CN116058230A - 一种香菇菌株L808-Ndt及其应用 - Google Patents

一种香菇菌株L808-Ndt及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种香菇菌株L808‑Ndt及其应用。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管普理委员会通生物中心，保藏编号为CGMCC No.21089，保藏日期为2020年12月07日。该菌株为国家认定品种L808(国品认菌2008009)菌株的变异菌株，菌柄、菌盖不分化，子实体呈不规则球形、表面褐色并有瘤状突起。

Description

一种香菇菌株L808-Ndt及其应用
技术领域
本发明属于香菇育种技术领域，具体涉及一种香菇菌株L808-Ndt及其应用。
背景技术
香菇为我国生产量最大的食用菌种类。2020年全国香菇总产量达到1188.21万吨，占全国食用菌总产量的34.28％(数据来源：中国食用菌协会)。香菇L808为国家认定中温型品种 (国品认菌2008009)，菌龄120天，具有子实体中大叶形，厚实，菌肉致密，不易开伞，产量高、品质优、广适性好、货架期长等优点，深受种植户、经销商和消费者的青睐，在浙江、河南、河北、湖北、山东、辽宁等各主产省广泛栽培，高峰时期占全国栽培总量的40％以上。如该品种在全国香菇重点产区的浙江丽水市占总栽培量的60％、河北平泉县的56％、河南驻马店市的83％(中高温香菇)，曾是国内栽培范围最广、应用规模最大的香菇主栽品种，产生了显著的社会经济效益，为我国香菇品质的显著提升，菇农增收、菇业增效和产业持续发展起到了重要的作用。目前L808品种仍在各主产地栽培使用，随着推广范围的扩大，各级菌种在不同地区经过各种形式的运输、保藏、分离、传代与繁育与栽培，品种出现了变异现象。变异菌株是进行遗传育种研究的关键，尤其为特异性状的遗传机理研究提供了基础优良的材料，优良的变异菌株将为食用菌产业发展带来新的突破口。
发明内容
第一方面，本发明提供一种香菇菌株L808-Ndt，该菌株的分类命名：Lentinulaedodes，于2020年12月07日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.21089。该菌株为L808菌株变异菌株，菌柄、菌盖不分化，子实体呈不规则球形、表层表面褐色并有瘤状突起。
第二方面，本发明提供一种前述所述的香菇菌株L808-Ndt产生的菌丝体。
第三方面，本发明提供一种前述所述的香菇菌株L808-Ndt产生的原生质体。
第四方面，本发明提供一种前述所述的香菇菌株L808-Ndt产生的子实体，其中，所述子实体为无菌柄菌盖分化的不规则球形，表层表面褐色并有瘤状突起，本发明提供的菌丝体在恒温下容易产生子实体原基。
第五方面，本发明提供前述一种包含前述所述的香菇菌株L808-Ndt产生的菌棒。
第六方面，本发明将前述所述的香菇菌株L808-Ndt应用于香菇育种。在一些实施例中，所述应用包括如下步骤：
(1)料棒制作
将栽培料装入筒袋中，扎口，制成料棒，常压灭菌，当料棒温度达到98℃以上，开始计时保持18小时。灭菌结束后，待料棒温度降至80℃以下开门，趁热把料捧搬到冷却室冷却，料温度降至28℃以下时接种；
(2)料棒接种
采用接种箱或开放式接种，接种前将接种箱或接种场地清理干净，对内部进行表面消毒，放入已经降冷却的料棒、打孔棒、菌种、75％酒精、酒精灯、气雾消毒剂、套袋等物品；点燃气雾消毒剂，封闭接种箱，消毒；消毒结束后，接种人员洗净双手，使用75％酒精擦拭双手及打孔棒；点燃酒精灯，对打孔棒或打孔机进行灼烧灭菌；在料棒上均匀打3个接种穴，直径1.5cm左右，深2cm～2.5cm。将菌种用手分块塞入接种穴，各孔接好后套袋，换接另一棒；
(3)菌棒培养
接种好后菌棒以墙式堆叠，层高10层左右，每行之间留50cm过道。等待菌丝生长到10cm 左右后，去掉套袋，在菌丝内侧2cm处刺4个～6个孔，深度1cm～1.5cm，进行第一次放气，并将菌棒排放到培养架上；采用棚顶加盖遮阳网、喷水、四周下垂遮阳网等措施，控制环境条件在24℃～26℃之间；待菌丝长满菌棒后，进行第二次刺孔通气，每棒30个～60个孔；菌棒转色后，要在脱袋之前半个月，选择在气温12℃～20℃时，第三次放气，每棒80个左右；排气后选择合适的天气进行脱袋；
(4)出菇管理
拉大昼夜温差刺激菌棒出菇，连续操作7天～10天，促使原基发生；菇蕾形成后，早晚喷水、通风换气，使菇棚内保持稳定的温湿度；第一批菇长至7分～8分成熟后采摘；第一潮菇采收后，停止喷水，增加通风降低湿度，养菌7天左右，待采接处菌丝发白，菌丝明显恢复后，根据菌棒含水量适时补水，使菌棒含水量达到60％～65％，拉大温差，刺激第二潮出菇。如此往复管理至采收结束。
在一些具体实施例中，香菇栽培配方为，杂木屑79％，麦麸20％，石膏1％，含水量为 55％～60％左右，pH自然。
第七方面，本发明将前述的香菇菌株L808-Ndt应用于制备香菇子实体、香菇菌丝体。
本发明的香菇菌株子实体因无菌盖与菌柄分化，没有明显的成熟时期，可以延长香菇采摘时期，减少集中出菇期的劳动强度，增加对市场价格的承受力。
附图说明
图1为香菇L808-Ndt子实体照片；
图2为香菇L808-Ndt在三角烧瓶内原基发生；
图3为香菇L808-Ndt在大试管内原基发生；
图4为香菇L808-Ndt栽培出菇照片；
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1组织分离与室内出菇验证
以丽水市大山菇业研究开发有限公司选育的香菇L808(国品认菌2008009)作为用于开发本发明所述香菇L808-Ndt菌株的出发对照菌株。
(1)组织分离
2019年，在香菇L808正常栽培的菌棒中发现一个无柄、无菌盖分化的异常香菇子实体。使用75％酒精表面消毒后，使用手术刀将子实体剖开，切取0.5mm3大小组织块，接种到葡萄糖马铃薯琼脂培养基(PDA)平板上，于25℃±1℃条件培养，待菌丝生长后，将新生菌丝体转接到新的PDA平板上进行纯化分离，如此反复转接3次，最终获得1个组织分化异常分离菌株L808-Ndt。
香菇菌株L808-Ndt，该菌株的分类命名：Lentinula edodes，于2020年12月07日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.21089。该菌株L808菌株变异菌株，菌柄、菌盖不分化，如图1所示，子实体呈不规则球形、表层表面褐色并有瘤状突起。
(2)室内出菇验证
为了初步验证L808-Ndt菌株的子实体发生的遗传稳定性，在室内初步进行出菇验证。
PDA加富培养基的出菇验证。培养基配方为，马铃薯200g成1cm2小块煮30min，经双层纱布过滤取浸出液，加入蛋白胨1g，葡萄糖20g，酵母膏1g，7水硫酸镁(MgSO4·7H2O) 2g，磷酸二氢钾(KH2PO4)2g，加蒸馏水至1000mL。每个250mL三角烧瓶分装100mL， 121℃，20min高压灭菌后备用。
木屑培养基的出菇验证。培养基配方为，杂木屑79％，麦麸20％，石膏1％，含水量为 55％～60％左右，pH自然，每个30mm×200mm玻璃大试管分装45g，于121℃，120min高压灭菌后备用。
将L808-Ndt分别接种于完PDA加富培养基和木屑培养基中，置于25℃±1℃条件下静置培养35天。
实施例2香菇菌株L808-Ndt变异性检测
(1)DNA提取与检测
将L808-Ndt与L808正常菌株菌丝体，接种含有20mLPDA培养基的90mm培养皿中，培养皿内平铺已经灭菌的赛璐酚玻璃纸，于25℃±1℃条件培养。待菌丝长满后，收集适量菌丝体，于液氮中研磨并使用CTAB法提取菌丝体DNA。使用琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有RNA污染，Nanodrop检测DNA的OD260/280比值，Qubit精确定量DNA浓度。检测结果中，OD值在1.8～2.0之间，总量在1.5ug以上的DNA样品被用来进行重测序分析。
(2)基因组重测序及序列分析
试验委托北京诺禾致源科技有限公司进行。
合格的DNA样品通过Covaris破碎机随机打断成长度为350bp的片段。采用TruSeqLibrary Construction Kit进行建库。DNA片段经末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。构建好的文库通过Illumina的HiSeq PE150平台进行测序。测序得到的原始图像数据文件经碱基识别分析转化为原始测序序列(Raw Data)。后续通过对测序数据进行序质量分布、测序错误率分布、测序数据过滤，获得有效数据(cleandata)。使用BWA软件(参数：mem-t 4-k 32-M)将比对到参考基因组，比对结果经SAMTOOLS软件去除重复(参数：rmdup)。采用SAMTOOLS(mpileup-m 2-F 0.002-d 1000)进行个体 SNP的检测，并以SNP的reads支持数不低于4、NP的质量值不低于20为标准对SNP进行过滤。利用SAMTOOLS(mpileup-m 2-F 0.002-d 1000)检测长度小于50bp的小片段插入与缺失(InDel)。
结果
(1)基因组重测序数据质量及与参考基因组比对
利用Illumina平台对L808-Ndt与L808正常菌株进行重测序。所测得的raw data分别为 1115019000bp、1138422900bp，clean data分别为1110753300bp、1133963400bp，clean
data的有效率为99.62％、99.61％，clean data中Q30质量的碱基达到94.25％和94.37％，两个菌株GC碱基含量在43.70％～44.27％之间，相差不大，说明样本建库测序的质量达到重测序标准。
表1.两个菌株的重测序质量
Figure BDA0003929969500000041
Figure BDA0003929969500000051
(2)重测序结果的比对分析
以日本岩手县生物技术研究中心(Iwate Biotechnology Research Center)在2017年公布的NBRC 111202菌株序列为参考基因组进行序列比对分析。经过比对L808-Ndt与L808正常菌株的成功比对率分别为92.71％、92.83％，平均测序深度均达到22X以上。1X覆盖度分别为86.49％、86.43％，4X覆盖度分别为84.39％、84.19％，比对结果正常，可用于后续的变异检测及相关分析。
表2.两个菌株的比对结果
Figure BDA0003929969500000052
表3.L808-Ndt菌株的特异性SNP/InDel位点
Figure BDA0003929969500000053
实施例3香菇L808-Ndt菌株的组织分离与栽培验证
将获得的L808-Ndt菌株、L808正常菌株在浙江省丽水市景宁县进行高棚层架式栽培。
(1)料棒制作
采用香菇栽培配方为，杂木屑79％，麦麸20％，石膏1％，含水量为55％～60％左右， pH自然。将1.8kg栽培料装入15厘米×55厘米规格筒袋中，扎口，制成料棒。每个菌株108 棒，常压灭菌，当料棒温度达到98℃以上，开始计时保持18小时。灭菌结束后，待料棒温度降至80℃以下开门，趁热把料捧搬到冷却室冷却，料温度降至28℃以下时接种。
(2)料棒接种
采用接种箱法接种。接种前将接种箱清理干净，对内部进行表面消毒。放入已经降冷却的料棒、打孔棒、菌种、75％酒精、酒精灯、气雾消毒剂、套袋等物品。点燃气雾消毒剂，封闭接种箱，消毒30分钟。消毒结束后，接种人员洗净双手，伸入接种箱，使用75％酒精擦拭双手及打孔棒。点燃酒精灯，对打孔棒进行灼烧灭菌。使用打孔棒在料棒上均匀打三个3 个接种穴，直径1.5cm左右，深2cm～2.5cm。将菌种用手分块塞入接种穴，各孔接好后套袋，换接另一棒。
(3)菌棒培养
接种好后菌棒以墙式堆叠，层高10层左右，每行之间留50cm过道。等待菌丝生长到10cm 左右后，去掉套袋，在菌丝内侧2cm处刺4个～6个孔，深度1cm～1.5cm，进行第一次放气，并将菌棒排放到培养架上。每个菌株随机摆放3个小区，每小区36棒。采用棚顶加盖遮阳网、喷水、四周下垂遮阳网等措施，控制环境条件在24℃～26℃之间。待菌丝长满菌棒后，进行第二次刺孔通气，每棒30个～60个孔。菌棒转色后，要在脱袋之前半个月，选择在气温12℃～ 20℃时，第三次放气，每棒80个左右。排气后选择合适的天气进行脱袋。
(4)出菇管理
拉大昼夜温差刺激菌棒出菇，连续操作7天～10天，促使原基发生。菇蕾形成后，早晚喷水、通风换气，使菇棚内保持稳定的温湿度。第一批菇长至7分～8分成熟后采摘。第一潮菇采收后，停止喷水，增加通风降低湿度，养菌7天左右，待采接处菌丝发白，菌丝明显恢复后，根据菌棒含水量适时补水，使菌棒含水量达到60％～65％，拉大温差，刺激第二潮出菇。如此往复管理至采收结束。
(5)出菇照片
出菇照片如图4所示，本发明提供的香菇L808-Ndt因无菌盖菌柄分化，没有明显的成熟时期，子实体无明显采接节点。而正常L808菌株在子实体长至7分熟时必须采摘，否则抢劫商品价值。因此L808-Ndt菌株可以延长香菇采摘时期，减少集中出菇期的劳动强度，增加对市场价格的承受力。此外其子实体无菌柄，可食用部分更大，易于加工与食用。

Claims (9)

1.一种香菇菌株L808-Ndt，其特征在于，该菌株的分类命名：Lentinula edodes，于2020年12月07日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心”，保藏号为CGMCC No.21089。
2.一种如权利要求1所述的香菇菌株L808-Ndt产生的菌丝体。
3.一种如权利要求1所述的香菇菌株L808-Ndt产生的原生质体。
4.一种如权利要求1所述的香菇菌株L808-Ndt产生的子实体，其中，所述子实体为无菌柄菌盖分化的瘤状。
5.一种包含如权利要求1所述的香菇菌株L808-Ndt产生的菌棒。
6.一种如权利要求1所述的香菇菌株L808-Ndt在香菇育种中的应用。
7.一种如权利要求1所述的香菇菌株L808-Ndt在制备香菇子实体、香菇菌丝体中的应用。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：
(1)料棒制作
将栽培料装入筒袋中，扎口，制成料棒，常压灭菌，当料棒温度达到98℃以上，开始计时保持18小时。灭菌结束后，待料棒温度降至80℃以下开门，趁热把料捧搬到冷却室冷却，料温度降至28℃以下时接种；
(2)料棒接种
采用接种箱或开放式接种，接种前将接种箱或接种场地清理干净，对内部进行表面消毒，放入已经降冷却的料棒、打孔棒、菌种、75％酒精、酒精灯、气雾消毒剂、套袋等物品；点燃气雾消毒剂，封闭接种箱，消毒；消毒结束后，接种人员洗净双手，使用75％酒精擦拭双手及打孔棒；点燃酒精灯，对打孔棒或打孔机进行灼烧灭菌；在料棒上均匀打3个接种穴，直径1.5cm左右，深2cm～2.5cm。将菌种用手分块塞入接种穴，各孔接好后套袋，换接另一棒；
(3)菌棒培养
接种好后菌棒以墙式堆叠，层高10层左右，每行之间留50cm过道。等待菌丝生长到10cm左右后，去掉套袋，在菌丝内侧2cm处刺4个～6个孔，深度1cm～1.5cm，进行第一次放气，并将菌棒排放到培养架上；采用棚顶加盖遮阳网、喷水、四周下垂遮阳网等措施，控制环境条件在24℃～26℃之间；待菌丝长满菌棒后，进行第二次刺孔通气，每棒30个～60个孔；菌棒转色后，要在脱袋之前半个月，选择在气温12℃～20℃时，第三次放气，每棒80个左右；排气后选择合适的天气进行脱袋；
(4)出菇管理
拉大昼夜温差刺激菌棒出菇，连续操作7天～10天，促使原基发生；菇蕾形成后，早晚喷水、通风换气，使菇棚内保持稳定的温湿度；第一批菇长至7分～8分成熟后采摘；第一潮菇采收后，停止喷水，增加通风降低湿度，养菌7天左右，待采接处菌丝发白，菌丝明显恢复后，根据菌棒含水量适时补水，使菌棒含水量达到60％～65％，拉大温差，刺激第二潮出菇。如此往复管理至采收结束。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，香菇栽培配方为，杂木屑79％，麦麸20％，石膏1％，含水量为55％～60％左右，pH自然。
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