CN116047050A - 一种高稳定性校准品、抗原检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高稳定性校准品、抗原检测试剂盒，涉及体外诊断试剂技术领域。本发明的高稳定性校准品，通过向抗原中添加具有抗原特异性的游离抗体，室温下混匀反应2‑5h，使所述游离抗体与抗原形成免疫复合物，再加入校准品缓冲液进行配制，最终得到具有高稳定性的校准品产品。本发明通过在校准品中添加与免疫检测体系中有重叠抗原结合位点但亲和力更弱的游离抗体，使抗原以稳定性更佳的免疫复合物的形式保存于校准品中。本发明提供的校准品能够有效保护抗原结构，同时不影响试剂盒对抗原的定量检测，让抗原失活的时间大幅延长，解决了医学检验领域中抗原稳定性差的问题。

Description

一种高稳定性校准品、抗原检测试剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，尤其涉及一种高稳定性校准品、抗原检测试剂盒。

背景技术

在临床医学检测领域，试剂的稳定性是体外诊断试剂产品质量的一个重要参数，特别是化学发光试剂。化学发光试剂的稳定性通常包括试剂的稳定性，校准品与质控品的稳定性等。试剂的稳定性需通过可靠的校准品进行校准后得到准确的测值，而当校准品存在稳定性不佳问题时，尤其对于一些诊断金标准，如超敏肌钙蛋白I等项目，则可能会直接影响检测结果的客观性和准确性，导致临床医师根据不正确的检查结果，做出错误的诊断或治疗。

影响蛋白稳定性的因素可粗略分为两部分：(1)蛋白自身的稳定性，这是由蛋白质本身分子结构决定，包括其物理稳定性(与结构、构象直接相关的稳定性)以及化学稳定性(是否容易发生脱酰胺、氧化、异构化、水解等化学反应)。以上因素就可能会导致蛋白的失活、聚集等现象，无法供临床使用(Trends inBiotechnology,2014,32(7),372-380)；(2)蛋白的存储环境，绝大多数蛋白试剂都是以液相形式保存在以水为溶剂的缓冲液中，维持抗体(试剂)、抗原(校准品、质控品)在溶液中的稳定性，目的是在保存过程中维持蛋白质的结构完整性和活性。也就是说，蛋白质的稳定性不但与自身结构有关，也与存储环境(pH，温度，盐离子浓度，表面活性剂等)相关，蛋白质与溶液中的溶质、溶剂的相互作用也能够影响蛋白质结构。同一个蛋白质在不同的缓冲液中，其稳定性可能差别非常大(Proteinstabilityandstorage,ThermoSCIENTIFIC)。通过分析影响蛋白质稳定性的因素，调节蛋白质储存环境，对于蛋白质的稳定性有重要的意义。

体外诊断领域，检测试剂盒中的抗原往往需要被稀释至很低的浓度，很多抗原的稳定性会受到影响，组分单一的缓冲液很难把低浓度抗原维持在稳定状态。通常我们对校准品稳定性的优化主要围绕缓冲溶液的优化方向，包括基质(血清、稀释液)、缓冲体系(MES、PB、Tris等等)、溶液pH、离子强度、金属离子浓度、蛋白酶抑制剂、保护蛋白(血清白蛋白、酪蛋白、胶原蛋白多肽等)等，从中寻找有利于提升稳定性的关键因子，并确定最佳组合浓度(US8071723B2,StableD-DimerLiquidPreparation)。对于自身稳定性良好的蛋白来说，上述组分的最优化添加可起到锦上添花的作用，而对于自身稳定性较差的蛋白，这类优化方向常常如隔靴止痒，在耗费大量的时间、人力和物力的前提下，收效甚微，不能有效提升蛋白结构稳定性。对于这类蛋白，市场上还有冻干的校准品生产工艺，而现有的冷冻干燥制备工艺，投入大、过程复杂、控制点多、对时间和人员的要求都极高，虽已极大延长产品效期，方便贮存和运输，但其复溶后的稳定性及临床使用可重复性仍存在一定的风险，并未从本质上解决抗原稳定性不佳的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有的校准品试剂稳定性差，生产工艺复杂，生产成本高。

为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：

一种高稳定性校准品，包括抗原、具有抗原特异性的游离抗体及校准品缓冲液，所述游离抗体与抗原结合形成免疫复合物。

进一步地，所述游离抗体的浓度为抗原的2-4倍。

本发明提供的一种高稳定性校准品，通过在校准品中添加过量的游离抗体，推动校准品中的抗原与游离抗体结合的平衡反应向形成免疫复合物的方向进行，减少未结合游离抗体的抗原比例，从而起到更好的对抗原的保护效果。

进一步地，所述校准品缓冲液包括缓冲液、表面活性剂、无机盐离子、稳定蛋白和防腐剂。

进一步地，所述缓冲液选自：TRIS缓冲液、磷酸盐缓冲液、MES缓冲液中的一种，浓度为50-100mmol/L；所述表面活性剂选自：吐温20、吐温80、Brij35、曲拉通100、NP40中的一种或几种，浓度为0.5-2g/L；

所述无机盐离子选自：氯化钠或氯化钾浓度为50-100mmol/L；所述稳定蛋白选自：酪蛋白或BSA，浓度为5～15g/L；所述防腐剂选自NaN₃、procline300或硫化汞，浓度为0.4～1.2g/L。

另一方面，本发明公开了一种抗原检测试剂盒，包含所述的校准品。

进一步地，所述试剂盒还包括标记抗体，所述标记抗体用可检测标记物标记。

进一步地，所述可检测标记物包括荧光标记、发光标记或固相载体标记。

进一步地，所述荧光标记，包括但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；

所述发光标记，包括但不限于鲁米诺，吖啶酯，三联吡啶钌；生物发光物质，如但不限于萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；

所述固相载体标记包括时间分辨荧光微球、纳米磁性颗粒、免疫乳胶颗粒、量子点或上转换发光颗粒。

进一步地，所述标记抗体与所述抗原的亲和力大于所述游离抗体与所述抗原的亲和力。

本发明通过在校准品中添加与免疫检测体系中有重叠抗原结合位点但亲和力更弱的游离抗体，使抗原以稳定性更佳的免疫复合物的形式保存于校准品中。

进一步地，所述标记抗体与所述游离抗体具有重叠的抗原结合位点。

本发明所述“重叠”是指有部分抗原结合位点相同。

进一步地，所述抗原检测试剂盒为化学发光检测试剂盒。

在使用所述化学发光检测试剂盒进行测定时，样本中的抗原与检测试剂充分反应，形成链霉亲和素磁珠-生物素标记抗体-抗原-碱性磷酸酶标记抗体的夹心免疫复合物，再通过洗涤磁微粒，去除未参与免疫反应的物质及其他物质；再加入化学发光底物液，与碱性磷酸酶进行酶促反应产生光子，测量相对发光强度(RLU)，从而得到准确的测量结果。

本发明所述游离抗体可以使用抗原检测试剂盒筛选得到。

进一步说明，关于所述游离抗体：

(1)所述游离抗体与检测体系中的标记抗体具有重叠的抗原结合位点，但亲和力更弱：现有免疫检测体系中，通常是以生物素标记抗体或酶标记抗体来识别抗原。本发明所述的游离抗体与生物素标记抗体或酶标记抗体由于有重叠的抗原结合位点，因此，游离抗体与检测体系中的标记抗体在和抗原的结合过程中存在竞争关系。在使用抗原检测试剂盒筛选游离抗体时，直观表现为：校准品中该株游离抗体的添加会导致信号值大幅下降，即游离抗体的添加对信号值具有抑制作用。由于游离抗体亲和力较弱，检测体系仍保留有约40％-80％的信号。此特性有助于筛选出既有对抗原的保护效果又能节约成本的游离抗体。

(2)所述游离抗体对抗原有良好的保护性：表现为校准品中添加游离抗体后，通过37℃加速7天模拟试剂1年内的加速退化，进而对稳定性性能进行评估，信号值跌幅可控在10％以内。

本发明通过在校准品中添加与免疫检测体系中有重叠抗原结合位点但亲和力更弱的游离抗体，在考虑到成本的基础上，使检测体系中的标记抗体识别的抗原结合位点在保存过程中不受破坏，以稳定性更佳的免疫复合物的形式保存于校准品中，有效保护抗原结构的同时不影响定量检测，让抗原失活的时间大幅延长。

本发明对于抗原和具有抗原特异性的游离抗体的种类并没有限制，本领域技术人员可以根据检测项目的不同，选择不同的抗原和具有抗原特异性的游离抗体。

有益效果:

本发明提供的高稳定性校准品，通过在校准品中添加具有抗原特异性的游离抗体使其形成免疫复合物，从而使抗原能够以免疫复合物的形式保存在校准品缓冲液中，从而起到保护免疫检测体系中抗体所识别抗原位点的作用，减少抗原在保存过程中因识别位点暴露而引起的蛋白损伤，提高了校准品的稳定性。本发明提供的校准品能够有效保护抗原结构，同时不影响试剂盒对抗原的定量检测，让抗原失活的时间大幅延长，解决了医学检验领域中抗原稳定性差的问题。

相比常规的优化校准品缓冲液中基质、缓冲体系、溶液pH、离子强度、金属离子浓度、蛋白酶抑制剂、保护蛋白种类与浓度等方法，本发明提供的高稳定性校准品的制备方法特异性强，可实现度高，能有效保护抗原的蛋白结构不被破坏，具有推广和应用价值。

相比将校准品直接冻干的生产工艺，本发明提供的高稳定性校准品，制备方法简单，原料确定后生产过程简易、不需要额外的设备和人力投入，临床使用中无复溶后稳定性风险，更贴合临床需求。

本发明提供的测定试剂盒校准品，添加了特异性游离抗体以保护抗原蛋白，有效稳定了抗原的蛋白结构，大幅提升校准品的稳定性，从而满足临床检测需求。

附图说明

图1是实施例1和对比例1的抗原浓度为0.05ng/mL的校准品添在1年内的实时稳定性监测数据；实施例1为添加抗体组；对比例1为无添加抗体组。

图2是实施例2和对比例2的抗原浓度为48ng/mL的校准品在1年内的实时稳定性监测数据；实施例2为添加抗体组；对比例2为无添加抗体组。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。

还应当理解，在此本发明实施例说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明实施例。如在本发明实施例说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。

实施例1-2

本实施例选择使用现有肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂盒(磁微粒化学发光法)对肌钙蛋白I校准品中待添加的游离肌钙蛋白I抗体进行筛选。

表1现有肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂盒试剂组分及浓度范围

所用现有肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂盒的具体试剂选择如下：

表2现有肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂盒试剂组分

本实施例筛选游离抗体的操作方法为：

(1)根据现有肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂盒(磁微粒化学发光法)使用的校准品与质控品浓度，使用两种方式稀释cTnI抗原浓缩液，配制cTnI抗原样本：

A.使用稀释液将cTnI抗原浓缩液直接稀释至0.05μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、和2.0μg/mL。

B.使用稀释液将添加2倍cTnI抗原浓度的待筛抗体的cTnI抗原浓缩液稀释至0.05μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、和2.0μg/mL。

(2)使用肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂分别对上述两种配制方式的cTnI抗原样本的信号进行检测，比较其光值差异，结果如下表3：

表3cTnI抗原样本的信号进行检测

表3的结果表明，待筛抗体2#和待筛抗体3#的添加对检测光值无明显影响，而待筛抗体1#的添加会导致检测体系约40％信号值的下降，说明待筛抗体1#的结合位点与检测体系中的标记抗体的抗原识别位点有部分重叠，使得三者之间形成一定的竞争关系，同时待筛抗体1#与抗原的结合能力弱于检测体系抗体，检测体系保留约60％的光值。

(3)将通过上述两种方式配制好的cTnI抗原分别放置在37℃和2-8℃7天，使用肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂盒对其进行检测，计算各组(添加/不添加抗体)加速7天的光值跌幅。结果如下表4-1至表4-4：

表4-1无抗体添加组加速7天的光值跌幅

表4-2添加待筛抗体1#组加速7天的光值跌幅

表4-3添加待筛抗体2#组加速7天的光值跌幅

表4-4添加待筛抗体3#组加速7天的光值跌幅

上述结果表明，未添加抗体组的单独的cTnI蛋白稳定性不佳，37℃加速7天最大跌幅可达38％；而添加1#抗体后，该游离抗体与cTnI蛋白结合生成免疫复合物，明显提升了校准品稳定性，保护抗原的效果显著，各点37℃加速7天跌幅可控制在10％以内，证实待筛抗体1#对抗原保护的有效性。

综上，筛选出1#抗体作为游离肌钙蛋白I抗体，具体为鼠抗人肌钙蛋白I抗体，其满足以下特性：

(1)所述游离抗体与检测体系中的标记抗体具有重叠的抗原结合位点，但结合能力更弱：表现为校准品中该株游离抗体的添加会导致信号值大幅下降，检测体系仍保留有约40％-80％的信号。

(2)所述游离抗体对抗原有良好的保护性：表现为校准中添加游离抗体后，37℃加速7天信号值跌幅可控在10％以内。

将筛选得到的鼠抗人肌钙蛋白I抗体1#作为游离抗体添加至校准品中，进行配制校准品浓缩液：选人肌钙蛋白I抗原浓度为2000ng/mL，游离抗体的添加浓度为10-20ug/mL，向人肌钙蛋白I抗原中添加了游离抗体后，在室温下混匀2-5小时，使人肌钙蛋白I抗原与该游离抗体充分反应，形成免疫复合物，再使用校准品缓冲液进行稀释，进一步配制得到不同浓度的校准品。

具体地，本发明实施例1和实施例2提供的肌钙蛋白I测定试剂盒校准品，各组分及浓度如表5。本实施例抗原浓度选自肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂盒(磁微粒化学发光法)可检测范围0.03ng/mL-50ng/mL的两个低高值点。实际操作中本领域技术人员可以根据需求选择合适的浓度，不同项目的浓度会有所差别，所以本发明对浓度并不进行限制。

表5实施例1及实施例2的校准品成分

校准品组分	实施例1	实施例2
			人肌钙蛋白I抗原	0.05ng/mL	50ng/mL
鼠抗人肌钙蛋白I抗体	0.1ng/mL	100ng/mL
			Tris缓冲液	50mmol/L	100mmol/L
表面活性剂	0.5g/L	2g/L
			无机盐离子	50mmol/L	100mmol/L
稳定蛋白	5g/L	15g/L
			防腐剂	0.4g/L	1.2g/L
溶剂为纯化水	溶剂为纯化水	溶剂为纯化水

对比例1：

一种肌钙蛋白I测定试剂盒校准品，与实施例1的区别在于，对比例1未添加鼠抗人肌钙蛋白I抗体。

对比例2：

肌钙蛋白I测定试剂盒校准品，与实施例2的区别在于，对比例2未添加鼠抗人肌钙蛋白I抗体。

对实施例1及对比例1，实施例2及对比例2的校准品进行稳定性测试，实时监测其在4℃的保存条件下储存1年的情况，在第2、4、6、8、12个月时取样检测，得到实时稳定性测试结果，见图1-图2。

根据图1、图2的结果可知，在4℃的保存条件下，实施例1和实施例2添加了抗体的校准品稳定性明显优于对对比例1和对比例2，实施例1和实施例2的校准品12个月的跌幅小于10％，证实该方法可有效保护抗原，提高校准品稳定性，满足临床检测的需求。

实施例3：

本实施例对添加肌钙蛋白I游离抗体的浓度的保护效果进行了比较。其操作方法为：

(1)根据实施例1-2中现有肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂盒(磁微粒化学发光法)使用的校准品与质控品浓度，使用以下三种方式稀释cTnI抗原浓缩液，配制cTnI抗原样本：

A.使用稀释液将cTnI抗原浓缩液直接稀释至0.05μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、和2.0μg/mL。

B.使用稀释液将添加2倍cTnI抗原浓度的待筛抗体的cTnI抗原浓缩液稀释至0.05μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、和2.0μg/mL。

C.使用稀释液将添加4倍cTnI抗原浓度的待筛抗体的cTnI抗原浓缩液稀释至0.05μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、和2.0μg/mL。

(2)将通过上述三种方式配制好的cTnI抗原分别放置在37℃和2-8℃7天，使用肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂盒对其进行检测，计算各组加速7天的光值跌幅，模拟不同浓度下肌钙蛋白I游离抗体对抗原的保护效果。结果如下：

表6-1未添加肌钙蛋白I游离抗体对抗原的保护效果

表6-2添加2倍抗原浓度的肌钙蛋白I游离抗体对抗原的保护效果

表6-3添加4倍抗原浓度的肌钙蛋白I游离抗体对抗原的保护效果

以上结果表明，添加2-4倍的游离肌钙蛋白I游离抗体的抗原在37℃加速7天后信号跌幅均在10％以内，证实游离抗体1#的添加浓度在抗原浓度2-4倍的条件下，对抗原保护的有效性。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。

以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内，例如其他检测项目的选择，不局限于肌钙蛋白I；或者该校准品并不局限于应用在抗原检测中，其在抗体检测中理论上根据抗原抗体的平衡反应，也是能够应用的。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种高稳定性校准品，其特征在于，包括抗原、具有抗原特异性的游离抗体及校准品缓冲液，所述游离抗体与抗原结合形成免疫复合物。

2.如权利要求1所述的高稳定性校准品，其特征在于，所述游离抗体的浓度为抗原2-4倍。

3.如权利要求1或2所述的高稳定性校准品，其特征在于，所述校准品缓冲液包括缓冲液、表面活性剂、无机盐离子、稳定蛋白和防腐剂。

4.如权利要求3所述的高稳定性校准品，其特征在于，所述缓冲液选自：TRIS缓冲液、磷酸盐缓冲液、MES缓冲液中的一种，浓度为50-100mmol/L；

所述表面活性剂选自：吐温20、吐温80、Brij35、曲拉通100、NP40中的一种或几种，浓度为0.5-2g/L；

所述无机盐离子选自：氯化钠或氯化钾，浓度为50-100mmol/L；

所述稳定蛋白选自：酪蛋白或BSA，浓度为5～15g/L；

所述防腐剂选自NaN₃、procline300或硫化汞，浓度为0.4～1.2g/L。

5.一种抗原检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-4任意一项所述的校准品。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标记抗体，所述标记抗体用可检测标记物标记。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述可检测标记物包括荧光标记、发光标记或固相载体标记；

所述荧光标记，包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；

所述发光标记，包括鲁米诺、吖啶酯、三联吡啶钌、萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；

所述固相载体标记包括时间分辨荧光微球、纳米磁性颗粒、免疫乳胶颗粒、量子点或上转换发光颗粒。

8.如权利要求5-7任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述标记抗体与所述抗原的亲和力大于所述游离抗体与所述抗原的亲和力。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述标记抗体与所述游离抗体具有重叠的抗原结合位点。

10.如权利要求5-7任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为化学发光检测试剂盒。

Images