CN116106552B - 一种靶向检测溶液中胶原蛋白的试剂盒及其在肝纤维化诊断中的应用 - Google Patents

一种靶向检测溶液中胶原蛋白的试剂盒及其在肝纤维化诊断中的应用

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种靶向检测溶液中胶原蛋白的试剂盒及其在肝纤维化诊断中的应用，包括微针芯片、固定于微针芯片上的捕获探针和游离的检测探针；所述微针芯片由活化的PEGDA溶液与胶原蛋白捕获探针混合，光固化3D打印得到；捕获探针序列为D‑(Gly‑Pro‑Hyp)n‑Ahx‑Cys‑X或D‑(Gly‑Pro‑Pro)n‑Ahx‑Cys‑X，n为8‑20之间的整数，其中X为纳米粒子；所述检测探针序列为Y‑CTP‑X‑R，X为纳米粒子，R为拉曼信号分子，Y‑CTP为不同类型胶原蛋白靶向探针；所述试剂盒操作简单方便，可以同时检测溶液中的多种胶原蛋白标志物，特异性高，检测限低，可用于肝纤维化的无损早期诊断，具有广泛的应用前景。

Description

一种靶向检测溶液中胶原蛋白的试剂盒及其在肝纤维化诊断 中的应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种靶向检测溶液中胶原蛋白的试剂盒及其在肝纤维化诊断中的应用。
背景技术
肝纤维化是由乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、酗酒、代谢综合征等各种致病因子导致肝内结缔组织异常增生的病理状况。任何肝脏损伤在修复愈合的过程中都有肝纤维化的发生，如果纤维化的过程长期持续，会最终导致肝硬化。因此，肝纤维化是预测慢性肝脏损伤和疾病进展的重要因素，对肝纤维化及时进行诊断至关重要。目前肝纤维化的诊断方法主要包括肝穿刺活组织检查和血清分子标志物检测。血清分子标志物检测作为一种无损检测方法，成本低、简单方便，因此在肝纤维化的诊断领域备受关注。
胶原蛋白是肝纤维化血清分子检测的重要生物标志物。发明专利CN105911296A公开了一种IV型胶原蛋白化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法；发明专利WO2021193763A1公开了一种IV型胶原7S域片段的测定方法及其使用试剂盒。这些专利提供了单一组分IV型胶原蛋白的荧光检测方法，但是肝纤维化是多种类型胶原蛋白共同作用的结果，开发更加高效的、同时检测血液中不同类型胶原蛋白的方法，仍然是巨大挑战。
光固化3D打印是一种新型的自由形式制造技术，采用数字控制的逐层沉积方案来生产复杂的组件和架构材料。该技术从计算机辅助设计(CAD)开始设计3D模型，由专用程序切片并以多层切片方式提供给3D打印机。光固化技术具有模型可定制、选择精度高、聚合速度快，打印速度快的优点。3D打印应用于生物检测中，可实现多种功能成分均匀、牢固地分布于芯片中。
发明人在研究过程中意外的发现，一种靶向检测溶液中胶原蛋白的试剂盒及其在肝纤维化诊断中的应用，包括3D打印的微针芯片、固定于微针芯片上的捕获探针和游离的检测探针；所述微针芯片由活化的PEGDA溶液与胶原蛋白捕获探针混合，光固化3D打印得到；捕获探针序列为D-(Gly-Pro-Hyp)n-Ahx-Cys-X或D-(Gly-Pro-Pro)n-Ahx-Cys-X，n为8-20之间的整数，其中X为纳米粒子；所述检测探针序列为Y-CTP-X-R，X为纳米粒子，R为拉曼信号分子，Y-CTP为不同类型胶原蛋白靶向探针；所述试剂盒操作简单方便，可以同时检测溶液中的多种胶原蛋白标志物，特异性高，检测限低，可用于肝纤维化的无损早期诊断，具有广泛的应用前景。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种靶向检测溶液中胶原蛋白的试剂盒，包括3D打印的微针芯片、固定于微针芯片上的捕获探针和游离的检测探针；所述微针芯片由活化的PEGDA溶液与胶原蛋白捕获探针混合，光固化3D打印得到；所述捕获探针序列为D-(Gly-Pro-Hyp)n-Ahx-Cys-X或D-(Gly-Pro-Pro)n-Ahx-Cys-X，n为8-20之间的整数，其中X为纳米粒子；所述检测探针序列为Y-CTP-X-R，X为纳米粒子，R为拉曼信号分子，Y-CTP为不同类型胶原蛋白的靶向探针。
优选的，Y为I型，II型，Ⅲ型或IV型胶原蛋白。
优选的，X为过渡金属纳米粒子和/或半导体纳米粒子中。
优选的，X为Au、Ag或Cu纳米粒子。
优选的，所述PEGDA溶液的活化方法为：取PEGDA，加入0.1％wt光引发剂苯基双(2，4，6-三甲基苯甲酰基)氧化膦，搅拌至均一溶液。
