CN116033920A - 大序列泛冠状病毒疫苗组合物 - Google Patents

大序列泛冠状病毒疫苗组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN116033920A
CN116033920A CN202180042301.9A CN202180042301A CN116033920A CN 116033920 A CN116033920 A CN 116033920A CN 202180042301 A CN202180042301 A CN 202180042301A CN 116033920 A CN116033920 A CN 116033920A
Authority
CN
China
Prior art keywords
composition
coronavirus
protein
cell
conserved
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180042301.9A
Other languages
English (en)
Inventor
L·本穆罕默德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of CN116033920A publication Critical patent/CN116033920A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

泛冠状病毒疫苗，其用于诱导针对所有冠状病毒感染和疾病的有效、强力和持久的保护，该疫苗包含多个高度保守的大序列，该大序列可包含一个以上保守的B细胞、CD4T细胞和CD8T细胞表位(有助于为身体提供多个靶点)以形成预防冠状病毒感染和/或疾病的免疫反应。在某些实施方式中，大序列为保守蛋白或保守大序列，例如在人类冠状病毒和/或动物冠状病毒(例如从易受冠状病毒感染的动物中分离的冠状病毒)中高度保守的序列。

Description

大序列泛冠状病毒疫苗组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年4月14日提交的美国临时申请第63/009,907号和2020年9月28日提交的美国临时申请第63/084,421号的权益，这些申请的说明书通过引用整体并入本文。
序列表
申请人声明，根据第13条之三.1(a)提交的以附件C/ST.25文本文件(题为UCI_20_06B_PCT_Sequence_Listing_ST25)形式记录的信息与所提交的国际申请的组成部分相同。序列表的内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及疫苗，例如病毒疫苗，例如针对冠状病毒的疫苗，例如泛冠状病毒疫苗。
背景技术
在过去二十年内，由新兴的人畜共患冠状病毒(CoV)导致了三次致命的CoV(SARS-CoV、MERS-CoV和最新的高传播性和致命性的SARS-CoV-2)的人类爆发，后者导致了当前的COVID-19全球大流行。所有这三种致命的CoV都来自自然宿主蝙蝠，并通过各种中间动物宿主(例如穿山甲、果子狸和骆驼)传播给人类。由于目前尚无可用的通用泛冠状病毒疫苗，因此未来几年仍然极有可能出现其他类似COVID的全球大流行病(由未知人畜共患的蝙蝠来源的SARS样冠状病毒(SL-CoV)再次扩散到未接种疫苗的人类群体中导致)。
中和抗体和抗病毒的效应CD4+T细胞和CD8+T细胞似乎对减少大多数感染的无症状患者和恢复期患者的病毒载量至关重要。然而，关于人类和蝙蝠冠状病毒株中保守的抗原情况以及B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表位库的信息非常少。
发明内容
通过确定在人类和动物冠状病毒中具有抗原性、免疫原性、保护性和保守性的抗原和表位情况，以及与无症状COVID-19患者中出现的抗性相关的B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的库、表型和功能，可为未来泛冠状病毒疫苗的开发提供参考。本发明描述了在人类体外和动物模型(例如小鼠、仓鼠和猴子)体内使用几种免疫信息学和序列比对方法和几种免疫学测定法，以确定几种具有抗原性、免疫原性、保护性的高度保守的大序列，其包括高度保守的人B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表位，例如在如下株系中高度保守：(i)在六大洲190个国家中鉴定出的超过81000种SARS-CoV-2人类株系；(ii)导致先前人类爆发“普通感冒”的6种流行CoV；(iii)从蝙蝠分离的9种SL-CoV；(iv)从穿山甲分离的9种SL-CoV；(v)从果子狸分离的3种SL-CoV；以及(vi)从骆驼分离的4种MERS株系。此外，本发明描述了交叉反应表位的鉴定：从COVID-19患者和从未暴露于SARS-CoV-2的健康个体中召回B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞；以及在“人源化”的人白细胞抗原(HLA)-DR1/HLA-A*02:01双转基因小鼠以及不表达HLA-DR-1或HLA-A*02:01单倍型的人类中诱发强烈的B细胞和T细胞反应。不同于受某些HLA单倍型限制的小表位，大序列涵盖了受大量HLA单倍型限制的几个表位，从而确定人群的大规模疫苗覆盖度，而不考虑HLA单倍型以及种族和民族。
本发明不限于用于人类的疫苗组合物。本发明包括用于其他宠物动物(例如犬、猫等)的疫苗组合物。
