CN116047072A - 唾液酸酶neu1化学发光检测试剂盒及检测唾液酸酶neu1的方法 - Google Patents

唾液酸酶neu1化学发光检测试剂盒及检测唾液酸酶neu1的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116047072A
CN116047072A CN202211715911.3A CN202211715911A CN116047072A CN 116047072 A CN116047072 A CN 116047072A CN 202211715911 A CN202211715911 A CN 202211715911A CN 116047072 A CN116047072 A CN 116047072A
Authority
CN
China
Prior art keywords
magnetic particles
diluent
mixing
antibody
reagent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211715911.3A
Other languages
English (en)
Inventor
蒋小龙
马芳
姚凯成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chengdu Siruido Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Chengdu Siruido Medical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chengdu Siruido Medical Technology Co ltd filed Critical Chengdu Siruido Medical Technology Co ltd
Priority to CN202211715911.3A priority Critical patent/CN116047072A/zh
Publication of CN116047072A publication Critical patent/CN116047072A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本申请提供一种唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒及检测唾液酸酶NEU1的方法，属于免疫检测技术领域。唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒包括第一试剂和第二试剂。第一试剂中含有免疫磁微粒，免疫磁微粒为第一磁微粒和/或第二磁微粒；第一磁微粒为表面连接有包被物的链霉亲和素磁微粒，包被物为生物素酯标记的第一抗体；第二磁微粒为表面连接有第二抗体的羧基磁微粒。第二试剂中含有发光标记物标记的第三抗体。第一抗体、第二抗体、第三抗体均为能够与NEU1特异性结合的抗体。本申请提供的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒兼具高灵敏度、高准确度、高重复性、宽检测范围以及高稳定性，可快速对待测样本(特别是精浆样本)中的NEU1的含量进行检测。

Description

唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒及检测唾液酸酶NEU1的方法
技术领域
本申请涉及免疫检测技术领域，具体而言，涉及一种唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒及检测唾液酸酶NEU1的方法。
背景技术
唾液酸(Sialic Acid，SA)又称神经氨酸(Neuraminic Acid)，是一类普遍存在于生物体内的糖蛋白或糖脂分子末端的九碳酸性单糖的总称。精子膜表面存在唾液酸，唾液酸在精子发生、附睾精子成熟及精卵结合过程中均发挥重要作用。
唾液酸酶又称神经氨酸酶(NEU)，是一个在细胞表面分解唾液酸的酶家族。唾液酸酶主要包括NEU1、NEU2、NEU3和NEU4四种亚型蛋白，其中，精子膜表面存在NEU1和NEU3，且NEU1和NEU3能够影响精子生殖能力。唾液酸在人的体外获能过程中，精子膜上的唾液酸以单个糖分子的方式从精子的细胞膜上脱落，而与此同时，精子膜上的唾液酸酶(NEU1或NEU3)由于精子膜的流动性而脱落，并参与剪切致单个唾液酸分子脱落。因此，对精浆样本中NEU1或NEU3进行检测，可以用于评估精子质量，以判断男性是否存在不育的情况。
因此，急需一种兼具高灵敏度、高准确度、高重复性、宽检测范围以及高稳定性的检测精浆样本中的唾液酸酶NEU1的试剂盒。
发明内容
本申请的目的在于提供一种唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒及检测唾液酸酶NEU1的方法，其能够用于检测精浆样本中的NEU1，且兼具高灵敏度、高准确度、高重复性、宽检测范围以及高稳定性。
第一方面，本申请提供一种唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒，包括第一试剂和第二试剂。
第一试剂中含有免疫磁微粒，免疫磁微粒为第一磁微粒和/或第二磁微粒；第一磁微粒为表面连接有包被物的链霉亲和素磁微粒，包被物为生物素酯标记的第一抗体；第二磁微粒为表面连接有第二抗体的羧基磁微粒。