优选的，所述的光固化打印参数为：层高25μm，基层层数5，基层曝光2.1s，片层层数90，片层曝光2.1s，光强2mW/cm2。
优选的，所述拉曼信号分子选自4-MBA、4-MBN、4-EBT、S-(4-乙炔基苯基)乙硫代酸酯、S-(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)乙硫代酸酯和S-(4-氰基苯基)乙硫代酸酯中任一种。
优选的，所述的捕获探针序列通过固相合成法制备。
优选的，所述的固相合成法包括如下步骤：
a.将80-120mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；
b.由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；
c.将4eq N端由Fmoc保护的氨基酸、4eq HOBt和4eq HBTU由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加6eq DIEA，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs；
d.反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mLDMF和DCM洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mLDMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
e.之后重复步骤c)和d)，直到合成目标序列的胶原多肽后，然后向反应器中加入20-30％乙酸酐，显色反应检测反应完全后，树脂分别由3-8mLDMF和DCM洗2-4次；
f.树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-4次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为TFA:TIS:水的质量比为90:5:5，反应1-6hrs；
g.向反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽，然后将溶液冻干得到探针。
本发明的第二目的是提供所述的试剂盒检测血液中/肝纤维化早期血液中胶原蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)通过固相合成法制备胶原蛋白的捕获探针，光固化打印制备微针芯片；
(2)将测样品添加到微针芯片上，结合结束后清洗多余样品；
(3)将制备好的检测探针加入到步骤(2)得到的微针芯片，结合，结束后清洗；
(4)在共焦拉曼光谱仪上进行光谱采集。
本发明的第三目的是提供所述的试剂盒在检测血液中胶原蛋白的应用。
本发明的第四目的是提供所述的试剂盒在检测肝纤维化早期血液中胶原蛋白的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种用于靶向SERS检测溶液中胶原蛋白的试剂盒，包括3D打印的微针芯片、固定于微针芯片上的捕获探针和游离的检测探针；将胶原多肽捕获探针与PEGDA混合进行打印，得到规则成型的微针芯片；在靶向多肽探针序列中引入带电氨基酸，以调节多肽的整体带电特性，得到稳定的单分子捕获探针；胶原多肽探针的制备，通过固相合成法，合成特定序列的胶原多肽，通过Cys与纳米粒子结合；SERS进行胶原蛋白同时检测，多肽检测探针连接SERS纳米粒子组装成SERS多肽探针；溶液胶原蛋白捕获；体外血清检测；肝纤维化分期；所述的试剂盒制备方法简单，且形状可变，可以同时检测多种标志物，特异性高，随着胶原浓度增加，SERS信号不断增强，该体系是对溶液中胶原蛋白的良好富集和检测的方法，线性检测范围为10-400ng/mL，检测限低至3.09ng/mL，本发明所述的试剂盒可以用于诊断或辅助诊断早期肝纤维化，且诊断的准确率高，具有良好的临床应用前景。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
图1 3D打印微针芯片的表征；
图2 3D打印微针芯片捕获并检测溶液中的I型/IV型胶原蛋白；
图3 3D打印微针芯片检测溶液中的I型/IV型胶原蛋白的特异性；
图4 3D打印微针芯片检测溶液中的I型/IV型胶原蛋白的线性关系；
图5 3D打印微针芯片检测血液中的I型/IV型胶原蛋白的线性关系；
图6小鼠肝纤维化组织和血液中I型胶原和IV型胶原蛋白的检测；
具体实施方式
下面结合具有实施例对本发明的保护范围进行详细的说明，应当理解的是，本发明的保护范围并不受以下实施例的限制。
实施例1 3D打印微针芯片(MC)及表征
1.胶原捕获探针的设计
本次设计的胶原捕获探针序列如下所示：D-(Gly-Pro-Hyp)8-Ahx-Cys-X，其中X为Ag纳米粒子；
2.胶原捕获探针的制备
a.将100mg Rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5mL二氯甲烷溶胀树脂；
b.由20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；
c.将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3hrs。
d.反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5mLDMF和DCM洗3次。显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min。树脂分别由5mLDMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
e.重复步骤c、d，直到合成目标序列的胶原多肽D-(Gly-Pro-Hyp)8-Ahx-Cys-X。向反应器中加入25％乙酸酐，显色反应检测反应完全，树脂分别由5mLDMF和DCM洗3次。
f.树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤3次。将树脂抽干，加入切割液(TFA:TIS:水＝90:5:5)，反应3hrs。
g.反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀。离心收集沉淀，用少量TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后风干，得到粗肽。粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽，将溶液冻干得到探针D-(Gly-Pro-Hyp)8-Ahx-Cys(D-PCTP)。
h.取1mLAg纳米粒子，向其中加入85℃预热20min，冰水淬灭的D-PCTP(0.5mM)探针200μL，搅拌1-4hrs，5000rpm离心5min除去未结合多肽，得到捕获探针Ag@PCTP-D。
3.PEGDA活化：取一定质量PEGDA，向其中加入0.1％wt光引发剂苯基双(2，4，6-三甲基苯甲酰基)氧化膦，磁力搅拌48h直至成为均一溶液，常温下磁力搅拌备用。
4. 3D打印微针芯片(MC)：将活化后的PEGDA溶液与Ag@PCTP-D捕获探针混合(v/v＝4:1)，充分混匀避光备用。混匀后的打印材料取1ml置于3D打印样品台上(EFL)，设置相应参数，开始光固化打印。具体参数为：层高25μm，基层层数5，基层曝光2.1s，片层层数90，片层曝光2.1s，光强2mW/cm2。
5.MC表征：正置荧光显微镜采集微针芯片图像。SEM元素分析和Mapping验证芯片中PEGDA和多肽的存在。
如图1所示，a为通过TEM表征捕获探针Ag@PCTP-D的分散状态，捕获探针的TEMMapping元素分布，S代表的多肽探针均匀分布在Ag纳米粒子周围，且以单个粒子形式存在。b为捕获探针Ag@PCTP-D的DLS表征，表明捕获探针粒径约为70nm，进一步表明捕获探针在溶液中的均匀性。c为荧光显微镜记录的微针芯片的规则阵列，以及通过SEM表征单个微针的形貌，进一步表征了Mapping和元素分析，C代表了整个芯片的组分和PCTP-D的信号，N代表Ag@PCTP-D捕获纳米探针的位置，说明捕获探针均匀分布在微针芯片中。
实施例2微针芯片捕获检测I型/IV型胶原蛋白表征
1.检测探针为DDD-KLWVLPK-Ahx-Cys-X-R1(S-IV)，DD-LRELHLNNN-Ahx-Cys-X-R2(S-I)，其中X为Ag纳米粒子，R1为S-(4-氰基苯基)乙硫代酸酯，R2为S-(4-乙炔基苯基)乙硫代酸酯；
2.胶原蛋白检测
MC捕获胶原所用I型和IV型胶原蛋白均需70℃预加热10min变性。首先向MC中加入I型胶原蛋白(Col-I)或IV型胶原蛋白(Col-IV)，结合结束后清洗，再向其中加入检测探针S-I或S-IV，检测结束后清洗进行MC+Col-I+S-I和MC+Col-IV+S-IV的SERS信号表征。同时检测了水为对比MC+H2O+S-I的SERS信号，MC的SERS信号和MC结合胶原蛋白(MC+Col-I或MC+Col-IV)SERS信号。
具体过程为：I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白溶液在70℃预加热10min使其变性。MC与(1)水，(2)400ng/mL I型胶原蛋白，(3)400ng/mL IV型胶原蛋白，在未处理24孔板中孵育4h，PB(10mMpH 7.4)缓冲溶液洗去未结合的胶原蛋白，洗涤3次，每次3min。600μL探针S-I分别加入到孔板(1)和(2)中，S-IV分别加入到孔板(1)和(3)，4℃孵育4h。之后用600μL PB溶液洗涤3次，每次3min，以除去未结合的检测探针。在共焦拉曼光谱仪上进行800-2600cm-1光谱采集，激发光为633nm，激光强度0.258mW。
如图2a所示，从下到上分别为MC、MC+Col-I、MC+H2O+S-I、MC+Col-I+S-I的SERS光谱，特征峰为2102cm-1。只有当待检测物为Col-I，检测探针为S-I时，特征峰信号才会出现，其它条件下均无特征峰信号。图2c从上到下分别为MC、MC+Col-IV、MC+H2O+S-IV、MC+Col-IV+S-IV的SERS信号，特征峰为2227cm-1。只有当待检测物为Col-IV，检测探针为S-IV时，特征峰信号才会出现，其它条件下均无特征峰信号，检测信号均为MC的信号，且两种胶原蛋白的检测信号与其它对比条件下的信号存在显著性差异。该结果证明MC可以捕获溶液中变性胶原蛋白，两种SERS检测探针也可以分别检测IV型、I型胶原蛋白。此外，I型胶原蛋白在2102cm-1的信号强度和IV型胶原蛋白在2227cm-1的信号强度明显大于其它样品(图2b，d)。
通过对比BSA、溶菌酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白在MC上的捕获检测结果验证该方法的特异性。具体为：MC与BSA、溶菌酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白在未处理24孔板中孵育4h，PB(10mM pH 7.4)缓冲溶液洗去未结合的胶原蛋白，洗涤3次，每次3min。600μL探针S-I分别加入到孔板中，4℃孵育4h。之后用600μL PB溶液洗涤3次，每次3min，以除去未结合的检测探针。同样的，MC与BSA、溶菌酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白在未处理24孔板中孵育4h，PB(10mMpH7.4)缓冲溶液洗去未结合的胶原蛋白，洗涤3次，每次3min。600μL探针S-IV分别加入到孔板中，4℃孵育4h。之后用600μL PB溶液洗涤3次，每次3min，以除去未结合的检测探针。共焦拉曼光谱仪采集800-2600cm-1光谱，通过特征峰2102cm-1和2227cm-1比较蛋白捕获检测结果。
如图3a所示，从上到下待检测蛋白分别为I型胶原、BSA、胃蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶，检测探针为S-I，I型胶原有较好的检测特征信号2102cm-1出现，而其它蛋白均无特征峰信号。b为特征信号2102cm-1的信号峰强度值，对比可知I型胶原信号显著强于其它蛋白，说明S-I对I型胶原有特异性结合。c图从上到下待检测蛋白分别为IV型胶原、BSA、胃蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶，检测探针为S-I，I型胶原有较好的检测特征信号2102cm-1出现，而其它蛋白均无特征峰信号。d为特征信号2227cm-1的信号峰强度值，对比可知IV型胶原信号显著强于其它蛋白，说明S-IV对IV型胶原有特异性结合。
实施例3溶液中I型胶原和IV型胶原的检测线性关系
将I型胶原蛋白配成10，20，50，100，200，400ng/mL梯度浓度溶液备用。MC与热变性I型胶原蛋白于未处理的24孔板中4℃孵育4h。600μL PB溶液洗去未结合的蛋白，洗涤3次，每次3min。600μL探针S-I加入到孔板中，4℃孵育4h。之后用600μL PB溶液洗涤3次，每次3min，以除去未结合的SERS多肽探针。将IV型胶原蛋白配成10，20，50，100，200，400ng/mL梯度浓度溶液备用。将3D打印制备的MC与热变性IV型胶原蛋白于未处理的24孔板中4℃孵育4h。600μL PB溶液洗去未结合的胶原蛋白，洗涤3次，每次3min。600μL SERS多肽探针S-IV加入到孔板中，4℃孵育4h。之后用400μL PB溶液洗涤3次，每次3min，以除去未结合的SERS多肽探针。
在正常小鼠血清中配制不同浓度的I型胶原溶液(10，20，50，100，200，400ng/mL)，IV型胶原溶液(10，20，50，100，200，400ng/mL)，重复以上捕获检测步骤，分别得到血清样品中I型胶原和IV型胶原的捕获检测线性关系。
如图4a所示为不同浓度I型胶原(10，20，50，100，200，400ng/mL)样品体系SERS信号，特征峰为2102cm-1，随着I型胶原浓度增加，SERS信号不断增强。b为以不同浓度I型胶原蛋白所测得的2102cm-1处信号强度做线性回归曲线(R2＝0.97)，显示该方法线性范围为10-400ng/mL。c为10，20，50，100，200，400ng/mL IV型胶原不同浓度样品体系SERS信号，特征峰为2227cm-1，随着IV型胶原浓度增加，SERS信号不断增强。d为不同浓度的IV型胶原蛋白所测得的2227cm-1处信号强度做线性回归曲线(R2＝0.97)，IV型胶原蛋白检测范围为10-400ng/mL。这些结果表明，该体系是对溶液中I型和IV型胶原蛋白的良好富集和检测的方法。
如图5为正常小鼠血液样本加标不同浓度的I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白，得到血清样本中检测I型和IV型胶原蛋白的线性关系曲线。a为正常小鼠血清中加标不同浓度的I型胶原(10，20，50，100，200，400ng/mL)测得的SERS光谱。b为以不同浓度I型胶原蛋白所测得的2102cm-1处信号强度做线性回归曲线(R2＝0.96)，显示该方法线性范围为10-400ng/mL，检测限低至4.36ng/mL。c为正常小鼠血清中加标不同浓度的IV型胶原(10，20，50，100，200，400ng/mL)测得的SERS光谱。d为以不同浓度IV型胶原蛋白所测得的2227cm-1处信号强度做线性回归曲线(R2＝0.97)，显示该方法线性范围为10-400ng/mL，检测限低至3.09ng/mL。
实施例4肝纤维化小鼠肝脏组织提取液和血液中胶原蛋白的捕获与检测
1.肝纤维化模型构建
取4mL四氯化碳及2mL注射用橄榄油于圆底烧瓶中磁力搅拌10分钟，充分混匀得混合液，1mL注射器抽取备用。通过腹腔注射CCl4混合液构建肝纤维化小鼠模型，每周两次，连续注射2，4，6，8周得到S1-S4期肝纤维化小鼠。
将80只KM小鼠随机分为模型组70只，对照组10只。模型组按70μL/100g体重注射混合液，持续8周；实验组10只，按70μL/100g体重注射橄榄油，持续8周。每周注射完一天后随机选取两只小鼠并处死，去肝脏组织，石蜡包埋做病理切片，HE染色。其余小鼠确定分期后，随机取10只小鼠眼球取血，处死并取肝组织备用，直至模型S0-S4模型小鼠取样结束。
2.肝组织提取胶原蛋白
取肝组织切碎后用20％NaCl水溶液泡洗过夜，胃蛋白酶的醋酸溶液提取肝组织胶原3天。搅拌加入NaCl颗粒进行盐析，沉淀过夜。3000rmp离心10min沉淀得到胶原蛋白，透析除盐。醋酸溶液复溶胶原蛋白，将得到的1-4期肝纤组织提取液用SDS-PAGE表征和羟脯氨酸浓度确定，稀释的胶原溶液放在4℃冰箱备用。
3.组织提取液中胶原蛋白检测
将胶原蛋白捕获芯片与稀释的组织提取液于未处理的24孔板中4℃孵育4h。600μLPB(10mM pH7.4)缓冲洗去未结合的蛋白，洗涤3次，每次3min。600μL S-I和S-IV探针的混合溶液加入到孔板中，4℃孵育4h，对芯片捕获的蛋白进行特异性检测。之后用400μL PB缓冲洗涤3次，每次3min，以除去未结合的检测探针。共焦拉曼光谱仪上进行800-2600cm-1光谱采集，由特征峰2227和2102cm-1强度得到组织提取液中IV型和I型胶原蛋白的浓度。
4.血清中胶原蛋白检测
肝纤维化S0-S4期小鼠眼球取血得到模型小鼠全血，加入肝素抗凝血剂。3000rmp离心10min得到上层血清。将S1、S2、S3、S4期血清溶液分别与微针芯片孵育4h，PB洗去多余血清溶液。将不同分期的血清与微针芯片于未处理24孔板中4℃孵育4h，600μL PB溶液洗去未结合的蛋白，洗涤3次，每次3min。600μL S-I和S-IV探针混合加入到孔板中，4℃孵育4h。用600μL PB缓冲洗涤3min/3次，以除去未结合的检测探针。共焦拉曼光谱仪上采集800-2600cm-1光谱信号，由特征峰2102和2227cm-1的强度得到血清中I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白的浓度。
