CN116082422A - 一种高纯度山柰酚3-o-(2″-o-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法 - Google Patents
一种高纯度山柰酚3-o-(2″-o-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116082422A CN116082422A CN202310068538.5A CN202310068538A CN116082422A CN 116082422 A CN116082422 A CN 116082422A CN 202310068538 A CN202310068538 A CN 202310068538A CN 116082422 A CN116082422 A CN 116082422A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- apifuranyl
- purity
- preparation
- rutin
- eluent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
- C07H17/06—Benzopyran radicals
- C07H17/065—Benzo[b]pyrans
- C07H17/07—Benzo[b]pyran-4-ones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
- C07H1/08—Separation; Purification from natural products
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高纯度山柰酚3‑O‑(2”‑O‑阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法，步骤如下：药材提取；将提取液进样制备液相色谱仪，以乙腈‑1％冰乙酸为流动相，收集10‑11分钟流出液，得一次制备洗脱液；将得到的洗脱液回收溶剂，残渣用适量甲醇溶解，将所得溶液进样高效液相色谱仪，以乙腈‑1％冰乙酸为流动相，收集5‑7分钟流出液，得二次制备洗脱液；将洗脱液回收溶剂减压干燥得到目标化合物。本发明可将目标化合物从耳叶番泻叶中高效快速有针对性的分离出来，且纯度高(＞98％)、得率是现有方法的123倍。该目标化合物可作为对照品用于番泻叶中掺伪耳叶番泻叶的专属性鉴别，对控制番泻叶药材及其制剂的质量有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域，特别涉及一种高纯度山柰酚3-O-(2″-O-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法。
背景技术
耳叶番泻叶(Cassia auriculata L Plant)，又名圆叶番泻叶，为豆科Lesuminosae植物耳叶番泻Cassia auriculataL.的干燥叶，常掺杂于狭叶番泻叶中。番泻叶中的二蒽酮类衍生物番泻苷A、B、C、D的泻下作用及刺激性较其他含蒽醌类的泻药更强，且口服用药毒性很小，临床常用于急性便秘。耳叶番泻叶中二蒽酮类化合物的种类和含量大幅低于番泻叶，掺入过多会影响番泻叶的质量，影响用药的有效性和安全性。所以寻找一种耳叶番泻叶中专属性成分，用于耳叶番泻叶掺伪番泻叶的鉴别具有重要意义。经质谱鉴定，山柰酚3-O-(2″-O-阿哌呋喃基)芸香苷(kaempferol 3-O-(2”-O-apiofuranosyl)rutinoside)(结构式参见式Ⅰ)为耳叶番泻叶中专属性成分，在番泻叶中不含有，但该化合物无市售对照品。
关于kaempferol 3-O-(2”-O-apiofuranosyl)rutinoside的分离纯化技术，目前未见有针对性的分离方法。现有方法一般为传统提取分离方式，且报道较少，往往通过对植物进行广泛提取分离得到该化合物，无目标追踪性，得率极低。较先进的报道之一是采用葡聚糖凝胶柱和半制备液相对其进行分离纯化，其工艺为取0.89kg红瓜Cocciniagrandis(L.)Voigt的叶子，在室温下加入甲醇3.25L，浸渍3天，回收溶剂后得到27.86g粗提取物。取上述粗提物10g，置于Sephadex LH-20柱(4×78cm)上，用甲醇洗脱，得到22个馏分(F1–F22)。进一步使用半制备型C18 HPLC SunFire色谱柱(19×250mm，5.0μm)对上一步中的所有馏分进行分离，从F9和F10馏分中得到3个化合物，其中之一为Kaempferol3-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside(即kaempferol 3-O-(2″-O-apiofuranosyl)rutinoside，8.3mg)。该方法步骤较繁琐，采用甲醇浸渍，耗时长且易提取不完全；采用葡聚糖凝胶柱分离，有机溶剂用量大、工作量大且耗时长，对目标成分分离没有明确追踪性。此外，该方法提取效率极低，最后得率仅为0.0026％(得率％＝8.3mg/10g×27.86g/0.89kg×100％＝0.0026％)。