本发明的疫苗组合物具有提供持久的B细胞和T细胞免疫力的潜力，而与冠状病毒突变无关。这可能至少部分是由于疫苗组合物靶向高度保守的结构和非结构冠状病毒抗原，例如冠状病毒核蛋白(也称为核衣壳)，以及可能在每种人类和动物冠状病毒变体和株系中发现的具有低突变率的其他冠状病毒结构和非结构抗原。
本发明还涉及选择病毒内部的高度保守的结构(例如刺突蛋白(spike protein))和非结构(例如非刺突蛋白，例如核衣壳)冠状病毒抗原，其可以是通常不一定处于免疫系统突变压力下的病毒蛋白。
本发明提供了泛冠状病毒重组疫苗组合物，该组合物在人类、宠物和动物中可诱导广泛、强力和长效的B细胞和T细胞保护性免疫反应。
在某些实施方式中，疫苗组合物用于人类。在某些实施方式中，疫苗组合物用于动物，例如但不限于小鼠、猫、犬、非人灵长类动物、其他易受冠状病毒感染的动物、其他可用作冠状病毒感染的临床前动物模型的动物等。
如本文所用，术语“多表位”指包含超过一种B细胞和T细胞表位的组合物，其中至少：一种CD4和/或CD8 T细胞表位是MHC限制性的并被TCR识别，并且至少一种表位为B细胞表位。例如，本文的疫苗组合物可以为多表位的泛冠状病毒疫苗组合物。
如本文所用，术语“重组疫苗组合物”可指由一个以上重组基因(例如已被克隆至支持所述基因表达的一个以上系统的基因)编码的一种以上蛋白质或肽。术语“重组疫苗组合物”可指重组基因或支持所述重组基因表达的系统。
例如，本发明提供一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，该组合物包含一个以上大序列，其中，一个以上大序列中的每一个均包含如下中的至少一种：一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位；一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；和/或一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
本发明还涉及一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，该组合物包含两个以上大序列，其中，两个以上大序列中的每一个均包含如下中的至少一种：一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位；一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；和/或一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
本发明还涉及一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，该组合物包含：全刺突蛋白(whole spike protein)；以及如下中的一种或两种：一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；和/或一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
本发明还涉及一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，该组合物包含：至少一部分刺突蛋白，所述刺突蛋白的一部分包含三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)；以及如下中的一种或两种：一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
本发明还涉及一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，该组合物包含：全刺突蛋白；一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；以及一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
本发明还涉及一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，该组合物包含：至少一部分刺突蛋白，所述刺突蛋白的一部分包含三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)；一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；以及一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
本发明还涉及一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，该组合物包含编码一个以上大序列的抗原递送系统，其中，一个以上大序列中的每一个均包含如下中的至少一种：一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位；一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；和/或一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；其中，至少一种表位来自非刺突蛋白。
本发明还涉及一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，该组合物包含编码两个以上大序列的抗原递送系统，其中，两个以上大序列中的每一个均包含如下中的至少一种：一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位；一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；和/或一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