第二试剂中含有发光标记物标记的第三抗体。
其中，第一抗体、第二抗体、第三抗体均为能够与NEU1特异性结合的抗体。
本申请提供的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒采用双抗体夹心法检测原理，试剂盒中的免疫磁微粒(含有第一抗体或第二抗体)以及含有发光标记物标记的第三抗体均能够与NEU1结合。使用本申请提供的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒并借助磁微粒化学发光技术，可快速对待测样本(特别是精浆样本)中的NEU1的含量进行检测，且试剂盒兼具高灵敏度、高准确度、高重复性、宽检测范围以及高稳定性。
结合第一方面，本申请可选的实施方式中，发光标记物选自吖啶酯、三联吡啶钌、鲁米诺以及AMPPD中的任意一种。
上述发光标记物的发光强度较大，更易被化学发光免疫分析仪检测。
可选地，发光标记物选自吖啶酯。
吖啶酯具有较高的量子产率，发光效率高且强度大；吖啶酯的发光系统简单，不需要催化剂，从而提高了信噪比；吖啶酯的分子量小，对第三抗体的构象影响极小，且含有发光标记物标记的第三抗体的稳定性好；因此，发光标记物选自吖啶酯时，试剂盒更灵敏且更稳定。
结合第一方面，本申请可选的实施方式中，第一磁微粒中，链霉亲和素磁微粒与包被物的质量比为100:(0.2-2)；包被物中，第一抗体与生物素酯的质量比为20:(1-2)。和/或，第二磁微粒中，羧基磁微粒与第二抗体的质量比为100:(0.2-2)。
上述配比条件下，有利于进一步提高试剂盒的灵敏度、准确度、重复性、检测范围以及稳定性。
结合第一方面，本申请可选的实施方式中，免疫磁微粒为第一磁微粒。
在上述技术方案中，免疫磁微粒为第一磁微粒，包被物中的生物素酯可与链霉亲和素特异性结合，以实现信号放大作用。
可选地，免疫磁微粒在第一试剂中的质量浓度为0.2-1.0mg/mL。
免疫磁微粒在第一试剂中的质量浓度为0.2-1.0mg/mL，有利于进一步提高试剂盒的灵敏度、准确度、重复性、检测范围以及稳定性。
结合第一方面，本申请可选的实施方式中，发光标记物标记的第三抗体中，第三抗体与发光标记物的质量比为20:(1-5)。
上述配比条件下，有利于进一步提高试剂盒的灵敏度、准确度、重复性、检测范围以及稳定性。
可选地，发光标记物标记的第三抗体在第二试剂中的质量浓度为0.05-0.5μg/mL。
发光标记物标记的第三抗体在第二试剂中的质量浓度为0.05-0.5μg/mL，有利于进一步提高试剂盒的灵敏度、准确度、重复性、检测范围以及稳定性。
结合第一方面，本申请可选的实施方式中，第一试剂中还含有蛋白保护剂。
在上述技术方案中，第一试剂中还含有蛋白保护剂，有利于提高试剂盒的稳定性。
可选地，蛋白保护剂与免疫磁微粒的质量比为1:(0.4-0.8)。
可选地，蛋白保护剂在第一试剂中的质量浓度为0.5-1.0mg/mL。
上述条件下，有利于进一步提高试剂盒的稳定性。
结合第一方面，本申请可选的实施方式中，免疫磁微粒为第一磁微粒；第一试剂的制备方法包括：将链霉亲和素磁微粒与第一稀释液混合，磁液分离后得到第一沉淀物；将第一沉淀物与第二稀释液混合，然后加入包被物混合30-60min，磁液分离后得到第二沉淀物；将第二沉淀物与第三稀释液混合，然后加入第一封闭液混合30-60min，磁液分离后得到第三沉淀物；将第三沉淀物与第四稀释液混合。
其中，第一稀释液、第二稀释液、第三稀释液以及第四稀释液各自独立地包括5-20mM的PBS缓冲液、0.1-1wt％的牛血清白蛋白、0.01-0.05wt％的Triton X-100以及0.05-0.1wt％的蛋白保护剂；第一封闭液包括0.1-0.5wt％的生物素缓冲液。
上述技术方案，可快速制备形成第一试剂，且制备方法简单易行，易于大规模生产。
可选地，包被物的制备方法包括：将生物素酯溶于二甲基亚砜后，加入第一抗体混合30-60min；然后加入第一终止液混合10-30min，于PBS缓冲液中透析12-24h；其中，第一终止液包括0.5-1M的Tris缓冲液。
结合第一方面，本申请可选的实施方式中，免疫磁微粒为第二磁微粒；第一试剂的制备方法包括：将羧基磁微粒与第五稀释液混合，磁液分离后得到第四沉淀物；将第四沉淀物与第六稀释液混合，加入第七稀释液混合，然后再加入第二抗体混合2-4h，磁液分离后得到第五沉淀物；将第五沉淀物与第八稀释液混合，然后加入第二封闭液混合30-45min，磁液分离后得到第六沉淀物；将第六沉淀物与第九稀释液混合。
其中，第五稀释液、第六稀释液以及第八稀释液各自独立地包括0.05-0.2M的吗啉乙磺酸缓冲液；第七稀释液包括15-35mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液；第二封闭液包括20-30mM的氨基乙酸缓冲液；第九稀释液包括5-20mM的PBS缓冲液、0.1-1wt％的牛血清白蛋白、0.01-0.05wt％的Triton X-100以及0.05-0.1wt％的蛋白保护剂。
上述技术方案，采用EDC/NHS原理将羧基磁微粒的羧基基团和第二抗体上的氨基基团共价连接，可快速制备形成第一试剂，且制备方法简单易行，易于大规模生产。
结合第一方面，本申请可选的实施方式中，第二试剂的制备方法包括：先将含有发光标记物与第三抗体的溶液于避光条件下混合30-60min；然后加入第二终止液于避光条件下混合10-30min；纯化后，将纯化后的物质溶于第十稀释液。
其中，第二终止液包括0.1-1wt％的赖氨酸缓冲液；第十稀释液包括5-20mM的PBS缓冲液、0.1-1wt％的酪蛋白以及0.01-0.05wt％的Triton X-100。
