CN116042930A - Ppv7荧光定量pcr检测的引物和探针及试剂盒 - Google Patents
Ppv7荧光定量pcr检测的引物和探针及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了PPV7荧光定量PCR检测的引物和探针及试剂盒。所述PPV7‑F、PPV7‑R、PPV7‑P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~3所示。基于本发明引物和探针建立的荧光定量PCR检测方法对猪细小病毒7型的检测灵敏度可达到1.76copies/μl，表明该方法具有良好的敏感性。本发明所建立的方法与PRV、TGEV、PEDV、PRoV、JEV、PPV1型、PRRSV及CSFV等病毒核酸均无交叉反应，具有良好的特异性，组间变异系数小于2%，重复性和稳定性良好。本方法可在1h内完成PPV7的检测，并能同时进行大批量的样本检测，可以实现对猪细小病毒7型快速检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及PPV7荧光定量PCR检测的引物和探针及试剂盒。
背景技术
猪细小病毒病(Porcine Parvovirus，PPV)又称猪繁殖障碍病，极易与猪瘟、蓝耳病、猪伪狂犬病等混合感染，不同年龄段及性别猪均易感。该病毒主要通过胎盘垂直传播，并且公猪带毒配种对母猪及胎儿感染影响巨大，有研究发现可在公猪的精液、精索、附睾、性腺中分离到该病毒。感染PPV后主要临床症状表现为怀孕母猪流产、产死胎、木乃伊胎，仔猪生长受阻、皮炎、非化脓性心肌炎和消瘦综合征等。
2016年Palinski等通过宏基因组测序首次在美国健康成年猪的肛拭子中发现一种猪细小病毒新成员7型猪细小病毒(PPV7)。2017年，韩国一家养猪场的流产胎儿组织与育肥猪中也发现PPV7。同年，我国研究人员对2014年从广东省某商业化猪场收集的血清样本进行检测，其中PPV7检出率为32.8％，与美国流行毒株具有高度同源性，说明PPV7早已感染我国猪群。随后，中国、波兰、瑞典各地均出现有关PPV7的报道，提示PPV7在世界范围内开始流行。
目前虽然针对PPV7建立了相关的PCR方法，但基于TaqMan探针的PPV7的荧光定量PCR检测方法较少。而普通PCR方法存在着灵敏度低、产物需通过凝胶电泳实验进行鉴定等缺点。因此迫切需要一种能够快速鉴定PPV7的荧光定量PCR检测方法。
发明内容
鉴于PPV7的高感染率，而目前针对PPV7检测技术手段的缺乏，本发明提供一种PPV7荧光定量PCR检测的引物和探针及试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
猪细小病毒7型荧光定量PCR检测的引物和探针，包括PPV7的上游引物PPV7-F、下游引物PPV7-R和探针PPV7-P组成；所述PPV7-F、PPV7-R、PPV7-P的核苷酸序列如下：
PPV7-F：GACCTGCCGAGAACACCCA(SEQ ID NO:1)
PPV7-R：TGCGAACGAACACACCGTCAG(SEQ ID NO:2)
PPV7-P：FAM-ACGACCAACCACGCGCCCTG-BHQ1(SEQ ID NO:3)
所述探针带有可检测的标记，为自身淬灭探针，PPV7-P 5’端带有FAM荧光发射基团，3’端带有BHQ1荧光淬灭基团。
猪细小病毒7型荧光定量PCR检测试剂盒，由以下成分组成：PPV7-F、PPV7-R和PPV7-P，阳性对照，标准质粒pMD-PPV7，阴性对照，双蒸水，探针法荧光定量预混试剂TaqManmultiplex qPCR master mix。
所述标准质粒pMD-PPV7的拷贝数为1.76×1010拷贝/μl。
所述阴性对照为Rnase-free ddH2O，所述阳性对照为PPV7基因片段的质粒。
基于本发明引物和探针建立的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
1)提取待检样品DNA
2)配置荧光定量PCR反应体系，体系如下：TaqMan multiplex qPCR master mix10μl，PPV7上下游引物(10μM)各1μl，PPV7探针(10μM)0.8μl，模板DNA2μl，加入双蒸水将体系补足至20μl。
3)荧光定量PCR反应条件如下：37℃2min，95℃30s，(95℃10s，60℃30s)共设置40个循环。
本发明的有益效果：基于本发明引物和探针建立的荧光定量PCR检测方法对于猪细小病毒7型的检测灵敏度可达到1.76copies/μl，表明该方法具有良好的敏感性，而且与猪伪狂犬病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行型腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRoV)、乙型脑炎病毒(JEV)、猪细小病毒1型(PPV1)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪瘟病毒(CSFV)均无交叉反应，具有良好的敏感性和特异性。组间变异系数小于2％，重复性和稳定性良好。本方法可在1h内完成PPV7的检测，并能同时进行大批量的样本检测，可以实现对猪细小病毒7型快速检测。
附图说明
图1是猪细小病毒7型阳性病料单项PCR扩增结果，其中，M:DNA分子质量标准；1：猪细小病毒7型阳性病料扩增结果；2：阴性对照。
图2是实时荧光定量PCR标准曲线的建立及PPV7标准曲线；其中，1：1.76×106拷贝/μl的标准品；2：1.76×105拷贝/μl的标准品；3：1.76×104拷贝/μl的标准品；4：1.76×103拷贝/μl的标准品；5：1.76×102拷贝/μl的标准品；6：1.76×101拷贝/μl的标准品；7：阴性对照。
图3是实时荧光定量PCR检测方法的特异性试验结果，其中，1：PPV7阳性核酸；2：PRV阳性核酸；3：TGEV、PEDV、PRoV的三阳性核酸；4：CSFV阳性核酸；5：PRRSV阳性核酸；6：JEV阳性核酸；7：PPV1阳性核酸；8：阴性对照。
图4是实时荧光定量PCR检测方法的敏感性试验结果，其中，1：1.76×106拷贝/μl的标准品；2：1.76×105拷贝/μl的标准品；3：1.76×104拷贝/μl的标准品；4：1.76×103拷贝/μl的标准品；5：1.76×102拷贝/μl的标准品；6：1.76×101拷贝/μl的标准品；7：1.76×100拷贝/μl的标准品；8：1.76×10-1拷贝/μl的标准品；9：阴性对照；
具体实施方式
1材料与方法
1.1病毒株及临床样品来源
猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)活疫苗、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastro enteritis virus,TGEV)弱毒华毒株、猪流行型腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)CV777株及猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PRoV)NX株均购自吉林正业生物制品股份有限公司；乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus,JEV)灭活疫苗及猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)1型灭活疫苗均购自山东绿都生物制品有限公司；猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus,PRRSV)CH-1R株购自哈尔滨维科生物技术有限公司；猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)兔化弱毒株购自广东永顺生物制药股份有限公司；临床阳性样品均由龙岩学院动物医学研究所鉴定后于-80℃保存。
1.2主要试剂与仪器
柱法病毒总核酸(DNA/RNA)提取试剂盒(货号D3191-02C)购自广州美基生物科技有限公司；2×TaqMan multiplex qPCR master mix(货号1120ES)购自翌圣生物科技股份有限公司；2×Taq Master Mix、质粒小量抽提试剂盒(货号DC201-01)、DH5α感受态细胞、反转录试剂(货号312-01/02)及pMD-19T载体均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；DL500DNAMarker购自宝生物工程(大连)有限公司；Roche LightCycler480Ⅱ实时荧光定量PCR仪购自瑞士罗氏公司；ABI Veriti96孔梯度PCR仪购自ABI公司；NanoDrop ND-2000C微量分光光度计购自美国Thermo Fisher生物公司。
1.3引物设计及合成
根据GenBank上已公布的PPV7全基因序列，利用MEGA7进行序列对齐，针对PPV7基因组的保守序列分别设计两对引物和探针(PPV7Tq1、PPV7Tq2)，及文献公布的荧光定量PCR检测法中的引物和探针(PPV7Tq3)，委托上海生工生物工程股份有限公司合成。引物及探针均稀释至10μmol/L以备用。引物和探针信息见表1。
表1引物和探针信息
1.4病毒核酸提取
根据柱法病毒总核酸(DNA/RNA)提取试剂盒(货号D3191-02C)说明书提取PPV7阳性病料及PRV、TGEV、PEDV、PRoV、CSFV、PRRSV、JEV、PPV1疫苗的基因组DNA/RNA，DNA置于-20℃保存；根据反转录试剂说明书将提取的TGEV、PEDV、PRoV，CSFV、PRRSV及JEV基因组RNA反转录为cDNA，-20℃保存。
1.5猪细小病毒7型质粒标准品的制备
采用PPV7-F/R引物对PPV7阳性样品进行PCR扩增，反应体系为：2×Taq MasterMix 12.5μl，引物对2μl，样品DNA 2μl，ddH2O 8.5μl，总反应体系为25μl。反应程序均为：95℃预变性5min；循环反应包括95℃30s、58℃30s、，共设置35个循环；72℃充分延伸10min。将扩增的目的片段回收后克隆至pMD-19T载体，构建质粒经鉴定正确后命名为pMD-PPV7。质粒送至广东睿博兴科生物科技有限公司进行测序。确定序列正确性后使用质粒小量抽提试剂盒(货号DC201-01)说明书提取质粒pMD-PPV7。NanoDrop ND-2000C微量分光光度计测量质粒浓度，并根据公式[拷贝数＝质粒浓度×10-9×6.02×1023/(660×质粒长度)]计算其拷贝数。将质粒pMD-PPV7作10倍梯度稀释，于-20℃保存备用。
1.6荧光定量PCR检测方法的优化
荧光定量PCR扩增总体系为20μl，对引物浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1μmol/L)、探针浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1μmol/L)、延伸温度(56、58、60、62℃)、延伸时间(15、25、30、35s)及DNA模板量(0.5、1、1.5、2μl)进行优化，根据荧光曲线、荧光强度及Ct值以确定荧光定量PCR扩增程序的最佳优化条件。
1.7荧光定量PCR方法的特异性试验
分别以PRV、TGEV、PEDV、PRoV、CSFV、PRRSV、JEV、PPV1、PPV7的核酸为模板，并设立阴性对照，采用已优化的反应条件进行荧光定量PCR扩增，检测特异性。
1.8荧光定量PCR检测方法的敏感性试验
分别以1.76×106拷贝/μl～1.76×10-1拷贝/μl的质粒为模板，应用已优化的反应条件进行荧光定量PCR扩增，检测灵敏性。
1.9荧光定量PCR的重复性试验
分别以1.76×106拷贝/μl～1.76×102拷贝/μl的质粒为模板，应用已优化的反应条件进行荧光定量PCR扩增，组内重复性试验：每个梯度设置3个重复；组间重复性试验：进行3次试验；计算平均值、标准差和变异系数，检测重复性。
2结果
2.1引物对符合率验证
三对荧光定量PCR引物和探针与常规PCR进行符合率比对，其中PPV7Tq1与常规PCR符合率为90％，PPV7Tq2与常规PCR符合率为63.3％，PPV7Tq3与常规PCR符合率为76.67％。经验证，PPV7Tq1符合率最好，因此使用该引物和探针进行本研究。
2.2阳性标准质粒的构建
应用PPV7F/R引物对PPV7阳性病料进行单项PCR扩增，单项PCR扩增产物特异性条带大小约为1400bp(图1)。将扩增产物链接至pMD-19T载体，挑取阳性单克隆进行测序鉴定，测序结果经NCBI Blast比对显示与PPV7现有毒株序列同源性最高，均为100％，证明重组质粒构建正确，命名为pMD-PPV7。质粒经NanoDrop ND-2000C微量分光光度计测量浓度，计算出pMD-PPV7的拷贝数为1.76×1010拷贝/μl。
2.3反应条件优化
经对荧光定量PCR反应的引物浓度、探针浓度、退火温度、退火时间及模板量进行摸索，确定最终反应体系为20μl:TaqMan multiplex qPCR master mix10μl，PPV7上下游引物(10μM)各1μl，PPV7探针(10μM)0.8μl，模板DNA 2μl，加入ddH2O将体系补足至20μl。反应程序为：37℃2min；95℃30s，循环反应包括95℃10s，60℃30s，共设置40个循环，并在60℃最后一秒设置收集荧光信号。
2.4标准曲线的构建
分别以1.76×106拷贝/μl～1.76×101拷贝/μl的质粒为模板，应用已优化的反应条件进行荧光定量PCR扩增，以拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线(图2)。结果显示Ct值与质粒浓度对数之间具有良好的线性关系，标准曲线方程为：Y1＝-3.0954х+30.444，R2＝0.9997，E＝110.40％。表明该荧光定量方法具有良好的扩增效率及相关系数。
2.5特异性试验
分别以PRV、TGEV、PEDV、PRoV、CSFV、PRRSV、JEV、PPV1、PPV7的核酸为模板，并设立阴性对照，采用已优化的反应条件进行荧光定量PCR扩增，结果显示(图3)，仅PPV7出现扩增曲线，其他病原均无扩增曲线。
2.6敏感性试验
分别以1.76×106拷贝/μl～1.76×10-1拷贝/μl的质粒为模板，应用已优化的反应条件进行荧光定量PCR扩增，结果显示(图4)，对稀释度为10-1的混合标准质粒检测未出现扩增曲线，因此判断本研究建立的双重实时荧光定量PCR方法对pMD-PPV7标准质粒的最低检出量为1.76拷贝/μl。
2.7重复性试验
分别以1.76×106拷贝/μl～1.76×102拷贝/μl的质粒为模板，应用已优化的荧光定量PCR方法进行组内与组间重复性试验，结果显示(表2)，PPV7的组内变异系数均小于1.18％，组间变异系数均小于1.62％，表明本研究建立的荧光定量PCR检测方法具有良好的重复性及稳定性。
表2重复性试验结果
Claims (4)
1.猪细小病毒7型荧光定量PCR检测的引物和探针，其特征在于，其包括PPV7的上游引物PPV7-F、下游引物PPV7-R和探针PPV7-P组成；所述PPV7-F、PPV7-R、PPV7-P的核苷酸序列如下：
PPV7-F：GACCTGCCGAGAACACCCA
PPV7-R：TGCGAACGAACACACCGTCAG
PPV7-P：ACGACCAACCACGCGCCCTG
所述探针PPV7-P的5’端进行荧光基团修饰，所述探针的3’端进行猝灭基团修饰。
2.猪细小病毒7型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，其由以下成分组成：权利要求1所述的PPV7-F、PPV7-R和PPV7-P，阳性对照，标准质粒pMD-PPV7，阴性对照，双蒸水，探针法荧光定量预混试剂TaqMan multiplex qPCR master mix。
3.根据权利要求2所述的猪细小病毒7型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述标准质粒pMD-PPV7的拷贝数为1.76×1010拷贝/μl。
4.采用权利要求1所述的引物和探针的猪细小病毒7型荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测样品DNA
2)配置荧光定量PCR反应体系，体系如下：TaqMan multiplex qPCR master mix 10μl，10μM的PPV7-F 1μl，10μM的PPV7-R 1μl，10μM的PPV7-P 0.8μl，模板DNA 2μl，加入双蒸水，将体系补足至20μl。
3)荧光定量PCR反应条件为：37℃2min；95℃30s；循环反应包括95℃10s，60℃30s，共设置40个循环，并在60℃最后一秒设置收集荧光信号。
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