本发明还涉及一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，该组合物包含编码全刺突蛋白以及如下中的一种或两种的抗原递送系统：一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；和/或一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
本发明还涉及一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，该组合物包含抗原递送系统，该抗原递送系统至少编码：刺突蛋白的一部分，所述刺突蛋白的一部分包含三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)；以及如下中的一种或两种：一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
本发明还涉及一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，该组合物包含抗原递送系统，该抗原递送系统编码：全刺突蛋白；一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；以及一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
本发明还涉及一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，该组合物包含抗原递送系统，该抗原递送系统至少编码：刺突蛋白的一部分，所述刺突蛋白的一部分包含三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)；一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；以及一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
参照上述组合物和本文的实施方式，在一些实施方式中，非刺突蛋白为ORF1ab蛋白、ORF3a蛋白、包膜蛋白、膜糖蛋白、ORF6蛋白、ORF7a蛋白、ORF7b蛋白、ORF8蛋白、核衣壳蛋白和ORF10蛋白。
在一些实施方式中，一个以上大序列在人类和动物冠状病毒中高度保守。在一些实施方式中，一个以上大序列来源于SARS-CoV-2蛋白中的至少一种。在一些实施方式中，一个以上大序列来源于如下中的一种以上：一种以上目前流行的SARS-CoV-2人类株系或变体；一种以上先前导致人类爆发的冠状病毒；一种以上从动物中分离的冠状病毒，所述动物选自蝙蝠、穿山甲、果子狸、貂、骆驼和其他容易感染冠状病毒的动物；或一种以上导致普通感冒的冠状病毒。在一些实施方式中，一种以上目前流行的SARS-CoV-2人类株系或变体选自：株系B.1.177；株系B.1.160；株系B.1.1.7；株系B.1.351；株系P.1；株系B.1.427/B.1.429；株系B.1.258；株系B.1.221；株系B.1.367；株系B.1.1.277；株系B.1.1.302；株系B.1.525；株系B.1.526；株系S:677H；以及株系S:677P。在一些实施方式中，一种以上导致普通感冒的冠状病毒选自：229Eα冠状病毒、NL63α冠状病毒、OC43β冠状病毒和HKU1β冠状病毒。在一些实施方式中，保守的大序列选自关注的变体或感兴趣的变体。
在一些实施方式中，该组合物包含两个以上大序列。在一些实施方式中，该组合物包含三个以上大序列。在一些实施方式中，该组合物包含两个大序列。在一些实施方式中，该组合物包含三个大序列。在一些实施方式中，该组合物包含四个大序列。在一些实施方式中，该组合物包含五个大序列。
在一些实施方式中，大序列来源于结构蛋白、非结构蛋白或它们的组合。在一些实施方式中，大序列或靶表位来源于SARS-CoV-2蛋白，SARS-CoV-2蛋白选自：ORF1ab蛋白、刺突糖蛋白、ORF3a蛋白、包膜蛋白、膜糖蛋白、ORF6蛋白、ORF7a蛋白、ORF7b蛋白、ORF8蛋白、核衣壳蛋白和ORF10蛋白。
在一些实施方式中，来源于刺突糖蛋白的大序列或靶表位为RBD。在一些实施方式中，来源于刺突糖蛋白的大序列或靶表位为NTD。在一些实施方式中，来源于刺突糖蛋白的大序列或靶表位包括RBD区域和NTD区域。在一些实施方式中，来源于刺突糖蛋白的大序列或靶表位被中和抗体和封闭抗体识别。在一些实施方式中，来源于刺突糖蛋白的大序列或靶表位诱导中和抗体和封闭抗体。在一些实施方式中，来源于刺突糖蛋白的大序列或靶表位诱导识别并中和病毒的中和抗体和封闭抗体。
在一些实施方式中，来源于刺突糖蛋白的大序列或靶表位诱导识别刺突蛋白的中和抗体和封闭抗体。
在一些实施方式中，ORF1ab蛋白包含非结构蛋白(Nsp)1、Nsp2、Nsp3、Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp7、Nsp8、Nsp9、Nsp10、Nsp11、Nsp12、Nsp13、Nsp14、Nsp15和Nsp16。在一些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自：刺突糖蛋白、包膜蛋白、ORF1ab蛋白、ORF7a蛋白、ORF8a蛋白、ORF10蛋白或它们的组合。在一些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自：S2-10、S1220-1228、S1000-1008、S958-966、E20-28、ORF1ab1675-1683、ORF1ab2363-2371、ORF1ab3013-3021、ORF1ab3183-3191、ORF1ab5470-5478、ORF1ab6749-6757、ORF7b26-34、ORF8a73-81、ORF103-11和ORF105-13。在一些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：29。在一些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：30至SEQ ID NO：57。在一些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自：刺突糖蛋白、包膜蛋白、膜蛋白、核衣壳蛋白、ORF1a蛋白、ORF1ab蛋白、ORF6蛋白、ORF7a蛋白、ORF7b蛋白、ORF8蛋白或它们的组合。在一些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自：ORF1a1350-1365、ORF1ab5019-5033、ORF612-26、ORF1ab6088-6102、ORF1ab6420-6434、ORF1a1801-1815、S1-13、E26-40、E20-34、M176-190、N388-403、ORF7a3-17、ORF7a1-15、ORF7b8-22、ORF7a98-112和ORF81-15。在一些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：58至SEQ ID NO：73。在一些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：74至SEQ ID NO：105。在一些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位选自刺突糖蛋白。在一些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位选自：S287-317、S524-598、S601-640、S802-819、S888-909、S369-393、S440-501、S1133-1172、S329-363和S13-37。在一些实施方式中，一种以上冠状病毒B细胞靶表位选自SEQID NO：106至SEQ ID NO：116。在一些实施方式中，一种以上冠状病毒B细胞靶表位选自SEQID NO：117至SEQ ID NO：138。
在一些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位为大序列的形式。在一些实施方式中，大序列为全长刺突糖蛋白。在一些实施方式中，大序列为部分刺突糖蛋白。在一些实施方式中，刺突糖蛋白在氨基酸986位和987位处具有两个连续的脯氨酸取代。在一些实施方式中，刺突糖蛋白在包含Tyr-83、Tyr-489、Gln-24和Asn-487的氨基酸位置处具有单个氨基酸取代。在一些实施方式中，刺突蛋白的跨膜锚具有完整的S1-S2切割位点。在一些实施方式中，刺突蛋白处于其稳定构象。在一些实施方式中，刺突蛋白通过在S2亚基的中心螺旋顶部的氨基酸986位和987位处用脯氨酸取代而稳定。
在一些实施方式中，一个以上大序列来源于由SARS-CoV-2表达的全蛋白序列。在一些实施方式中，一个以上大序列来源于由SARS-CoV-2表达的部分蛋白序列。在一些实施方式中，来自刺突蛋白的一个以上保守的大序列来自全长刺突糖蛋白。在一些实施方式中，来自刺突蛋白的一个以上保守的大序列来自部分刺突糖蛋白。在一些实施方式中，一个以上大序列包含刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分、核蛋白或核蛋白的一部分、膜蛋白或膜蛋白的一部分，以及ORF1a/b或ORF1a/b的一部分。在一些实施方式中，一个以上大序列包含刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分、核蛋白或核蛋白的一部分，以及ORF1a/b或ORF1a/b的一部分。在一些实施方式中，刺突糖蛋白的一部分为RBD。在一些实施方式中，一个以上大序列选自：ORF1ab蛋白、刺突糖蛋白、ORF3a蛋白、包膜蛋白、膜糖蛋白、ORF6蛋白、ORF7a蛋白、ORF7b蛋白、ORF8蛋白、核衣壳蛋白和ORF10蛋白。在一些实施方式中，ORF1ab蛋白包含非结构蛋白(Nsp)1、Nsp2、Nsp3、Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp7、Nsp8、Nsp9、Nsp10、Nsp11、Nsp12、Nsp13、Nsp14、Nsp15和Nsp16。在一些实施方式中，一个以上大序列包含T细胞表位，该T细胞表位受大量人类1类和2类HLA单倍型限制，且不受1类的HLA-0201或2类的HLA-DR限制。
在一些实施方式中，大序列来源于结构蛋白、非结构蛋白或它们的组合。
本发明还涉及包含全长刺突蛋白的重组疫苗组合物。本发明还涉及包含全长刺突蛋白或部分刺突蛋白的重组疫苗组合物。
在一些实施方式中，刺突蛋白包含Tyr-489和Asn-487。在一些实施方式中，Tyr-489和Asn-487有助于与ACE-2上的Tyr 83和Gln-24相互作用。在一些实施方式中，刺突蛋白包含Gln-493。在一些实施方式中，Gln-493有助于与ACE-2上的Glu-35和Lys-31相互作用。在一些实施方式中，刺突蛋白包含Tyr-505。在一些实施方式中，Tyr-505有助于与ACE-2上的Glu-37和Arg-393相互作用。