上述技术方案，可快速制备形成第二试剂，且制备方法简单易行，易于大规模生产。
第二方面，本申请提供一种检测唾液酸酶NEU1的方法，检测唾液酸酶NEU1的方法采用上述第一方面提供的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒；检测唾液酸酶NEU1的方法包括：将待测样本、第一试剂和第二试剂混合并进行第一孵育后，采用化学发光免疫分析仪进行检测。
本申请提供的检测唾液酸酶NEU1的方法采用本申请第一方面提供的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒，可快速高效且准确地对待测样本(特别是精浆样本)中的NEU1的含量进行测定。
可选地，检测唾液酸酶NEU1的方法还包括：第一孵育后，加入预激发液和激发液进行第二孵育，然后采用化学发光免疫分析仪进行检测；其中，预激发液包括0.5-1.0wt％的过氧化物；激发液包括0.2-0.5M的氢氧化钠。
可选地，第一孵育和第二孵育的温度各自独立地为36.5-37.5℃，第一孵育的时间为8-12min，第二孵育的时间为1-5min。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本申请提供一种唾液酸酶检测试剂盒，包括第一试剂和第二试剂。第一试剂中含有免疫磁微粒，免疫磁微粒为第一磁微粒和/或第二磁微粒；第一磁微粒为表面连接有包被物的链霉亲和素磁微粒，包被物为生物素酯标记的第一抗体；第二磁微粒为表面连接有第二抗体的羧基磁微粒。第二试剂中含有发光标记物标记的第三抗体。
其中，第一抗体、第二抗体、第三抗体均为能够与NEU1特异性结合的抗体。
需要说明的是，在本申请中，链霉亲和素磁微粒是指：磁微粒中含有链霉亲和素的磁微粒；羧基磁微粒是指：磁微粒中含有羧基基团的磁微粒。
本申请提供的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒采用双抗体夹心法检测原理，试剂盒中的免疫磁微粒(含有第一抗体或第二抗体)以及含有发光标记物标记的第三抗体均能够与NEU1结合。使用本申请提供的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒并借助磁微粒化学发光技术，可快速对待测样本中的NEU1的含量进行检测，且试剂盒兼具高灵敏度、高准确度、高重复性、宽检测范围以及高稳定性。
在本申请中，发光标记物选自吖啶酯、三联吡啶钌、鲁米诺以及AMPPD中的任意一种。上述发光标记物的发光强度较大，更易被化学发光免疫分析仪检测。
进一步地，发光标记物选自吖啶酯。吖啶酯具有较高的量子产率，发光效率高且强度大；吖啶酯的发光系统简单，不需要催化剂，从而提高了信噪比；吖啶酯的分子量小，对第三抗体的构象影响极小，且含有发光标记物标记的第三抗体的稳定性好；因此，发光标记物选自吖啶时，试剂盒更灵敏且更稳定。
在本申请中，第一磁微粒中，链霉亲和素磁微粒与包被物的质量比为100:(0.2-2)；包被物中，第一抗体与生物素酯的质量比为20:(1-2)。上述配比条件下，有利于进一步提高试剂盒的灵敏度、准确度、重复性、检测范围以及稳定性。
作为示例性地，链霉亲和素磁微粒与包被物的质量比可以为100:0.2、100:0.5、100:1、100:1.5或者100:2等等；第一抗体与生物素酯的质量比可以为20:1.2、20:1.4、20:1.6、20:1.8或者20:2.0等等。
第二磁微粒中，第二抗体与羧基磁微粒的质量比为100:(0.2-2)。上述配比条件下，有利于进一步提高试剂盒的灵敏度、准确度、重复性、检测范围以及稳定性。
作为示例性地，第二抗体与羧基磁微粒的质量比可以为100:0.2、100:0.5、100:1、100:1.5或者100:2等等。
进一步地，免疫磁微粒在第一试剂中的质量浓度为0.2-1.0mg/mL，有利于进一步提高试剂盒的灵敏度、准确度、重复性、检测范围以及稳定性。
作为示例性地，免疫磁微粒在第一试剂中的质量浓度可以为0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL或者1.0mg/mL等等。
在本申请一些可选的实施方式中，第一试剂中还含有蛋白保护剂。
需要说明的是，在本申请中，蛋白保护剂是指：用于保护第一试剂和第二试剂中抗体(第一抗体或第二抗体、第三抗体)，以维持第一抗体(或第二抗体)以及第三抗体的生物活性。
第一试剂中还含有蛋白保护剂，有利于提高试剂盒的稳定性。
作为示例性地，蛋白保护剂可以为郑州赛图康生物科技有限公司的IVD专用蛋白保护剂。
进一步地，蛋白保护剂与免疫磁微粒的质量比为1:(0.4-0.8)，有利于进一步提高试剂盒的稳定性。
作为示例性地，蛋白保护剂与免疫磁微粒的质量比可以为1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7以及1:0.8等等。
再进一步地，蛋白保护剂在第一试剂中的质量浓度为0.5-1.0mg/mL，有利于进一步提高试剂盒的稳定性。
作为示例性地，蛋白保护剂在第一试剂中的质量浓度可以为0.5mg/mL、0.8mg/mL以及1.0mg/mL等等。
当免疫磁微粒为第一磁微粒时，第一试剂的制备方法包括：将链霉亲和素磁微粒与第一稀释液混合，磁液分离后得到第一沉淀物；将第一沉淀物与第二稀释液混合，然后加入包被物混合30-60min，磁液分离后得到第二沉淀物；将第二沉淀物与第三稀释液混合，然后加入第一封闭液混合30-60min，磁液分离后得到第三沉淀物；将第三沉淀物与第四稀释液混合。其中，第一稀释液、第二稀释液、第三稀释液以及第四稀释液各自独立地包括5-20mM的PBS缓冲液、0.1-1wt％的牛血清白蛋白、0.01-0.05wt％的Triton X-100以及0.05-0.1wt％的蛋白保护剂；第一封闭液包括0.1-0.5wt％的生物素缓冲液。