如图6a所示为小鼠肝组织提取液中胶原蛋白的捕获与检测，从下到上分别为肝纤维化S1期、S2期、S3期和S4期检测结果。随着肝纤程度的增加，2102cm-1代表的I型胶原蛋白和2227cm-1代表的IV型胶原蛋白都在不断增加。且同一样品可以实现两种胶原蛋白的同时检测，互不干扰。经计算，小鼠S1-S4期肝组织提取液稀释1000倍中I型胶原浓度分别为18.0、46.4、254.5和406.7ng/mL。b为不同分期肝组织提取液中I型胶原(黑色)和IV型胶原的浓度折线图。I型胶原蛋白在肝组织中占比分别为0.323mg/g、0.856mg/g、5.15mg/g、7.929mg/g。小鼠S1-S4期肝组织提取液稀释1000倍中IV型胶原浓度分别为17.2、34.5、95.3和249.7ng/mL。IV型胶原蛋白在肝组织中占比分别为0.309mg/g、0.636mg/g、1.929mg/g、4.87mg/g。c为S1-S4期肝纤维化小鼠血清中I型胶原和IV型胶原的捕获与检测，结果表明I型胶原蛋白SERS信号很低，表明血清中基本不存在I型胶原蛋白。IV型胶原蛋白SERS信号强度对应浓度分别为，S1期5.44ng/mL，S2期10.97ng/mL，S3期29.24ng/mL，S4期36.65ng/mL。d为不同分期肝纤维化小鼠血清中I型胶原(黑色)和IV型胶原的浓度折线图。
本发明提供了一种用于靶向SERS检测溶液中胶原蛋白的试剂盒，包括3D打印的微针芯片、固定于微针芯片上的捕获探针和游离的检测探针；将胶原多肽捕获探针与PEGDA混合进行打印，得到规则成型的微针芯片；在靶向多肽探针序列中引入带电氨基酸，以调节多肽的整体带电特性，得到稳定的单分子捕获探针；胶原多肽探针的制备，通过固相合成法，合成特定序列的胶原多肽，通过Cys与纳米粒子结合；SERS进行胶原蛋白同时检测，多肽检测探针连接SERS纳米粒子组装成SERS多肽探针；溶液胶原蛋白捕获；体外血清检测；肝纤维化分期；所述的试剂盒制备方法简单，且形状可变，可以同时检测多种标志物，特异性高，随着胶原浓度增加，SERS信号不断增强，该体系是对溶液中胶原蛋白的良好富集和检测的方法，线性检测范围为10-400ng/mL，检测限低至3.09ng/mL，本发明所述的试剂盒可以用于诊断或辅助诊断早期肝纤维化，且诊断的准确率高，具有良好的临床应用前景。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种靶向检测溶液中胶原蛋白的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括3D打印的微针芯片、固定于微针芯片上的捕获探针和游离的检测探针；所述微针芯片由活化的PEGDA溶液与捕获探针混合，光固化打印得到；所述捕获探针序列为D-(Gly-Pro-Hyp)n-Ahx-Cys-X或D-(Gly-Pro-Pro)n-Ahx-Cys-X，n为8-20之间的整数，其中X为纳米粒子；所述检测探针序列为Y-CTP-X-R，X为纳米粒子，R为拉曼信号分子，Y-CTP为不同类型胶原蛋白的靶向探针，D为天冬氨酸。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，X为过渡金属纳米粒子和/或半导体纳米粒子。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，X为Au、Ag或Cu纳米粒子。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PEGDA溶液的活化方法为：取PEGDA，加入0.1％wt光引发剂苯基双(2，4，6-三甲基苯甲酰基)氧化膦，搅拌至均一溶液。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的光固化打印参数为：层高25μm，基层层数5，基层曝光2.1s，片层层数90，片层曝光2.1s，光强2mW/cm2。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述拉曼信号分子选自4-MBA、4-MBN、4-EBT、S-(4-乙炔基苯基)乙硫代酸酯、S-(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)乙硫代酸酯和S-(4-氰基苯基)乙硫代酸酯中任一种。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，Y为I型，II型，Ⅲ型或IV型胶原蛋白。
8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的捕获探针序列通过固相合成法制备。
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