CN116063552A - 一种靶向cea的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向CEA的嵌合抗原受体以及含有该靶向CEA嵌合抗原受体的T细胞。所述嵌合抗原受体由识别CEA抗原的纳米抗体、胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区、自裂解多肽T2A和透明质酸酶依次串联组成。该嵌合抗原受体能够高效识别CEA抗原，并以CD28和CD137作为共刺激信号区，激活T细胞从而发挥细胞免疫作用，且特异性杀伤CEA阳性的肿瘤细胞，在肿瘤细胞免疫治疗领域具有重要的应用前景。

Description

一种靶向CEA的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及一种嵌合抗原受体及含有该嵌合抗原受体的T细胞，属于多肽和细胞技术领域。
背景技术
癌胚抗原（CEA，又称为CEACAM-5或CD66e）是一种具有约180kDa 分子量的糖蛋白。CEA是免疫球蛋白超家族的一名成员，并且含有经由糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚与细胞膜连接的7个域。7个域包括单一N端Ig可变域和与Ig恒定域同源的6个域 (A1-B1-A2-B2-A3-B3)。CEA最初分类为仅在胎儿组织中表达的蛋白质，现在已经在几种正常成年组织中鉴定出。CEA的过量表达在许多类型的癌症中观察到，包括结肠直肠癌、 胰腺癌、肺癌、胃癌、肝细胞瘤、乳腺癌和甲状腺癌。因此CEA已被作为一种广谱肿瘤标志物。更重要的是，CEA不仅被用于临床检测及诊断，同时也成为了用于靶向治疗的潜在有用的肿瘤相关抗原。已经报道的使用 CEA靶向免疫治疗癌症主要有2种方法。一种方法使用抗CEA抗体引发免疫细胞的溶解活性，特别是通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）或补体依赖性细胞毒性（CDC），以消除表达CEA的肿瘤细胞。另一种方法是通过抗CEA抗体或抗体片段与药物、毒素、放射性核苷酸、免疫调节剂或细胞因子等效应分子缀合，特异性靶向表达CEA的肿瘤细胞，从而发挥效应分子的治疗作用。目前已经研究出针对CEA的多种单克隆抗体，应用于ADC药物、双特异性抗体、放射免疫疗法、嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T疗法）及手术导航系统中。
CAR-T疗法全称为嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy）。这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。技术人员通过基因工程技术，将T细胞激活，并装上肿瘤嵌合抗原受体，专门识别体内肿瘤细胞，并通过免疫作用释放大量的多种效应因子，它们能高效地杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。目前，世界各国都在开展CAR-T疗法的临床试验。其中，美国开展实验数目最多，包括血液肿瘤和实体瘤。目罗氏、上海吉凯基因以及Cancer Research Technology开发的靶向CEA的CAR-T产品均已进入临床试验阶段。但是还没有真正上市的靶向CEA的CAR-T产品，且单链抗体作为CAR靶向结构域具有一定的局限性。
在骆驼科动物（骆驼、单峰骆驼和美洲驼）的体内存在着一类仅有重链二聚体抗体H2，其主要是IgG2和IgG3类型。此类抗体由于缺乏轻链而被称为仅有重链的抗体（heavychain-only-like Antibody，HCAbs），而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体（sdAb）。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kD，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体（Nbs）。相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。纳米抗体的小分子量，使得其容易达到渗透到某些难以达到的癌变组织，分布均一性更好。与人源VH抗体相比，纳米抗体有较长的CDR1和CDR3区，而且较长的CDR3区会与相邻的CDR2或者CDR1区形成二硫键来稳定其结构，这个CDR3形成凸出的环状可能特异性识别隐藏的抗原表位，而这些表位是常规抗体无法识别的。因此纳米抗体作为替代的CAR靶向结构域表现出特别的优势，这主要得益于纳米抗体的低免疫原性、稳定性、特异性和高亲和力以及简单可行的开发过程。许多研究结果证实，在临床前和临床环境中，基于纳米抗体的CAR-T可以与基于单链抗体的CAR-T发挥同样的功能。
鉴于目前对表达CEA的实体肿瘤还没有很好的治疗方法，且市场上还没有成功上市的靶向CEA的CAR-T产品等问题，本发明的目的就是提供一种靶向CEA的嵌合抗原受体，以及含有该嵌合抗原受体的T细胞及其在治疗实体瘤方面的应用。
发明内容
基于上述发明目的，本发明首先提供了一种抗CEACAM-5抗原的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQ ID NO.11所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.12所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ IDNO.13所述氨基酸序列组成。
在一个优选的技术方案中，所述纳米抗体的可变区序列由SEQ ID NO.10所述氨基酸序列组成。在本发明中具有该可变区序列的纳米抗体的一个优选实施例为纳米抗体14F1。
其次，本发明还提供了一种靶向CEA的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由抗CEACAM-5抗原的纳米抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区、自裂解多肽T2A和透明质酸酶HAase依次串联组成，其中所述抗CEACAM-5抗原的纳米抗体由14F1纳米抗体可变区序列经人源化处理后的氨基酸序列组成；所述胞外铰链区为CD8α铰链区，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示；所述跨膜区为CD28跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述胞内信号区包括共刺激信号区和第一信号区，其中共刺激信号区包括CD28信号区和CD137信号区，CD28信号区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，CD137信号区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，而第一信号区为CD3ζ信号区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示; 所述自裂解多肽T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示；所述HAase的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
在一个优选的技术方案中，所述抗CEACAM-5抗原的纳米抗体人源化后的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
更为优选地，所述嵌合抗原受体的氨基端连接有信号肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示。
尤为优选地，所述跨膜区和胞内信号区之间设有连接肽，所述连接肽为（G4S）n，其中n为1-7之间的整数。
最为优选地，所述n=4，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。
第三，本发明提供了一种编码上述嵌合抗原受体的核酸，所述核酸的序列由SEQID NO.27所示。
第四，本发明还提供了一种靶向CEA的嵌合抗原受体T细胞，所述T细胞含有上述述的嵌合抗原受体。
第五，本发明提供了上述的嵌合抗原受体在制备表达CEACAM-5抗原的肿瘤治疗药物中的应用。
最后，本发明提供了上述的嵌合抗原受体T细胞在制备表达CEACAM-5抗原的肿瘤治疗药物中的应用。
本发明提供的抗CEACAM-5的纳米抗体，第一方面，可特异性结合CEACAM-5抗原，亲和力可达10nM以上。第二方面，本发明提供的靶向CEA的嵌合抗原受体（14F1CAR-CEA）可使含有其的T细胞特异性地靶向杀伤表达CEA的阳性肿瘤细胞（LoVo细胞和SW480细胞），14F1CAR-CEA与肿瘤细胞表面的CEA结合后，以CD28和CD137信号区作为共刺激信号，激活了14F1CAR-T细胞内的胞内信号区，促进了T细胞的增殖，进一步更加增强了对表达CEA阳性的恶性肿瘤细胞（LoVo细胞或SW480细胞）的杀伤作用。由T2A连接的HAase在转入T细胞后能正常翻译和表达，HAase可以降解细胞外基质中的透明质酸，降低透明质酸的粘度，增强细胞外基质组织的通透性，有利于CAR-T细胞进入实体瘤和实体瘤中的浸润，从而增强CAR-T细胞的治疗效果。这显示出本发明的嵌合抗原受体及CAR-T细胞在临床治疗CEA阳性肿瘤以及药物制备领域的应用价值。
附图说明
图1. 提取的总RNA电泳鉴定图；
图2. 第一轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；
图3. 第二轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；
图4. pMES4载体双酶切反应产物电泳鉴定图；
图5. 菌落PCR鉴定转化子电泳鉴定图；
图6. 纳米抗体14F1纯化SDS-PAGE图；
图7. Biacore分析纳米抗体14F1人源化前后亲和力曲线图；
图8. 人源化纳米抗体H-14F1与细胞结合的间接免疫荧光结果图；
图9. 慢病毒滴度测定方法示意图；
图10. 14F1CAR-CEA-T细胞对靶细胞的杀伤力检测结果；
图11. 14F1CAR-CEA-T细胞在不同效靶比条件下的杀伤力检测结果；
图12. 14F1CAR-CEA-T细胞杀伤靶细胞后释放的IFN-γ含量检测结果；