上述技术方案，可快速制备形成第一试剂，且制备方法简单易行，易于大规模生产。
进一步地，包被物的制备方法包括：将生物素酯溶于二甲基亚砜后，加入第一抗体混合30-60min；然后加入第一终止液混合10-30min，于PBS缓冲液中透析12-24h；其中，第一终止液包括0.5-1M的Tris缓冲液。
上述技术方案，可快速制备形成包被物，且制备方法简单易行，易于大规模生产。
当免疫磁微粒为第二磁微粒时，第一试剂的制备方法包括：将羧基磁微粒与第五稀释液混合，磁液分离后得到第四沉淀物；将第四沉淀物与第六稀释液混合，加入第七稀释液混合，然后再加入第二抗体混合2-4h，磁液分离后得到第五沉淀物；将第五沉淀物与第八稀释液混合，然后加入第二封闭液混合30-45min，磁液分离后得到第六沉淀物；将第六沉淀物与第九稀释液混合。其中，第五稀释液、第六稀释液以及第八稀释液各自独立地包括0.05-0.2M的吗啉乙磺酸缓冲液；第七稀释液包括15-35mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液；第二封闭液包括20-30mM的氨基乙酸缓冲液；第九稀释液包括5-20mM的PBS缓冲液、0.1-1wt％的牛血清白蛋白、0.01-0.05wt％的Triton X-100以及0.05-0.1wt％的蛋白保护剂。
上述技术方案，采用EDC/NHS原理将羧基磁微粒的羧基基团和第二抗体上的氨基基团共价连接，可快速制备形成第一试剂，且制备方法简单易行，易于大规模生产。
需要说明的是，在本申请中，吗啉乙磺酸是指CAS号为4432-31-9的物质，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐指CAS号为25952-53-8的物质，氨基乙酸是指CAS号为56-40-6的物质。
在本申请一些可选的实施方式中，免疫磁微粒为第一磁微粒；第一磁微粒中，包被物中的生物素酯可与链霉亲和素特异性结合，以实现信号放大作用。
在本申请中，发光标记物标记的第三抗体中，第三抗体与发光标记物的质量比为20:(1-5)。上述配比条件下，有利于进一步提高试剂盒的灵敏度、准确度、重复性、检测范围以及稳定性。
需要说明的是，荧光标记物标记的第三抗体是指：含有发光标记物和第三抗体的整体物质。
作为示例性地，第三抗体与发光标记物的质量比可以为20:1、20:2.5、或者20:5等等。
进一步地，发光标记物标记的第三抗体在第二试剂中的质量浓度为0.05-0.5μg/mL，有利于进一步提高试剂盒的灵敏度、准确度、重复性、检测范围以及稳定性。
作为示例性地，发光标记物标记的第三抗体在第二试剂中的质量浓度可以为0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.25μg/mL、0.35μg/mL以及0.5μg/mL等等。
第二试剂的制备方法包括：先将含有发光标记物与第三抗体的溶液于避光条件下混合30-60min；然后加入第二终止液于避光条件下混合10-30min；纯化后，将纯化后的物质溶于第十稀释液。其中，第二终止液包括0.1-1wt％的赖氨酸缓冲液；第十稀释液包括5-20mM的PBS缓冲液、0.1-1wt％的酪蛋白以及0.01-0.05wt％的Triton X-100。
上述技术方案，可快速制备形成第二试剂，且制备方法简单易行，易于大规模生产。
唾液酸酶检测试剂盒还包括用于化学发光免疫分析检测时使用的预激发液和激发液。预激发液包括0.5-1.0wt％的过氧化物；激发液包括0.2-0.5M的氢氧化钠。
本申请还提供一种检测唾液酸酶NEU1的方法，检测唾液酸酶NEU1的方法采用上述的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒；检测唾液酸酶NEU1的方法包括：将待测样本、第一试剂和第二试剂混合并进行第一孵育后，采用化学发光免疫分析仪进行检测。
本申请提供的检测唾液酸酶NEU1的方法采用本申请第一方面提供的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒，可快速高效且准确地对待测样本(特别是精浆样本)中的NEU1的含量进行测定。
进一步地，检测唾液酸酶NEU1的方法还包括：第一孵育后，加入预激发液和激发液进行第二孵育，然后采用化学发光免疫分析仪进行检测；其中，预激发液包括0.5-1.0wt％的过氧化物；激发液包括0.2-0.5M的氢氧化钠。
在一些可选的实施方式中，第一孵育和第二孵育的温度各自独立地为36.5-37.5℃，第一孵育的时间为8-12min，第二孵育的时间为1-5min。
作为示例性地，第一孵育和第二孵育的温度均为37℃。
实施例1
本实施例提供一种唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒，唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒由第一试剂和第二试剂组成，其采用如下方法制备：
(1)生物素酯标记的NEU1抗体1的制备
