CN116087504A - 免疫磁珠保护液、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种免疫磁珠保护液、其制备方法及应用。所述免疫磁珠保护液的主要成分包括两亲性高分子聚合物、基于HOVE的嵌段氟化共聚物、保护性蛋白、蛋白酶抑制剂、甘油和/或高分子聚合物、络合剂、两亲性表面活性剂和防腐剂。利用本发明的免疫磁珠保护液保存磁珠，可使得磁珠即使保存在低至‑20℃的条件下仍保持悬浮分散状态，可长期维持免疫磁珠的稳定性以及减少非特异性免疫吸附。

Description

免疫磁珠保护液、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种免疫磁珠保护液、其制备方法及应用。
背景技术
免疫磁珠(Immunomagnetic Beads)以磁性粒子Fe2O3或Fe3O4为核心，在磁珠表面包被无机层或者聚合物层，然后通过磁珠表面的功能基团(如-氨基、-羧基、-巯基、-环氧基、-NHS酯基)将抗体、蛋白、酶等活性分子进行固定，可进一步用于细胞分选、免疫检测、蛋白与核酸的分离纯化、酶的固定等多个领域。在外加电场存在的情况下，免疫磁珠会表现出磁性，并被聚集起来。离开磁场后，他们又能如普通颗粒一般，均匀分散。
免疫磁珠的制备比较复杂，对反应条件和反应设备有较高的要求，大部分条件下无法现场直接制备；另外由于免疫磁珠的制备周期也比较长，无法满足现用现制的要求。所以事先制备好的免疫磁珠更受欢迎，但免疫磁珠表面的活性分子的稳定性较差，一般难于长期保存。
免疫磁珠比较有利的保存条件是冻存，冻存能够很好地保持其表面分子的活性。但常规冻存会造成磁珠的结块聚集从而降低磁珠的活性，所以需要寻找一种高效的磁珠冻存保护液，能保证磁珠在冻存条件下保持均匀分散，从而使免疫磁珠具有长期稳定性。现有商品化磁珠的保存液在本领域中有所研究，然而现有的免疫磁珠保存液往往仅能在0℃以上的情况下保存磁珠才具有较显著的保护作用、而不易于在零下例如-20℃条件下发挥保护作用。
在专利CN114480369A使用了不同分子量的聚乙二醇和甘油组分，并探讨了-20℃保存，但其针对的是核酸磁珠，该磁珠表面没有活性抗体或蛋白，该发明的组分不能很好地降低免疫磁珠的非特异吸附性能。
免疫磁珠由于其本身的粒径较小，比表面积较大，所以磁珠本身容易吸附待测样品中的各种蛋白，并且磁珠倾向于自身聚集而降低比表面积以保持稳定性，所以需要寻求合适的保护液用来降低磁珠的团聚和磁珠的非特异性吸附。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫磁珠保护液、其制备方法及应用。
在本发明的第一方面，提供一种保护免疫磁珠或提高其性能的方法，包括将免疫磁珠与免疫磁珠保护液混合；其中，所述免疫磁珠保护液包括以下组分：基于HOVE的嵌段氟化共聚物，两亲性高分子聚合物，保护性蛋白，蛋白酶抑制剂，甘油和/或高分子聚合物，络合剂，两亲性表面活性剂和防腐剂；所述基于HOVE的嵌段氟化共聚物选自：聚(HOVE-b-HFBOVE)或其类似物，聚(HOVE-b-TFEOVE)或其类似物，聚(HOVE-b-PFPOVE)或其类似物，或其组合；其中所述类似物(单体的聚合度增减形成的类似物)分子量1000-10000(较佳地4000-6000)；所述两亲性高分子聚合物选自：聚甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(PMPC)或其类似物，聚磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(PSBMA)或其类似物，聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯(PCBMA)或其类似物，或它们的组合；其中所述类似物(单体的聚合度增减形成的类似物)分子量1000-10000(较佳地6000-10000)。
在一种或多种优选实施方式中，所述免疫磁珠表面包括蛋白活性分子；较佳地，所述蛋白活性分子包括(但不限于)：功能蛋白、抗体、酶。
在一种或多种优选实施方式中，所述保护性蛋白包括选自：BSA、L-赖氨酸、酪氨酸，或其组合。
在一种或多种优选实施方式中，所述高分子聚合物包括：聚乙二醇，较佳地为PEGm且m为100-1000的正整数(如PEG200、PEG300、PEG400或PEG600)。
在一种或多种优选实施方式中，所述络合剂包括：EDTA或葡萄糖酸钠。
在一种或多种优选实施方式中，所述两亲性表面活性剂包括：吐温试剂或TritonX-100，较佳地为Tween-20。
在一种或多种优选实施方式中，所述防腐剂包括：ProClean 300。
在一种或多种优选实施方式中，所述免疫磁珠保护液中，各组分的量包括：
Figure BDA0004094301620000031
在一种或多种优选实施方式中，所述组分包含在缓冲液(较佳地pH7.4±0.3，更佳地pH7.4±0.2或pH7.4±0.1)中。
在一种或多种优选实施方式中，所述甘油与高分子聚合物择一使用或联合使用。
在本发明的另一方面，提供一种免疫磁珠保护液，包括以下组分：两亲性高分子聚合物，基于HOVE的嵌段氟化共聚物，保护性蛋白，蛋白酶抑制剂，甘油和/或高分子聚合物，络合剂，两亲性表面活性剂和防腐剂；所述两亲性高分子聚合物选自：聚甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(PMPC)或其类似物，聚磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(PSBMA)或其类似物，聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯(PCBMA)或其类似物，或它们的组合；其中所述类似物(单体的聚合度增减形成的类似物)分子量1000-10000(较佳地6000-10000)；所述基于HOVE的嵌段氟化共聚物选自：聚(HOVE-b-HFBOVE)或其类似物，聚(HOVE-b-TFEOVE)或其类似物，聚(HOVE-b-PFPOVE)或其类似物，或其组合；其中所述类似物(单体的聚合度增减形成的类似物)分子量1000-10000(较佳地4000-6000)。
在本发明的另一方面，提供一种制备免疫磁珠保护液的方法，包括：将两亲性高分子聚合物，基于HOVE的嵌段氟化共聚物，保护性蛋白，蛋白酶抑制剂，甘油和/或高分子聚合物，络合剂，两亲性表面活性剂和防腐剂进行混合，形成所述的免疫磁珠保护液；较佳地，混合于缓冲液(较佳地pH7.4±0.3，更佳地pH7.4±0.2或pH7.4±0.1)中。
在本发明的另一方面，提供所述的免疫磁珠保护液的应用，用于保护免疫磁珠或提高其性能；较佳地，所述提高性能包括：提高磁珠的结合效率，提高磁珠的稳定性或降低磁珠的非特异性吸附；较佳地，所述免疫磁珠表面包括蛋白活性分子；较佳地，所述蛋白活性分子包括(但不限于)：功能蛋白、抗体、酶。
在本发明的另一方面，提供一种对蛋白活性分子进行固定和保存的方法，包括：
(a)将蛋白活性分子与磁珠进行混合，所述蛋白活性分子结合于磁珠表面，获得固定有蛋白活性分子的磁珠；
(b)将(a)的固定有蛋白活性分子的磁珠加入到所述的免疫磁珠保护液中；
所述蛋白活性分子包括(但不限于)：功能蛋白、抗体、酶；
在一种或多种优选实施方式中，(b)之后，还包括(但不限于)进行：细胞分选、免疫检测、蛋白与核酸的分离纯化、酶的固定的步骤。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1：Protein A+G磁珠在不同保护液中，在2年内的结合效率。
图2：Protein A+G磁珠在不同保护液中，在半年和2年磁珠和FT(Flow Through)的非特异吸附结果。
图3：例6、例12和对照的磁珠分散状态图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究筛选，公开了一种免疫磁珠保护液，主要成分含有两亲性高分子聚合物、基于HOVE的嵌段氟化共聚物、保护性蛋白、蛋白酶抑制剂、甘油和/或高分子聚合物、络合剂、两亲性表面活性剂和防腐剂。利用本发明的免疫磁珠保护液保存磁珠，可使得磁珠即使保存在低至-20℃的条件下仍保持悬浮分散状态，可长期维持免疫磁珠的稳定性以及减少非特异性免疫吸附。
如本发明中所用，所述的“含有”，“包括”或“具有”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
如本发明中所用，“约”、“大约”、“大概”或“基本上”一般应指一特定数值或范围如20％以内、较佳10％以内、更佳地5％以内的上下浮动。在此所使用的数值为近似值，代表若未明示地陈述，“约”、“大约”、“大概”或“基本上”等词可以被推断适用。
如本发明中所用，所述的“主要成分(组分)”或“主要活性成分”或“活性成分”是指在护免疫磁珠或提高其性能中起作用的必要成分，本发明中主要包括以下组分：两亲性高分子聚合物，基于HOVE的嵌段氟化共聚物，保护性蛋白，蛋白酶抑制剂，甘油和/或高分子聚合物，络合剂，两亲性表面活性剂和防腐剂或由它们组成。
与现有免疫磁珠保存液相比，本发明的技术方案具有但不限于如下的特点：(1)通过在溶液中添加两亲性高分子聚合物(无需进行磁珠表面的修饰/改造，从而不会影响磁珠本身的效果以及无需复杂的改造程序)，比常规的非离子型聚合物如PEG，更能降低磁珠的非特异吸附；(2)通过添加基于HOVE的嵌段氟化共聚物，降低了免疫磁珠自身的聚集，从而更好地保护免疫磁珠包被蛋白或抗体的活性位点；(3)通过添加甘油和/或高分子聚合物，提高了免疫磁珠的长期稳定性；(4)添加到保护液里，不需要化学合成和改造磁珠，使用方便，效果好。
本领域常用的用于保持磁珠稳定性的物质包括有PVP，PEG，明胶等，具有一定的抗团聚作用，然而在降低非特异吸附方面却并没有呈现优势。本发明则揭示了降低磁珠自身聚集的同时降低非特异吸附方面、两种优势兼具的免疫磁珠保护液。
基于本发明人的新发现，本发明提供了一种新型的用于保护免疫磁珠或提高其性能的组合物(免疫磁珠保护液)，其能够-20℃保存以保证免疫磁珠的活性和长期稳定性，并降低免疫磁珠间的团聚和非特异吸附性能。所述免疫磁珠保护液包括：两亲性高分子聚合物、基于HOVE的嵌段氟化共聚物、保护性蛋白、蛋白酶抑制剂、甘油和/或高分子聚合物、络合剂、两亲性表面活性剂和防腐剂。
在本发明的优选方式中，所述保护性蛋白包括选自：BSA、L-赖氨酸、酪氨酸，或其组合；所述高分子聚合物包括：聚乙二醇，较佳地为PEGm且m为100-1000的正整数(如PEG200、PEG300、PEG400或PEG600)；所述络合剂包括：EDTA或葡萄糖酸钠；所述两亲性表面活性剂包括：吐温试剂或Triton X-100，较佳地为Tween-20；所述防腐剂包括：ProClean300。
在本发明的进一步优选的方式中，所述的免疫磁珠保护液所包括的组分的用量如表1所示。
表1
Figure BDA0004094301620000061
作为本发明实施例中的一个优选的具体实例，本发明的免疫磁珠保存液包括：两亲性高分子聚合物PMPC 5g/L、PSBMA 5g/L、PCBMA 5g/L，基于HOVE的嵌段氟化共聚物聚(HOVE-b-HFBOVE)1g/L、聚(HOVE-b-TFEOVE)1g/L、聚(HOVE-b-PFPOVE)1g/L，保护性蛋白BSA30g/L，L-赖氨酸10g/L，蛋白酶抑制剂1v/v％，甘油40v/v％和/或聚乙二醇200 10v/v％，络合剂EDTA0.2g/L、两亲性表面活性剂Tween-20 0.05v/v％，防腐剂ProClean 300 0.1v/v％。
作为本发明实施例中的另一优选的具体实例，本发明的免疫磁珠保存液包括：两亲性高分子聚合物PMPC 8g/L、PSBMA 8g/L、PCBMA 8g/L，基于HOVE的嵌段氟化共聚物聚(HOVE-b-HFBOVE)2g/L、聚(HOVE-b-TFEOVE)2g/L、聚(HOVE-b-PFPOVE)2g/L，保护性蛋白BSA40g/L，L-赖氨酸20g/L，蛋白酶抑制剂1v/v％，甘油40v/v％和/或聚乙二醇10v/v％，络合剂EDTA 0.5g/L、两亲性表面活性剂Tween-20 0.1v/v％，防腐剂ProClean 300 0.1v/v％。
作为本发明实施例中的另一优选的具体实例，本发明的免疫磁珠保存液包括：两亲性高分子聚合物PMPC 10g/L、PSBMA 10g/L、PCBMA 10g/L，基于HOVE的嵌段氟化共聚物聚(HOVE-b-HFBOVE)2g/L、聚(HOVE-b-TFEOVE)2g/L、聚(HOVE-b-PFPOVE)2g/L，保护性蛋白BSA40g/L，L-赖氨酸20g/L，蛋白酶抑制剂1v/v％，甘油40v/v％和/或聚乙二醇10v/v％，络合剂EDTA 0.5g/L、两亲性表面活性剂Tween-20 0.1v/v％，防腐剂ProClean 300 0.1v/v％。
本发明的的组合物(免疫磁珠保存液)中各个组分以合适的量相互配伍，协同作用，实现免疫磁珠的性能的显著促进。
本发明还包括与上述主要活性成分等效的化合物、化学制品、类似物和/或其盐、水合物或前体。对于高分子聚合物、基于HOVE的嵌段氟化共聚物或高分子聚合物，本发明包括一定聚合度的聚合物或一定分子量范围内的聚合物。优选地，两亲性高分子聚合物可以是分子量1000-10000的聚合物、优选分子量6000-10000的聚合物且与PMPC、PSBMA或PCBMA具有共同的单体结构。优选地，基于HOVE的嵌段氟化共聚物可以是分子量1000-10000的聚合物、优选分子量4000-6000的聚合物且与聚(HOVE-b-HFBOVE)、聚(HOVE-b-TFEOVE)或聚(HOVE-b-PFPOVE)具有共同的单体结构。高分子聚合物可以为PEGm且m为100-1000的正整数(如PEG200、PEG300、PEG400或PEG600)。实施例中提供了优选的具体聚合物且进行了效果试验。
所述化合物的类似物包括但不限于：所述化合物的异构体、外消旋体。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。也可以是“盐”的形式。
应理解，本发明的免疫磁珠保存液可以是浓缩型的或稀释型的。浓缩型的组合物中活性成分的含量较高，而稀释型组合物和实际使用的组合物中活性成分含量可能相对低。此外，还可以包含其他合适的化学剂、增效剂、微量元素、稳定剂、分散剂、溶剂等常用组分，它们一般不会改变主要的活性成分的活性功能。
可将免疫磁珠加入到本发明的免疫磁珠保存液中，进行多种多样的基于免疫磁珠技术的应用。应用于包括但不限于如下的方面：
蛋白纯化：利用氨基、羧基、生物素、亲和素、巯基上交联上蛋白质对应的抗体，从而高效、特异性的分离到相应的蛋白质。
细胞纯化/分选：利用免疫磁珠结合目标细胞表面的标记物，从而在短时间内从复杂的细胞混合物中分离出高纯度的目标细胞；免疫磁珠通常不会激活细胞或影响细胞的功能和活力，也不会改变细胞的生理功能，磁性标记细胞可随即用于分析和随后的实验。
抗体分离纯化：传统的抗体分离纯化一般采用层析法，步骤繁琐，耗时长，设备要求及投入成本高，而基于蛋白包被的免疫磁珠的抗体磁性纯化通过简单的磁性吸附即可实现从单抗表达产物中分离单抗的目的。与传统的分离方法相比，免疫磁珠可同时进行分离和富集，有效地提高了分离速度和富集效率。免疫磁珠还能够实现自动化和大批量操作，符合生物学高通量的操作要求，具有操作简单、成本低的特点。
细胞刺激：免疫磁珠在细胞疗法中也发挥了重要作用；例如，在T细胞、NK细胞的活化和扩增中，抗体或蛋白偶联的免疫磁珠可以代替APC，一定程度上避免了细胞处理的繁琐操作。在完成细胞刺激和活化后，通过外加磁场，可以将免疫磁珠完全去除。
微生物富集：利用微生物相应的抗体免疫磁珠可以高效的可可逆性的富集相应的微生物。
体外诊断：利用免疫磁珠能够结合目标分子的特点，可应用于体外诊断。首先，将免疫磁珠作为底物，可用于捕获样品。由于磁珠流动性好，表面积大，可以充分暴露配体蛋白，大大增加了捕获效率。同时，使用荧光，电化学或者化学发光等多样的检测方式，也为方法学的开发带来了很大的自由度。还可将免疫磁珠作为标记物，利用磁珠的磁性来获得信号。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料与方法
1、实验材料、试剂与仪器
Protein A+G磁珠；
辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(碧云天A0216)；
小鼠IgG(碧云天A7028)；
缓冲液[PBS(C0221A)、Tris-HCl，pH7.4](碧云天ST774)；
两亲性高分子聚合物[聚甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(PMPC，Mn9000)(Sigma，货号922749)；
聚磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(PSBMA，Mn7500)(Sigma，货号922390)；
聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯(PCBMA，合成方法见后)]；
基于HOVE的嵌段氟化共聚物[聚(2-羟乙基乙烯基醚)-嵌段(b)-聚(2-(2,2,3,3,4,4,4-七氟丁氧基)乙基乙烯基醚)](聚(HOVE-b-HFBOVE)，为一种氟化两亲嵌段共聚物；
基于HOVE的嵌段氟化共聚物[聚-(2-羟乙基乙烯基醚)-嵌段-聚(2-(2,2,2-三氟乙氧基)乙基乙烯基醚)](聚(HOVE-b-TFEOVE)；
基于HOVE的嵌段氟化共聚物[聚(2-羟乙醚)-嵌段-聚(2-(2,2,3,3,3-五氟丙氧基)乙基乙烯醚)](聚(HOVE-b-PFPOVE)；
保护性蛋白[BSA，Fraction V(ST023)，L-赖氨酸(CAS:39665-12-8)，酪蛋白酸钠(碧云天ST1132)]；
蛋白酶抑制剂[蛋白酶抑制剂混合物(通用型，100X)](碧云天P1005)；
甘油和/或高分子聚合物[甘油(CAS:56-81-5)，聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400、聚乙二醇600(CAS:25322-68-3)]；
络合剂[乙二胺四乙酸EDTA(CAS:60-00-4)，葡萄糖酸钠(CAS:527-07-1)](二选一，除非另外说明后续用EDTA)；
表面活性剂[Tween-20(ST825)、Triton X-100/曲拉通X-100]；
防腐剂[ProClean 300(抑菌防腐剂)](碧云天ST853)；
BeyoGelTM Plus PAGE预制胶(Hepes，4-15％，10孔)(碧云天P0519)；
BeyoGelTM Plus SDS-PAGE Hepes电泳液(20X)(碧云天P0552)；
BeyoColorTM彩色预染蛋白分子量标准(6.5-270kD)(碧云天P0071)；
SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X,无气味)(碧云天P0286)；
TMB显色液(ELISA HRP显色用)(碧云天P0209)；
辣根过氧化物酶标记Streptavidin(碧云天A0303)；
2-羟乙基乙烯基醚(HOVE)购于Sigma(CAS:764-48-7，货号:410020)；
2,2,3,3,4,4,4-七氟-1-丁醇购于Sigma(CAS:375-01-9，货号:H1604)；
NaH购于Sigma(60％dispersion in mineral oil，CAS：7646-69-7)；
氯化锌溶液(1M in diethyl ether，CAS:7646-85-7)；
四氢呋喃(THF)(国药，CAS:109-99-9，货号:40058161)；
三乙胺(国药，CAS:121-44-8，货号:80134318)；
乙醚(国药，CAS:60-29-7，货号:10009318)；
乙基磺酰氯(国药，CAS:594-44-5，货号:XW05944451)；
碳酸氢钠(NaHCO3)(国药，CAS:144-55-8，货号:10018960)；
硫酸钠(Na2SO4)(国药，CAS:7757-82-6，货号:10020518)；
氢化钙(CaH2)(国药，CAS:7789-78-8，货号:80028760)；
己烷(国药，CAS:110-54-3，货号:80068618)；
乙烯基丁醚购于Sigma(CAS:111-34-2，货号:110299)；
氯苯(国药，CAS:108-90-7，货号:80032618)；
二氯甲烷(国药，CAS:75-09-2，货号:80047318)；
氨溶液(2M in methanol，CAS:7664-41-7，货号:H27080，Alfa)；
2,2,2-三氟乙醇购于Sigma(CAS:75-89-8，货号：808259)；
2,2,3,3,3-五氟-1-丙醇购于Sigma(CAS:422-05-9，货号：257478)。
BeyoMagTM磁分离架(8孔，1.5ml/2ml)(碧云天FMS008)；
96孔板(平底，带盖)(碧云天FPT010)；
LCD数控型长轴旋转混匀仪；
干式恒温器(加热)迷你金属浴；
MiniProGelTM蛋白制胶与电泳系统；
多功能酶标仪Varioskan LUX；
BeyoImagerTM 600化学发光成像系统。
2、Protein A+G磁珠的稳定性检测
将Protein A+G磁珠保存在保护液“例1-18”中和对照保存液(含有BSA和ProClean300的对照)中，置于-20℃保存不同时间，分别在0个月、2个月、4个月、6个月、12个月、18个月、24个月(注：12个月、18个月和24个月分别采用37℃孵育7天、10.5天和14天进行模拟)，观察不同保存时间磁珠的性状，是否容易分散等。取待考察的磁珠，使用辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)考察其结合能力，进而验证Protein A+G磁珠的稳定性。
取20μl不同保存液不同时间的Protein A+G磁珠，使用500μl 1×PBS洗涤三次，然后使用400μl PBS重悬磁珠，并加入10μl辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)混匀，置于LCD数控型长轴旋转混匀仪室温翻转混匀2小时。留取每个样品的上清，计为FlowThrough(FT)，使用PBS翻转洗涤磁珠3次，每次5分钟。加入400μl PBS重悬磁珠，然后把重悬后的磁珠和FT一起做梯度稀释，稀释至10倍、100倍、1000倍、10000倍，阳性对照辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)做相同的稀释。稀释完成后取20μl加入到96孔板中，然后加入100μl TMB显色液。室温避光孵育半小时，直接在370nm测定吸光度值，计算结合率时以1000倍的稀释读值为主要参考数据。
结合效率％＝不同保护液中磁珠的吸光度值/阳性对照的吸光度值*100。
3、Protein A+G磁珠非特异性吸附的检测
将Protein A+G磁珠保存在保护液“例1-18”中和对照保存液中，各取20μl不同保存液的磁珠与10μl辣根过氧化物酶标记Streptavidin孵育，考察其非特异吸附性能。20μl的Protein A+G磁珠使用500μl 1×PBS洗涤三次，然后使用400μl PBS重悬磁珠，并加入10μl辣根过氧化物酶标记Streptavidin。置于LCD数控型长轴旋转混匀仪室温翻转混匀2小时。留取每个样品的上清，计为Flow Through(FT)，使用PBS翻转洗涤磁珠3次，每次5分钟。加入400μl PBS重悬磁珠，然后把重悬后的磁珠和FT一起做梯度稀释，稀释至10倍、100倍、1000倍、10000倍，阳性辣根过氧化物酶标记Streptavidin做相同的稀释。稀释完成后取20μl加入到96孔板中，然后加入100μl TMB显色液。室温避光孵育半小时，直接在370nm测定吸光度值，计算非特异吸附效率时以1000倍的稀释读值为主要参考数据。
非特异吸附效率％＝不同保护液中磁珠吸光度值/阳性对照的吸光度值*100。
实施例1、免疫磁珠保护液的制备
1、PCBMA的合成
(1)羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯(CBMA)的合成
在高纯氮气的保护下，向装有100ml恒压滴液漏斗的250ml三口圆底烧瓶中加入甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯(8.43ml，50mmol)(阿拉丁，货号D111129，CAS:2867-47-2)和丙酮45ml(国药，货号:10000418，CAS:67-64-1)，向恒压漏斗中加入β-丙内酯(3.53ml，55mmol)(百灵威，货号：996513，CAS:57-57-8)和丙酮5ml，然后将漏斗中的溶液缓慢滴加到三口烧瓶中，反应在冰水浴中进行，液体滴加完毕后继续搅拌6小时，反应温度不超过15℃。将反应后的溶液过滤，用50ml丙酮和10 0ml无水乙醚(国药，货号:80059628，CAS:60-29-7)分别冲洗。抽滤后收集固体，25℃干燥24小时得到白色固体产物，即为羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯。
(2)PCBMA(聚(羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯))的合成
将CBMA(0.311g，1.35mmol)，0.022g 2-2’-偶氮二异丁腈(AIBN)(阿拉丁，货号:A104256，CAS:78-67-1)和10ml甲醇(国药，货号:10014108，CAS:64-56-1)加入到50ml离心管中，用高纯氮气脱气30分钟后放入60℃恒温油浴中反应16小时。冷却后蒸除大部分甲醇，并将反应液滴入到大量冷异丙醇(国药，货号:40064360，CAS:67-63-0)中沉淀、离心，反复三次，然后再干燥得到黄色固体产物。
2、基于HOVE的嵌段氟化共聚物的合成
(1)2-乙基乙氧基乙磺酸酯的合成
2-羟乙基乙烯基醚(HOVE)(18.7g,212mmol)和三乙胺(32.3ml,232mmol)溶于150ml乙醚，加入到三口瓶中，然后0℃加入乙基磺酰氯到三口烧瓶中，氮气保护。随后室温搅拌并反应10小时。然后反应液倒入NaHCO3溶液，并用乙醚萃取。萃取物用Na2SO4干燥，减压蒸馏得到2-乙基乙氧基乙磺酸酯。
(2)HFBOVE(2-(2,2,3,3,4,4-七氟丁氧基)乙基乙烯基醚)的合成
16g NaH(60％in oil，390mmol)加入三口圆底烧瓶，机械搅拌，烧瓶通氮气除氧，NaH用干己烷洗涤3次，每次50ml。烧瓶里加入120ml四氢呋喃并且冷却到0℃，2,2,3,3,4,4,4-七氟-1-丁醇(50g，250mmol)缓慢加入到烧瓶中，然后加入2-乙基乙氧基乙磺酸酯(44g,240mmol)，搅拌并加热回流反应24小时。反应结束后，产物倒入1M NaHCO3溶液，并用乙醚萃取。有机层使用无水Na2SO4干燥并浓缩，然后用CaH2蒸馏并用NaH减压蒸馏得到2-(2,2,3,3,4,4-七氟丁氧基)乙基乙烯基醚(HFBOVE)。
(3)TFEOVE(2-(2,2,2-三氟乙氧基)乙基乙烯基醚)的合成
10g NaH(60％in oil，240mmol)在氮气保护下用四氢呋喃洗涤4次，每次20ml。在0℃烧瓶里缓慢加入80ml 2,2,2-三氟乙醇，然后加入2-乙基乙氧基乙磺酸酯(23.1g,128mmol)，搅拌并加热回流反应10小时。反应结束后，产物倒入1M NaHCO3溶液，并用乙醚萃取。有机层使用无水Na2SO4干燥并浓缩，然后用CaH2蒸馏并用NaH减压蒸馏得到2-(2,2,2-三氟乙氧基)乙基乙烯基醚的合成(TFEOVE)。
(4)PFPOVE(2-(2,2,3,3,3-五氟丙氧基)乙基乙烯醚))的合成
16g NaH(60％in oil，400mmol)加入三口圆底烧瓶，机械搅拌，烧瓶通氮气除氧，NaH用干己烷洗涤3次，每次50ml。烧瓶里加入160ml四氢呋喃并且冷却到0℃，2,2,3,3,3-五氟-1-丙醇(25g，167mmol)缓慢加入到烧瓶中，然后加入2-乙基乙氧基乙磺酸酯(27.2g,151mmol)，搅拌并加热回流反应24小时。反应结束后，产物倒入1M NaHCO3溶液，并用乙醚萃取。有机层使用无水Na2SO4干燥并浓缩，然后用CaH2蒸馏并用NaH减压蒸馏得到2-(2,2,3,3,3-五氟丙氧基)乙基乙烯醚)(PFPOVE)。
(5)嵌段聚合物的合成
准备2个舒伦克试管(Schlenk tubes)，装好三通阀，氮气保护进行两个嵌段共聚物的合成。一个管(A管)用来合成均聚物，另一个管(B管)用来合成嵌段共聚物。首先在-20℃加入乙烯基丁醚溶液(0.1M溶于己烷，2.5ml，0.25mmol)和氯化锌溶液(0.1M溶于乙醚，0.8ml，0.08mmol)到2-羟乙基乙烯基醚(HOVE；第一单体)(1.9ml，15mmol)和氯苯(0.5ml)的二氯甲烷溶液中，0.1ml的反应混合物用注射器加入到A管中进行，然后用氨溶液(1.5wt％,0.3ml)进行终止反应。此反应过程用气相色谱法(Shimadzu GC-8A色谱仪，配备玻璃柱，固相:silicon-DC11(20％)，基架：Celite 545S)来分析单体的转化率，当95％的单体被转化后，A管中的聚合反应用5ml氨溶液(1.5wt％)进行终止。另一方面，B管冷却至-40℃，第二单体(HFBOVE，TFEOVE，PFPOVE(5.0mmol))加入到混合物中反应4小时，然后用氨溶液(1.5wt％)进行终止反应。A管和B管得到的混合物倒入水中和乙醚中进行萃取，萃取物用无水Na2SO4干燥并真空浓缩得到嵌段共聚物：聚(HOVE-b-HFBOVE)、聚(HOVE-b-TFEOVE)、聚(HOVE-b-PFPOVE)。
3、保护液的制备
免疫磁珠保护液配方如表2，配制于PBS缓冲液中，根据表2配方进行制备。
表2、免疫磁珠保护液配方
Figure BDA0004094301620000141
Figure BDA0004094301620000151
此外，PEG200、PEG300、PEG400、PEG600和甘油可以选择一种或者多种或者全部添加，但是在所述磁珠保护液中的浓度为50v/v％；甘油、PEG可择一使用。
此外，BSA、L-赖氨酸和酪氨酸，可以选择一种或多种全部添加。
实施例2、Protein A+G磁珠的稳定性检测结果
将Protein A+G磁珠保存在上述实施例1制备的保护液中，置于-20℃保存不同时间，针对不同的保存时间考察其结合辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)的能力。由A370的吸光度值可以得出其结合抗体的百分比。对照保护液是已知的磁珠保护液。对照为相同稀释倍数的辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)。
结果显示，例4、例5、例6保护液对Protein A+G磁珠有较好的保存效果，其中例6的保存效果最好，以其作为保护液比对照保护液在2年保存期内高了约50％的结合效率。如表3，在一定浓度范围内，随着保护液各组分浓度的提高，Protein A+G磁珠的结合效率可有提高，但并非浓度越高越好。
表3、Protein A+G磁珠结合效率*
Figure BDA0004094301620000161
*，以37℃孵育7天、10.5天和14天分别模拟12个月、18个月、24个月；0-6个月为非模拟的实验结果。
Protein A+G磁珠在不同保护液中，在2年内的结合效率也呈现于图1。
同时，观察不同保存液的磁珠，即使在-20℃条件下，例1-18的磁珠再次的分散效果都非常好，没有观察到结块团聚现象，证明保护液起到了对磁珠的保护作用；而对照保护液里的Protein A+G磁珠有一定的结块现象。显示部分配方的磁珠分散状态的照片如图3。
实施例3、Protein A+G磁珠的非特异性检测结果
将Protein A+G磁珠保存在上述保护液中半年和两年时间，测定磁珠的非特异性吸附。使用的是辣根过氧化物酶标记Streptavidin。
如表4和表5，结果显示，例4、例5、例6保护液对Protein A+G磁珠有较好的降低非特异性吸附的效果(磁珠上吸附降低，FT中增加)，其中例6的保存效果最好。与对照保护液相比，非特异性结合效率可以降低约80％。随着保护液各组分的增加，非特异吸附效率也在逐渐降低。
表4、Protein A+G磁珠非特异性吸附结果(半年)
Figure BDA0004094301620000162
表5、Protein A+G磁珠非特异性吸附结果(两年)*
Figure BDA0004094301620000171
*以37℃孵育14天模拟两年的实验结果。
Protein A+G磁珠在部分保护液中，在半年和2年磁珠和FT的非特异吸附结果也呈现于图2。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (10)

1.一种保护免疫磁珠或提高其性能的方法，包括将免疫磁珠与免疫磁珠保护液混合；其中，所述免疫磁珠保护液包括以下组分：基于HOVE的嵌段氟化共聚物，两亲性高分子聚合物，保护性蛋白，蛋白酶抑制剂，甘油和/或高分子聚合物，络合剂，两亲性表面活性剂和防腐剂；
所述基于HOVE的嵌段氟化共聚物选自：聚(HOVE-b-HFBOVE)或其类似物，聚(HOVE-b-TFEOVE)或其类似物，聚(HOVE-b-PFPOVE)或其类似物，或其组合；其中所述类似物分子量1000-10000；
所述两亲性高分子聚合物选自：聚甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱或其类似物，聚磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯或其类似物，聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯或其类似物，或它们的组合；其中所述类似物分子量1000-10000。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫磁珠表面包括蛋白活性分子；较佳地，所述蛋白活性分子包括：功能蛋白、抗体、酶。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述保护性蛋白包括选自：BSA、L-赖氨酸、酪氨酸，或其组合；
所述高分子聚合物包括：聚乙二醇，较佳地为PEGm且m为100-1000的正整数；
所述络合剂包括：EDTA或葡萄糖酸钠；
所述两亲性表面活性剂包括：吐温试剂或Triton X-100，较佳地为Tween-20；
所述防腐剂包括：ProClean 300。
4.如权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，所述免疫磁珠保护液中，各组分的量包括：
Figure FDA0004094301610000011
Figure FDA0004094301610000021
较佳地，所述组分包含在缓冲液中。
5.一种免疫磁珠保护液，包括以下组分：两亲性高分子聚合物，基于HOVE的嵌段氟化共聚物，保护性蛋白，蛋白酶抑制剂，甘油和/或高分子聚合物，络合剂，两亲性表面活性剂和防腐剂；
所述两亲性高分子聚合物选自：聚甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱或其类似物，聚磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯或其类似物，聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯或其类似物，或它们的组合；其中所述类似物分子量1000-10000；
所述基于HOVE的嵌段氟化共聚物选自：聚(HOVE-b-HFBOVE)或其类似物，聚(HOVE-b-TFEOVE)或其类似物，聚(HOVE-b-PFPOVE)或其类似物，或其组合；其中所述类似物分子量1000-10000。
6.如权利要求5所述的免疫磁珠保护液，其特征在于，所述保护性蛋白包括选自：BSA、L-赖氨酸、酪氨酸，或其组合；
所述高分子聚合物包括：聚乙二醇，较佳地为PEGm且m为100-1000的正整数；
所述络合剂包括：EDTA或葡萄糖酸钠；
所述两亲性表面活性剂包括：吐温试剂或Triton X-100，较佳地为Tween-20；
所述防腐剂包括：ProClean 300。
7.如权利要求5所述的免疫磁珠保护液，其特征在于，所述免疫磁珠保护液包括：
Figure FDA0004094301610000031
较佳地，所述组分包含在缓冲液中。
8.一种制备免疫磁珠保护液的方法，包括：将两亲性高分子聚合物，基于HOVE的嵌段氟化共聚物，保护性蛋白，蛋白酶抑制剂，甘油和/或高分子聚合物，络合剂，两亲性表面活性剂和防腐剂进行混合，形成权利要求4～6任一所述的免疫磁珠保护液；较佳地，混合于缓冲液中。
9.权利要求5～7任一所述的免疫磁珠保护液的应用，用于保护免疫磁珠或提高其性能；较佳地，所述提高性能包括：提高磁珠的结合效率，提高磁珠的稳定性或降低磁珠的非特异性吸附；较佳地，所述免疫磁珠表面包括蛋白活性分子；较佳地，所述蛋白活性分子包括：功能蛋白、抗体、酶。
10.一种对蛋白活性分子进行固定和保存的方法，包括：
(a)将蛋白活性分子与磁珠进行混合，所述蛋白活性分子结合于磁珠表面，获得固定有蛋白活性分子的磁珠；
(b)将(a)的固定有蛋白活性分子的磁珠加入到权利要求5～7任一所述的免疫磁珠保护液中；
所述蛋白活性分子包括：功能蛋白、抗体、酶；
较佳地，(b)之后，还包括进行：细胞分选、免疫检测、蛋白与核酸的分离纯化、酶的固定的步骤。
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