在一些实施方式中，该组合物包含三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)序列。在一些实施方式中，三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)序列通过添加T4纤维蛋白来源的折叠三聚体化结构域来进行修饰。在一些实施方式中，添加T4纤维蛋白来源的折叠三聚体化结构域通过多价显示增加免疫原性。在一些实施方式中，该组合物编码三聚体化的SARS-CoV-2刺突糖蛋白RBD抗原以及一个以上高度保守的结构和非结构SARS-CoV-2抗原。在一些实施方式中，抗原的序列为GenBank登录号MN908947.3。在一些实施方式中，保守的大序列选自关注的变体和感兴趣的变体。在一些实施方式中，该组合物包含S1-S2切割位点中的突变682-RRAR-685→682-QQAQ-685。
在一些实施方式中，该组合物包含至少一个脯氨酸取代。在一些实施方式中，该组合物包含至少两个脯氨酸取代。在一些实施方式中，脯氨酸取代在K986位和V987位。在一些实施方式中，该组合物包含K986P突变和V987P突变。
在一些实施方式中，大序列选自SEQ ID NO：182至SEQ ID NO：185(表1)或SEQ IDNO：148至SEQ ID NO：159(表10)。
在一些实施方式中，该组合物还包含药物载体。
在一些实施方式中，接头包含T2A。在一些实施方式中，接头选自T2A、E2A和P2A。在一些实施方式中，每个开放阅读框之间设置不同接头。
在一些实施方式中，疫苗构建体用于人类。在一些实施方式中，该组合物包含人CXCL-11和IL-7或IL-2或IL-15。在一些实施方式中，疫苗构建体用于动物。在一些实施方式中，该组合物包含动物CXCL-11和IL-7或IL-2或IL-15。在一些实施方式中，动物为猫和犬。
在一些实施方式中，递送系统为腺病毒系统。在一些实施方式中，腺病毒递送系统为Ad26、Ad5、Ad35或它们的组合。在一些实施方式中，一个以上大序列与通用启动子可操作地连接。在一些实施方式中，通用启动子为CMV启动子或CAG启动子。在一些实施方式中，一个以上大序列与肺特异性启动子可操作地连接。在一些实施方式中，肺特异性启动子为SpB或CD144。在一些实施方式中，该组合物还包含T细胞吸引趋化因子(T cell attractingchemokine)。
在一些实施方式中，抗原递送系统还编码T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，抗原递送系统包括两个递送系统，其中，第二递送系统编码T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，T细胞吸引趋化因子为CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11或它们的组合。在一些实施方式中，T细胞吸引趋化因子与肺特异性启动子可操作地连接。在一些实施方式中，T细胞吸引趋化因子与通用启动子可操作地连接。在一些实施方式中，该组合物还包含促进T细胞增殖的组合物。
在一些实施方式中，抗原递送系统还编码促进T细胞增殖的组合物。在一些实施方式中，抗原递送系统包括两个递送系统，其中，第二递送系统编码促进T细胞增殖的组合物。在一些实施方式中，促进T细胞增殖的组合物为IL-7、IL-2或IL-15。在一些实施方式中，促进T细胞增殖的组合物与肺特异性启动子可操作地连接。在一些实施方式中，促进T细胞增殖的组合物与通用启动子可操作地连接。在一些实施方式中，T细胞吸引趋化因子和促进T细胞增殖的组合物由同一启动子驱动。在一些实施方式中，疫苗还编码包含T细胞吸引趋化因子和促进T细胞增殖的组合物的肽。在一些实施方式中，肽与肺特异性启动子可操作地连接。在一些实施方式中，肽与通用启动子可操作地连接。在一些实施方式中，肺特异性启动子为SpB或CD144。在一些实施方式中，通用启动子为CMV启动子或CAG启动子。
在一些实施方式中，抗原递送系统还编码分子佐剂。在一些实施方式中，抗原递送系统包括两个递送系统，其中，第二递送系统编码分子佐剂。在一些实施方式中，分子佐剂为CpG。在一些实施方式中，分子佐剂为CpG聚合物。在一些实施方式中，分子佐剂为鞭毛蛋白。在一些实施方式中，分子佐剂与启动子可操作地连接。在一些实施方式中，启动子为肺特异性启动子或通用启动子。
在一些实施方式中，大序列中的一个以上被接头隔开。在一些实施方式中，大序列中的每一个均被接头隔开。在一些实施方式中，接头的长度为2至10个氨基酸。
在一些实施方式中，重组疫苗组合物包含标签，例如一个以上大序列包含标签。在一些实施方式中，标签为His标签。
本发明还包括rVSV-泛CoV重组疫苗组合物，该组合物包含本文所述的任何疫苗组合物。
本发明还包括rAdV-泛CoV重组疫苗组合物，该组合物包含本文所述的任何疫苗组合物。
在一些实施方式中，该组合物用作疫苗。在一些实施方式中，该组合物用作预防和治疗冠状病毒感染和疾病的免疫治疗剂。在一些实施方式中，该组合物用于在受试者中预防冠状病毒疾病。在一些实施方式中，该组合物用于预防性地在受试者中预防冠状病毒感染。在一些实施方式中，该组合物在受试者体内引发免疫反应。在一些实施方式中，该组合物延长由泛冠状病毒重组疫苗组合物诱导的免疫反应，并增加T细胞向肺部的迁移。
本发明还包括泛冠状病毒重组疫苗组合物，该组合物包含SEQ ID NO：139至SEQID NO：147(表10)。
非刺突蛋白包含除刺突之外的任何冠状病毒蛋白，例如但不限于包膜蛋白、膜蛋白、核衣壳蛋白、ORF1a蛋白、ORF1ab蛋白、ORF6蛋白、ORF7a蛋白、ORF7b蛋白、ORF8蛋白等。
在某些实施方式中，本发明的组合物(例如大序列)包含一个以上保守的靶表位，例如：一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位；一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；和/或一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位。在一些实施方式中，保守的靶表位为序列比对和分析中鉴定出的5个最保守的表位(对于其表位类型，例如B细胞、CD4 T细胞、CD8T细胞)之一。在一些实施方式中，保守的靶表位为序列比对和分析中鉴定出的10个最保守的表位(对于其表位类型，例如B细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞)之一。在一些实施方式中，保守的靶表位为序列比对和分析中鉴定出的15个最保守的表位(对于其表位类型，例如B细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞)之一。在一些实施方式中，保守的靶表位为序列比对和分析中鉴定出的20个最保守的表位(对于其表位类型，例如B细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞)之一。在一些实施方式中，保守的靶表位为序列比对和分析中鉴定出的25个最保守的表位(对于其表位类型，例如B细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞)之一。在一些实施方式中，保守的靶表位为序列比对和分析中鉴定出的30个最保守的表位(对于其表位类型，例如B细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞)之一。在一些实施方式中，保守的靶表位为序列比对和分析中鉴定出的35个最保守的表位(对于其表位类型，例如B细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞)之一。在一些实施方式中，保守的靶表位为序列比对和分析中鉴定出的40个最保守的表位(对于其表位类型，例如B细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞)之一。在一些实施方式中，保守的靶表位为序列比对和分析中鉴定出的50个最保守的表位(对于其表位类型，例如B细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞)之一。序列比对和分析的实例如本文所述。例如，选择或鉴定保守的大序列的步骤或方法可首先包括对特定数量的冠状病毒序列进行序列比对和分析，以确定分析的序列组中的序列相似性或同一性。在一些实施方式中，用于比对的序列可包括人类序列和动物序列。在某些实施方式中，用于比对的序列包括一种以上目前流行的SARS-CoV-2人类株系或变体；一种以上先前导致人类爆发的冠状病毒；一种以上从动物中分离的冠状病毒，所述动物选自蝙蝠、穿山甲、果子狸、貂、骆驼和其他容易感染冠状病毒的动物；和/或一种以上导致普通感冒的冠状病毒。在一些实施方式中，保守的大序列如下进行鉴定：对特定数量的冠状病毒序列进行序列比对和分析，以确定分析的序列组中的序列相似性或同一性。保守的大序列为那些在分析中鉴定出的最高度保守的序列。例如，保守的大序列可以为鉴定出的2个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的5个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的8个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的10个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的15个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的20个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的30个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的40个最高度保守的序列。本发明不限于上述阈值。在一些实施方式中，对50个以上序列、100个以上序列、200个以上序列、300个以上序列、400个以上序列、500个以上序列、1000个以上序列、2000个以上序列、3000个以上序列、4000个以上序列、5000个以上序列、10000个以上序列、15000个以上序列、15000个以上序列等进行比对和分析。在一些实施方式中，用于比对的序列可包括人类序列和动物序列。在某些实施方式中，用于比对的序列包括一种以上目前流行的SARS-CoV-2人类株系或变体；一种以上先前导致人类爆发的冠状病毒；一种以上从动物中分离的冠状病毒，所述动物选自蝙蝠、穿山甲、果子狸、貂、骆驼和其他容易感染冠状病毒的动物；和/或一种以上导致普通感冒的冠状病毒。在一些实施方式中，一种以上目前流行的SARS-CoV-2人类株系或变体选自：株系B.1.177；株系B.1.160；株系B.1.1.7；株系B.1.351；株系P.1；株系B.1.427/B.1.429；株系B.1.258；株系B.1.221；株系B.1.367；株系B.1.1.277；株系B.1.1.302；株系B.1.525；株系B.1.526；株系S:677H；以及株系S:677P。在一些实施方式中，一种以上导致普通感冒的冠状病毒选自：229Eα冠状病毒、NL63α冠状病毒、OC43β冠状病毒和HKU1β冠状病毒。如本文所讨论，包含靶表位的一个以上保守的大序列在人类和动物冠状病毒中高度保守。对于本文的任何实施方式，所选表位可以为在结合测定(例如与HLA分子结合)中达到特定得分的那些表位。
在某些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自：刺突糖蛋白、包膜蛋白、ORF1ab蛋白、ORF7a蛋白、ORF8a蛋白、ORF10蛋白或它们的组合。在某些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自：S2-10、S1220-1228、S1000-1008、S958-966、E20-28、ORF1ab1675-1683、ORF1ab2363-2371、ORF1ab3013-3021、ORF1ab3183-3191、ORF1ab5470-5478、ORF1ab6749-6757、ORF7b26-34、ORF8a73-81、ORF103-11和ORF105-13。在某些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：29。在某些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：30至SEQ ID NO：57。
在某些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自：刺突糖蛋白、包膜蛋白、膜蛋白、核衣壳蛋白、ORF1a蛋白、ORF1ab蛋白、ORF6蛋白、ORF7a蛋白、ORF7b蛋白、ORF8蛋白或它们的组合。在某些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自：ORF1a1350-1365、ORF1ab5019-5033、ORF612-26、ORF1ab6088-6102、ORF1ab6420-6434、ORF1a1801-1815、S1-13、E26-40、E20-34、M176-190、N388-403、ORF7a3-17、ORF7a1-15、ORF7b8-22、ORF7a98-112和ORF81-15。在某些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：58至SEQ ID NO：73。在某些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：74至SEQ ID NO：105。
在某些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位选自刺突糖蛋白。在某些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位选自：S287-317、S524-598、S601-640、S802-819、S888-909、S369-393、S440-501、S1133-1172、S329-363和S13-37。在某些实施方式中，一种以上冠状病毒B细胞靶表位选自SEQ ID NO：106至SEQ ID NO：116。在某些实施方式中，一种以上冠状病毒B细胞靶表位选自SEQ ID NO：117至SEQ ID NO：138。
如前所述，在某些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位为大序列的形式，例如全刺突蛋白或部分刺突蛋白(例如全刺突蛋白的一部分)。在一些实施方式中，全刺突蛋白或其部分处于其稳定构象。在某些实施方式中，刺突蛋白(或其部分)的跨膜锚具有完整的S1-S2切割位点。在某些实施方式中，刺突糖蛋白在氨基酸986位和987位处具有两个连续的脯氨酸取代，例如用于稳定化。在某些实施方式中，刺突蛋白或其部分在氨基酸Tyr-83位处具有氨基酸取代。在某些实施方式中，刺突蛋白或其部分在氨基酸Tyr-489位处具有氨基酸取代。在某些实施方式中，刺突蛋白或其部分在氨基酸Gln-24位处具有氨基酸取代。在某些实施方式中，刺突蛋白或其部分在氨基酸位Asn-487位处具有氨基酸取代。在某些实施方式中，刺突蛋白或其部分在如下中的一个以上位置处具有氨基酸取代：Tyr-83、Tyr-489、Gln-24、Gln-493和Asn-487；例如，刺突蛋白或其部分可包含Tyr-489和Asn-487，刺突蛋白或其部分可包含Gln-493，刺突蛋白或其部分可包含Tyr-505等。Tyr-489和Asn-487可有助于与ACE-2上的Tyr 83和Gln-24相互作用。Gln-493可有助于与ACE-2上的Glu-35和Lys-31相互作用。Tyr-505可有助于与ACE-2上的Glu-37和Arg-393相互作用。
在某些实施方式中，该组合物包含S1-S2切割位点中的突变682-RRAR-685→682-QQAQ-685。在某些实施方式中，该组合物包含至少一个脯氨酸取代。在某些实施方式中，该组合物包含至少两个脯氨酸取代，例如在K986位和V987位处。
在某些实施方式中，来源于刺突糖蛋白的大序列为RBD。在某些实施方式中，来源于刺突糖蛋白的大序列为NTD。在某些实施方式中，来源于刺突糖蛋白的大序列为例如包含RBD区域和NTD区域的一个以上大序列。在某些实施方式中，来源于刺突糖蛋白的大序列被中和抗体和封闭抗体识别。在某些实施方式中，来源于刺突糖蛋白的大序列诱导中和抗体和封闭抗体。在某些实施方式中，来源于刺突糖蛋白的大序列诱导识别和中和病毒的中和抗体和封闭抗体。在某些实施方式中，来源于刺突糖蛋白的大序列诱导识别刺突蛋白的中和抗体和封闭抗体。
在某些实施方式中，在例如表位之间、大序列之间等使用接头。在某些实施方式中，接头的长度为2至10个氨基酸。在某些实施方式中，接头的长度为3至12个氨基酸。在某些实施方式中，接头的长度为5至15个氨基酸。在某些实施方式中，接头的长度为10个以上氨基酸。接头的非限制性实例包括AAY、KK和GPGPG(SEQ ID NO：186)。
在一些实施方式中，该组合物包含添加T4纤维蛋白来源的折叠三聚体化结构域。在一些实施方式中，添加T4纤维蛋白来源的折叠三聚体化结构域通过多价显示增加免疫原性。