将NEU1抗体1(购自成都贝思迪生物科技有限公司，型号B9)经20mM的PBS缓冲液透析20h，然后回收。取2mg的生物素酯，溶解于220μL二甲基亚砜中，得到生物素酯溶液。取1mg的前述透析后的NEU1抗体1，加入15μL的生物素酯溶液，混匀反应45min；加入30μL的第一终止液，混匀反应20min；然后经20mM的PBS缓冲液透析20h，回收得到生物素酯标记的NEU1抗体1。
其中，第一终止液为1.0M的Tris缓冲液。
(2)第一试剂的制备
将10mg的链霉亲和素磁微粒加入到10mL的第一稀释液中混匀后，置于磁分离器进行磁液分离，去除上清液，得到第一沉淀物；反复进行2次清洗第一沉淀物后，使用10mL的第二稀释液重悬第一沉淀物。
向上述重悬的第一沉淀物的溶液中加入0.1mg的步骤(1)制得的生物素酯标记的NEU1抗体1，混匀反应45min；置于磁分离器进行磁液分离，去除上清液，得到第二沉淀物。使用10mL的第三稀释液重悬第二沉淀物，然后加入1mL的第一封闭液，混匀反应45min；置于磁分离器进行磁液分离，去除上清液，得到第三沉淀物。使用第一清洗液清洗第三沉淀物2次，然后采用30mL的第四稀释液重悬第三沉淀物，得到第一试剂。
其中，第一稀释液、第二稀释液、第三稀释液以及第四稀释液均由10mM的PBS缓冲液、0.5wt％的牛血清白蛋白、0.02wt％的Triton X-100以及0.05wt％的蛋白保护剂(为郑州赛图康生物科技有限公司的IVD专用蛋白保护剂)组成。第一封闭液为0.2wt％的生物素缓冲液。
(3)第二试剂的制备
将NEU1抗体2(购自成都贝思迪生物科技有限公司，型号G3)经20mM的PBS缓冲液透析20h，然后回收。
向上述透析后的NEU1抗体2，加入30μL的10mM的吖啶酯溶液，避光混匀反应45min；加入0.2mL的第二终止液避光混匀反应20min；然后经脱盐柱纯化，将纯化后的物质溶于第十稀释液，稀释为吖啶标记的NEU1抗体2的质量浓度为0.1μg/mL，得到第二试剂。
其中，第二终止液为1.0wt％的赖氨酸缓冲液；第十稀释液由10mM的PBS缓冲液、0.5wt％的牛血清白蛋白以及0.02wt％的Triton X-100组成。
实施例2
本实施例提供一种唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒，唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒由第一试剂和第二试剂组成；本实施例与实施例1的区别在于：本实施例不包括步骤(1)，且本实施例与实施例1的步骤(2)不同。
本实施例的步骤(2)如下：
将NEU1抗体1(购自成都贝思迪生物科技有限公司，型号B9)经20mM的PBS缓冲液透析20h，然后回收。然后取10mg的羧基磁微粒加入到10mL的第五稀释液中，混匀后，置于磁分离器进行磁液分离，去除上清液，得到第四沉淀物；反复进行2次清洗第四沉淀物后，使用10mL的第六稀释液重悬第四沉淀物。
向上述重悬的第四沉淀物的溶液中加入1.5mL的第七稀释液，混匀后；再加入100μg的上述透析后的NEU1抗体1，混匀反应3h；置于磁分离器进行磁液分离，去除上清液，得到第五沉淀物，对第五沉淀物进行2次清洗。使用5mL的第八稀释液重悬第五沉淀物，然后加入5mL的第二封闭液，混匀反应40min；置于磁分离器进行磁液分离，去除上清液，得到第六沉淀物，对第六沉淀物进行2次清洗。使采用30mL的第九稀释液重悬第六沉淀物，得到第一试剂。
其中，第五稀释液、第六稀释液以及第八稀释液均为0.1M的吗啉乙磺酸缓冲液；第七稀释液为25mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液；第二封闭液为25mM的氨基乙酸缓冲液；第九稀释液由10mM的PBS缓冲液、0.5wt％的牛血清白蛋白、0.02wt％的Triton X-100以及0.05wt％的蛋白保护剂(为郑州赛图康生物科技有限公司的IVD专用蛋白保护剂)组成。
实施例3
本实施例提供一种唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒，唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒由第一试剂和第二试剂组成；本实施例与实施例1的区别在于：第一稀释液、第二稀释液、第三稀释液以及第四稀释液均由10mM的PBS缓冲液、0.5wt％的牛血清白蛋白以及0.02wt％的Triton X-100组成。
实施例4
本实施例提供一种唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒，唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒由第一试剂和第二试剂组成；本实施例与实施例2的区别在于：第九稀释液由10mM的PBS缓冲液、0.5wt％的牛血清白蛋白以及0.02wt％的Triton X-100组成。
实验例1
对实施例1提供的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒进行灵敏度的检测，灵敏度的检测结果如表1所示。
其中，灵敏度检测过程中的发光值采用化学发光免疫分析仪测定，发光值的测定步骤如下：(1)将精浆经20mM的PBS缓冲液稀释5倍，制成精液样本；(2)取30μL的精液样本，加入50μL的第一试剂和100μL第二试剂，混匀后，于37℃孵育10min，形成免疫复合物；(3)全自动化学发光免疫分析仪对免疫复合物进行清洗；(4)向清洗后的免疫复合物中加入100μL的预激发液和100μL的激发液，混匀后，于37℃孵育2min，使用全自动化学发光免疫分析仪检测其发光信号值；其中，预激发液含0.7wt％的过氧化物，激发液含0.3M的氢氧化钠。