图13. 14F1CAR-CEA-T细胞与14F1CAR-CEA1-HA-T细胞对小鼠肿瘤生长抑制作用结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
实施例1. 抗CEACAM-5纳米抗体的筛选
1.1羊驼的免疫
选取健康成年羊驼一只，将重组抗原CEACAM-5（厂家：义翘神州，货号为11077-H08H）与弗氏佐剂按1:1的比例混匀，按6-7μg/kg采用背部皮下多点注射的方式免疫羊驼，共免疫四次，免疫间隔为2周。之后采集羊驼外周血10ml，用于构建噬菌体展示文库。
1.2驼源淋巴细胞的分离
将采集的羊驼外周血利用骆驼外周血淋巴细胞分离液试剂盒（天津灏洋公司，货号LTS1076）说明书操作进行分离淋巴细胞，每2.5×107个活细胞加入1ml RNA分离试剂，取1ml进行RNA提取，其余-80℃保存。
1.3总RNA提取
将含有淋巴细胞的1ml Tipure Isolation Reagent反复吹打，放置5分钟；加入200μl氯仿，涡旋30秒后继续放置5分钟；4℃，12000g离心15分钟，吸取水相转入新的EP管中；加入等量异丙醇，放置10分钟；4℃，12000g离心10分钟，弃上清；用1ml预冷的70%乙醇洗涤，4℃，7500g离心5分钟，弃上清并干燥5分钟；加入30μl RNase-free水溶解沉淀，调整浓度到1μg/μl进行凝胶电泳检测，结果见图1。
1.4反转录合成cDNA
根据逆转录试剂盒说明书（Roche公司 的transcripor first stand cDNAsynthesis KIT）以1.3步骤获得的RNA为模板进行逆转录cDNA。
1.5抗体可变区基因扩增
将反转录得到的cDNA作为模版进行PCR反应。扩增共进行两轮，第一轮PCR的引物序列如下：
CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
PCR反应条件及程序为：95℃ 5分钟；95℃ 30秒，57℃ 30秒，72℃ 30秒，30个循环；72℃ 7分钟。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收700bp左右的条带，最终用水调整核酸浓度至5ng/μl（图2：M为Trans 2K DNA Marker；1为第一轮PCR产物）。第二轮PCR的引物序列如下：
VHH-Back：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
VHH-For：CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT
PCR反应条件及程序为：95℃ 5分钟；95℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒，15个循环；72℃ 7分钟。使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物（图3：M为Trans 2K DNA Marker；1为第二轮PCR产物）。
1.6载体构建
将pMES4（购自Biovector）与第二次PCR产物分别进行 PstI、BstEII双酶切，取1.5μg酶切后载体和450ng酶切后的第二次PCR产物，加15μl T4 DNA连接酶，补充缓冲液和水至150μl总体积，16℃过夜连接并回收连接产物。使用PCR产物回收试剂盒进行产物回收，20μl水洗脱。1%琼脂糖电泳凝胶检测pMES4载体双酶切结果（图4：M为Trans 5K plus DNAMarker；1为pMES4载体未酶切质粒；2为pMES4载体双酶切后产物）。
1.7电转化及库容测定
取10μl纯化后的连接产物，加入到含有50μl大肠杆菌TG1感受态细胞的预冷电转杯中置入电转仪（美国BTX的ECM630电转仪）进行电转化，取出电转杯，复苏并培养转化子。随机挑选克隆，进行菌落PCR鉴定（图5：M为100bp DNA Marker；N为阴性对照；1-23为随机挑选的单克隆PCR鉴定产物）。根据PCR阳性率推算库容（库容量=克隆数×稀释倍数×PCR鉴定阳性率×10）。引物序列如下：
MP57：TTATGCTTCCGGCTCGTATG
GIII：CCACAGACAGCCCTCATAG。
1.8噬菌体扩增
取复苏的菌液接种至YT-AG培养基中，37℃ 200rpm培养到培养物OD600=0.5。取出10ml菌液加入4×1010VCSM13，37℃静止感染30分钟。4000rpm，常温离心10分钟，去净上清。用2×YT-AK（含氨苄青霉素和卡那霉素）培养基重悬菌体，37℃ 200rpm培养过夜。离心取上清40ml管中，加入10ml PEG/NaCl（20%/2.5M）溶液充分混合，离心弃上清，沉淀用1ml冰PBS洗涤离心，取上清250μl预冷的PEG/NaCl，充分混匀并洗涤重悬。
测定噬菌体滴度：将TG1培养至OD600=0.4，用LB培养基梯度稀释噬菌体，取倍比稀释的噬菌体TG1培养物混合培养，次日观察培养板中噬菌斑形成情况，对噬菌斑数在30-300的稀释梯度平板进行计数并按照下列公式计算噬菌体滴度（pfu）。
噬菌体滴度（pfu/ml）=稀释倍数×噬菌斑数目×100。
1.9纳米抗体筛选
通过ELISA方法以抗原筛选阳性克隆。以抗原包被ELISA板，5% BSA封闭，PBST洗涤。每孔加入100μl噬菌体上清液，37℃放置1小时。弃上清，加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃放置1小时。弃上清，加入TMB溶液，室温孵育5小时，每孔加入2M硫酸终止液，用酶标仪450nm读数。
1.10纳米抗体在大肠杆菌中的表达和纯化
挑选噬菌体ELISA结果阳性的克隆，提取质粒并转化至菌株BL21感受态细胞，以IPTG诱导纳米抗体蛋白表达，收集上清（周质提取物），并将周质提取物透析至PBS，使用Ni-NTA树脂进行纯化，使用不同浓度咪唑进行洗脱和收集，将收集的样品进行还原型蛋白电泳分析，最后将纳米抗体透析到PBS中。
通过羊驼免疫、细胞分离、噬菌体文库的构建、纳米抗体的筛选，筛选出抗CEA的纳米抗体。用Vector NTI软件对测序结果进行抗体轻链和重链基因的分析，以确定可变区的框架区（Framework Regions，FR）和互补决定区（Complementary Determining Regions，CDR）。
本发明筛选到的一个优选实施方案的纳米抗体被命名为14F1。通过DNA测序，所述纳米抗体14F1重链核酸序列为SEQ ID NO.14所示，可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.10所示，其中第1-25位氨基酸序列为FR1，第26-33位氨基酸序列为CDR1，第34-50位氨基酸序列为FR2，第51-58位氨基酸序列为CDR2，第59-96位氨基酸序列为FR3，第97-104位氨基酸序列为CDR3，第105-115位氨基酸序列为FR4。
 实施例2. 纳米抗体14F1的制备
2.1纳米抗体原始菌株TG1扩增及纳米抗体重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)
将含有纳米抗体核酸的原始菌株TG1甘油菌，按照1:1000比例接种于5ml新鲜的LB-A培养基，37℃ 200rpm过夜培养。次日，使用Plasmid mini kit（OMEGA）按照说明书提取质粒。经验证后将上述质粒1μl转化于100μl感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30分钟，42℃水浴热击90秒，冰浴冷却3分钟。向离心管加入600μl LB培养基，37℃振荡培养60分钟。取上清100μl，用三角涂布器涂布在LB-A平板上，37℃倒置培养过夜。
2.2纳米抗体的诱导表达
挑取上述单克隆菌落于LB-A培养基中，37℃振荡培养过夜。次日，取该菌液按照1:100比例加入100ml新鲜LB-A培养基，37℃振荡培养3小时至菌液OD600=0.8左右，加入终浓度为1mM IPTG，30℃诱导过夜。第三日，8000rpm，离心10分钟收集菌体，加入1.5ml的预冷TES缓冲液重悬沉淀。冰浴2分钟后，轻柔振荡30秒，重复此循环6次。加3.0ml TES/4（将TES用水稀释4倍），轻柔振荡30秒后，冰浴静置2分钟，同样重复振荡和静置步骤共6次。9000rpm，4℃离心10分钟，收集约4.5ml的上清（周质提取物）。
2.3纳米抗体的纯化和鉴定
将IMAC Sepharose（GE公司）重悬后，取2ml加入到重力柱内，静置30分钟，使sepharose自然沉降于重力柱底部，流出保存缓冲液。加入2倍柱体积的硫酸镍溶液（0.1M），按照约8秒/滴的流速流出硫酸镍溶液；加入10倍柱体积的平衡缓冲液平衡并洗涤sepharose，流速维持不变；将样品使用平衡缓冲液2倍稀释后，加入重力柱中，调节流速为6秒/滴，收集穿透液；加入10倍柱体积洗涤缓冲液洗涤sepharose，维持流速不变，收集洗涤液；加入3倍柱体积的洗脱缓冲液，流速维持在6秒/滴，收集含有目的蛋白的洗脱液；最后依次加入10倍柱体积的平衡缓冲液、10倍柱体积的纯水和10倍柱体积的20%乙醇洗涤sepharose，并最终保留4ml的20%乙醇来保存柱子。上述收集的样品分别进行SDS-PAGE检测（图6: M为彩虹广谱蛋白Marker；1-2为大肠杆菌诱导表达纯化后的纳米抗体14F1）。
实施例3. 纳米抗体与抗原的亲和活性测定
3.1芯片抗原偶联
将抗原用不同pH的醋酸钠缓冲液（pH 5.5，pH 5.0， pH 4.5， pH 4.0）配制成20μg/ml的工作液，同时准备50mM的NaOH再生溶液，利用Biacore T100 蛋白相互作用分析系统仪器中的模板方法对不同pH条件的抗原与芯片（GE公司）表面之间的静电结合进行分析，以信号增加的量达到5倍RL为标准，选择合适的最偏中性的pH体系并根据需要调整抗原浓度作为偶联时的条件。按照仪器中自带的模板方法对芯片进行偶联：其中1通道选择空白偶联模式，2通道选择Target偶联模式，目标设置为设计好的理论偶联量。偶联过程大概耗时60分钟。
3.2分析物浓度设置条件探索及再生条件优化
采取手动进样模式，选择1，2通道2-1模式进样，流速设置为30 μl/分钟。进样条件均为120秒，30μl/分钟。再生条件均为30秒，30μl/分钟。首先持续空走运行缓冲液直至所有基线均稳定。准备浓度跨度较大的纳米抗体溶液，以运行缓冲液配置，设置200μg/ml，150μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，20μg/ml，10μg/ml，2μg/ml。准备再生溶液，选择谷氨酸盐酸体系四个pH梯度的再生溶液：1.5，2.0，2.5，3.0。手动进样200μg/ml分析物样品，观察2通道，从最偏中性pH的再生缓冲液进行再生，直至2通道再生后的响应线回到与基线同一高度。再手动进样一次200μg/ml分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量，用上一步中最后使响应线回到基线的再生溶液进行再生后，再次收手动进样200μg/ml分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量与刚才的结合量数值对比，若偏差小于5%，即认为此pH的再生溶液为最佳的再生溶液，若再次进样的结合量偏低，则继续以更低pH的再生缓冲液进行实验。以选择的最佳再生溶液，作为每次进样后的芯片表面再生试剂。分别进样上面设置的分析物浓度样品，并对每个浓度的结合量进行分析，最终确定亲和力测试所需的浓度梯度。
3.3亲和力测试
按优化好的样品浓度梯度，再生溶液，使用仪器自带的模板方法（其中设置进样条件为60秒，30μl/min；解离时间：600秒；再生条件：30秒，30μl/min）对纳米抗体及抗原之间的亲和力进行测试。随时观察2-1通道的信号情况。亲和力测试过程大概耗时200分钟。
3.4结果分析
选择合适的几个浓度梯度的结合解离曲线采用1：1binding的模式对所有曲线进行拟合，最终得到亲和力数值及结合常数和解离常数等重要参数（见图7）。抗CEA纳米抗体14F1的亲和力数值为1.973E-9。
实施例4. 抗CEA纳米抗体的人源化
目前由于在开发CAR-T的过程中，许多嵌合抗原受体很难在病人的T淋巴细胞上稳定表达，大多数转染后都会随着细胞的培养时间延长，表达效率逐渐降低。造成这种现象的主要原因为嵌合抗原受体的免疫原性，从而影响其在体内的安全性和作用效果。
因此，本实施例将14F1的氨基酸序列中的CDR区保持不变的前提下，根据Vincke等公布的h-NbBcⅡ10FGLA人源化纳米抗体通用模板（Vincke C,Loris R,Saerens D,etal.General strategy to humanize a camelid single-domain antibody andidentification of a universal humanized nanobodyscaffold[J].J Biol Chem,2009,284(5):3273-3284），将14F1的CDR区移植至h-NbBcⅡ10FGLA人源化纳米抗体通用模板上，暂命名该抗体为h-NbBcⅡ10FGLA-14F1，氨基酸序列如SEQ ID NO.15。但按照实施例3的亲和力测定方法测定后，发现h-NbBcⅡ10FGLA-14F1相比于14F1，亲和力出现了明显的下降，仅为2.221E-8（结果见表1及图7）。在此基础上，又对h-NbBcⅡ10FGLA-14恢复个别位点的氨基酸突变。具体为第5位Val→Gln、第34位Leu→Met、第35位Gly→Arg、第37位Phe→Val、第43位Gln→Lys、第47位Ala→Leu、第59位Tyr→Ser。 定点突变使用Mut express multiS fastmutagenesis kit V2（诺唯赞，货号C215-01）。最终获得亲和力基本不变的人源化纳米抗体14F1，并命名为H-14F1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。按照实施例3的亲和力测定方法测定H-14F1的亲和力为3.959E-9（结果见表1及图7，图7中上图为h-NbBcⅡ10FGLA-14F1，简写为NbBc-14F1，中图为H-14F1，下图为H-14F1）。
表1亲和力测定结果
 。
实施例5. 纳米抗体与阳性细胞结合鉴定
SW480（人结肠癌细胞，购买于上海誉弛生物科技有限公司）和LoVo细胞（人结肠癌细胞，浙江省医学科学院实验动物中心馈赠）均分泌CEA抗原，而293T细胞（人胚胎肾上皮细胞，青岛大学馈赠）不分泌CEA抗原。利用这一特性，利用间接免疫荧光的方法鉴定人源化纳米抗体H-14F1是否可以与表达CEA的细胞结合。具体操作为：向24孔板底滴加20μl完全培养液，将细胞爬片轻轻地放入24孔板内。细胞消化后调整细胞浓度至5×104个/ml，每孔滴加100μl，放入培养箱中。待细胞生长达到80%左右后，取出爬片，放置至载玻片上。按照甲醛、丙酮1：1的比例配制固定液。将固定液滴在爬片上，室温放置15min，用PBST洗涤3次，每次5min。5%浓度的BSA溶液室温封闭1h，用PBST洗涤3次，每次5min。将H-14F1用1%浓度的BSA溶液稀释后（1mg/ml，稀释度约为1：200），室温孵育2h，用PBST洗涤3次，每次5min。将FITC标记的Rabbit Anti-Camelid VHH Cocktail二抗（金斯瑞生物，货号为A02017）用1%浓度的BSA溶液稀释后，避光室温孵育1h，用PBST洗涤5次，每次3min。滴加30%甘油，防止干燥，镜下观察。结果见图8。人源化纳米抗体H-14F1与LoVo细胞和SW480细胞均可见荧光现象。通过镜下观察可以看出，LoVo细胞的荧光强度要略强于SW480细胞，而293T细胞未见明显荧光。这与目前研究报道的LoVo细胞分泌CEA的量要高于SW480细胞的结果一致。而293T细胞不分泌CEA抗原，因此未见明显荧光。由此结果可见，靶向CEA的纳米抗体14F1可与表达CEA抗原的细胞结合，而与不表达CEA的细胞未见非特异性结合。
实施例6. 靶向CEA的嵌合抗原受体T细胞的制备
6.1 靶向CEA嵌合抗原受体编码基因的构建
根据目前常用的CAR-T结构（具体见表2），针对H-14F1抗体设计了三种靶向CEA嵌合抗原受体，并分别命名为14F1CAR-CEA-1、14F1CAR-CEA-2、14F1CAR-CEA-3。其具体构成为：14F1CAR-CEA-1从N端到C端由CD8α信号肽、H-14F1、CD8α铰链区、CD28跨膜区、CD28信号区、CD137信号区、CD3ζ信号区串联构成；14F1CAR-CEA-2从N端到C端由CD8α信号肽、H-14F1、CD8α铰链区、CD28跨膜区、CD278信号区（氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示）、CD137信号区、CD3ζ信号区串联构成；14F1CAR-CEA-3从N端到C端由CD8α信号肽、H-14F1、CD8α铰链区、CD28跨膜区、CD27信号区（氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示）、CD137信号区、CD3ζ信号区串联构成。具体制备方法如下：分别人工合成各部分的基因序列，通过融合PCR的方法将上述各部分的基因序列依次从5’端到3’端连接在一起，得到靶向CEA的嵌合抗原受体的编码基因，其中14F1CAR-CEA-1核酸序列如SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；14F1CAR-CEA-2核酸序列如SEQ ID NO.19所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；14F1CAR-CEA-3核酸序列如SEQ ID NO.21所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。
表2 CAR-T各部分结构
。
6.2 靶向CEA嵌合抗原受体慢病毒载体的制备
6.2.1 慢病毒载体质粒的制备
将三种14F1CAR-CEA的编码基因通过EcoRⅠ和XbaⅠ限制性酶切位点克隆至pLVX-IRES-ZsGreen1载体（购自擎科生物）上，利用无内毒素质粒大提试剂盒（天根生化科技，货号DP117）提取质粒。
6.2.2 准备293T细胞
镜下观察293T细胞状态良好（细胞边缘光滑、成小叶状、细胞核明显），用10ml移液管弃瓶中细胞培养液，加入3ml PBS，放平轻轻摇晃培养瓶，胰酶均匀铺在细胞层，将培养瓶立起，用10ml移液管弃PBS；用10ml移液管加入3ml胰酶，放平轻轻摇晃培养瓶，胰酶均匀铺在细胞层，放入细胞培养箱中静置2min；取出培养瓶，镜下观察细胞完全悬浮后用10ml移液管加入5ml 细胞培养液，轻轻吹打后全部转移至15ml离心管中，100g离心5min；将废液倒入废液桶内，静置离心管1-2min，用200ul枪头吸去残余废液，加入10ml病毒包装液重悬，轻轻吹打混匀后，细胞计数板计数，将细胞浓度调整至6×105个/ml，6孔板每孔加入2ml细胞悬液。每加三个孔轻轻吹打细胞悬液；顺时针轻轻敲打6孔板四个边，保证细胞均匀分布，镜下检查无误后，放入细胞培养箱中培养24h。
6.2.3 慢病毒包装
取两个1.5ml无菌离心管，标记为A管和B管，分别加入250μl DMEM；向A管中加入7μl lipo3000，向B管中加入1.5μg目的质粒、1μg psPAX2包装质粒、0.5μg pMD2G包膜质粒和6μl P3000；将A管中液体缓慢滴入B管内，静置20min；将6孔板内的293T细胞培养液吸出1ml，将脂质体质粒预混液沿孔壁边缘缓慢滴入对应孔内，放入细胞培养箱中培养；静置培养6h后，弃孔内培养液，加入新的预热的病毒包装液2ml，放入细胞培养箱中培养；48h后将六孔板内培养液转入15ml离心管内，标记后4℃保存，加入2ml新的预热病毒包装液，放入细胞培养箱中再次培养24h后收集上清至15ml离心管内，共收集4ml样品；2000rpm离心10min，0.45μm滤膜过滤。
6.2.4 慢病毒浓缩
将病毒样品与病毒浓缩液（吉满生物，货号为GM-040801-15）混合，比例为4：1，4℃放置过夜。开始每半个小时八字晃动离心管，共晃动3次。4℃条件下4000g离心30min，弃去上清，按原液体积1/100的PBS重悬，每管50μl分装后冻存于-80℃。
6.2.5 病毒滴度的测定
将293T细胞消化后用完全培养液将细胞浓度调整为6×104个/ml，每孔100μl接种至96孔板内，放入细胞培养箱中过夜培养；5ml完全培养液里加入5μl 10mg/ml polybrene，吹打混匀；取一个新的96孔板，如图9所示，向16个孔内每孔加入135μl上述混合液。向N1-N4孔内均加入15μl病毒样品，吹打混匀后取15μl孔内稀释液，加入下一行对应孔内，依次稀释；第4天所铺96孔板内培养液弃掉，每孔对应加入100μl预混好的病毒稀释液，2000rpm离心30min，放入细胞培养箱中培养10h后弃孔内样品，加入100μl新的预热的细胞培养液，放入细胞培养箱中培养；最后观察荧光。按照以下公式计算滴度：Titer= (F×C/V)×D。其中F为荧光阳性率；C为侵染时细胞个数；V为侵染体积；D为病毒稀释倍数。
6.3 靶向CEA嵌合抗原受体T细胞的制备
6.3.1 分离人的外周血单核细胞
无菌采集病人静脉血20ml至加有抗凝剂的试管中，轻轻混匀。加入20ml PBS溶液稀释后，缓慢加入10ml Ficoll分离液（北京索莱宝，货号为P9011），以水平离心机2000r/min离心20min。此时可见试管中的悬液分3层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，在紧贴红细胞层上有一呈乳白色的淋巴细胞层（正常人外周血单核细胞）。用毛细管吸取位于中间的富含白色淋巴细胞的细胞悬液，移入另一试管中。加入5倍体积的PBS溶液混匀，以水平离心机2000r/min离心10min，弃上清，相同方法洗涤两次。2ml PBS溶液重悬沉淀细胞，并计数备用。
6.3.2 筛选CD3阳性的T淋巴细胞
取上述分离后的PBMC，加入适量MACS缓冲液洗涤PBMC（107/ml）。离心后再次加入MACS缓冲液重悬PBMC，按照每107个PBMC加入20μl的CD3免疫磁珠（Miltenyi公司，货号为130-111-551），混匀后4℃孵育20min；利用MACS缓冲液洗涤1次；加入500μl的MACS重悬，加入预先洗涤过的MS分离柱，先流出的细胞为CD3阴性T细胞；再次加入MACS缓冲液洗涤分离柱3次；加1ml洗脱细胞，得到的即为CD3阳性T细胞。取少量计数后，加入X-VIVO培养基重悬。
6.3.3慢病毒侵染CD3阳性的T细胞
根据MOI=1及病毒滴度确定侵染病毒体积，按照1/1000比例加入polybrene，与CD3+T细胞孵育6-12h后更换培养液，培养2-4d后观察荧光效率。
6.3.4 流式细胞分选阳性克隆
利用Alexa Fluor® 647偶联试剂盒(Fast) - Lightning-Link®（厂家为Abcam，货号为ab269823）对CEA进行红色荧光标记，BCA测定标记后蛋白浓度；将标记后的CEA-647用FACE-Buffer（1%FBS＋PBS）调整浓度为5μg/ml；胰酶消化侵染慢病毒后的CD3+T细胞，使用FACE-Buffer调整浓度为3×106个/ml；500μl细胞悬液装入一个1.5ml离心管内，500g离心5min；用50μl CEA-647重悬，吹打混匀，4℃静置30min；500g离心5min，PBS重悬；再次500g离心5min，用1ml FACE-Buffer重悬，冰上避光保存，上机分选；设置CD3+T细胞对照组、CD3+T细胞＋CEA-647对照组。最后将分选的阳性细胞继续培养，即可得14F1CAR-CEA-T细胞。
 实施例7. 14F1CAR-CEA-T细胞对肿瘤细胞的杀伤力以及CAR-T细胞活力检测
利用xCELLigence RTCA实时无标记细胞功能分析仪检测不同抗原嵌合受体T细胞对LoVo细胞以及SW480细胞的杀伤能力，具体操作如下：第一天取生长较好的LoVo细胞或SW480细胞稀释至2×106个/ml，加入15μl的细胞（3×104个/孔）至配套的96孔板中，每20分钟记录一次电阻指数。第二日按照1：1、3：1、9：1的效应细胞：靶细胞比例（效靶比，E:T）分别加入15μl、45μl、135μl的14F1CAR-CEA-T细胞，每孔用X-VIVO基础培养基补充至200μl，每20分钟记录一次电阻指数。按照公式：CAR-T细胞对靶细胞的杀伤率=基线电阻指数-实时电阻指数进行计算，结果见图10（横坐标为细胞种类，纵坐标为靶细胞的最高杀伤率，其中UTD（untransducted）为未转染CAR的T细胞对照组）和图11（横坐标为效靶比，纵坐标为靶细胞的杀伤率）。第三日，收集96孔板中的细胞上清，1000g离心10min后取上清利用人IFN-γ检测试剂盒（酶联生物，货号为ml077386）检测IFN-γ以此评判CAR-T细胞的活化水平。结果见图12（横坐标为细胞种类，纵坐标为IFN-γ的含量）。图10结果显示，14F1CAR-CEA-1-T细胞对LoVo细胞的杀伤率可达91%，对SW480细胞的杀伤率为48%；14F1CAR-CEA-2-T细胞对LoVo细胞的杀伤率可达73%，对SW480细胞的杀伤率可达46%；14F1CAR-CEA-3-T细胞对LoVo细胞的杀伤率可达81%，对SW480细胞的杀伤率可达23%。图11结果显示，不管是LoVo细胞还是SW480细胞，随着效靶比的增加，CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用均增强。图12结果显示（图12中UTD（untransducted）为未转染CAR的T细胞对照组），14F1CAR-CEA-1-T细胞在杀伤LoVo细胞后释放的IFN-γ要明显高于14F1CAR-CEA-2-T细胞和14F1CAR-CEA-3-T细胞，而对于SW480细胞，三种CAR-T细胞释放的IFN-γ含量基本一致。
 实施例8. CAR-T细胞对结直肠癌小鼠模型的肿瘤抑制作用
8.1 抗原嵌合受体14F1CARCEA1-HA的构建
针对CAR-T对实体瘤的治疗效果较血液肿瘤差，为了使CAR-T在治疗实体瘤中发挥更好的效果，在14F1CAR-CEA-1的基因C端，克隆T2A和透明质酸酶HAase序列，构建14F1CARCEA1-HA。由T2A连接的HAase酶可以降解细胞外基质中的透明质酸，降低透明质酸的粘度，增强细胞外基质组织的通透性，有利于CAR-T细胞进入实体瘤和实体瘤中的浸润，从而增强CAR-T细胞的治疗效果。其中T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，核酸序列如SEQ ID NO.23所示；HAase的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示，核酸序列如SEQ ID NO.25所示。14F1CARCEA1-HA的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示，核酸序列如SEQ ID NO.27所示。
8.2 14F1CARCEA1-HA-T细胞的制备
制备方法同实施例6。
8.3 透明质酸酶的活性检测
收取14F1CARCEA1-HA-T细胞上清，浓缩后采用50mM 醋酸钠-醋酸缓冲液（pH6.0）适当稀释，用对-二甲氨基苯甲醛法测定37℃的透明质酸酶活性。结果显示酶活性为327.6U/mg。
将处于生长对数期的LoVo细胞，使用PBS溶液稀释至2.5×107个/ml。选择20g左右的雌性裸鼠（C57），每只于右侧腹部皮下接种200μl。定期观察肿瘤生长情况，于瘤径80mm3左右开始药物干预。共3组，分别为CAR-T-HA治疗组、CAR-T治疗组和对照组，每组8只小鼠。CAR-T-HA治疗组，尾部静脉注射2×106个14F1CAR-CEA-1-T细胞，于注射7天后进行第二次注射，剂量与方法同第一次注射；CAR-T治疗组，尾部静脉注射2×106个14F1CARCEA1-HA-T细胞，于注射7天后进行第二次注射，剂量与方法同第一次注射；对照组，尾部静脉注射同等数量的T细胞。每两天检测瘤径并称量体重，取平均值绘制抑制肿瘤生长曲线，结果如图13（图13中UTD（untransducted）为未转染CAR的T细胞对照组）。14F1CARCEA1-HA-T和14F1CAR-CEA-1-T均能抑制肿瘤的生长，且14F1CARCEA1-HA-T的抑制效果更佳。

Claims (10)

1.一种靶向CEA的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由抗CEACAM-5抗原的纳米抗体、胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区、自裂解多肽T2A和透明质酸酶HAase依次串联组成，其中，所述抗CEACAM-5的纳米抗体氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外铰链区为CD8α铰链区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述跨膜区为CD28跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述胞内信号区包括共刺激信号区和第一信号区，其中第一信号区为CD3ζ信号区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；共刺激信号区包括CD28信号区和CD137信号区，其中CD28信号区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示， CD137信号区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述自裂解多肽T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示；所述HAase的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基端连接有信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区和胞内信号区之间设有连接肽，所述连接肽为（G4S）n，其中n为1-7之间的整数。
5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述n=4。
6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示。
7.一种编码权利要求6所述嵌合抗原受体序列的核酸，其特征在于，所述核酸的序列由SEQ ID NO.27所示。
8.一种靶向CEA的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述T细胞含有如权利要求1-6任一所述的嵌合抗原受体。
9.权利要求1-6任一所述的嵌合抗原受体在制备表达CEACAM-5抗原的肿瘤治疗药物中的应用。
10.权利要求8所述的嵌合抗原受体T细胞在制备表达CEACAM-5抗原的肿瘤治疗药物中的应用。
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