CN116067742A - CTCs染色试剂盒和染色方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种CTCs染色试剂盒，其包括0.1%w/v的吖啶橙磷酸盐缓冲液溶液、含有还原性物质的0.1w/v%的氯化钙水溶液、1%w/w的盐酸以及磷酸盐缓冲液。通过使用特定的分色液，本申请的试剂盒使用时可以以高浓度的吖啶橙染色液染色CTCs，提供更高的CTCs回收率，进而提升CTCs检出率。
Description
技术领域
本申请属于肿瘤诊断和细胞生物学技术领域，具体地，本申请提供了一种吖啶橙CTCs染色试剂盒及其相应的染色方法。
背景技术
循环肿瘤细胞（circulating tumor cells、CTCs）在肿瘤诊断、疗效预测、预后判断，特别是肿瘤转移性预测方面的价值已经被医学领域广泛认可。目前临床上普遍认为可靠的CTCs检测方法仅有基于磁珠捕获荧光检测的Cell Search系统，虽然其为半自动检测系统，但操作程序的复杂、设备/试剂价格的高昂以及循环肿瘤细胞多次动态检测的要求限制了其在临床上的使用。
因此，本领域中一直在发展使用一般细胞染色方法检测循环肿瘤细胞的技术，包括吖啶橙荧光（AO-F）在内的多种染色试剂都曾经被使用；这些染色方法的最大缺点在于肿瘤细胞检出率/回收率低，在检测对象为稀少的循环肿瘤细胞时，会使得检测灵敏性有明显缺陷。
发明内容
针对上述问题，一方面，本申请提供了一种CTCs染色试剂盒，其包括0.1%w/v的吖啶橙磷酸盐缓冲液溶液、0.1w/v%的氯化钙水溶液、1%w/w的盐酸以及磷酸盐缓冲液。
进一步地，所述试剂盒中还包含亚硫酸钠。
进一步地，所述亚硫酸钠为固体。
由于亚硫酸钠的还原性和不稳定性，试剂盒中保存时需要以棕色瓶保存固体无水亚硫酸钠粉末。
进一步地，所示试剂盒使用时使用磷酸盐缓冲液将0.1%w/v的吖啶橙磷酸盐缓冲液溶液稀释至0.02%w/v；使用0.1w/v%的氯化钙溶液配制含0.01w/v%亚硫酸钠和0.1w/v%氯化钙分色液。
使用0.1w/v%的氯化钙水溶液配制含0.01w/v%亚硫酸钠和0.1w/v%氯化钙分色液时由于亚硫酸钠浓度较低，对溶液体积影响微小；因此直接按照所用的亚硫酸钠质量计算所需氯化钙水溶液体积即可，忽略溶解亚硫酸钠后溶液体积的变化。
另一方面，本申请提供了上述试剂盒在制备CTCs检测试剂中的应用。
进一步地，所述CTCs为结肠癌和肺癌CTCs。
上述检测试剂可用于诊断相应癌症。
另一方面，本申请提供了染色CTCs的方法，所述方法用于非诊断目的，所述方法包括：将标本滴加在载片上，干燥；0.02%w/vv吖啶橙染色工作液中静置染色2分钟，pH为6的0.1M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液冲洗；1%w/w的盐酸中漂洗30秒，pH为6的0.1M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液冲洗；使用含0.01w/v%亚硫酸钠和0.1w/v%氯化钙分色液，浸泡分色5分钟、pH为6的0.1M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液冲洗；在荧光显微镜下观察。
进一步地，所述0.02%w/vv吖啶橙染色工作液使用pH为6的0.1M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液配制。
进一步地，所述CTCs为结肠癌和肺癌CTCs。
另一方面，本申请提供了上述方法在检测CTCs中的应用，所述应用用于非诊断目的。
本申请的方法可用于诊断肿瘤或者非诊断目的，非诊断目的包括但不限于科研、生物材料制备等
本申请配制染色液所用的缓冲液和冲洗所用的缓冲液可选0.02-0.2M，pH 4-7的各种磷酸盐缓冲液，包括但不限于磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠等；本领域技术人员可以根据肿瘤细胞种类、培养基等因素调整。
附图说明
图1为吖啶橙染色下正常细胞（左）和肿瘤细胞（右）的典型图像（400x）。
具体实施方式
实施例1 基本试剂和操作方法
吖啶橙染色液的配制：
使用0.1M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液（pH=6）配制0.1%w/v的吖啶橙储备液（可避光保存储备使用）；使用时以0.1M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液（pH=6）进一步稀释至0.005%w/v或者0.02%w/v的染色工作液。
蒸馏水配制0.1w/v%的氯化钙溶液作为分色液（可保存储备使用）；含有0.01w/v%亚硫酸钠、0.04v/v%β-巯基乙醇、0.05w/v%抗坏血酸的分色液在使用时以0.1w/v%的氯化钙溶液配制。
蒸馏水配制1%w/w的盐酸。
吖啶橙染色和观察方法：
将标本（细胞悬液或模拟外周血样品）滴加在载片上，干燥；0.005%w/v吖啶橙染色工作液中静置染色3分钟或者0.02%w/vv吖啶橙染色工作液中静置染色2分钟，0.1M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液（pH=6）冲洗；1%w/w的盐酸中漂洗30秒，0.1M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液（pH=6）冲洗；分色液中浸泡2-5分钟（各种分色液的适合分色时间/获得清洗图像的时间不同，含0.01w/v%亚硫酸钠和0.1w/v%氯化钙分色液适合的分色时间约5分钟、含0.04v/v%β-巯基乙醇和0.1w/v%氯化钙分色液适合的分色时间约2分钟、含0.05w/v%抗坏血酸和0.1w/v%氯化钙的分色液以及仅含0.1w/v%氯化钙的分色液的适合分色时间约3分钟），0.1M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液（pH=6）冲洗；在荧光显微镜下观察（申请人实验室中所用的荧光显微镜均为AMSCOPE的相同型号）。
将细胞核着黄绿色、细胞浆着橘红色，体积明显增大，核异形明显的细胞计为循环肿瘤细胞（正常外周血单个核细胞的细胞浆没有明显颜色，仅细胞核着黄绿色）。
模拟外周血中的循环肿瘤细胞
使用的细胞系HT29结肠癌细胞系、A549肺癌细胞系、Hep G2肝癌细胞系均为常规市售细胞系，申请人购买后使用常规培养基自行传代培养。
使用欣润生物的外周血单个核细胞分离纯化试剂盒（KH4104-4）来分离健康志愿者（无明显影响单个核细胞性能的疾病）静脉血中的外周血单个核细胞；将所需个数的HT29结肠癌细胞系、A549肺癌细胞系或Hep G2肝癌细胞系肿瘤细胞与1×106个制备的外周血单个核细胞混合，制备模拟癌症患者外周血样品。使用上述方法染色和观察，通过检测所用的样品体积与模拟癌症患者外周血样品的总体积倍数关系，计算肿瘤细胞回收率=可以检测到的肿瘤细胞数量/加入外周血单个核细胞中的肿瘤细胞重量×100%。
实施例2使用吖啶橙染色区分外周血中循环肿瘤细胞的可行性
经过初步试验，吖啶橙染色方法（0.005%w/v吖啶橙染色工作液，0.1w/v%氯化钙溶液分色液）可以有效地染色区别HT29结肠癌细胞系、A549肺癌细胞系、Hep G2肝癌细胞系的肿瘤细胞，将活肿瘤细胞与死肿瘤细胞和外周血单个核细胞区分开（典型情况如图1所示）；除低浓度下对Hep G2肝癌细胞系肿瘤细胞回收率较差外，高浓度下的Hep G2肝癌细胞系肿瘤细胞和各种浓度下的HT29结肠癌细胞系、A549肺癌细胞系细胞回收率均稳定在10%左右。
如先前论文中记载的类似，此方法的主要缺点在于肿瘤细胞回收率较低，根据肿瘤细胞浓度的不同和肿瘤细胞种类的不同在6-11%不等，这样的回收率用于检测时显然遗漏肿瘤细胞的概率较高，检测的准确度不足（按照之前的一些类似研究报道，吖啶橙染色用于识别实际临床样本中的循环肿瘤细胞时，阳性样品的检出率不足20%）。
实施例3 吖啶橙染色方法的改进
根据最基本的染色原理，提高染色效果最简单的方式在于提高染料浓度或增加染色时间，申请人在这两方面均进行了尝试，结果表明，提高染料浓度或增加染色时间均会导致染色过度/染料堆积，分色程度难以把握（分色不足则观察困难，分色过度则染色脱落，回收率反而下降）；典型情况如图1所示。参考现有技术制定的0.005%w/v吖啶橙染色工作液，0.1w/v%氯化钙溶液分色液已经是一种合理的选择。
申请人尝试了进一步改进分色液配方，发现加分色液中提供还原性环境可以有效提高分色效果（在0.1w/v%氯化钙溶分色液基础上加入某些还原性物质后，最直观的体现是染色结果清晰度相比仅使用氯化钙时明显更好）。申请人以HT29结肠癌细胞系，200个肿瘤细胞/1×106外周血单个核细胞，为例，筛选了多种还原性物质加入的效果，优选结果如表2所示（详细的种类和浓度筛选结果由于篇幅未显示）：
亚硫酸钠、β-巯基乙醇、抗坏血酸在适合的浓度和分色时间下均可以一定程度上提高回收率，但回收率仍然不足以对实际检测效果带来根本性的变化。但在分色效果提高的基础上，申请人得以尝试更高的的染色液浓度，经过初步试验，发现0.02%w/v的吖啶橙的效果较好，优选结果如表3所示（详细的浓度筛选结果由于篇幅未显示）：