灵敏度的检测方法如下：将零浓度校准品A(0ng/mL)，重复测定20次，得出20次测定的发光值，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出(M+2SD)所对应的发光值。根据零浓度校准品A测定20次发光值的均值和相邻校准品B(1ng/mL)测定3次的发光值的均值回归得出一次方程，将(M+2SD)所对应的发光值带入一次方程中，计算得出对应的浓度，即为空白限(LOB)。
表1
Figure BDA0004027806670000141
Figure BDA0004027806670000151
可见，本申请实施例1的唾液酸酶检测试剂盒的LOB为0.0318ng/mL，远小于目前行业对试剂盒灵敏度的要求(0.2ng/mL)，表明实施例1提供的唾液酸酶检测试剂盒具有高灵敏度。
实验例2
对实施例1提供的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒进行准确度的检测，准确度的检测结果如表2所示。
其中，准确度检测过程中的发光值采用化学发光免疫分析仪测定，发光值的测定步骤与实验例1相同。
回收率的计算参照如下公式：
Figure BDA0004027806670000152
式中：
R为回收率；C为回收样品的检测浓度，单位为ng/mL；Vo为被添加的待测样本的体积，单位为mL；V为添加样品的体积，单位为mL；Co为被添加的待测样本的检测浓度，单位为ng/mL；Cs为添加样品的检测浓度，为1000ng/mL。
表2
Figure BDA0004027806670000153
Figure BDA0004027806670000161
表2中，S1、S2以及S3分别为低、中和高浓度的样本。“添加前”是指：没有加入高值样品的待测样本；“添加10％高值样品后”是指：在低、中、高浓度样本中添加高值样品，且添加的高值样品的体积为待测样本总体积的10％。
从表2中可以看出，本申请实施例1的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒的回收率为96-101％，远高于目前行业对试剂盒准确度的要求(回收率：85％～115％)，表明实施例1提供的唾液酸酶检测试剂盒具有高准确度。
实验例3
对实施例1提供的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒进行线性的检测，线性的检测结果如表3所示。
其中，线性检测过程中的发光值采用化学发光免疫分析仪测定，发光值的测定步骤与实验例1相同。
线性的检测方法如下：将接近检测范围上限的高值样品按一定比例稀释为9个浓度，其中稀释的最低浓度样品应接近检测范围的下限；将稀释的9个浓度进行发光值测定，各重复测定3次，将测定浓度的平均值与理论浓度或稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数(r)。
表3
Figure BDA0004027806670000162
Figure BDA0004027806670000171
表3中，L1至L9分别为浓度由高至低的9个待测样品。
从表3中可以看出，本申请实施例1的唾液酸酶检测试剂盒的线性相关系数r为1.00，符合目前行业对试剂盒线性的要求(r≥0.99)，表明实施例1提供的唾液酸酶检测试剂盒具有宽检测范围。
实验例4
对实施例1提供的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒进行重复性的检测，重复性的检测结果如表4所示。
其中，重复性检测过程中的发光值采用化学发光免疫分析仪测定，发光值的测定步骤与实验例1相同。
重复性的检测方法如下：将一个样品重复测定10次发光值，变异系数(CV)的计算参照如下公式：
Figure BDA0004027806670000172
式中：
CV为变异系数，M为10次发光值的平均值，SD为10次发光值的标准差。
表4
Figure BDA0004027806670000173
Figure BDA0004027806670000181
从表4可以看出，本申请实施例1的唾液酸酶检测试剂盒的变异系数CV为0.9-2.7％，远低于目前行业对试剂盒变异系数CV的要求(CV≤10％)，表明实施例1提供的唾液酸酶检测试剂盒具有高重复性。
实验例5
对实施例1和实施例3提供的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒分别进行稳定性的检测，稳定性的检测结果如表5所示。
其中，稳定性检测过程中的发光值采用化学发光免疫分析仪测定，发光值的测定步骤与实验例1相同。
表5
Figure BDA0004027806670000182
Figure BDA0004027806670000191
从表5可以看出，本申请实施例1和实施例3提供的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒均具有良好的热稳定性，且实施例1提供的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒的热稳定性高于实施例3提供的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒的热稳定性。
本申请提供的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒兼具高灵敏度、高准确度、高重复性、宽检测范围以及高稳定性，可快速对精液样本中的NEU1的含量进行检测。
