CN116113704A - 人工改造蛋白质的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供一种能够对蛋白质原料进行改性的新的手段。通过使肽基脯氨酰异构酶、或者、肽基脯氨酰异构酶和蛋白质改造酶作用于蛋白质原料，能够对蛋白质原料进行改性。

Description

人工改造蛋白质的制备方法
技术领域
本发明涉及人工改造蛋白质的制备方法和改性的蛋白质原料的制备方法。
背景技术
肽基脯氨酰异构酶(以下，有时简称为“PPIase”)作用于肽或蛋白质中的脯氨酸(Pro)残基的N末端侧的肽键，催化顺-反异构化。PPIase具有参与蛋白质折叠的、所谓伴侣蛋白的功能(例如参照非专利文献1)。PPIase的伴侣蛋白功能，例如，用于提高宿主细胞中的异种蛋白质的表达效率(例如参照专利文献1～3)。另一方面，免疫抑制物质的筛选也利用了PPIase(例如参照专利文献4)。另外，已知通过PPIase能够提高酶的热稳定性(例如参照专利文献5)。非专利文献2中公开了利用糜蛋白酶仅作用于合成底物(肽)的反式型的PPIase活性测定法。
另一方面，通过酶对蛋白质原料进行改性的研究正在积极地进行。蛋白质原料的改性利用基于蛋白酶等的蛋白质分解、基于蛋白质谷氨酰胺酶等的蛋白质侧链修饰、基于转谷氨酰胺酶或氧化酶的蛋白质分子间交联等的、蛋白质分子的分子转换反应，这样的分子转换反应能够进行使蛋白质原料的呈味性、物性、功能性(例如起泡性、乳化稳定性、可溶性等)等特性变化(即，改性)。作为这样的蛋白质原料改性的更具体的方式，例如已知基于蛋白酶的食用肉的软化、基于转谷氨酰胺酶的食用肉的粘结、以及基于蛋白质谷氨酰胺酶的蛋白质原料的可溶性提高等技术，通过这样的技术改性的蛋白质原料作为新蛋白质原料而被提供。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2002-525120号公报
专利文献2：日本特开2004-215591号公报
专利文献3：日本特开2005-046066号公报
专利文献4：日本特开平2-124100号公报
专利文献5：日本特开平11-075837号公报
非专利文献
非专利文献1：Biochim Biophys Acta.2015October；1850(10)：2017-2034.
非专利文献2：Biomed Biochim Acta 1984；43(10)：1101-11.
发明内容
发明所要解决的技术问题
改性的蛋白质原料的特性改良，或被赋予新的功能，因此能够期待应用于各种领域，其利用价值高。为了提供这样的利用价值高的蛋白质原料，对进一步的手段的需求依然高。因此，本发明的课题在于提供用于对蛋白质原料进行改性(加工)的新的手段。
用于解决技术问题的手段
本发明人发现：PPIase本身能够进行蛋白质原料的改性。鉴于仅知晓PPIase催化异构化的反应，目前，通过催化蛋白质分子的分子转换反应的酶进行的蛋白质原料的改性通过PPIase而成为可能是预料之外的。进一步发现，通过并用PPIase与催化蛋白质分子的分子转换反应的酶(以下，也记载为“蛋白质改造酶”)，能够调节基于蛋白质改造酶的反应效率。以下发明主要基于上述见解。
[1]一种人工改造蛋白质的制造方法，其包含以下工序：
使肽基脯氨酰异构酶和蛋白质改造酶作用于蛋白质的工序。
[2]根据[1]所述的制造方法，其中，同时进行使所述蛋白质改造酶作用的处理和使所述肽基脯氨酰异构酶作用的处理。
[3]根据[1]或[2]所述的制造方法，其中，所述蛋白质改造酶选自蛋白水解酶、蛋白质侧链修饰酶和蛋白质交联酶。
[4]根据[1]或[2]所述的制造方法，其中，所述蛋白质改造酶选自蛋白酶、蛋白质脱酰胺酶、转谷氨酰胺酶和催化蛋白质交联化的氧化还原酶。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的制造方法，其中，所述蛋白质选自来源于豆、谷物、坚果及种子的植物蛋白质；乳蛋白质、卵蛋白质、血液蛋白质、肌肉蛋白质和肌腱蛋白质；以及，来源于微生物、藻和昆虫的蛋白质。
[6]一种改性的蛋白质原料的制造方法，其包含以下工序：
利用肽基脯氨酰异构酶和蛋白质改造酶处理含有蛋白质的食品原料、医药原料或工业原料的工序。
[7]根据[6]所述的制造方法，其中，同时进行利用所述蛋白改造酶的处理和利用所述肽基脯氨酰异构酶的处理。
[8]一种蛋白质改造用酶制剂，其含有肽基脯氨酰异构酶和蛋白质改造酶。
[9]根据[8]所述的蛋白质改造用酶制剂，其中，所述蛋白质改造酶选自蛋白水解酶、蛋白质侧链修饰酶和蛋白质交联酶。
[10]根据[8]所述的蛋白质改造用酶制剂，其中，蛋白质改造酶选自蛋白酶、肽酶、蛋白质脱酰胺酶、转谷氨酰胺酶和催化蛋白质交联化的氧化还原酶。
[11]一种改性的蛋白质原料的制造方法，其包含以下工序：
利用肽基脯氨酰异构酶处理含有蛋白质的食品原料、医药原料或工业原料的工序。
[12]一种蛋白质原料的改性用酶制剂，其含有肽基脯氨酰异构酶。
根据本发明，提供一种能够对蛋白质原料进行改性的新手段。
附图说明
图1的上图：大豆蛋白质的脱酰胺化的评价。比较在使蛋白质谷氨酰胺酶反应时添加PPIase(Cyclophilin A)的情况(空白的条)与未添加PPIase的情况(涂满的条)之间的脱酰胺化。图1的下图：小麦面筋蛋白的脱酰胺化的评价。比较在使蛋白质谷氨酰胺酶反应时添加PPIase(Cyclophilin A)的情况(空白条)与未添加PPIase的情况(涂满条)之间的脱酰胺化。
图2源自小麦面筋蛋白的33mer肽的分解后残留率。比较单独使胃蛋白酶反应的情况(涂满条。相当于人工胃液的消化)和并用胃蛋白酶和PPIase(Cyclophilin A)而反应的情况(空白条)之间33mer肽的残留率(％)(将单独使胃蛋白酶反应的情况的残留率作为100％的相对值)。
图3示出源自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的PPIase(SgPPI)的性质。
图4示出并用SgPPI和蛋白质谷氨酰胺酶处理小麦面筋蛋白、大豆蛋白质、豌豆蛋白质、乳酪蛋白、或卵白蛋白的情况下的效果。
图5示出确认并用SgPPI和蛋白质谷氨酰胺酶(PG)的情况下的、对PG的影响的有无的结果。
图6示出并用SgPPI和漆酶处理乳酪蛋白的情况下的效果。
图7示出单独利用PPIase处理鹰嘴豆蛋白质的情况下的效果。
具体实施方式
在本说明书中蛋白质的“改造”(modification)是指通过分解、合成、交联等进行分子转换，换言之，以改变蛋白质分子(也记载为“蛋白质底物”)的构成原子的数量和/或种类的方式进行使蛋白质的结构变化的加工(因此，不包含单纯的异构化)，相对于后述的“改性”，意指结构的改变(structural-modification)。另外，将通过对含有蛋白质的原料(也记载为“蛋白质原料”)进行蛋白质的酶处理，基于蛋白质的物性变化以蛋白质原料的特性变化的方式进行的加工，记载为“改性”(property modification)。在本发明中，蛋白质原料的“改性”包含基于蛋白质的“改造”的作用效果、基于利用肽基脯氨酰异构酶的蛋白质的异构化的作用效果、以及这两个作用效果相互结合而发挥的作用效果。
进而，本发明中的“蛋白质”广泛的包含多个氨基酸肽结合而成的物质。因此，本发明中的“蛋白质”包含10个以下氨基酸残基的寡肽、超过10个氨基酸残基的多肽、以及多肽形成的三维结构的蛋白质中的任一种。
1.人工改造蛋白质的制造方法
本发明的第一方面涉及人工改造蛋白质的制造方法。本发明的人工改造蛋白质的制造方法的特征在于，包含使肽基脯氨酰异构酶(PPIase)和蛋白质改造酶作用于蛋白质(以下也记载为“底物蛋白质”)的工序。
通过使用PPIase和蛋白质改造酶这两个酶处理蛋白质，利用蛋白质改造酶的蛋白质的改造反应调节成为可能。对于蛋白质的处理，该调节在典型例且优选例中为上方调节(反应的促进)，在该情况下，促进蛋白质改造酶的反应。另一方面，该调节也可接受为下方调节(反应的抑制)，在该情况下，抑制PPIase和蛋白质改造酶的反应。这样的下方调节的方式例如适用于反应过度进行的问题(例如，如果蛋白质改造酶为交联酶，则过交联引起食感等恶化，如果蛋白质改造酶为分解(切断)酶则呈味性、物性恶化等)的情况。
1-1.蛋白质(底物蛋白质)
本发明中使用的蛋白质(底物蛋白质)的来源没有特别的限制。例如，作为本发明中使用的蛋白质的示例即植物性蛋白质，可举出源自大豆(Soy beans)、豌豆(Greenpeas)、小扁豆(Lentils)、鹰嘴豆(Chickpeas)、黑豆(Black beans)等豆；小麦、大麦、黑麦、燕麦(Oat)、米等谷物；扁桃仁、花生等坚果；大麻种子(Hemp)、奇亚种子(Chia)、藜麦(Quinoa)、苋菜籽(Amaranthus)等种子的蛋白质。作为本发明中使用的蛋白质的其他例子即动物性蛋白质，可举出酪蛋白、β-乳球蛋白等乳蛋白质；卵清蛋白等卵蛋白质；血清白蛋白等血液蛋白质；肌球蛋白、肌动蛋白等肌肉蛋白质；明胶、胶原蛋白等肌腱蛋白质。作为本发明中使用蛋白质的更进一步的例子即其他蛋白质，可举出源自蟋蟀、蚕等昆虫；酵母、丝状菌等微生物、螺旋藻等藻的蛋白质。
作为本发明中使用蛋白质的进一步的其他例子，除了所述的天然蛋白质以外，还可举出该天然蛋白质通过酸、碱等化学地受到部分分解得到的蛋白质，该天然蛋白质通过蛋白酶等酶性地受到部分分解得到的蛋白质，该天然蛋白质通过各种试剂而受到化学修饰得到的蛋白质等预改造蛋白质。
需要说明的是，在本发明中成为处理对象的蛋白质不仅包含工业上有用的蛋白质(即，通过基于本发明的处理赋予新的特性而有用性提高的蛋白质)，还包含在工业上无用的蛋白质(即，通过基于本发明的处理使该蛋白质具有的不期望的特性降低或消失，由此新赋予有用性)。作为工业上无用的蛋白质，可举出各种过敏原(可举出小麦、大麦、黑麦、燕麦等麦中包含的麸质等)、毒性肽(例如，可举出麸质分解物中包含的33mer麦醇溶蛋白肽(Gliadin Peptide)等)、外源性类鸦片活性肽(例如，酪蛋白分解物中包含的酪啡肽、麸质分解物中包含的麦醇溶蛋白(Gliadorphin)等)等。
1-2.肽基脯氨酰异构酶(PPIase)
PPIase是作用于肽或蛋白质中的脯氨酸(Pro)残基的N末端侧的肽键，催化顺-反异构化的酶。换言之，PPIase具有使肽或蛋白质中的Pro残基的N末端侧的肽键变化为顺/反型的活性(PPIase活性)。作为本发明中使用的PPIase，只要是具有该活性的多肽，就没有特别限定。因此，即使在公式数据库中没有被分类为PPIase，具有PPIase活性的多肽也属于本发明中使用的PPIase。
PPIase活性的有无可举出，在合成底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(Suc-AAPF-pNA)中加入PPIase和糜蛋白酶，检测pNA的游离的方法；添加Abz-Ala-Xaa-Pro-Phe-pNA、PPIase和蛋白酶，检测Abz的荧光的方法；使用FRET(Fluorescence Resonance EnergyTransfer：荧光共振能量转移)底物的活性检测法等，只要能够通过这些方法中的至少任一种方法检测PPIase活性，就能够判断为具有PPIase活性。优选PPIase活性的有无能够通过所述方法中检测pNA的游离的方法来确认。需要说明的是，在本发明中，关于PPIase的活性的具体值，为基于检测pNA的游离的方法而测定得到的值。
本发明中使用的PPIase的来源没有特别限定，可举出包含原核生物、真核生物、古细菌(Archaea)(Biochim Biophys Acta.2015Oct；1850(10)：2017-2034.)的广泛的生物。另外，PPIase的活性与侧链的存在无关，只要有直径为
Figure BDA0004094623440000071
深度为
Figure BDA0004094623440000072
的特征的口袋(空腔)就能够具备(Protein Engineering，Design and Selection，Volume21，Issue2，February 2008，Pages83-89)，因此只要是具有该口袋的多肽，就能够作为本发明的PPIase使用。作为具有PPIase活性的多肽的具体例，可举出亲环蛋白(Cyclophilin A等)、FKBP(FKBP12等)、Pin1、细蛋白(parvulin)、下述[1]～[3]的多肽等。
[1]包含序列号1所示氨基酸序列的多肽，
[2]包含在序列号1所示氨基酸序列中，1个或多个氨基酸被替换、添加、插入或缺失而成的氨基酸序列，且具有PPIase活性的多肽，
[3]包含相对于序列号1所示氨基酸序列的序列同一性为68％以上的氨基酸序列，且具有PPIase活性的多肽。
[1]中的序列号1是源自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的PPIase的氨基酸序列。
[2]及[3]的多肽是以[1]的多肽的氨基酸序列为基本骨架的序列类似的PPIase。
关于导入到所述[2]的多肽中的氨基酸的改变，可以仅包含选自替换、添加、插入和缺失中的1种改变(例如替换)，也可以包含2种以上的改变(例如，替换和插入)。所述[2]的多肽中，替换、添加、插入或缺失的氨基酸为1个或多个或者数个即可，例如可举出1～97个、1～80个、1～60个、1～40个、1～20个、1～10个、优选1～8个、1～6个、1～5个、或1～4个、进一步优选1～3个、特别优选1或2个或者1个。
另外，所述[3]的多肽中，序列一同一性只要为68％以上即可，优选为80％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上，进一步优选为98％以上，更进一步优选为99％以上，特别优选为99.5％以上，最优选为99.8％以上。
在此，在所述[3]的多肽中，例如相对于序列号1所示氨基酸序列的序列同一性是与序列号1所示氨基酸序列比较而算出的序列同一性。另外，“序列同一性”表示通过BLASTPACKAGE[sgi32 bit edition，Version2.0.12；available from National Center forBiotechnology Information(NCBI)]的bl2seq program(Tatiana A.Tatsusova，ThomasL.Madden，FEMS Microbiol.Lett.，Vol.174，p247-250，1999)得到氨基酸序列的同一性的值。参数设定为Gap insertion Cost value：11、Gap extension Cost value：1即可。
在所述[2]和[3]的多肽中，序列号1所示的氨基酸序列中的第41位～165位、第220～第309位构成FK506结合蛋白(FK506 binding protein(FKBP))结构域，因此优选在这些部位不导入替换或缺失。
在所述[2]和[3]的多肽中导入氨基酸替换的情况下，作为氨基酸替换的方式，可举出保守性替换。即，在[2]和[3]的多肽中，作为相对于序列号1所示的氨基酸序列导入的氨基酸替换，例如可举出，如果替换前的氨基酸为非极性氨基酸，则替换为其它非极性氨基酸；如果替换前的氨基酸为非荷电性氨基酸，则替换为其它非荷电性氨基酸；如果替换前的氨基酸为酸性氨基酸，则替换为其它酸性氨基酸；以及如果替换前的氨基酸为碱性氨基酸，则替换为其它碱性氨基酸。
在所述[2]和[3]的多肽中导入氨基酸添加的情况下，作为氨基酸添加的形态，例如可举出，向N末端的蛋氨酸残基的添加、纯化用标记(例如，寡聚组氨酸等的结合性寡肽)的添加等。
在所述[2]和[3]的多肽中，不仅包含人为变异而得到的多肽，还包含通过基于多肽来源的生物的个体差异或物种的差异的、天然产生的变异(突变体或变体)而产生的多肽。
进而，所述[2]和[3]的多肽中的“PPIase活性”的确认方法如上所述。优选地，所述[2]和[3]的多肽中的“PPIase活性”与所述[1]的多肽相同，具体而言，对于所述[2]和[3]的多肽，基于在糜蛋白酶的共存下检测pNA从合成底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(Suc-AAPF-pNA)游离的方法测定得到的游离pNA的量为对所述[1]的多肽测定的游离pNA的量的80～120％，优选为90～110％。
一些PPIase有市售(例如Sigma公司的FKBP12、Sigma公司的亲环蛋白A(Cyclophilin A))，能够容易获得。这些PPIase可以单独使用1种，也可以组合使用两种以上。
关于PPIase的使用量，以每1g基质蛋白质的量计，例如可举出0.0001mg～1g，优选0.01mg～100mg，或者，例如0.01～100000U，优选0.1～10000U，更优选1～1000U，进一步优选10～200U。
1-3.蛋白质改造酶
在本发明的人工改造蛋白质的制造方法中，PPIase并用蛋白质改造酶(蛋白质加工酶)。即，使PPIase作用于底物蛋白质同时也使蛋白质改造酶作用。
蛋白质改造酶是指通过其催化作用能够改造底物蛋白质分子(能够以改变蛋白质分子的构成原子的数量和/或种类的方式进行改变蛋白质的结构的加工)的酶。作为蛋白质改造酶的例子，可举出蛋白水解酶、蛋白质侧链修饰酶和蛋白质交联酶。作为蛋白水解酶的具体例，可举出蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶等蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶等)。作为蛋白质侧链修饰酶的具体例，可举出蛋白质脱酰胺酶(蛋白质谷氨酰胺酶、蛋白精氨酸脱亚氨酶(ProteinArginine Deiminase)等、转谷氨酰胺酶。作为蛋白质交联酶的具体例，可举出催化蛋白质交联化的氧化还原酶(赖氨酰氧化酶、巯基氧化酶、酪氨酸酶、漆酶、胆红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶、血浆铜蓝蛋白、过氧化酶等)。
蛋白质脱酰胺酶是指将蛋白质中的谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的酰胺基进行脱酰胺的酶。作为对蛋白质中的谷氨酰胺残基进行脱酰胺的酶，例如已知有来源于解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)的蛋白质谷氨酰胺酶(Eur J Biochem,268(5),1410,2001,Protein-glutaminase From Chryseobacterium Proteolyticum,anEnzyme That Deamidates Glutaminyl Residues in Proteins.Purification,Characterization and Gene Cloning,S Yamaguchi 1,D J Jeenes,D B Archer或者Front Microbiol,9,1975,2018,Complete Genome Sequence and Characterization ofa Protein-Glutaminase Producing Strain,Chryseobacterium proteolyticumQSH1265,Ruidan Qu,Xiaoyu Zhu,Min Tian,Yingjie Liu,Wenjuan Yan,Jian Ye,Hongliang Gao,Jing Huang)，但并不限定于此。关于对蛋白质中的天冬酰胺残基进行脱酰胺的酶，例如在WO2015/133590中公开，但并不限定于此。本发明中所说的蛋白质脱酰胺酶也包含对精氨酸残基进行脱亚氨化的酶。作为对精氨酸残基进行脱亚氨化的酶，已知有例如来自禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)的精氨酸脱氨酶。
通常将蛋白质中的谷氨酰胺及天冬酰胺残基进行脱酰胺化，如果产生羧基，则该蛋白质的负电荷增加，其结果等电点降低，水合力增加。进而导致由静电斥力的上升引起的蛋白质间的相互作用降低即缔合性降低。通过这些变化，蛋白质的可溶性、水分散性大幅增大。另外蛋白质的负电荷的增加解开该蛋白质的折叠，改变高次结构，使埋入分子内部的疏水性区域在分子表面露出。因此，脱酰胺化蛋白质具有双亲液性，成为理想的表面活性剂，蛋白质的乳化力、乳化稳定性、起泡性、泡沫稳定性大幅提高。如此，蛋白质的脱酰胺化导致蛋白质的各种功能特性的提高，其蛋白质的用途飞跃性地增大(例如MolecularApproaches toImproving Food Quality and Safety,D.Chatnagar and T.E.Cleveland,eds.,Van Nostrand Reinhold,New York,1992,p.37)。另外，在将蛋白质中的精氨酸残基进行脱亚氨化的情况下，也使蛋白质的疏水性增大，使蛋白质的高级结构变化。
转谷氨酰胺酶是对位于肽链内的谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基的酰基转移反应进行催化的酶，如果蛋白质中的赖氨酸残基的ε-氨基作为酰基受体发挥作用，则在蛋白质分子的分子内或分子间形成ε-(γ-Gln)-Lys交联键。如果利用转谷氨酰胺酶的作用，则能够进行蛋白质的改性，因此来源于链霉菌属的转谷氨酰胺酶用于肉的粘结、香肠、豆腐、面包、面类的制造。另外，不限定于食品领域，还在纤维领域、医疗领域、化妆品领域等中实现了转谷氨酰胺酶的利用。
所述蛋白质改造酶可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。作为2种以上蛋白质改造酶的组合的例子，可举出蛋白质谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶的组合、蛋白质谷氨酰胺酶和漆酶的组合、转谷氨酰胺酶和漆酶的组合、蛋白酶和转谷氨酰胺酶的组合等。
关于蛋白质改造酶的使用量，以每1g底物蛋白质的量计，例如可举出0.001mg～1g，优选0.01mg～0.1g，或者，例如0.001～10000U，优选0.01～5000U，更优选0.1～3000U。
1-4.反应操作、反应条件等
使PPIase作用的处理和使蛋白质改造酶作用的处理可以同时进行，也可以逐次进行。在本发明中，从作业效率和/或反应效率等观点出发，优选同时进行利用PPIase的处理和利用蛋白质改造酶的处理。
在同时进行利用PPIase的处理和利用蛋白质改造酶的处理的情况下，只要在底物蛋白质溶液中形成PPIase和蛋白质改造酶并存的状态即可，处理的开始时机可以同时，也可以使任一者的处理开始时机延迟。另外，在同时进行两个处理的情况下，处理的结束时机可以同时，也可以使任一者的处理结束时机延迟。例如，在组合使用两种以上蛋白质改造酶的情况下，可以将所有蛋白质改造酶用于与PPIase的同时反应，也可以将部分蛋白质改造酶用于与PPIase的同时反应，将剩余的蛋白质改造酶用于该同时反应后。
关于蛋白质处理中的温度条件和pH条件，本领域技术人员能够根据使用酶的最适温度和最适pH来适当决定。关于利用PPIase的处理和利用蛋白质改造酶的处理中的任一种，作为温度条件，例如可举出10℃～60℃，优选20℃～50℃，作为pH条件，例如可举出3～9，优选4～8。
另外，关于蛋白质的处理花费的反应时间，以利用PPIase的处理和利用蛋白质改造酶的处理花费的时间的合计来计算，例如可举出1分钟～24小时，优选为10分钟～16小时。
需要说明的是，具体而言最适反应条件只要通过预实验来决定即可。
1-5.人工改造蛋白质
通过本发明的改性蛋白质的制造方法得到的人工改造蛋白质是在所述的“1-1.蛋白质(底物蛋白质)”中记载的蛋白质受到所述的“1-3.蛋白质改造酶”中记载的利用蛋白质改造酶的改造作用而产生的。作为人工改造蛋白质的具体例，可举出在使用蛋白水解酶作为蛋白质改造酶的情况下的蛋白质分解物；在使用蛋白质侧链修饰酶作为蛋白质改造酶的情况下接受侧链修饰的蛋白质；在使用蛋白质交联酶作为蛋白质改造酶的情况下在分子间和/或分子内交联的蛋白质。
2.一种改性的蛋白质原料的制备方法
本发明的第二方面涉及一种改性的蛋白质原料的制造方法。如所述第一方面涉及的人工改造蛋白质的制造方法记载所示，肽基脯氨酰异构酶与蛋白质改造酶的组合能够用于底物蛋白质的改造，因此通过应用于蛋白质原料的处理，蛋白质原料的改性成为可能。进而，即使单独使用肽基脯氨酰异构酶，通过应用于蛋白质原料的处理，蛋白质原料的改性也成为可能。因此，本发明还提供一种改性的蛋白质原料的制造方法。
具体而言，本发明的改性的蛋白质原料的制造方法的特征在于，包含利用肽基脯氨酰异构酶、或者、肽基脯氨酰异构酶和蛋白质改造酶处理含有蛋白质的食品原料、医药原料或工业原料的工序。
关于改性的具体的方式，只要能够从蛋白质改性酶的作用效果中期待的方式，则可以是任何方式。
作为改性的具体方式的例子，可举出根据蛋白质原料的种类和/或形态等，蛋白质原料中的蛋白质的水分散性的提高、蛋白质原料中的蛋白质可溶性的提高、蛋白质原料的乳化稳定性的提高、蛋白质原料的体内消化性的提高、蛋白质原料的呈味的提高、蛋白质原料的起泡性的提高、蛋白质原料的凝胶化特性的提高等。
作为改性的具体方式的其他例子，还可举出过敏性或阿片性的降低或消失、赋予对脱敏疗法有用的被限制的过敏特性(即，使过敏性降低且在规定的限制范围内残留)等。
在本发明的改性的蛋白质原料的制造方法中成为处理对象的蛋白质原料是指，包含蛋白质且在各种工业界中流通的物品(作为具体例，可举出食品、医药品、工业物品)的制造中使用的原料。关于蛋白质原料中包含的蛋白质，如所述的“1-1.蛋白质(底物蛋白质)”记载所示。作为蛋白质原料的具体例，可举出食品原料、医药原料及工业原料。作为食品原料的具体例，可举出动物组织及植物组织、以及它们的分散液(特别优选举出将植物的可食用部分的粉碎物分散于水中而成的植物性奶)、提取物等加工品等、作为所谓食材使用的物质整体、包含过敏原和食品学上可接受的成分的组合物、包含外源性类鸦片活性肽和食品学上可接受的成分的组合物、包含毒性肽和食品学上可接受的成分的组合物等。另外，作为医药原料的更具体的例子，可举出包含过敏原和药学上可接受的成分的组合物等。进而，作为工业原料的更具体的例子，可举出丝绸和羊毛等纤维等。
在本发明的改性的蛋白质原料的制造方法中得到的改性的蛋白质原料，是所述蛋白质原料受到肽基脯氨酰异构酶的作用、或者、肽基脯氨酰异构酶和蛋白质改造酶的作用而产生的。
作为改性的蛋白质原料中、所述蛋白质原料受到肽基脯氨酰异构酶的作用而产生的蛋白质原料的例子，可举出蛋白质的水分散性提高、蛋白质的可溶性提高、和/或乳化稳定性提高的蛋白质原料(具体而言为食品原料或医药原料)等。
作为改性的蛋白质原料中、所述蛋白质原料受到肽基脯氨酰异构酶和蛋白质改造酶的作用而产生的物质的例子，可举出蛋白质的水分散性提高的、蛋白质的可溶性提高的、乳化稳定性提高的、起泡性提高的、和/或凝胶化特性提高的蛋白质原料(具体而言为食品原料或医药原料)、体内消化性提高和/或呈味提高的蛋白质原料(具体而言为食品原料)、以及过敏性、阿片性、毒性、和/或不需要物减少或消失的蛋白质原料(具体而言为食品原料、医药原料或工业原料)等。
在所述改性的蛋白质原料中，体内消化性提高的食品原料，例如能够用于消化功能降低的动物用饮食品、提高消化吸收能力的健康饮食品等中，过敏性降低或消失的食品原料，由于过敏原减少或消失，因此例如能够用于具有对该过敏原引起过敏的体质的动物用饮食品等中；阿片性降低或消失的食品原料，由于外源性类鸦片活性肽降低或消失，因此例如能够用于患有该类鸦片活性肽引起的自闭症等精神疾病的动物用饮食品等中；毒性降低或消失的食品原料，由于毒性肽降低或消失，因此例如能够用于患有乳糜泻及其他麦麸相关疾病的动物用饮食品等中。
在所述改性的蛋白质原料中，过敏性降低的医药原料被调整为部分过敏原从包含过敏原和药学上可接受的成分的组合物中分解等，使过敏原含量残留在规定限制的浓度范围内，因此例如能够作为过敏的脱敏疗法用医药品使用。
在所述改性的蛋白质原料中，过敏性降低或消失的工业原料能够用作与肌肤接触的纤维制品的原料；作为不需要物质减少或消失的工业原料，可举出去除了丝胶蛋白的(精炼的)丝绸、去除了鳞状物(scale)的羊毛等，能够用作手感提高的纤维制品的原料。
需要说明的是，对于所述动物，其种类没有特别限制，例如可举出哺乳类和鸟类等，优选举出哺乳类，进一步优选举出人。
关于本发明的改性的蛋白质原料的制造方法中应用的PPIase、蛋白质改造酶、这些酶的使用量、反应操作、反应条件等的详细情况，如所述第一方面涉及的人工改造蛋白质的制造方法中记载所示。
3.蛋白质改造用酶制剂
本发明的第三方面涉及蛋白质改造用酶制剂。如所述第一方面涉及的人工改造蛋白质的制造方法中记载所示，肽基脯氨酰异构酶和蛋白质改造酶的组合，能够用于底物蛋白质的改造。因此，本发明还提供含有肽基脯氨酰异构酶和蛋白质改造酶的蛋白质改造用酶制剂。
在蛋白质改造用酶制剂中，有效成分即PPIase和蛋白质改造酶的含量没有特别限定。例如，作为每1g蛋白质改造用酶制剂的PPIase的含量，例如可举出0.0001mg～1000mg，优选0.01mg～100mg。作为每1g蛋白质改造用酶制剂的蛋白质改造用酶的含量，在使用蛋白酶作为蛋白质改造用酶的情况下，例如可举出0.0001mg～1000mg，优选0.01mg～100mg；在使用肽酶作为蛋白质改造用酶的情况下，例如可举出0.0001mg～1000mg，优选0.01mg～100mg；在使用蛋白质谷氨酰胺酶作为蛋白质改造用酶的情况下，例如，可举出每1g该酶制剂0.0001mg～1000mg，优选0.01mg～100mg；在使用转谷氨酰胺酶作为蛋白质改造用酶情况下，例如可举出0.0001mg～1000mg，优选0.01mg～100mg。
本发明的蛋白质改造用酶制剂，除了有效成分即所述酶以外，还可以含有赋形剂、缓冲剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等其他成分。作为赋形剂，可举出乳糖、山梨糖醇、D-甘露醇、麦芽糖糊精、白糖等。作为缓冲剂，可举出磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐等。作为稳定剂，可举出丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可举出苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可举出苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。
作为本发明的蛋白质改造用酶制剂的性状，没有特别限定，可举出固体状、液体状和担载状。在本发明的蛋白质改造用酶制剂为固体状的情况下，作为更具体的形态，可举出颗粒和粉体等。在本发明的蛋白质改造用酶制剂为担载状的情况下，作为更具体的形态，可举出在二氧化硅、多孔聚合物等不溶性载体的表面固定化有有效成分即所述酶的形态。
关于本发明的蛋白质改造用酶制剂中使用的PPIase、蛋白质改造酶、改造方式、成为对象的蛋白质、以及使用方法的详细情况，如所述第一方面涉及的人工改造蛋白质的制造方法中记载所示。
4.蛋白质原料的改性用酶制剂
本发明的第四方面涉及蛋白质原料的改造用酶制剂。如所述第二方面涉及的改性的蛋白质原料的制造方法中记载所示，肽基脯氨酰异构酶能够单独使用，或者，能够以肽基脯氨酰异构酶和蛋白质改造酶的组合用于蛋白质原料的改性。因此，本发明还提供含有肽基脯氨酰异构酶的蛋白质原料的改性用酶制剂。本发明的改性用酶制剂能够进一步含有蛋白质改造酶。
在本发明的蛋白质原料的改性用酶制剂中，关于有效成分即酶的含量、进而可以含有的其他成分的种类及性状，与所述第三方面涉及的蛋白质改造用酶制剂相同。
关于本发明的蛋白质原料的改性用酶制剂中使用的PPIase、蛋白质改造酶、改性的方式、成为对象的蛋白质原料和使用方法的详细情况，如所述第二方面涉及的改性的蛋白质原料的制造方法记载所示。
实施例
以下，示出实施例，更具体说明本发明，本发明并非限定于此。
＜漆酶活性的测定法＞
关于漆酶的活性，在作为底物的2,2'-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)(2,2'-Azino-di-[3-ethylbenzthiazoline sulfonate])(ABTS)的50mM溶液20μL和125mM的磷酸钠缓冲液160μL中添加酶液20μL，在37℃进行反应，测定15分钟后和0分钟后的405nm的吸光度的情况下，将1分钟内催化1μmol的ABTS氧化的酶量作为1单元(U)。
＜PPIase活性的测定法＞
关于PPIase的活性，使用Protease-coupled assay进行测定。将0.2mM四肽(Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p NA)溶解于0.47M氯化锂(LiCl)+三氟乙醇溶液中作为底物溶液。在底物溶液中添加0.3mg/ml糜蛋白酶和适量的PPIase，进行混合，在30℃处理3分钟后，测定390nm的吸光度(Abs390(Ch+PPI))。作为空白，在不添加0.1μM PPIase的条件下与上述同样实施，测定吸光度(Abs390(Ch))。将1分钟内游离1μmol的pNA的酶量作为1U，由以下数学式算出。
[数学式1]
U/mL或U/g＝{Abs390(Ch+PPI)－Abs390(Ch)}÷0.0133÷3÷n
0.0133：系数
3：处理时间(分钟)
N：反应体系中的酶样品的最终浓度(mL/L或g/L)
＜试验例1：并用PPIase和蛋白酶的情况下的效果＞
(1)方法
在100μL的底物水溶液(20mM醋酸Na(pH6.0)中加入2％(w/v)的偶氮酪蛋白(Sigma公司制造))中添加10μL的1mg/mL Umamizyme G(源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的蛋白酶，天野酶株式会社制造，150u/g)和10μL的0.1mg/mL FKBP12(源自微生物的PPIase，Sigma公司制造，0.15mg/ml)，在37℃反应0、10或30分钟后，添加240μL的10％(w/v)TCA溶液，停止反应。离心分离后，回收120μL上清液。在回收的上清液中添加140μL的1N NaOH，进行混合、显色，测定OD440nm的吸光度，评价偶氮酪蛋白的分解性。关于偶氮酪蛋白的分解性，以添加纯化水代替FKBP12的样品(仅蛋白酶)为基准进行比较。
(2)结果
在蛋白酶与PPIase组合的情况下，与仅蛋白酶的情况相比，偶氮酪蛋白被更多地分解。具体而言，以将仅蛋白酶的情况下的分解度为100％时的相对值进行评价，结果在组合PPIase的情况下，在10分钟的反应中确认到在102％、30分钟的反应中105％的分解。反应时间越长，与仅蛋白酶的情况之间分解度越产生差异。PPIase只是对蛋白质进行异构化的作用，迄今为止，只有利用伴侣蛋白功能，但通过组合蛋白酶，能够确认到促进利用蛋白酶的分解。
＜试验例2：并用PPIase和蛋白质谷氨酰胺酶的情况下的效果＞
(1)方法
在1mL的底物溶液(10％(w/v)大豆蛋白质(Fujipro F，不二制油公司制造)水溶液或10％(w/v)小麦面筋蛋白水溶液)中添加10μL的25u/mL的PG-500(蛋白质谷氨酰胺酶“AMANO”500，天野酶株式会社制造)和10μL的0.1mg/ml亲环蛋白A(来源于牛胸腺的PPIase，Sigma公司制造C7696)或纯化水，在37℃振荡反应10、60、120或960分钟后，添加1mL的10％(w/v)TCA溶液，停止反应。使用Ammonia-test Wako(FUJIFILM公司制造)测定各反应停止后样品中的氨的生成量，由此评价脱酰胺化的程度。具体而言，将各反应停止后样品利用试剂盒附带的除蛋白质液稀释5倍后，离心分离回收上清液(除去蛋白成分)。使上清液中的氨态氮显色，比较630nm的吸光度。
(2)结果
将结果示于图1。如图1所示，对于大豆蛋白质和小麦蛋白质中的任一者，在蛋白质谷氨酰胺酶组合PPIase的情况下，与仅蛋白质谷氨酰胺酶的情况相比，能够确认到脱酰胺化被促进。
＜试验例3：并用PPIase和胃蛋白酶的情况下的效果＞
(1)方法
将作为源自小麦面筋蛋白的毒性肽已知的33mer肽(肽研究所公司制造)在水中调整为1.0mg/ml，作为基质溶液。相对于该底物溶液10μl，添加1M醋酸钠缓冲液(pH4.5)0.5μl、5mg/mL的胃蛋白酶(Sigma公司制造)溶液2.5μl和0.1mg/mL的亲环蛋白A(Sigma公司制造)溶液10μl或蒸馏水10μl，在37℃反应1小时。通过使用抗33mer肽抗体的ELISA检测算出反应液中的33mer肽的残留率。关于肽的分解性，将仅使用胃蛋白酶作为酶的情况(不并用亲环蛋白A的情况)的该肽的残留率作为100％的相对量进行评价。
(2)结果
将结果示于图2。如图2所示，在胃蛋白酶组合PPIase的情况下，与仅胃蛋白酶的情况相比，能够确认到源自小麦面筋蛋白的33mer肽的分解被促进。
＜试验例3：并用源自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的PPIase(SgPPI)和蛋白质谷氨酰胺酶的情况下的效果＞
(1)源自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的PPIase的取得和性质确认
通过BLAST检索探索具有细胞外分泌信号的PPIase，结果发现在灰色链霉菌(Streptomyces griseus)(BSL1)基因组编码具有细胞外分泌信号的PPIase。该源自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的PPIase(以下也记载为“SgPPI”)的氨基酸序列如序列号1所示。
在E.coli BL21中发现并回收SgPPI，研究其性质。将SgPPI的最适pH、最适温度、pH稳定性和温度稳定性示于图3。另外，虽未图示，但也确认到SgPPI具有热稳定性提高效果等公知的PPIase作用。
(2)方法
对于5％(w/v)的小麦面筋蛋白水溶液、5％(w/v)的大豆蛋白质水溶液、5％(w/v)的豌豆蛋白质水溶液、5％(w/v)的乳酪蛋白水溶液、5％(w/v)的卵白蛋白水溶液，分别添加每1g蛋白质0.1U的PG-500(蛋白质谷氨酰胺酶“AMANO”500，天野酶株式会社制造)、或者、每1g蛋白质0.1U的PG-500和每1g蛋白质174U的SgPPI，在40℃振荡反应4小时后，添加1mL的10％(w/v)TCA溶液，停止反应。与试验例2同样进行评价脱酰胺化的程度。
(3)结果
将结果示于图4。如图4所示，对于小麦面筋蛋白、大豆蛋白质、豌豆蛋白质、乳酪蛋白、卵白蛋白中的任一者，在SgPPI与蛋白质谷氨酰胺酶组合的情况下，与仅蛋白质谷氨酰胺酶的情况相比，能够确认到脱酰胺化被促进。
(4)补充：SgPPI与蛋白质谷氨酰胺酶(PG)并用情况下的对PG的影响的确认
构建蛋白质谷氨酰胺酶(PG)的底物即Cbz-Gln-Gly与PG的共存体系、以及Cbz-Gln-Gly、PG和SgPPI的共存体系，对于各个体系，经时调查PG活性(以Cbz-Gln-Gly为底物产生氨的活性)。将结果示于图5。如图5所示，SgPPI不提高对Cbz-Gln-Gly的PG活性。因此，图4所示的效果可以推测为SgPPI不是PG而是通过作用于底物蛋白质而得到的效果。
＜试验例4：并用SgPPI和漆酶的情况下的效果＞
(1)方法
在5％(w/v)的乳酪蛋白水溶液中添加每1g蛋白质2400U的LC-Y120(漆酶，天野酶株式会社制造)、或者，每1g蛋白质2400U的LC-Y120和每1g蛋白质174U的SgPPI，在40℃振荡反应4小时，然后，将反应液供于SDS-PAGE。蛋白质的交联化及其程度能够通过在SDS-PAGE中接近原点的条带的存在及该条带的浓度来确认。
(2)结果
将结果示于图6。如图6所示，可知与仅使用漆酶的情况下得到的交联蛋白质的量相比，组合使用漆酶和SgPPI的情况下，交联蛋白质的量增加。
＜试验例5：单独使用PPIase的情况下的效果＞
(1)方法
使印度产的“鹰嘴豆”(KOBE GROCERS)蛋白质以成为离子水中10w/v％的方式混悬，制备鹰嘴豆奶。在得到的鹰嘴豆奶10mL中，以成为每1g蛋白质87U的方式添加SgPPI，在24小时40℃的条件下孵育(静置)。然后，拍摄鹰嘴豆奶的性状。
(2)结果
将结果示于图7。如图7所示，在未使用PPIase的情况下(对照)，鹰嘴豆奶未分散，产生了大量的沉淀，但在使用了PPIase的情况下，鹰嘴豆奶均匀分散，确认到分散性提高的改性效果。
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供一种能够对蛋白质原料进行改性的新的手段。具体而言，通过使肽基脯氨酰异构酶和蛋白质改造酶作用于蛋白质能够调节(典型地促进)蛋白质的改造反应，因此通过组合这些酶来处理蛋白质原料，能够对蛋白质原料进行改性。另外，通过利用肽基脯氨酰异构酶处理蛋白质原料，也能够对蛋白质原料进行改性。这样的改性的蛋白质原料能够用作食品原料、医药原料及工业原料等产业用原料，有助于食品、医药及工业制品等产业制品的制造。
上述发明的实施方式和实施例的说明对本发明没有任何限定。不脱离权利要求书的记载，在本领域技术人员能够容易想到的范围内，各种变形方式也包含在本发明中。本说明书中明确记载的论文、公开专利公报和专利公报等的内容通过参照而引用其全部内容。
序列表
<110>  天野酶制品株式会社
<120> 人工改造蛋白质的制备方法
<130>  21054WO
<150>  JP2020-141053
<151>  2020-08-24
<160>  1
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  312
<212>  PRT
<213>  灰色链霉菌
<400>  1
Met Arg Arg Ile Ala Gly Leu Leu Leu Ala Pro Leu Leu Leu Leu Thr
1               5                   10                  15
Ala Val Ala Cys Gly Ser Asp Asp Lys Ala Ser Asp Ser Ala Ser Ser
            20                  25                  30
Lys Asn Gly Val Pro Ala Ile Thr Ala Gly Ala Glu Phe Gly Glu Lys
        35                  40                  45
Pro Thr Leu Ser Lys Gly Glu Gly Asp Pro Pro Lys Glu Leu Lys Thr
    50                  55                  60
Asp Val Ile Ser Glu Gly Asp Gly Ala Lys Leu Lys Asn Gly Asp Ala
65                  70                  75                  80
Ile Gln Val Asn Tyr Leu Gly Gln Ala Trp Asp Ser Thr Lys Pro Phe
                85                  90                  95
Asp Asn Ser Phe Asp Arg Lys Gln Pro Phe Asp Leu Thr Leu Gly Ala
            100                 105                 110
Gly Met Val Ile Gln Gly Trp Asp Lys Gly Leu Val Gly Gln Lys Val
        115                 120                 125
Gly Ser Arg Val Glu Leu Val Ile Pro Pro Glu Leu Gly Tyr Gly Glu
    130                 135                 140
Gln Gly Gln Gly Asp Ile Lys Pro Asn Ala Thr Leu Val Phe Val Val
145                 150                 155                 160
Asp Ile Leu Lys Ala Thr Gln Ile Pro Ala Ser Ala Lys Gly Thr Glu
                165                 170                 175
Val Ala Gln Asp Asn Val Asp Leu Pro Lys Val Gly Val Lys Thr Asp
            180                 185                 190
Gly Lys Ala Pro Thr Val Thr Ile Pro Lys Ser Asp Pro Pro Lys Lys
        195                 200                 205
Leu Val Ser Asn Tyr Val Leu Glu Ser Asp Gly Glu Val Val Lys Glu
    210                 215                 220
Ser Asp Ser Val Val Val Asn Tyr Val Gly Met Ile Trp Lys Gly Ala
225                 230                 235                 240
Lys Glu Phe Asp Asn Thr Tyr Ser Thr Gly Lys Thr Gln Thr Phe Pro
                245                 250                 255
Leu Ser Gln Val Thr Leu Lys Gly Leu Lys Asn Gly Leu Val Asp Lys
            260                 265                 270
Lys Val Gly Ser Arg Val Leu Leu Val Ile Pro Pro Asp Gln Ala Phe
        275                 280                 285
Gly Asp Gln Gln Gln Gln Ala Ile Pro Lys Asn Ser Thr Leu Val Phe
    290                 295                 300
Ala Val Asp Ile Leu Ala Lys Val
305                 310

Claims (12)

1.一种人工改造蛋白质的制造方法，其特征在于，包含：
使肽基脯氨酰异构酶和蛋白质改造酶作用于蛋白质的工序。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，同时进行使所述蛋白质改造酶作用的处理和使所述肽基脯氨酰异构酶作用的处理。
3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述蛋白质改造酶选自由蛋白水解酶、蛋白质侧链修饰酶和蛋白质交联酶组成的组。
4.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述蛋白质改造酶选自由蛋白酶、蛋白质脱酰胺酶、转谷氨酰胺酶和催化蛋白质交联化的氧化还原酶组成的组。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，所述蛋白质选自由来源于豆、谷物、坚果及种子的植物蛋白质；乳蛋白质、卵蛋白质、血液蛋白质、肌肉蛋白质及肌腱蛋白质；以及来源于微生物、藻和昆虫的蛋白质组成的组。
6.一种改性的蛋白质原料的制造方法，其特征在于，包含：
利用肽基脯氨酰异构酶和蛋白质改造酶处理含有蛋白质的食品原料、医药原料或工业原料的工序。
7.根据权利要求6所述的制造方法，其中，同时进行利用所述蛋白改造酶的处理和利用所述肽基脯氨酰异构酶的处理。
8.一种蛋白质改造用酶制剂，其特征在于，含有肽基脯氨酰异构酶和蛋白质改造酶。
9.根据权利要求8所述蛋白质改造用酶制剂，其中，所述蛋白质改造酶选自蛋白水解酶、蛋白质侧链修饰酶和蛋白质交联酶。
10.根据权利要求8所述蛋白质改造用酶制剂，其中，蛋白质改造酶选自由蛋白酶、肽酶、蛋白质脱酰胺酶、转谷氨酰胺酶和催化蛋白质交联化的氧化还原酶组成的组。
11.一种改性的蛋白质原料的制造方法，其特征在于，包含：
利用肽基脯氨酰异构酶处理含有蛋白质的食品原料、医药原料或工业原料的工序。
12.一种蛋白质原料的改性用酶制剂，其特征在于，含有肽基脯氨酰异构酶。
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