结果表明，除0.01w/v%亚硫酸钠之外，0.04v/v%β-巯基乙醇和0.05w/v%抗坏血酸并不能与高浓度的吖啶橙染色液匹配增效；0.01w/v%亚硫酸钠+0.02%w/v的吖啶橙的染色方案（详细方法如实施例1中所述），相比原始的吖啶橙染色方法回收率提高到接近3倍的水平。
将改进后的方法（0.02%w/v吖啶橙染色液；含0.01w/v%亚硫酸钠和0.1w/v%氯化钙分色液；分色时间约5分钟）用于各种浓度的不同肿瘤细胞，结果如表4所示：
结果表明，改进的吖啶橙染色法对结肠癌细胞和肺癌细胞都有明显增加的染色观察回收率，对肝癌细胞也有一定改进效果。
实施例4 实际临床样本研究
研究中所使用的染色方法为原始吖啶橙染色法（0.005%w/v吖啶橙染作液，含0.1w/v%氯化钙溶液分色液；分色时间约3分钟）和改进的啶橙染色法（0.02%w/v吖啶橙染色液；含0.01w/v%亚硫酸钠和0.1w/v%氯化钙分色液；分色时间约5分钟）。
检测对象为85例有明确转移灶（肝、肾、胃、头颈部转移）的肺癌II-III期患者血液。以及45例有明确转移灶（肝、肾、胃转移）的结肠癌III期患者血液。
染色检查时使用从严标准，即图片内观察到明显阳性细胞时计为阳性；图片内全部为阴性细胞或者有疑似细胞时均计为阴性。共使用三名检测人员（分别负责30、30、25分样品），同一位检测人员检测的样本固定，尽量消除观察者水平的误差。
结果显示：对于肺癌，原始吖啶橙染色法共检出11个阳性样品（12.9%检出率）；而改进的啶橙染色法检出19个阳性样品（22.3%检出率）。对于结肠癌原始吖啶橙染色法共检出5个阳性样品（11.1%检出率）；而改进的啶橙染色法检出13个阳性样品（28.9%检出率）。虽然不及先前研究中报道的Cell Search系统下理想的40-50%检出率，但也明显增加了方法用于实际临床检测时的灵敏度，而且本申请的方法在操作简易型和成本上明显低于CellSearch系统。
Claims (10)
1.一种CTCs染色试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括0.1%w/v的吖啶橙磷酸盐缓冲液溶液、0.1w/v%的氯化钙水溶液、1%w/w的盐酸以及磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒中还包含亚硫酸钠。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述亚硫酸钠为固体。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其中所述试剂盒使用时使用磷酸盐缓冲液将0.1%w/v的吖啶橙磷酸盐缓冲液溶液稀释至0.02%w/v；使用0.1w/v%的氯化钙溶液配制含0.01w/v%亚硫酸钠和0.1w/v%氯化钙分色液。
5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒在制备CTCs检测试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其中所述CTCs为结肠癌或肺癌CTCs。
7.染色CTCs的方法，所述方法用于非诊断目的，所述方法包括：将标本滴加在载片上，干燥；0.02%w/vv吖啶橙染色工作液中静置染色2分钟，pH为6的0.1M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液冲洗；1%w/w的盐酸中漂洗30秒，pH为6的0.1M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液冲洗；使用含0.01w/v%亚硫酸钠和0.1w/v%氯化钙分色液，浸泡分色5分钟，pH为6的0.1M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液冲洗；在荧光显微镜下观察。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述0.02%w/vv吖啶橙染色工作液使用pH为6的0.1M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液配制。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述CTCs为结肠癌或肺癌CTCs。
10.根据权利要求8或9所述的方法在检测CTCs中的应用，所述应用用于非诊断目的。
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