以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

Claims (10)

1.一种唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒，其特征在于，包括：第一试剂和第二试剂；
所述第一试剂中含有免疫磁微粒，所述免疫磁微粒为第一磁微粒和/或第二磁微粒；所述第一磁微粒为表面连接有包被物的链霉亲和素磁微粒，所述包被物为生物素酯标记的第一抗体；所述第二磁微粒为表面连接有第二抗体的羧基磁微粒；
所述第二试剂中含有发光标记物标记的第三抗体；
其中，所述第一抗体、所述第二抗体、所述第三抗体均为能够与NEU1特异性结合的抗体。
2.根据权利要求1所述的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述发光标记物选自吖啶酯、三联吡啶钌、鲁米诺以及AMPPD中的任意一种；
可选地，所述发光标记物选自吖啶酯。
3.根据权利要求1所述的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述第一磁微粒中，所述链霉亲和素磁微粒与所述包被物的质量比为100:(0.2-2)；所述包被物中，所述第一抗体与所述生物素酯的质量比为20:(1-2)；
和/或，所述第二磁微粒中，所述羧基磁微粒与所述第二抗体的质量比为100:(0.2-2)。
4.根据权利要求3所述的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述免疫磁微粒为第一磁微粒；
可选地，所述免疫磁微粒在所述第一试剂中的质量浓度为0.2-1mg/mL。
5.根据权利要求1所述的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述发光标记物标记的第三抗体中，所述第三抗体与所述发光标记物的质量比为20:(1-5)；
可选地，所述发光标记物标记的第三抗体在所述第二试剂中的质量浓度为0.05-0.5μg/mL。
6.根据权利要求3所述的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述第一试剂中还含有蛋白保护剂；
可选地，所述蛋白保护剂与所述免疫磁微粒的质量比为1:(0.4-0.8)；
可选地，所述蛋白保护剂在所述第一试剂中的质量浓度为0.5-1.0mg/mL。
7.根据权利要求6所述的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述免疫磁微粒为第一磁微粒；所述第一试剂的制备方法包括：将所述链霉亲和素磁微粒与第一稀释液混合，磁液分离后得到第一沉淀物；将所述第一沉淀物与第二稀释液混合，然后加入所述包被物混合30-60min，磁液分离后得到第二沉淀物；将所述第二沉淀物与第三稀释液混合，然后加入第一封闭液混合30-60min，磁液分离后得到第三沉淀物；将所述第三沉淀物与第四稀释液混合；
其中，所述第一稀释液、所述第二稀释液、所述第三稀释液以及所述第四稀释液各自独立地包括5-20mM的PBS缓冲液、0.1-1wt％的牛血清白蛋白、0.01-0.05wt％的Triton X-100以及0.05-0.1wt％的所述蛋白保护剂；所述第一封闭液包括0.1-0.5wt％的生物素缓冲液；
可选地，所述包被物的制备方法包括：将所述生物素酯溶于二甲基亚砜后，加入所述第一抗体混合30-60min；然后加入第一终止液混合10-30min，于PBS缓冲液中透析12-24h；其中，所述第一终止液包括0.5-1M的Tris缓冲液。
8.根据权利要求6所述的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述免疫磁微粒为第二磁微粒；所述第一试剂的制备方法包括：将所述羧基磁微粒与第五稀释液混合，磁液分离后得到第四沉淀物；将所述第四沉淀物与第六稀释液混合，加入第七稀释液混合，然后再加入所述第二抗体混合2-4h，磁液分离后得到第五沉淀物；将所述第五沉淀物与第八稀释液混合，然后加入第二封闭液混合30-45min，磁液分离后得到第六沉淀物；将所述第六沉淀物与第九稀释液混合；
其中，所述第五稀释液、所述第六稀释液以及所述第八稀释液各自独立地包括0.05-0.2M的吗啉乙磺酸缓冲液；所述第七稀释液包括15-35mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液；所述第二封闭液包括20-30mM的氨基乙酸缓冲液；所述第九稀释液包括5-20mM的PBS缓冲液、0.1-1wt％的牛血清白蛋白、0.01-0.05wt％的Triton X-100以及0.05-0.1wt％的所述蛋白保护剂。
9.根据权利要求1所述的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述第二试剂的制备方法包括：先将含有所述发光标记物与所述第三抗体的溶液于避光条件下混合30-60min；然后加入第二终止液于避光条件下混合10-30min；纯化后，将纯化后的物质溶于第十稀释液；
其中，所述第二终止液包括0.1-1wt％的赖氨酸缓冲液；所述第十稀释液包括5-20mM的PBS缓冲液、0.1-1wt％的酪蛋白以及0.01-0.05wt％的Triton X-100。
10.一种检测唾液酸酶NEU1的方法，其特征在于，所述检测唾液酸酶NEU1的方法采用权利要求1-9中任一项所述的唾液酸酶NEU1化学发光检测试剂盒；所述检测唾液酸酶NEU1的方法包括：将待测样本、所述第一试剂和所述第二试剂混合并进行第一孵育后，采用化学发光免疫分析仪进行检测；
可选地，所述检测唾液酸酶NEU1的方法还包括：所述第一孵育后，加入预激发液和激发液进行第二孵育，然后采用所述化学发光免疫分析仪进行检测；其中，所述预激发液包括0.5-1.0wt％的过氧化物；所述激发液包括0.2-0.5M的氢氧化钠；
可选地，所述第一孵育和所述第二孵育的温度各自独立地为36.5-37.5℃，所述第一孵育的时间为8-12min，所述第二孵育的时间为1-5min。
CN202211715911.3A 2022-12-29 2022-12-29 唾液酸酶neu1化学发光检测试剂盒及检测唾液酸酶neu1的方法 Pending CN116047072A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211715911.3A CN116047072A (zh) 2022-12-29 2022-12-29 唾液酸酶neu1化学发光检测试剂盒及检测唾液酸酶neu1的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211715911.3A CN116047072A (zh) 2022-12-29 2022-12-29 唾液酸酶neu1化学发光检测试剂盒及检测唾液酸酶neu1的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116047072A true CN116047072A (zh) 2023-05-02

Family

ID=86125824

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211715911.3A Pending CN116047072A (zh) 2022-12-29 2022-12-29 唾液酸酶neu1化学发光检测试剂盒及检测唾液酸酶neu1的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116047072A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108362688B (zh) 一种25羟基维生素d磁微粒化学发光检测试剂盒
CA2668001C (en) A method of immunoassaying a component to be measured in a sample containing hemoglobin
CA2978998C (en) Method and kit for measuring component to be assayed in specimen
KR20070026576A (ko) 비특이 반응이 억제된 면역 측정 방법 및 시약
EP4379377A1 (en) Magnetic bead coating, preparation method therefor, and test kit
CN112904023B (zh) 一种降钙素原化学发光免疫检测试剂盒
US5338684A (en) Stable aqueous FK506 standards
CN117434274A (zh) 一种单人份白介素6磁微粒化学发光试剂盒及其测定方法
CN116047072A (zh) 唾液酸酶neu1化学发光检测试剂盒及检测唾液酸酶neu1的方法
CN111273033A (zh) 一种高尔基体蛋白73的测定试剂盒及其化学发光测定方法
KR20010025027A (ko) 면역측정시약 및 면역측정법
CN116008524A (zh) 一种无蛋白通用型保护液及其制备方法和在真菌毒素定量检测试剂盒中的应用
CN108303543B (zh) 一种猪瘟e2蛋白抗体检测试剂盒及其检测方法
WO2024138959A1 (zh) 唾液酸酶neu1化学发光检测试剂盒及检测唾液酸酶neu1的方法
CN115902231A (zh) 用于化学发光免疫检测的抗体检测液及外泌体检测试剂盒
CN118033148B (zh) 一种用于检测抗mda5抗体的荧光免疫层析试纸条
CN114965990B (zh) 一种糖类抗原CA125表面Tn抗原检测用校准品缓冲液及其制备方法、检测试剂盒
CN114047339A (zh) 一种检测黏病毒抗性蛋白a的磁微粒发光法检测试剂盒及其制备方法和应用
CN113933497A (zh) I型胶原氨基端延长肽磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法
CN116125077A (zh) 一种活化血小板cd62p的检测试剂盒及其检测方法
CN117420306A (zh) 一种甲型流感病毒抗原的检测试剂盒及检测方法
CN113533735A (zh) 吖啶酯类似物在制备吖啶酯类似物标记抗体中的应用
CN116773794A (zh) 一种检测试剂盒及其应用
CN114578046A (zh) 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗体检测试剂
KR20020015919A (ko) 돼지 호흡기 생식기증 바이러스 ｏｒｆ5와 ｏｒｆ7 유전자재조합 단백질을 이용한 복합항원 ｅｌｉｓａ 방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination