CN116035007A - 一种脂肽类化合物kurstakin的应用、生物制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种脂肽类化合物kurstakin的应用、生物制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种脂肽类化合物kurstakin的应用、生物制剂及其制备方法和应用，该脂肽类化合物kurstakin为蜡质芽胞杆菌分泌；植物病害包括葫芦科植物蔓枯病、禾本科植物赤霉病和芭蕉科植物枯萎病。其优点在于，蜡质芽胞杆菌特别是蜡质芽胞杆菌AT31分泌的kurstakin对葫芦科植物蔓枯病、禾本科植物赤霉病和芭蕉科植物枯萎病具有较好的防治作用，由于脂肽类化合物kurstakin属于生物制剂，不会产生因化学农药的使用所带来的一系列破坏环境的问题，有利于推进农作物绿色有机生产的发展。

Description

一种脂肽类化合物kurstakin的应用、生物制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及农业生物防治技术领域，尤其涉及一种脂肽类化合物kurstakin的应用、生物制剂及其制备方法和应用。
背景技术
农业生产中存在种植密度过高、种植品种单一化、过度施用化肥农药、连作障碍等问题，这些问题导致植物病害愈发严重，严重影响农产品品质、威胁我国粮食安全。
尽管化学药剂可在一定程度上控制植物病害，但是在杀灭病菌的同时，环境中的有益生物及土壤中的有益微生物也会受到化学药剂的损害，某些化学药剂的使用不当或滥用甚至会造成土壤污染和化学农药残留超标等一系列严重的后果。
选育抗病品种和加强田间管理措施对防治植物病害具有一定的作用，然而抗病品种选育周期长，抗病效果受病原菌小种分化影响，抗性品系种植限制大且抗性易丧失。
生物防治避免了化学防治带来的一系列问题，与其他方法相比具有安全、有效、持久的特点。生防制剂对病害防治效果好，对人畜无毒，不污染环境，无残留；对病虫害的杀伤特异性强，不伤害天敌，有益生物，能保持生态平衡；生产原料和有效成分为天然产物易降解，可回归大自然，保证可持续发展；可用生物技术和基因工程的方法对微生物进行改良；多种因素和成分发挥作用，病原菌难以产生抗药性等众多优越性。因此，近年来利用生防微生物，尤其是生防芽胞杆菌及其天然次生代谢产物对田间植物病害进行防治已成为研究热点。
但目前对于直接拮抗植物病原真菌的蜡质芽胞杆菌群细菌的关键因子仍鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是为解决现有防治植物病害技术中的化学药剂的使用不当或滥用会造成土壤污染和化学农药残留超标，以及选育抗病品种和加强田间管理措施对防治植物病害效果不佳的技术问题，提供一种脂肽类化合物kurstakin的应用、生物制剂及其制备方法和应用，该脂肽类化合物kurstakin在有效防治植物病害的同时能够绿色环保。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
第一方面，本发明提供一种脂肽类化合物kurstakin在防治植物病害中的应用，所述脂肽类化合物kurstakin为蜡质芽胞杆菌分泌。
在其中的一些实施例中，所述蜡质芽胞杆菌为AT31，保藏编号为CGMCCNO.3128。
在其中的一些实施例中，所述植物病害包括葫芦科植物蔓枯病、禾本科植物赤霉病和芭蕉科植物枯萎病。
在其中的一些实施例中，所述葫芦科植物蔓枯病包括瓜类蔓枯病。
在其中的一些实施例中，所述瓜类蔓枯病包括西瓜蔓枯病。
在其中的一些实施例中，所述禾本科植物赤霉病包括小麦赤霉病。
在其中的一些实施例中，所述芭蕉科植物枯萎病包括香蕉枯萎病。
在其中的一些实施例中，所述植物病害还包括禾本科植物纹枯病和稻瘟病。
在其中的一些实施例中，所述禾本科植物纹枯病包括水稻纹枯病。
第二方面，本发明提供一种生防制剂，包含脂肽类化合物kurstakin，所述生防制剂通过蜡质芽胞杆菌AT31制备得到。
第三方面，本发明提供一种制备如第二方面所述的生防制剂的方法，包括以下步骤：
将蜡质芽胞杆菌AT31接种于培养基中进行培养，收集菌体，该菌体以清水稀释，得到生防制剂。
在其中的一些实施例中，包括以下步骤：
将蜡质芽胞杆菌AT31接种于LB培养基中，于26～30℃，200～240rpm培养20～28h后，收集菌体，该菌体以清水稀释至4×107～6×107CFU/mL，得到生防制剂。
在其中的一些实施例中，包括以下步骤：
将蜡质芽胞杆菌AT31接种于LB培养基中，于28℃，220rpm培养24h后，收集菌体，该菌体以清水稀释至5×107CFU/mL，得到生防制剂。
第四方面，本发明提供一种如第二方面所述的生防制剂在防治瓜类蔓枯病或小麦赤霉病或香蕉枯萎病的应用。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明的一种脂肽类化合物kurstakin的应用、生物制剂及其制备方法和应用，蜡质芽胞杆菌特别是蜡质芽胞杆菌AT31分泌的kurstakin对葫芦科植物蔓枯病、禾本科植物赤霉病和芭蕉科植物枯萎病具有较好的防治作用，由于脂肽类化合物kurstakin防治植物病害属于生物防治，其对人畜无毒，不污染环境，无残留；防治特异性强，有益生物，能保持生态平衡；生产原料和有效成分为天然产物易降解，可回归大自然，保证可持续发展，不会产生因化学农药的使用所带来的一系列破坏环境的问题，有利于推进农作物绿色有机生产的发展。
附图说明
图1是根据本发明实施例的脂肽类化合物环状Kurstakin的化学结构示意图(图中R代表不同链长的脂肪链)；
图2是根据本发明实施例的脂肽类化合物链状Kurstakin的化学结构示意图(图中R代表不同链长的脂肪链)；
图3是根据本发明实施例的AT31拮抗能力缺失突变体转座子插入位点示意图；
图4是根据本发明实施例的对AT31及AT31ΔkrsC的MALDI-TOF-MS的检测结果示意图；
图5是根据本发明实施例的AT31及AT31ΔkrsC对植物病原真菌的拮抗能力对比示意图；
【保藏信息】蜡质芽胞杆菌(Bacillus cereus)AT31，其保藏编号为CGMCCNo.3128，保藏日期为2009年06月18日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为质量百分比。除非另有定义或说明，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
实施例1
本实施例包括本发明的脂肽类化合物kurstakin在防治植物病害中的应用及以制备方法限定的该脂肽类化合物kurstakin。
一种脂肽类化合物kurstakin在防治植物病害中的应用，脂肽类化合物kurstakin为蜡质芽胞杆菌分泌。
在其中的一些实施例中，蜡质芽胞杆菌为AT31，保藏编号为CGMCCNO.3128，于2009年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
在其中的一些实施例中，植物病害包括葫芦科植物蔓枯病、禾本科植物赤霉病和芭蕉科植物枯萎病。
在其中的一些实施例中，葫芦科植物蔓枯病包括瓜类蔓枯病。进一步地，瓜类蔓枯病包括西瓜蔓枯病。
在其中的一些实施例中，禾本科植物赤霉病包括小麦赤霉病。
在其中的一些实施例中，芭蕉科植物枯萎病包括香蕉枯萎病。
在其中的一些实施例中，植物病害还包括禾本科植物纹枯病和稻瘟病。进一步地，禾本科植物纹枯病包括水稻纹枯病。
上述应用中的脂肽类化合物kurstakin，其制备方法包括：将蜡质芽胞杆菌接种于培养基中进行培养，收集菌体，以乙醇萃取，收集萃取相得到脂肽类化合物kurstakin。
在其中的一些实施例中，脂肽类化合物kurstakin的制备方法包括将蜡质芽胞杆菌AT31接种于LBGM培养基中，于34～40℃，200～240rpm培养36～60h后，取菌体冷冻抽干后，以8～12倍菌体质量的乙醇萃取，收集萃取相得到脂肽类化合物kurstakin。
进一步地，脂肽类化合物kurstakin的制备方法包括将蜡质芽胞杆菌AT31接种于LBGM培养基中，于37℃，220rpm培养48h后，取菌体冷冻抽干后，以10倍菌体质量的乙醇萃取，收集萃取相得到脂肽类化合物kurstakin。
其中，Kurstakin是一系列以氨基酸基团为特征，连接不同长度脂肪酸链的脂肽类物质，其环状化学结构示意图如图1所示，其链状化学结构示意图如图2所示，其中，R可为11-14个碳的脂肪链。
蜡质芽胞杆菌内的kurstakin是由krsE、krsA、krsB、krsC、sfp、krsD编码的蛋白质合成及分泌的一类非核糖体合成的脂肽类物质，krsE、krsA、krsB、krsC、sfp、krsD核苷酸序列见说明书核苷酸和氨基酸序列表。
实施例2
本实施例为实施例1的脂肽类化合物kurstakin的制备方法的一个变形实施例。
脂肽类化合物kurstakin的制备方法包括将蜡质芽胞杆菌AT31接种于LBGM培养基中，于34℃，200rpm培养36h后，取菌体冷冻抽干后，以8倍菌体质量的乙醇萃取，收集萃取相得到脂肽类化合物kurstakin。
实施例3
本实施例为实施例1的脂肽类化合物kurstakin的制备方法的一个变形实施例。
脂肽类化合物kurstakin的制备方法包括将蜡质芽胞杆菌AT31接种于LBGM培养基中，于40℃，240rpm培养60h后，取菌体冷冻抽干后，以12倍菌体质量的乙醇萃取，收集萃取相得到脂肽类化合物kurstakin。
实施例4
本实施例包括本发明的生防制剂及其制备方法和应用。
一种生防制剂，包含脂肽类化合物kurstakin，生防制剂通过蜡质芽胞杆菌AT31制备得到。
一种制备上述生防制剂的方法，包括以下步骤：
将蜡质芽胞杆菌AT31接种于培养基中进行培养，收集菌体，该菌体以清水稀释，得到生防制剂。
在其中的一些实施例中，该方法包括以下步骤：
将蜡质芽胞杆菌AT31接种于LB培养基中，于26～30℃，200～240rpm培养20～28h后，收集菌体，该菌体以清水稀释至4×107～6×107CFU/mL，得到生防制剂。
进一步地，该方法包括以下步骤：
将蜡质芽胞杆菌AT31接种于LB培养基中，于28℃，220rpm培养24h后，收集菌体，该菌体以清水稀释至5×107CFU/mL，得到生防制剂。
一种如上述的生防制剂在防治瓜类蔓枯病或小麦赤霉病或香蕉枯萎病的应用。
实施例5
本实施例为实施例4制备生防制剂的方法的一个变形实施例。
制备生防制剂的方法包括以下步骤：
将蜡质芽胞杆菌AT31接种于LB培养基中，于26℃，200rpm培养20h后，收集菌体，该菌体以清水稀释至4×107CFU/mL，得到生防制剂。
实施例6
本实施例为实施例4制备生防制剂的方法的一个变形实施例。
制备生防制剂的方法包括以下步骤：
将蜡质芽胞杆菌AT31接种于LB培养基中，于30℃，240rpm培养28h后，收集菌体，该菌体以清水稀释至6×107CFU/mL，得到生防制剂。
实施例7
本实施例为本发明的脂肽类化合物kurstakin在防治植物病害中的应用的验证。
(一)生防菌株AT31的分离筛选及鉴定
(1)生防菌株的筛选
菌株来源：AT31由土壤中分离得到。
菌株分离方法：取100μL稀释液依次涂布在LB培养基上，每个梯度3个重复，于28℃培养24～48h，观察挑取形态特征不同的单菌落，纯化后保存在-80℃冰箱中备用。在LB培养基上采用点接法对分离、纯化后的菌株进行筛选，通过初筛和复筛挑取抑菌圈明显的菌株。
蜡质芽胞杆菌AT31的分离筛选方法参照稀释平板涂布法，对土壤细菌进行分离：取100μL稀释液依次涂布在LB培养基上，每个梯度3个重复，于28℃培养24～48h，观察挑取形态特征不同的单菌落，纯化后保存在-80℃冰箱中备用。在LB培养基上采用点接法对分离、纯化后的菌株进行筛选，通过初筛和复筛挑取抑菌圈明显的菌株。
(2)生防菌株的鉴定
利用原核生物16SrRNA及gyrB编码基因片段序列测序方法鉴定，具体包括下述步骤：
提取对应菌株基因组，通过引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增其16SrDNA序列；
用gyrB-For(5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3')和gyrB-Rev(5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3')进行PCR扩增其gyrB序列；
PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，将目的条带所在胶块切割并送至检测公司进行测序。利用生物信息学对所测的16SrDNA和gyrB序列进行同源性分析，确定菌株种属。鉴定结果如下表1所示。
表1蜡质芽胞杆菌AT31的测序比对结果
Figure BDA0003754936690000061
由上述鉴定结果可知，菌株AT31鉴定为蜡质芽胞杆菌(Bacillus cereus)，对该菌株进行保藏，其保藏编号为：CGMCCNo.3128。
(二)蜡质芽胞杆菌随机突变体文库的构建
利用上述(一)中筛选获得的菌株AT31进行插入突变体构建，其具体步骤包括：
pIC333质粒含有一个miniTn10转座子元件，通过电转化的方法转化AT31，得到含有温度敏感型质粒的菌株。
按照以下方法进行转座子诱变：将含有质粒pIC333的菌株在25℃，即pIC333质粒在革兰氏阳性菌中能够复制的温度下，在含有壮观霉素和红霉素的LB培养基中培养至对数中期，然后将培养物以1:100稀释至新鲜仅含有壮观霉素的LB培养液中继续培养，但是将温度从25℃转变为45℃，此处原理为pIC333质粒在革兰氏阳性菌中不能复制，过夜培养。这两个步骤重复进行8～10次。最后，梯度稀释，选择合适的浓度涂布于含有有壮观霉素的LB平板上，并将平板放置于45℃过夜培养。挑取过夜培养的转化子纯化，并将抗壮观霉素但是对红霉素敏感的转化子保存。
(三)随机突变体插入位点的鉴定
根据以下方法鉴定插入突变体的转座子插入位点：
首先提取基因组DNA，由于转座子元件上不含有EcoRI和HindIII酶切位点，因此使用EcoRI或HindIII酶切基因组DNA24小时；
纯化回收，并使用T4 DNA连接酶在16℃下连接过夜；
使用42℃热击的方法将连接混合物转化到大肠杆菌DH5α，利用壮观霉素抗性筛选大肠杆菌的转化子。提取质粒，并通过使用引物miniTn10-113-98和miniTn10-2235-2249测序；
如图3所示，这两个引物序列允许从转座子插入位点的边界序列向外读取DNA序列，将得到的DNA序列在NCBI上，用AT31的基因组序列进行比对，分析插入位点为krsC基因编码序列内。
(四)MALDI-TOF-MS鉴定
为了检测野生型AR156和krsC突变体合成物质的差异，将菌株在30℃的LB琼脂平板上培养72小时；然后使用灭菌棒将细菌细胞移入含有100mL 0.1％TFA溶液的1.5mL试管中；将样品旋转30秒并孵育10分钟；将一微升样品点在样品靶表面，并风干以进行进一步测试；使用Bruker ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF质谱仪记录MALDI质谱。
为了直接显示AR156和krsC突变体的kurstakin合成能力，使用MALDI-TOF-MS检测野生型和突变体的全细胞提取物。kurstakin在菌体中的含量为40mg/g。kurstakin为包含C12及C13的kurstakin，Kurstakins的分子离子在914处为C12[M+Na+]，在928处为C13[M+Na+]，在944处为C13[M+K+]。结果如图4所示，野生型提取物的质谱图中存在kurstakin的分子离子，914处的C12[M+Na+]，928处的C13[M+Na+]，944处的C13[M+K+]，但914处的C12[M+Na+]，928处的C13[M+Na+]，944处的C13[M+K+]在突变体的提取物中并未出现，这表明插入突变阻止了krsC突变体中kurstakin的合成。
(五)突变体拮抗表型验证
将储存在4℃中的真菌菌丝挑到PDA平板上培养，等到菌丝长满平板，用无菌打孔器，沿菌落外边缘整齐得打出一个个直径为8mm的圆形菌碟。生防菌在LB培养液中，28℃，220rpm震荡培养24h。将生防菌液以清水稀释至5×107CFU/mL制备成生防菌液备用，其中，菌体含量为0.6g/L，kurstakin在生防菌剂中浓度为24mg/L。将菌碟转接至WA板的中心，在距离圆形菌碟中心相同长度处的位置点上灭菌的湿滤纸片，在滤纸片上接种生防菌菌液。将平板放在25℃培养箱中培养，每天观察真菌生长状况，并记录拮抗圈的大小。
拮抗实验结果如图5所示，蜡质芽胞杆菌AT31本身对西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.niveum)没有显著的拮抗效果，而对其他测试的病原真菌显示出显著的拮抗效果。蜡质芽胞杆菌AT31的krsC突变体丧失了对水稻纹枯病病原菌(Rhizoctoniasolani)、稻瘟病病原菌(Magnaporthe oryzae)、瓜类蔓枯病菌(Mycosphaerellamelonis)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)及香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.cubense)的拮抗能力。这些结果都说明了蜡质芽胞杆菌AT31产生的脂肽类kurstakin参与了生防菌对病原物直接拮抗。
(六)防治瓜类蔓枯病效果检测
采用(一)中AT31及(三)中AT31的krsC突变体为菌株，采用(五)中描述的菌液制备方式制备的生防菌菌液防治瓜类蔓枯病方面的验证，其具体步骤包括：
将长至两片子叶的西瓜幼苗移栽至装有2kg无菌土的花盆(19cm×13cm)中，缓苗20d。以牙签接菌法在西瓜植株第3、4片老叶及距根20cm处的茎部分别进行处理，以40ml无菌水为CK水，以20mL无菌水+20mL病原菌孢子悬浮液为CK，以20mL病原菌孢子悬浮液+20mL各菌株发酵液液为处理组，每组15株，3次重复。2周后根据Smith等的分级标准及计算方法统计病情指数及防病效果。
0级：植株健康，茎叶处无病斑，或发病叶小于1％；
1级：茎叶有小块病斑，发病叶为1％～25％；
2级：茎叶有大块病斑，发病叶为26％～50％；
3级：茎叶有大量病斑，枯萎卷曲，发病叶为51％～75％；
4级：植株有大量病斑，发病叶片为76％～90％；
5级：发病叶片占到90％以上或全株病死。
病情指数＝∑(各级病株数×相应级数)/(调查植株总数×最高级数)×100
防病效果(％)＝(CK病病情指数～处理组病情指数)/CK病病情指数×100
温室实验结果如下表2所示，AT31能够显著防治瓜类蔓枯病，而krsC的突变显著降低了AT31的防治效果。说明kurstakin具有防治瓜类蔓枯病的功能。
表2AT31及AT31ΔkrsC突变体对瓜类蔓枯病的防病作用
Figure BDA0003754936690000091
(七)防治小麦赤霉病效果检测
采用(一)中AT31及(三)中AT31的krsC突变体为菌株，采用(五)中描述的菌液制备方式制备的生防菌菌液防治小麦赤霉病方面的验证，其具体步骤包括：
利用6％的绿豆汤液体培养基制备病原菌的孢子悬浮液，调整孢子浓度至5×104CFU/mL。小麦赤霉病的生物防治试验设拮抗细菌菌液、对照处理，于扬花期均匀喷洒小麦穗，套塑料袋保湿24h后接种病原菌孢子悬浮液，每个处理30个麦穗，三次重复，喷雾保湿3d，21d后参照小麦抗赤霉病评价技术规范(NY/T 1443.4～2007)的病情分级标准调查统计病害严重度。
病害严重度＝∑(病级数×该病级植株数)/(最高病级×总植株数)
生防效果＝(对照组病害严重度－处理组病害严重度)/对照组病害严重度×100％
温室实验结果如下表3所示，AT31能够显著防治小麦赤霉病，而krsC的突变显著降低了AT31的防治效果。说明kurstakin具有防治小麦赤霉病的功能。
表3AT31及AT31ΔkrsC突变体对小麦赤霉病的防病作用
Figure BDA0003754936690000092
(八)防治香蕉枯萎病效果检测
采用(一)中AT31及(三)中AT31的krsC突变体为菌株，采用(五)中描述的菌液制备方式制备的生防菌菌液防治香蕉枯萎病方面的验证，其具体步骤包括：
病原菌用PDA培养液在25℃，150rpm条件下培养7～10天，用无菌纱布滤去菌丝得孢子悬浮液。用血球计数板测定孢子悬浮液的浓度，并将孢子悬浮液浓度调至1×107CFU/mL，备用。
选用4～5叶期的香蕉苗，生防菌处理组，每株苗用30mL浓菌液灌根处理，对照组用清水处理，每个处理6棵苗，每处理重复3次。待生防菌处理5天后，每株苗浇30mL病原菌孢子悬浮液。待蕉苗开始发病后，观察记录叶片黄化状况，病原菌处理45天后统计最终结果。
按Ploetz的病情统计分级，根据植株黄化、萎蔫状况进行病情统计：
0级：植株健康；
1级：轻度褪绿和萎蔫，叶柄不下垂；
2级：中度褪绿、萎蔫，少数叶柄下垂和/或茎基部开裂；
3级：严重褪绿、萎蔫，叶柄下垂，植株矮化；
4级：死亡。
病害严重度(％)＝[∑(病级数×该病级植株数)/(最高病级×总植株数)]×100％
生防效果(％)＝[(对照1病害严重度～处理组病害严重度)/对照1病害严重度]×100％
温室实验结果如下表4所示，AT31能够显著防治香蕉枯萎病，而krsC的突变显著降低了AT31的防治效果。说明kurstakin具有防治香蕉枯萎病的功能。
表4AT31及AT31ΔkrsC突变体对香蕉枯萎病的防病作用
Figure BDA0003754936690000101
(九)防治水稻纹枯病效果检测
采用(一)中AT31及(三)中AT31的krsC突变体为菌株，采用(五)中描述的菌液制备方式制备的生防菌菌液防治水稻纹枯病方面的验证，其具体步骤包括：
在水稻分蘖期(1个月左右)，用制备的生防菌菌液灌根、喷施50mL/盆，以清水处理作为对照。每个处理4个重复，每个重复1盆。处理5d后将打取的立枯丝核菌菌饼(在25℃、相对湿度80％的培养箱中暗培养2d，待真菌长满平板后，用打孔器从菌落外边缘均匀打取直径为8mm的菌饼)接在水稻叶鞘上，每个叶鞘接种1个菌饼，置于28℃、相对湿度80％的暗箱喷雾保湿培养，让菌丝侵染24h后，取出置于28℃，光周期为8L:16D的温室，每天喷水保持湿度，以利于水稻发病。培养6d后记录每株水稻的发病程度，计算病情指数和温室防效。发病程度参考水稻纹枯病分级标准分级：
1级：基部叶鞘发病；
2级：基部叶片发病；
3级：倒第3叶以下各叶叶鞘发病；
4级：倒第3叶以下各叶叶片发病；
5级：倒第2叶以下各叶叶鞘发病；
6级：倒第2叶以下各叶叶片发病；
7级：剑叶叶鞘；
8级：叶片发病；
9级：全株发病枯死。
病害严重度＝Σ(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)×100％
温室防效＝(对照组病情指数～处理组病情指数)/对照组病情指数×100％
温室实验结果如下表5所示，AT31能够显著防治水稻纹枯病，而krsC的突变显著降低了AT31的防治效果。说明kurstakin具有防治水稻纹枯病的功能。
表5AT31及AT31ΔkrsC突变体对水稻纹枯病的防病作用
Figure BDA0003754936690000111
(十)防治稻瘟病效果检测
采用(一)中AT31及(三)中AT31的krsC突变体为菌株，采用(五)中描述的菌液制备方式制备的生防菌菌液防治稻瘟病方面的验证，其具体步骤包括：
在水稻破口露穗期，用制备的生防菌菌液灌根、喷施50mL/盆，以清水处理作为对照。每个处理4个重复，每个重复1盆。将稻瘟菌置于CM培养基上，28℃黑光下静置培养5d。将产生的孢子用无菌水洗脱并稀释成1×105CFU/mL孢子悬浮液备用。生防菌处理5d后将稻瘟菌孢子悬浮液均匀喷施于水稻表面，置于28℃、相对湿度80％的暗箱喷雾保湿培养，让菌丝侵染24h后，取出置于28℃，光周期为8L:16D的温室，每天喷水保持湿度，以利于水稻发病。培养6d后记录每株水稻的发病程度，计算病情指数和温室防效。
稻瘟病分级标准：
0级：无病；
1级：每穗损失5％以下，或个别枝梗发病；
2级：每穗损失5.1％～20％，或1/3左右枝梗发病；
3级：每穗损失20.1％～50％，或穗颈或主轴发病；
4级：每穗损失50.1％～70％，或穗颈发病，大部分秕谷；
5级：每穗损失70％以上，或穗颈发病导致白穗。
病害严重度(％)＝100％×Σ(病植株数×病级数)/(总植株数×最高病级数)
防病效果(％)＝100％×(对照病害严重度～处理病害严重度)/对照病害严重度
温室实验结果如下表6所示，AT31能够显著防治稻瘟病，而krsC的突变显著降低了AT31的防治效果。说明kurstakin具有防治稻瘟病的功能。
表6AT31及AT31ΔkrsC突变体对稻瘟病的防病作用
Figure BDA0003754936690000121
通过(六)～(十)的效果检测可知，本发明的kurstakin可绿色环保的高效防治瓜类蔓枯病、小麦赤霉病、香蕉枯萎病、水稻纹枯病和水稻稻瘟病，且含有本发明的kurstakin的生防制剂，如AT31生防菌液在有效防治植物病害的同时能够绿色环保。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种脂肽类化合物kurstakin在防治植物病害中的应用，其特征在于，
所述脂肽类化合物kurstakin为蜡质芽胞杆菌分泌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
所述蜡质芽胞杆菌为AT31，保藏编号为CGMCCNO.3128。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
所述植物病害包括葫芦科植物蔓枯病、禾本科植物赤霉病和芭蕉科植物枯萎病。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，
所述葫芦科植物蔓枯病包括瓜类蔓枯病；和/或
所述禾本科植物赤霉病包括小麦赤霉病；和/或
所述芭蕉科植物枯萎病包括香蕉枯萎病。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，
所述植物病害还包括禾本科植物纹枯病和稻瘟病。
6.一种生防制剂，其特征在于，包含脂肽类化合物kurstakin，所述生防制剂通过蜡质芽胞杆菌AT31制备得到。
7.一种制备如权利要求6所述的生防制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将蜡质芽胞杆菌AT31接种于培养基中进行培养，收集菌体，该菌体以清水稀释，得到生防制剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将蜡质芽胞杆菌AT31接种于LB培养基中，于26～30℃，200～240rpm培养20～28h后，收集菌体，该菌体以清水稀释至4×107～6×107CFU/mL，得到生防制剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将蜡质芽胞杆菌AT31接种于LB培养基中，于28℃，220rpm培养24h后，收集菌体，该菌体以清水稀释至5×107CFU/mL，得到生防制剂。
10.一种如权利要求6所述的生防制剂在防治瓜类蔓枯病或小麦赤霉病或香蕉枯萎病的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017125583A1 (fr) * 2016-01-22 2017-07-27 Institut National De La Recherche Agronomique Souche bacterienne genetiquement modifiee produisant de la kurstakine dans le milieu de culture
CN110312425A (zh) * 2016-12-30 2019-10-08 利波法布里克公司 用于植物生长的包含脂肽的生物刺激剂组合物
CN113061559A (zh) * 2021-05-10 2021-07-02 南京农业大学 一种复合生物菌剂及其在防治水稻稻瘟病和促进水稻生长中的应用

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