发明内容
本发明为了解决现有的山柰酚3-O-(2″-O-阿哌呋喃基)芸香苷分离纯化方法产率较低，且工艺繁琐的问题，提供了一种高纯度山柰酚3-O-(2″-O-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法，该方法联合使用制备液相色谱仪与高效液相色谱仪，将kaempferol3-O-(2”-O-apiofuranosyl)rutinoside从耳叶番泻叶提取液中分离出来，并且每步回收率高达80％以上，最终得到的kaempferol 3-O-(2”-O-apiofuranosyl)rutinoside纯度较高。
本发明是采用以下技术方案得以实现的。
一种高纯度山柰酚3-O-(2″-O-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法，包括以下步骤：
S1.药材提取：将耳叶番泻叶加入20-25倍量的甲醇溶液，超声处理20-40分钟，过滤得到提取液，重复多次合并提取液，减压回收溶剂，得到固体提取物，将所得固体提取物用10-15倍量甲醇溶液溶解，得到提取液；
S2.一次制备：将步骤S1得到的提取液进行液相色谱，液相色谱条件为：安捷伦制备液相色谱仪FL-L100G，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(250×9.4mm,5μm)，以乙腈-1％冰乙酸为流动相，流速为2.0ml/分钟，柱温为25℃，检测波长为270nm，收集10-11分钟流出液，得一次制备洗脱液；
S3.二次制备：将步骤S2得到的洗脱液回收溶剂得到固体提取物，再用5-10倍量甲醇溶解固体提取物，将所得溶液进行液相色谱，液相色谱条件为：岛津高效液相色谱仪LC-20AD，色谱柱为Thermo ODS HYPERSIL Dim(50×4.6mm,5μm)，以乙腈-1％冰乙酸为流动相，流速为1.5ml/分钟，柱温为40℃，检测波长为270nm，收集5-7分钟流出液，得二次制备洗脱液；
S4.将步骤S3得到的洗脱液回收溶剂后减压干燥，得到山柰酚3-O-(2″-O-阿哌呋喃基)芸香苷提取物。
进一步的，步骤S1中，甲醇溶液的浓度为50％-80％。
进一步的，步骤S1中，甲醇提取次数为2-3次。
进一步的，步骤S2中，乙腈-1％冰乙酸的体积比为20:80。
进一步的，步骤S2中，进样量为1-2ml。
进一步的，步骤S3中，乙腈-1％冰乙酸的体积比为11:89。
进一步的，步骤S3中，进样量为10-40μl。
进一步的，步骤S4中，减压干燥的条件为：温度为50-60℃，真空度为-0.05～-0.1MPa。
本申请具有以下有益效果。
(1)本发明首次将kaempferol 3-O-(2”-O-apiofuranosyl)rutinoside从耳叶番泻叶提取液中分离出来，采用两次制备液相的方法对其进行分离纯化，避免了传统柱层析分离需要使用大量有机溶剂洗脱，污染大、成本高、耗时长且目标追踪性差的难题，每步收率高于80％；
(2)本发明解决了kaempferol 3-O-(2”-O-apiofuranosyl)rutinoside与耳叶番泻叶中其他黄酮类杂质理化性质相似，无法运用常规的有机溶剂萃取方法将其特征性的纯化出来的难题，同时解决了传统柱层析分离有机溶剂洗脱收率较低且成本高，分辨率低，使用效果较差的问题，本发明的两次制备液相分离操作简单，成本低，分离效果好，高效液相(HPLC)图谱显示纯度可达98％以上，得到的化合物可直接作为标准物质使用；
(3)本发明的提取方法工艺稳定，可追踪性强，利于实验室小量生产，经后续改良后可工业化、规模化生产。本发明经过多次重复实验验证，两次制备液相分离可以很好的特征性的将kaempferol 3-O-(2”-O-apiofuranosyl)rutinoside分离纯化出来，易于放大生产。
附图说明
图1为本发明实施例1中一次制备后洗脱液的HPLC图谱；
图2为本发明实施例1中二次制备后洗脱液的HPLC图谱。
具体实施方式
以下结合实施例对本专利申请进行进一步的说明。
以下制备例和实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；以下制备例和实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
除非另有说明，本发明中“％”为体积百分比。
实施例1
一种高纯度山柰酚3-O-(2″-O-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法，包括以下步骤：
(1)药材提取：取10g耳叶番泻叶药材(其中kaempferol3-O-(2”-O-apiofuranosyl)rutinoside含量为5.09mg/g)，加入20倍(g/mL)50％甲醇溶液，超声提取30min后过滤得提取液，药渣中再次加入20倍(g/mL)50％甲醇溶液，重复上述步骤2次，合并3次提取液，减压回收溶剂至干，加入10倍(g/mL)50％甲醇溶液溶解，得到药材提取液；
(2)一次制备：将步骤(1)得到的提取液进样安捷伦制备液相色谱仪FL-L100G，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(250×9.4mm,5μm)，以乙腈-1％冰乙酸(20:80)为流动相，流速为2.0ml/分钟，柱温为25℃，检测波长为270nm，进样量1ml，收集10-11分钟流出液，得一次制备洗脱液，一次制备洗脱液的HPLC检测图谱见图1(方框中为kaempferol 3-O-(2”-O-apiofuranosyl)rutinoside色谱峰)；
(3)二次制备：将步骤(2)得到的洗脱液回收溶剂，得到固体提取物，用5倍量纯甲醇溶解，随后将溶液进样岛津高效液相色谱仪LC-20AD，色谱柱为Thermo ODS HYPERSILDim(50×4.6mm,5μm)，以乙腈-1％冰乙酸(11:89)为流动相，流速为1.5ml/分钟，柱温为40℃，检测波长为270nm，进样量40μl，收集5-7分钟流出液，得二次制备洗脱液，二次制备洗脱液的HPLC检测图谱见图2(方框中为kaempferol3-O-(2”-O-apiofuranosyl)rutinoside色谱峰)；
(4)将步骤(3)中得到的洗脱液回收溶剂后在温度为60℃、真空度为-0.05～-0.1MPa的条件下进行减压干燥，得到kaempferol 3-O-(2”-O-apiofuranosyl)rutinoside化合物的粉末状提取物(32.4mg)。
(5)对上述每一步进行样品取样，检测含量，实验数据参见表1。
表1
注：药材以提取10g计算含量；收率％＝本步含量/上一步含量×100％
(6)计算得率：得率％＝32.4mg/10g×100％＝0.32％。
实施例2
一种高纯度山柰酚3-O-(2″-O-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法，包括以下步骤：
(1)药材提取：取10g耳叶番泻叶药材(其中kaempferol3-O-(2”-O-apiofuranosyl)rutinoside含量为5.09mg/g)，加入25倍(g/mL)50％甲醇溶液，超声提取40min后过滤得提取液，药渣中再次加入25倍(g/mL)50％甲醇溶液，重复上述步骤1次，合并2次提取液，减压回收溶剂至干，加入10倍(g/mL)50％甲醇溶液溶解，得到药材提取液；
(2)一次制备：将步骤(1)得到的提取液进样安捷伦制备液相色谱仪FL-L100G，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(250×9.4mm,5μm)，以乙腈-1％冰乙酸(20:80)为流动相，流速为2.0ml/分钟，柱温为25℃，检测波长为270nm，进样量1ml，收集10-11分钟流出液，得一次制备洗脱液；
(3)二次制备：将步骤(2)得到的洗脱液回收溶剂，得到固体提取物，用5倍量纯甲醇溶解，随后将溶液进样岛津高效液相色谱仪LC-20AD，色谱柱为Thermo ODS HYPERSILDim(50×4.6mm,5μm)，以乙腈-1％冰乙酸(11:89)为流动相，流速为1.5ml/分钟，柱温为40℃，检测波长为270nm，进样量20μl，收集5-7分钟流出液，得二次制备洗脱液；
(4)将步骤(3)中得到的洗脱液回收溶剂后在温度为50℃、真空度为-0.05～-0.1MPa的条件下进行减压干燥，得到kaempferol 3-O-(2”-O-apiofuranosyl)rutinoside化合物的粉末状提取物(29.4mg)。
(5)对上述每一步进行样品取样，检测含量，实验数据参见表1。
表1
注：药材以提取10g计算含量；收率％＝本步含量/上一步含量×100％
(6)计算得率：得率％＝29.4mg/10g×100％＝0.29％。
实施例3
一种高纯度山柰酚3-O-(2″-O-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法，包括以下步骤：
(1)药材提取：取10g耳叶番泻叶药材(其中kaempferol3-O-(2”-O-apiofuranosyl)rutinoside含量为5.09mg/g)，加入20倍(g/mL)80％甲醇溶液，超声提取30min后过滤得提取液，药渣中再次加入20倍(g/mL)80％甲醇溶液，重复上述步骤2次，合并3次提取液，减压回收溶剂至干，加入10倍(g/mL)50％甲醇溶液溶解，得到药材提取液；
(2)一次制备：将步骤(1)得到的提取液进样安捷伦制备液相色谱仪FL-L100G，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(250×9.4mm,5μm)，以乙腈-1％冰乙酸(20:80)为流动相，流速为2.0ml/分钟，柱温为25℃，检测波长为270nm，进样量1ml，收集10-11分钟流出液，得一次制备洗脱液；
(3)二次制备：将步骤(2)得到的洗脱液回收溶剂，得到固体提取物，用5倍量纯甲醇溶解，随后将溶液进样岛津高效液相色谱仪LC-20AD，色谱柱为Thermo ODS HYPERSILDim(50×4.6mm,5μm)，以乙腈-1％冰乙酸(11:89)为流动相，流速为1.5ml/分钟，柱温为40℃，检测波长为270nm，进样量20μl，收集5-7分钟流出液；
(4)将步骤(3)中得到的洗脱液回收溶剂后在温度为60℃、真空度为-0.05～-0.1MPa的条件下进行减压干燥，得到kaempferol 3-O-(2”-O-apiofuranosyl)rutinoside化合物的粉末状提取物(30.7mg)。
(5)对上述每一步进行样品取样，检测含量，实验数据参见表1。
表1
注：药材以提取10g计算含量；收率％＝本步含量/上一步含量×100％
(6)计算得率：得率％＝30.7mg/10g×100％＝0.31％。
对比例1
一种山柰酚3-O-(2″-O-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法，包括以下步骤：
(1)药材提取：取红瓜Cocciniagrandis(L.)Voigt的叶子0.89kg，在室温下加入甲醇3.25L，浸渍3天，减压回收溶剂至干，得到27.86g粗提取物；
(2)LH-20柱分离：取上述粗提物10g，置于Sephadex LH-20柱(4×78cm)上，用甲醇洗脱，得到22个馏分(F1–F22)；
(3)半制备液相分离：使用半制备型C18 HPLC SunFire色谱柱(19×250mm，5.0μm)进一步纯化。使用乙腈：水(20:80)等度洗脱，流速10mL/min，总运行时间为30分钟。对上一步中F9和F10馏分进行分离，得到3个化合物，其中之一为kaempferol 3-O-(2″-O-apiofuranosyl)rutinoside(8.3mg)。
(4)计算得率：得率％＝8.3mg/10g×27.86g/0.89kg×100％＝0.0026％。
具体实验过程及结果参见LC-QTOF-MS/MS Based Molecular NetworkingApproach for the Isolation ofα-Glucosidase Inhibitors and Virucidal Agentsfrom Coccinia grandis(L.)Voigt,Maharani A.Astiti.et al,foods 2021,10,3041.
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种高纯度山柰酚3-O-(2”-O-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.药材提取：将耳叶番泻叶加入20-25倍量的甲醇溶液，超声处理20-40分钟，过滤得到提取液，重复多次合并提取液，减压回收溶剂，得到固体提取物，将所得固体提取物用10-15倍量甲醇溶液溶解，得到提取液；
S2.一次制备：将步骤S1得到的提取液进行液相色谱，液相色谱条件为：安捷伦制备液相色谱仪FL-L100G，色谱柱为AgilentZORBAXSB-C18(250×9.4mm,5μm)，以乙腈-1％冰乙酸为流动相，流速为2.0ml/分钟，柱温为25℃，检测波长为270nm，收集10-11分钟流出液，得一次制备洗脱液；
S3.二次制备：将步骤S2得到的洗脱液回收溶剂得到固体提取物，再用5-10倍量甲醇溶解固体提取物，将所得溶液进行液相色谱，液相色谱条件为：岛津高效液相色谱仪LC-20AD，色谱柱为ThermoODSHYPERSILDim(50×4.6mm,5μm)，以乙腈-1％冰乙酸为流动相，流速为1.5ml/分钟，柱温为40℃，检测波长为270nm，收集5-7分钟流出液，得二次制备洗脱液；
S4.将步骤S3得到的洗脱液回收溶剂后减压干燥，得到山柰酚3-O-(2”-O-阿哌呋喃基)芸香苷提取物。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度山柰酚3-O-(2”-O-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法，其特征在于：步骤S1中，甲醇溶液的浓度为50％-80％。
3.根据权利要求1所述的一种高纯度山柰酚3-O-(2”-O-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法，其特征在于：步骤S1中，甲醇提取次数为2-3次。
4.根据权利要求1所述的一种高纯度山柰酚3-O-(2”-O-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法，其特征在于：步骤S2中，乙腈-1％冰乙酸的体积比为20:80。
5.根据权利要求1所述的一种高纯度山柰酚3-O-(2”-O-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法，其特征在于：步骤S2中，进样量为1-2ml。
6.根据权利要求1所述的一种高纯度山柰酚3-O-(2”-O-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法，其特征在于：步骤S3中，乙腈-1％冰乙酸的体积比为11:89。
7.根据权利要求1所述的一种高纯度山柰酚3-O-(2”-O-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法，其特征在于：步骤S3中，进样量为10-40μl。
8.根据权利要求1所述的一种高纯度山柰酚3-O-(2”-O-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法，其特征在于：步骤S4中，减压干燥的条件为：温度为50-60℃，真空度为-0.05～-0.1MPa。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310068538.5A CN116082422A (zh) | 2023-02-06 | 2023-02-06 | 一种高纯度山柰酚3-o-(2″-o-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310068538.5A CN116082422A (zh) | 2023-02-06 | 2023-02-06 | 一种高纯度山柰酚3-o-(2″-o-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116082422A true CN116082422A (zh) | 2023-05-09 |
Family
ID=86198917
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310068538.5A Pending CN116082422A (zh) | 2023-02-06 | 2023-02-06 | 一种高纯度山柰酚3-o-(2″-o-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116082422A (zh) |
-
2023
- 2023-02-06 CN CN202310068538.5A patent/CN116082422A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Taber et al. | Clavine and lysergic acid alkaloids in varieties of morning glory | |
| CN108358991B (zh) | 一种澄广花中的三萜类化合物及其制备方法和应用 | |
| CN111110726A (zh) | 一种莲房总黄酮的制备方法 | |
| CN110590882B (zh) | 一种从金花葵花中同时分离纯化6种黄酮化合物的方法 | |
| WO2006058299A2 (en) | Manufacture of limonoid compounds | |
| CN109694366B (zh) | 一种分离提纯甘木通有效成分的方法 | |
| Gmelin et al. | Glucosinolates in the Caricaceae | |
| CN1307191C (zh) | 用栀子果实制备栀子苷、京尼平－1－β－D－龙胆双糖苷的方法 | |
| CN110357894B (zh) | 一种三环生物碱类化合物及其制备方法与应用 | |
| CN111560024B (zh) | 一种高速逆流色谱结合制备液相色谱从钩吻生物碱中分离钩吻生物碱单体的方法 | |
| CN109400665B (zh) | 从毛冬青中制备四种三萜类化合物对照品的方法 | |
| CN116082422A (zh) | 一种高纯度山柰酚3-o-(2″-o-阿哌呋喃基)芸香苷的制备方法 | |
| CN105175426B (zh) | 一种从四方藤中提取纯化岩白菜素的方法 | |
| CN112321664B (zh) | 提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法 | |
| CN110698532B (zh) | 一种海参皂苷Cladoloside A的提取方法 | |
| CN107686492A (zh) | 一种使用大孔吸附树脂提取纯化发酵液中红景天苷的方法 | |
| CN108516999B (zh) | 一种分离制备矮牵牛素-3-o-半乳糖苷的方法 | |
| CN102337308A (zh) | 利用青霉菌转化岩白菜素为一种特殊含氮衍生物的方法 | |
| CN109369752B (zh) | 从南山茶中提取山奈酚半乳糖类化合物的方法 | |
| CN109265493B (zh) | 山奈酚类化合物及其提取方法 | |
| CN109541063B (zh) | 从南山茶中提取山奈酚葡萄糖苷类化合物的方法 | |
| CN116003240B (zh) | 一种单萜化合物、制备方法及其应用 | |
| CN114177164B (zh) | 白花败酱蒽醇i的制备方法及其应用 | |
| CN113527380B (zh) | 一种分离提取鬼针聚炔苷和鬼针聚炔苷b的制备工艺 | |
| CN116102571B (zh) | 一种网状原角藻中海洋脂溶性毒素组分的分离纯化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |