CN1160464C - 基因重组制备人肌红蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为基因重组制备人肌红蛋白的方法，包括RT-PCR技术制备人肌红蛋白基因的过程、重组表达质粒的构建过程、重组表达质粒导入宿主大肠杆菌、纯化的目的基因在转化体表达的过程和表达产物纯化鉴定的过程，重组表达质粒所用的质粒为pET-21a(+)，所用的大肠杆菌选用BL21DE3菌株。该方法在插入基因片段两端设计了双酶切位点的人工接头，保证了正确的插入方向，使重组表达质粒的构建可一次完成，操作更快速、方便、简单，相对现有技术大大缩短了制备生产的时间；表达产物正确、特异、稳定、高效，纯化的人肌红蛋白能与抗人肌红蛋白单抗特异反应，证明纯化产物保持了其天然活性，因而，本发明为制备人肌红蛋白及其单抗奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因重组技术，与大量人工制备人肌红蛋白有关，具体为利用基因重组技术制备人肌红蛋白的方法。
背景技术
人肌红蛋白(myoglobin，Mb)由一条分子量17.8Kda的肽链组成，含一个血红素，作为贮存氧的载体存在于人心肌、骨骼肌中，是心肌和骨骼肌中的主要蛋白之一。人肌红蛋白基因在相关文献及基因库(Genebank)中已有记载，其全长10.4Kb，由3个外显子和2个内含子组成，并且在5’和3’端分别含有70bp和531bp非翻译区序列[AkaboshiE.Cloning of the human myoglobin gene.Gene，1985；33：241-249；WellerP，Jeffreys AJ，Wilson V&Blanchetot A.Organization of the humanmyoglobin gene.The EMBO.1984；3(2)：439-446]。
由于提取组织肌红蛋白有限及其分子的低分子量给大量获得肌红蛋白带来很大困难。经检索，美国医学索引[Natl.Acad.Sci.USA.1985；82：5681-5684](记录号06196066)记载了有关人肌红蛋白基因重组表达的研究，其利用λ噬菌体、pAS1质粒等作克隆载体，需经过4次重组，以融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行表达，但其制备的重组肌红蛋白翻译区仅有390bp(基因库中为462bp)，表达产物不完整，而且氨基酸序列有误，操作复杂，并且表达效率低。美国专利US5888766也公开了一种通过基因重组技术制备人肌红蛋白的方法，但其所需的人肌红蛋白的基因是用DNA合成仪通过化学合成方法得到的，然后再经修饰与载体重组，它用色氨酸启动子质粒和大肠杆菌JM109作载体进行重组表达，从其DNA序列和所表达蛋白的氨基酸序列分析，有8个氨基酸与文献及基因库(Genebank)的记载不符。而国内涉及肌红蛋白制备的方法大多为直接从组织中用物理化学方法提取纯化，采用基因重组表达制备人肌红蛋白的文献尚未见报道。
发明内容
本发明为解决现有技术存在的上述缺陷，提供一种新的、表达正确、简单的利用基因重组技术制备人肌红蛋白的方法。
本发明是采用如下技术方案实现的：基因重组制备人肌红蛋白的方法，包括从组织抽提总RNA、总RNA反转录成cDNA、加入上下游引物进行PCR扩增步骤的RT-PCR技术制备人肌红蛋白基因(cDNA)的过程、包括将所制备的人肌红蛋白基因片段、载体质粒双酶切、酶切产物纯化连接步骤的重组表达质粒的构建过程、重组表达质粒导入宿主大肠杆菌、纯化的目的基因在转化体表达的过程和表达产物纯化鉴定的过程，本发明在人肌红蛋白基因的制备过程中所采用的RT-PCR技术是现有公知的制备基因的技术，其中涉及的上下游引物，在被制备的基因结构已知的情况下，其DNA序列的设计是公知技术；由于人肌红蛋白的基因结构是公知的，因此，本发明在RT-PCR技术中加入的上下游引物的DNA序列设计对本领域技术人员来讲无需创造性劳动。本发明在RT-PCR技术中需要特定的扩增参数，其基因制备过程中的扩增参数为：变性：93-95℃1-3min，退火：60-68℃30-60s，延伸：68-72℃30-60s，该过程进行35次循环，在不同的循环过程温度和时间可在上述的范围内进行调整。重组表达质粒所用的质粒为pET-21a(+)，该载体质粒是由Novagen公司生产、销售的公知产品，所用的宿主大肠杆菌选用BL21DE3菌株，该菌株是一种非常常用的微生物，可以容易地从多种途径获得，至少可以向销售代理商——北方同正生物技术发展公司购买由Stratagene公司生产的该菌株(产品目录号：#200131)，或Novagen公司生产的同类产品(产品目录号：C602003)。选择pET载体质粒和BL21DE3菌株进行重组表达，其优点为：该质粒含有强启动子(T7启动子)，利用IPTG诱导T7聚合酶，显著提高目的基因表达水平；由于宿主菌不表达0mpt和Lon蛋白酶，因此表达产物比较稳定，不会被宿主菌蛋白水解酶所降解；该质粒在大肠杆菌的高效表达，便于使用多种方法进行鉴定和纯化；该质粒具有表达His5-Tag结构，为应用Ni柱亲和层析，快速纯化表达产物提供了方便、经济的手段。
重组表达质粒构建过程中，为提高基因与载体质粒的连接机率，纯化的目的基因和载体质粒的酶切产物以3∶1的比例相混合。
本发明所述的方法在插入基因片段两端设计了双酶切位点的人工接头，保证了正确的插入方向，使重组表达质粒的构建可一次完成，操作更快速、方便、简单，相对现有技术大大缩短了制备生产的时间；表达产物正确、特异、稳定、高效，纯化的人肌红蛋白能与抗人肌红蛋白单抗特异反应，证明纯化产物保持了其天然活性，因而，本发明所述的方法建立了人肌红蛋白基因的大肠杆菌表达株，所表达人肌红蛋白是正确的，亦为制备人肌红蛋白及其单抗奠定了基础。
附图说明
图1为人肌红蛋白基因片段的RT-PCR扩增结果；
图2为人肌红蛋白RT-PCR产物DNA序列测定结果；
图3为重组质粒酶切分析结果；
图4为重组质粒DNA测序结果；
图5为大肠杆菌BL21DE3中重组质粒表达产物的SDS-PAGE分析；
图6为纯化后的人肌红蛋白SDS-PAGE分析；
具体实施方式
实施例1
1、经RT-PCR扩增肌红蛋白cDNA
从新鲜骨骼肌用Trizol等试剂抽提总RNA，经紫外分光光度仪测定RNA浓度及纯度，变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性。用提取的总RNA反转录成cDNA，以此为模板，加入内对照β-actin、肌红蛋白上下游引物进行PCR扩增，所加入的Mb上下游引物的序列为：
P1 5’AACG
CGGATCCATGGGGCTCAGCGACGGGGA 3’(BamH I)
P2 5’ATCGG
CTCGAGGGTGGGGGTGGGAGCGGCA 3’(Xho I)扩增反应参数：变性：94℃2min，退火：63℃30s，延伸：70℃45s，进行35个循环。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定(结果见图1)并送上海生工生物工程公司进行DNA序列测定(结果见图2)。从图1中可以看出，在500bp附近有一条清晰条带，与预期产物511bp相符。从图2可见，经DNA序列分析与Genebank检索的肌红蛋白序列一致，测序结果480bp(除31个上游引物未测出，包括下游引物全部序列)正确。
2、重组表达质粒的构建
RT-PCR产物提纯的片段、载体质粒均经BamH I/Xho I 37℃双酶切过夜，酶切产物纯化后二者以3∶1浓度加入并加入T4 DNA连接酶14℃孵育过夜。
3、纯化的目的基因导入宿主大肠杆菌BL21DE3及重组表达质粒的鉴定
上述连接产物即表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21DE3，在含氨苄的LB平板上筛选出阳性克隆。取阳性克隆进行扩增，并从细菌中抽提重组质粒，用限制性核酸内切酶BamH I和Xho I进行酶切，琼脂糖凝胶电泳和测序分析鉴定该重组质粒是否含有插入片段及正确阅读框架(结果见图3，4)。从图3中看出，pET-21a(+)质粒大小为5443bp，通过T4 DNA连接酶连接后的重组表达质粒应为5942bp。挑取重组阳性克隆，经BamHI/Xho I双酶切后，在5kb及500bp附近分别有一条带，与载体质粒pET-21a(+)质粒及肌红蛋白片段大小相吻合。证明重组质粒含有插入片段。从图4中看出，重组质粒DNA序列分析结果与设计时预期的完全相同
4、纯化的目的基因在转化体中的表达及SDS-PAGE电泳分析
挑取正确插入克隆，接种于含100μg/ml氨苄的LB培养基中，37℃振荡培养16hrs，以1∶200比例接种于新鲜的含氨苄LB培养基中，37℃振荡培养3hrs至OD600＝0.8-1.0，取部分菌液作为诱导前对照，然后加入终浓度为1mmol/L的IPTG(异丙基硫代β-D-半乳糖苷)，在37℃振荡培养中诱导工程菌表达，分别于诱导3、6、12hrs取样，以未转化的BL21DE3空菌为对照，细菌经离心沉淀收获，经超声裂解细菌，然后14000rpm/min离心，分别取上清和沉淀经15％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R250染色，结果经Kodak Digital Science 1D凝胶成象系统扫描分析确定其分子量及蛋白表达量(结果见图5)。图5可以看出，诱导菌在分子量14.4和20.1KDa间比非诱导菌多一条蛋白条带，这与肌红蛋白预计分子量基本相符，诱导蛋白主要存在于上清中，沉淀中也有存在。图5中，Lane1、2、10为诱导12、6、3h上清，Lane3、4、5为诱导12、6、3h沉淀，Lane7、8、11为诱导前上清和沉淀，Lane9、12为空菌对照上清与沉淀，lane 6为蛋白标准分子量。
阳性克隆菌经含氨苄LB37℃振荡培养，IPTG诱导，离心沉淀收集细胞，用溶解缓冲液溶解处理细胞，并剪切DNA，经尿素沉淀，透析袋透析，硫酸铵盐析等方法提取分离Mb，最后用PEG4000浓缩，经SDS-PAGE电泳分析其纯度和分子量(结果见图6)。图6可见经纯化的肌红蛋白只有一条蛋白带，无任何杂带，所表达肌红蛋白分子量为17.8Kda。用抗人肌红蛋白进一步鉴定，证明纯化的人肌红蛋白能与抗人肌红蛋白单抗特异反应，证明所表达的肌红蛋白正确。
实施例2
该实施例除扩增反应参数外，其它与实施例1相同。该实施例的扩增反应参数为：变性：94℃1min、退火：60℃45s、延伸：68℃30s进行5个循环，变性：94℃1min、退火：65℃45s、延伸：68℃30s进行30个循环。本实施例的DNA扩增结果及表达效果与实施例1完全相同
实施例3
该实施例的扩增反应参数与其它的实施例不同。其扩增反应参数为：变性：94℃3min，退火：68℃60s，延伸：72℃60s，进行35个循环。本实施例与其它实施例具有同样的结果和效果。
Claims (2)
1、一种基因重组制备人肌红蛋白的方法，包括从组织抽提总RNA、总RNA反转录成cDNA、加入上下游引物进行PCR扩增步骤的RT-PCR技术制备人肌红蛋白基因的过程、包括将所制备的人肌红蛋白基因片段、载体质粒双酶切、酶切产物纯化连接步骤的重组表达质粒的构建过程、重组表达质粒导入宿主大肠杆菌、纯化的目的基因在转化体表达的过程和表达产物纯化鉴定的过程，其特征为：
其基因制备过程中的扩增参数为：变性：93-95℃1-3min，退火：60-68℃30-60s，延伸：68-72℃30-60s，该过程进行35次循环；
重组表达质粒所用的质粒为pET-21a(+)；
所用的宿主大肠杆菌选用BL21DE3菌株。
2、如权利要求1所述的基因重组制备人肌红蛋白的方法，其特征为：纯化的目的基因和载体质粒的酶切产物以3∶1的比例相混合。
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