼的二氯甲烷溶液(4M，2mL)缓慢滴加至反应瓶中，反应液于室温下反应3h后，加入2mL甲醇淬灭反应，将反应液倒入50mL水中，50mL DCM萃取多遍直至水相基本澄清，通过旋蒸的方法除去溶剂，得482mg化合物(7),性状为红色固体，产率83％。
取化合物(7)进行核磁检测，结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.67–8.55(m,2H),7.69–7.65(m,1H),7.64–7.59(m,2H),5.35(s,2H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.36,165.41,133.01,131.43,129.36,128.22,62.82.
3.在150mL圆底烧瓶中，称取化合物(7)(473mg，2.5mmol)，溴代丁二酰亚胺(NBS)(445mg，2.5mmol)、三苯基膦(327.5mg，1.25mmol)溶解于20mL干燥的二氯甲烷中，室温下搅拌，之后每隔半小时加入一次NBS(222.5mg，1.25mmol)与三苯基膦(165mg，0.63mmol)，加入两次，再反应一小时后反应液用50mLDCM与50mL水萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂得500mg化合物(8),性状为粉色固体，收率80％。
取化合物(8)进行核磁检测，结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.68–8.62(m,2H),7.70–7.66(m,1H),7.65–7.60(m,2H),5.02(s,2H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ133.28,133.24,131.21,131.18,129.39,128.47,128.45,42.47,27.65.
4.在100mL耐压管中，称取化合物(8)(500mg，2mmol)，亚磷酸三乙酯(1.2mL，8mmol)溶解于10mL二氯乙烷，反应液在100℃下搅拌3h，TLC点板监测直至反应完全，反应液用50mLDCM与50mL水萃取。收集有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，经硅胶柱层析纯化后(石油醚：乙酸乙酯＝2：1)，得406mg化合物(9)，性状为红色固体，收率66％。
取化合物(9)进行核磁检测，结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.72–8.48(m,2H),7.68–7.59(m,3H),4.29–4.21(m,4H),4.01(d,J＝22.2Hz,2H),1.36(t,J＝7.1Hz,6H).
5.在150mL圆底烧瓶中，称取化合物(9)(400mg，1.3mmol)，苯甲醛(1.06mL，1.04mmol),1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)(2.13mL，1.43mmol)、溴化锂(124.4mg，1.43mmol)溶解于10mL干燥的四氢呋喃中，于45℃下搅拌2h后，将反应液用50mLDCM与50mL水萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，过滤、取滤液真空浓缩，经硅胶柱层析纯化后(石油醚：乙酸乙酯＝20：1)，得190mg化合物(10a)，性状为粉色固体，收率为56％。
取化合物(10a)进行核磁检测，结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.64(s,2H),8.40(d,J＝16.5Hz,1H),7.73(s,2H),7.65(s,3H),7.54(s,1H),7.52–7.43(m,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ132.89,132.09,132.01,131.95,129.29,128.54,128.44,128.13,63.00,34.38,33.31,16.35,16.10.
6.在100mL圆底烧瓶中，称取化合物(10a)(182mg，0.6mmol)，碘苯二乙酸(386.4mg，1.2mmol)，醋酸钯(13.5mg，0.06mmol)溶解于3mL乙酸与3mL乙酸酐的混合溶剂中，反应液于80℃下搅拌1h后，将反应液用30mL二氯甲烷和30mL水以及30mL二氯甲烷和30mL饱和碳酸氢钠溶液各萃取两遍，收集有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、取滤液真空浓缩，经硅胶柱层析纯化后(石油醚：乙酸乙酯＝5：1)，得80mg化合物(11a)，性状为粉色固体，收率为45％。
取化合物(11a)进行核磁检测，结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.49(dd,J＝7.9,1.7Hz,1H),8.41(d,J＝16.3Hz,1H),7.77–7.71(m,2H),7.68(td,J＝7.7,1.7Hz,1H),7.58(d,J＝6.0Hz,1H),7.54–7.47(m,4H),7.31(d,J＝8.0Hz,1H),2.42(s,3H).
13C NMR(126MHz,CDCl3)δ170.42,166.53,164.27,146.00,135.36,132.79,131.30,129.14,128.83,127.37,126.77,123.89,121.95,21.17,21.08.
7.在50mL圆底烧瓶中，称取化合物(11a)(80mg，0.27mmol)无水碳酸钠(31.8mg，0.3mmol)溶解于1mL甲醇，1mL水，0.2mL二氯甲烷的混合溶剂中，反应液于37℃下搅拌30min后，将反应液用30mL二氯甲烷和30mL水萃取两遍，收集有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、取滤液真空浓缩，得65mg化合物(12a)，性状为红色固体，收率87％，反应完全，无副产物，直接进行下一步反应。
实施例2制备荧光开启型探针2a
在50mL圆底烧瓶中，称取65mg化合物(12a)(65mg，0.23mmol)溶解于2mL甲苯中，加入乙酸(340μL，5.98mmol)，将反应液加热至60℃后，立即加入三氟化硼乙醚(150μL，0.92mmol)，反应液于60℃下搅拌4h后，待反应液冷却至室温后，有红色固体析出，过滤取红色固体，用乙醚多次洗涤，最终得到25mg目标四嗪氟硼类化合物2a，性状为红色固体，收率33％。
取化合物(2a)进行核磁检测，其核磁谱图如图1所示，核磁数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.80–8.71(m,2H),8.50(d,J＝16.1Hz,1H),7.79–7.72(m,4H),7.66(dd,J＝5.0,1.3Hz,1H),7.57(dd,J＝5.1,2.9Hz,1H),7.49(d,J＝16.1Hz,1H),7.41(d,J＝16.1Hz,1H).
13C NMR(126MHz,CDCl3)δ164.90,163.02,138.50,137.48,134.96,134.74,132.46,131.99,131.73,130.96,129.25,128.15,127.86,127.19,125.15,120.41.
实施例3click反应开启探针2a荧光
在50mL圆底烧瓶中，称取化合物2a(25mg，0.08mmol)与降冰片烯(9mg，0.96mmol)溶解于1mL无水甲醇中，于室温下搅拌12h直至反应完全，将反应液用10mL二氯甲烷和10mL水萃取两遍，收集有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、取滤液真空浓缩，经硅胶柱层析纯化后(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)，得到24mg化合物4a，性状为淡黄色固体，收率79％。
实施例4探针2a的荧光开启检测
对荧光开启型探针2a进行荧光开启前后的荧光进行检测，激发波长为410nm，发射波长为560nm。
称取一定量的实施例2的化合物2a(荧光开启前)与实施例3的化合物4a(荧光开启后)，分别溶于二甲基亚砜，使母液浓度为0.4mM，抽取10μL母液加入390μLPBS缓冲液中，转移至96孔板中检测，得到化合物2a荧光开启前后的荧光发射光谱。
经检测，荧光开启后得到的化合物4a的最大吸收波长为ex＝410nm，最大发射波长为em＝560nm，开启前后荧光增强倍数为526倍。图2为化合物2a与化合物4a在PBS缓冲液中的荧光发射光谱，即化合物2a与降冰片烯反应前后(荧光开启前后)的荧光强度对比图。
实施例5探针2a的药物成像
1.亲二烯体修饰紫杉醇：将5-降冰片烯2-羧酸、紫杉醇、4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解于干燥的二氯甲烷中，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)，紫杉醇、5-降冰片烯2-羧酸、DMAP、EDCI的物质的量之比为1:1.2:2:0.1，溶剂的体积以底物的物质的量计为1mL/mmol。反应液于室温下搅拌12h直至反应完全后，用二氯甲烷和水萃取，收集有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、取滤液真空浓缩，然后用硅胶柱层析纯化，硅胶柱层析所用的洗脱液为体积比为30：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂，得化合物(14)，待用。
实施例6探针2a的线粒体靶向成像
1.将(3-氨基丙基)三苯基膦、(E)-环辛-2-烯-1-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(TCO-NHS ester)溶解于无水甲醇中，再加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，反应液于室温下搅拌4h直至反应完全后，用二氯甲烷和水萃取，收集有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、取滤液真空浓缩，经硅胶柱层析纯化后，得化合物(15)。细胞成像实验待用。
实施例7四嗪酚类化合物
的制备
1.将乙腈与苯甲腈溶解于干燥的二氧六环(Dioxane)中，加入三氟甲烷磺酸锌后，缓慢滴加80％水合肼，反应液于60℃下搅拌24h后，于冰浴下将反应液倒入亚硝酸钠水溶液中，缓慢滴加盐酸(12M)至溶液pH＝3，用乙酸乙酯和水进行萃取，收集有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、取滤液真空浓缩，然后使用硅胶柱层析纯化，硅胶柱层析所用的洗脱液为体积比为10:1的石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂，得四嗪底物。其中，苯甲腈、乙腈、三氟甲烷磺酸锌、水合肼、亚硝酸钠的物质的量之比为1:9.5:0.4:48:18，所用二氧六环的体积以所述底物的物质的量计为0.5mL/mmol。制备得到四嗪底物的结构式为：
2.将四嗪底物、碘苯二乙酸，醋酸钯溶解于乙酸与乙酸酐体积比为1:1的混合溶剂中，反应液于80℃下搅拌3h后，将反应液用二氯甲烷和水以及二氯甲烷和饱和碳酸氢钠溶液各萃取两遍，收集有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、取滤液真空浓缩，然后使用硅胶柱层析纯化，硅胶柱层析所用的洗脱液为体积比为3:1的石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂，得中间体。其中，四嗪底物、碘苯二乙酸、醋酸钯的物质的量之比为1:1:0.05，所用混合溶剂的体积以底物的物质的量计为0.5mL/mmol。制备得到中间体的结构式为：
3.将中间体溶于甲醇、水、二氯甲烷体积比为10:10:1的混合溶剂中，使反应液中的中间体浓度在1mmol/ml，加入无水碳酸钠控制pH为11，反应液于室温下搅拌30min后，将反应液用二氯甲烷和水进行萃取，收集有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、取滤液真空浓缩，得到四嗪酚类化合物。该四嗪酚类化合物的结构式为：
实施例8制备荧光开启型探针1a
将实施例7制备的四嗪酚类化合物溶解于甲苯中，并控制其在反应液中的浓度为2mmol/mL，加入26倍物质的量的乙酸，将反应液加热至60℃后，立即加入4倍物质的量的三氟化硼乙醚，反应液于60℃下搅拌4h后，待反应液冷却至室温后，有红色固体析出，过滤取红色固体，用乙醚多次洗涤，干燥后得到四嗪氟硼类化合物，即荧光开启型探针1a。探针1a的结构为：
实施例9click反应开启探针1a荧光
在50mL圆底烧瓶中，称取化合物1a与1.2倍物质的量的降冰片烯溶解于1mL无水甲醇中，于室温下搅拌12h直至反应完全，将反应液用10mL二氯甲烷和10mL水萃取两遍，收集有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、取滤液真空浓缩，经硅胶柱层析纯化后(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)，得到24mg化合物3a。探针1a荧光开启后得到化合物3a的结构为：
实施例10探针1a的荧光开启检测
对荧光开启型探针1a进行荧光开启前后的荧光进行检测，激发波长为410nm，发射波长为560nm。
称取一定量的实施例8的化合物1a(荧光开启前)与实施例9的化合物3a(荧光开启后)，分别溶于二甲基亚砜，使母液浓度为0.4mM，抽取10μL母液加入390μLPBS缓冲液中，转移至96孔板中检测，得到化合物1a荧光开启前后的荧光发射光谱。
经检测，荧光开启后得到的化合物3a的最大吸收波长为ex＝360nm，最大发射波长为em＝440nm，荧光开启前后荧光增强倍数为333倍。图5为化合物1a与化合物3a在PBS缓冲液中的荧光发射光谱，即化合物1a与降冰片烯反应前后(荧光开启前后)的荧光强度对比图。
实施例11四嗪酚类化合物
的制备
1.将乙腈与对甲氧基苯甲腈溶解于干燥的二氧六环(Dioxane)中，加入三氟甲烷磺酸锌后，缓慢滴加80％水合肼，反应液于65℃下搅拌18h后，于冰浴下将反应液倒入亚硝酸钠水溶液中，缓慢滴加盐酸(12M)至溶液pH＝2，用乙酸乙酯和水进行萃取，收集有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、取滤液真空浓缩，然后使用硅胶柱层析纯化，硅胶柱层析所用的洗脱液为体积比为10:1的石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂，得四嗪底物。其中，对甲氧基苯甲腈、乙腈、三氟甲烷磺酸锌、水合肼、亚硝酸钠的物质的量之比为1:10.5:0.6:53:23，所用二氧六环的体积以底物的物质的量计为2.5mL/mmol。制备得到四嗪底物的结构式为：
2.将四嗪底物、碘苯二乙酸，醋酸钯溶解于乙酸与乙酸酐体积比为1:1的混合溶剂中，反应液于85℃下搅拌2h后，将反应液用二氯甲烷和水以及二氯甲烷和饱和碳酸氢钠溶液各萃取两遍，收集有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、取滤液真空浓缩，然后使用硅胶柱层析纯化，硅胶柱层析所用的洗脱液为体积比为3:1的石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂，得中间体。其中，四嗪底物、碘苯二乙酸、醋酸钯的物质的量之比为1:3:0.2，所用混合溶剂的体积以底物的物质的量计为2.5mL/mmol。制备得到中间体的结构式为：
3.将中间体溶于甲醇、水、二氯甲烷体积比为10:10:1的混合溶剂中，使反应液中的中间体浓度在1mmol/ml，加入无水碳酸钠控制pH为11，反应液于室温下搅拌30min后，将反应液用二氯甲烷和水进行萃取，收集有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、取滤液真空浓缩，得到四嗪酚类化合物。该四嗪酚类化合物的结构式为：
实施例12制备荧光开启型探针1b
将实施例11制备的四嗪酚类化合物溶解于甲苯中，并控制其在反应液中的浓度为2mmol/mL，加入26倍物质的量的乙酸，将反应液加热至65℃后，立即加入4倍物质的量的三氟化硼乙醚，反应液于65℃下搅拌3h后，待反应液冷却至室温后，有红色固体析出，过滤取红色固体，用乙醚多次洗涤，干燥后得到四嗪氟硼类化合物，即荧光开启型探针1b。探针1b的结构为：
实施例13click反应开启探针1b荧光
在50mL圆底烧瓶中，称取化合物1b与1.2倍物质的量的降冰片烯溶解于1mL无水甲醇中，于室温下搅拌12h直至反应完全，将反应液用10mL二氯甲烷和10mL水萃取两遍，收集有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、取滤液真空浓缩，经硅胶柱层析纯化后(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)，得到24mg化合物3a。探针1b荧光开启后得到化合物3b的结构为：
实施例14探针1b的荧光开启检测
对荧光开启型探针1b进行荧光开启前后的荧光进行检测，激发波长为410nm，发射波长为560nm。
称取一定量的实施例12的化合物1b(荧光开启前)与实施例13的化合物3b(荧光开启后)，分别溶于二甲基亚砜，使母液浓度为0.4mM，抽取10μL母液加入390μL PBS缓冲液中，转移至96孔板中检测，得到化合物1b荧光开启前后的荧光发射光谱。
经检测，荧光开启后得到的化合物3b的最大吸收波长为ex＝380nm，最大发射波长为em＝480nm，开启前后荧光增强倍数为347倍。图6为化合物1b与化合物3b在PBS缓冲液中的荧光发射光谱，即化合物1b与降冰片烯反应前后(荧光开启前后)的荧光强度对比图。
实施例15制备四嗪酚类化合物
与实施例1的主要区别在于：步骤5.中不加入苯甲醛，将之替换为1.04mmol 3-甲氧基-苯甲醛。其他与实施例1相同。
最终制备得到四嗪酚类化合物
实施例16制备荧光开启型探针2b
在50mL圆底烧瓶中，称取0.23mmol实施例15制备得到四嗪酚类化合物溶解于2mL甲苯中，加入乙酸5.98mmol，将反应液加热至60℃后，立即加入三氟化硼乙醚0.92mmol，反应液于65℃下搅拌3h后，待反应液冷却至室温后，有固体析出，过滤取固体，用乙醚多次洗涤，最终得到目标四嗪氟硼类化合物2b，结构为：
实施例17click反应开启探针2b荧光
在50mL圆底烧瓶中，称取化合物2b0.08 mmol与降冰片烯0.96mmol溶解于1mL无水甲醇中，于室温下搅拌12h直至反应完全，将反应液用10mL二氯甲烷和10mL水萃取两遍，收集有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、取滤液真空浓缩，经硅胶柱层析纯化后(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)，得到探针2b荧光开启后的化合物4b，结构为：
实施例18探针2b的荧光开启检测
对荧光开启型探针2b进行荧光开启前后的荧光进行检测，激发波长为410nm，发射波长为560nm。
称取一定量的实施例16的化合物2b(荧光开启前)与实施例17的化合物4b(荧光开启后)，分别溶于二甲基亚砜，使母液浓度为0.4mM，抽取10μL母液加入390μL PBS缓冲液中，转移至96孔板中检测，得到化合物2b荧光开启前后的荧光发射光谱。
经检测，化合物4b的最大吸收波长为ex＝420nm，最大发射波长为em＝570nm，开启前后荧光增强倍数为582倍。图7为化合物2b与化合物4b在PBS缓冲液中的荧光发射光谱，即化合物2b与降冰片烯反应前后(荧光开启前后)的荧光强度对比图。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种荧光开启型探针，其特征在于：所述荧光开启型探针具有如式(1)所示的结构：
其中，R1为-H或-OMe；R2选自-CH3、
2.如权利要求1所述的一种荧光开启型探针，其特征在于：所述荧光开启型探针具有如式1a或1b或2a或2b所示的结构：
3.一种如权利要求1或2所述的荧光开启型探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：取四嗪酚类化合物溶于溶剂，加入乙酸、三氟化硼乙醚，搅拌反应，冷却析出固体得到所述荧光开启型探针；
其中，所述四嗪酚类化合物具有如式(2)所示的结构：
其中，R1为-H或-OMe；R2选自-CH3、
4.如权利要求3所述的荧光开启型探针的制备方法，其特征在于：
所述四嗪酚类化合物为：
所述四嗪酚类化合物的制备方法包括以下步骤：
S1：将乙腈与苯甲腈，或将乙腈与对甲氧基苯甲腈溶于溶剂，加入催化剂及水合肼，搅拌反应后，将反应液加入亚硝酸钠溶液中，加入盐酸调节pH，萃取，收集有机相干燥，纯化得到四嗪底物；
S2：将四嗪底物、碘苯二乙酸、醋酸钯溶于乙酸与乙酸酐混合溶剂中，搅拌反应后，萃取，收集有机相干燥，纯化得中间体；
S3：将中间体溶于甲醇、水、二氯甲烷的混合溶剂中，加入无水碳酸钠，并控制pH为碱性，反应，萃取，收集有机相，干燥，浓缩得到所述四嗪酚类化合物。
5.如权利要求3所述的荧光开启型探针的制备方法，其特征在于：
所述四嗪酚类化合物为：
其中，R为
所述四嗪酚类化合物的制备方法包括以下步骤：
(1)制备
将甲氧基乙腈与苯甲腈溶于溶剂，加入催化剂及水合肼，搅拌反应后，将反应液加入亚硝酸钠溶液中，加入盐酸调节pH，萃取，收集有机相，纯化；
(2)制备
将(1)中制备得到化合物溶于溶剂，加入三溴化硼反应后，加入甲醇淬灭，萃取，收集有机相，得中间体A；取中间体A、溴代丁二酰亚胺、三苯基膦溶于溶剂，搅拌反应，萃取，收集有机相，得中间体B；取中间体B与亚磷酸三乙酯溶于溶剂，搅拌反应，萃取，收集有机相，纯化；
(3)制备
将(2)中制备得到化合物与苯甲醛，或(2)中制备得到化合物与3-甲氧基-苯甲醛溶于溶剂，加入催化剂，搅拌反应后，萃取，收集有机相，纯化；
(4)制备
将(3)中制备得到化合物、碘苯二乙酸、醋酸钯溶于溶剂，搅拌反应，萃取，收集有机相，纯化后再溶于溶剂中，加入无水碳酸钠，并控制pH为碱性，反应，萃取，干燥，浓缩得到所述四嗪酚类化合物。
6.如权利要求3所述的荧光开启型探针的制备方法，其特征在于：所述四嗪酚类化合物、乙酸、三氟化硼乙醚的摩尔比为2:25-30:4-6。
7.如权利要求3所述的荧光开启型探针的制备方法，其特征在于：所述反应的温度为60～70℃。
8.如权利要求3或7所述的荧光开启型探针的制备方法，其特征在于：所述反应的时间为3～4h。
9.如权利要求3所述的荧光开启型探针的制备方法，其特征在于：所述溶剂为甲苯。
10.如权利要求1-2任一项所述荧光开启型探针或权利要求3-9任一项所述制备方法制备得到的荧光开启型探针在制备医用材料中的应用。
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| US20160121002A1 (en) * | 2013-05-06 | 2016-05-05 | The General Hospital Corporation | Bioorthogonal Turn-on Probes |
| CN106317112A (zh) * | 2016-08-19 | 2017-01-11 | 四川大学华西医院 | 四嗪类化合物及其制备方法、应用 |
| CN108997402A (zh) * | 2018-08-31 | 2018-12-14 | 四川大学华西医院 | 氟硼荧-四嗪生物正交探针的制备方法 |
| CN114106027A (zh) * | 2021-11-10 | 2022-03-01 | 四川大学华西医院 | 一种氟硼荧光染料-四嗪类荧光探针及其制备方法和用途 |
Non-Patent Citations (3)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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