在某些实施方式中，该组合物还包含T细胞吸引趋化因子。例如，该组合物还可以包含CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11或它们的组合中的一种或组合。
在某些实施方式中，该组合物还包含促进T细胞增殖的组合物。例如，该组合物还可以包含IL-7、IL-15、IL-2或它们的组合。
在某些实施方式中，该组合物还包含分子佐剂。例如，该组合物还可以包含CpG(例如CpG聚合物)或鞭毛蛋白中的一种或组合。
在某些实施方式中，该组合物包含标签。例如，一个以上大序列可以包含标签。在某些实施方式中，表位为两种以上抗原的形式，其中一种以上抗原包含标签。标签的非限制性实例包括His标签。
在某些实施方式中，“抗原递送系统”可以指两个递送系统，例如大序列的一部分(或诸如趋化因子等的其他成分)可以由一个递送系统编码，大序列的一部分(或其他成分)可以由第二递送系统(或第三递送系统等)编码。
参照抗原递送系统，在某些实施方式中，抗原递送系统为水疱性口炎病毒(VSV)载体。在某些实施方式中，抗原递送系统为腺病毒(例如Ad26、Ad5、Ad35等)。
大序列与启动子可操作地连接。在某些实施方式中，启动子为通用启动子(例如CMV、CAG等)。在某些实施方式中，启动子为肺特异性启动子(例如SpB、CD144)。在某些实施方式中，大序列与同一启动子可操作地连接。在某些实施方式中，一个以上大序列与第一启动子可操作地连接，一个以上大序列与第二启动子可操作地连接。在某些实施方式中，大序列与两个以上启动子可操作地连接，例如，一部分与第一启动子可操作地连接，一部分与第二启动子可操作地连接等。在某些实施方式中，大序列与三个以上启动子可操作地连接，例如，一部分与第一启动子可操作地连接，一部分与第二启动子可操作地连接，一部分与第三启动子可操作地连接等。在某些实施方式中，第一启动子与第二启动子相同。在某些实施方式中，第二启动子与第一启动子不同。在某些实施方式中，启动子为通用启动子(例如CMV、CAG等)。在某些实施方式中，启动子为肺特异性启动子(例如SpB、CD144)启动子。
在某些实施方式中，抗原递送系统或单独的抗原递送系统编码T细胞吸引趋化因子。在某些实施方式中，抗原递送系统或单独的抗原递送系统编码促进T细胞增殖的组合物。在某些实施方式中，抗原递送系统或单独的抗原递送系统编码T细胞吸引趋化因子和促进T细胞增殖的组合物。在某些实施方式中，抗原递送系统或单独的抗原递送系统编码分子佐剂。在某些实施方式中，抗原递送系统或单独的抗原递送系统编码T细胞吸引趋化因子、促进T细胞增殖的组合物和分子佐剂。在某些实施方式中，抗原递送系统或单独的抗原递送系统编码T细胞吸引趋化因子和分子佐剂。在一些实施方式中，抗原递送系统或单独的抗原递送系统编码促进T细胞增殖的组合物和分子佐剂。
在某些实施方式中，T细胞吸引趋化因子为CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11或它们的组合。在某些实施方式中，促进T细胞增殖的组合物为IL-7或IL-15或IL-2。在一些实施方式中，分子佐剂为CpG(例如CpG聚合物)、鞭毛蛋白等。
在某些实施方式中，T细胞吸引趋化因子与肺特异性启动子(例如SpB、CD144)可操作地连接。在某些实施方式中，T细胞吸引趋化因子与通用启动子(例如CMV、CAG等)可操作地连接。在某些实施方式中，促进T细胞增殖的组合物与肺特异性启动子(例如SpB、CD144)可操作地连接。在某些实施方式中，促进T细胞增殖的组合物与通用启动子(例如CMV、CAG等)可操作地连接。在某些实施方式中，分子佐剂与肺特异性启动子(例如SpB、CD144)可操作地连接。在某些实施方式中，分子佐剂与通用启动子(例如CMV、CAG等)可操作地连接。在某些实施方式中，T细胞吸引趋化因子和促进T细胞增殖的组合物由同一启动子驱动。在某些实施方式中，T细胞吸引趋化因子和促进T细胞增殖的组合物由不同的启动子驱动。在某些实施方式中，分子佐剂、T细胞吸引趋化因子和促进T细胞增殖的组合物由同一启动子驱动。在某些实施方式中，分子佐剂、T细胞吸引趋化因子和促进T细胞增殖的组合物由不同的启动子驱动。在某些实施方式中，分子佐剂和促进T细胞增殖的组合物由不同的启动子驱动。在某些实施方式中，分子佐剂和T细胞吸引趋化因子由不同的启动子驱动。
在某些实施方式中，T细胞吸引趋化因子和促进T细胞增殖的组合物被接头隔开。在某些实施方式中，接头包含T2A。在某些实施方式中，接头包含E2A。在某些实施方式中，接头包含P2A。在某些实施方式中，接头选自T2A、E2A和P2A。
参照抗原递送系统，在某些实施方式中，每个开放阅读框之间设置接头。在某些实施方式中，每个开放阅读框之间设置不同接头。在某些实施方式中，在特定开放阅读框之间可使用相同接头，而在其他开放阅读框之间可使用不同接头。
在一些实施方式中，疫苗组合物使用腺病毒施用。
本文的组合物可用于在受试者中预防冠状病毒疾病。本文的组合物可用于预防性地在受试者中预防冠状病毒感染。本文的组合物可用于在受试者体内引发免疫反应。在本文中，术语“受试者”可指人类、非人类灵长类动物、动物(例如小鼠、大鼠、猫、犬、其他易受冠状病毒感染的动物或其他用于临床前建模的动物)。本文的组合物可延长由泛冠状病毒重组疫苗组合物诱导的免疫反应，并增加T细胞向肺部的迁移。在某些实施方式中，该组合物诱导驻留记忆T细胞(Trm)。在一些实施方式中，疫苗组合物诱导针对冠状病毒疾病或感染的有效和强力的保护。在一些实施方式中，疫苗组合物诱导产生抗体(Ab)、CD4+T辅助(Th1)细胞和CD8+细胞毒性T细胞(CTL)。在一些实施方式中，促进T细胞增殖的组合物有助于促进长期免疫。在一些实施方式中，T细胞吸引趋化因子有助于将T细胞从循环拉入肺部。
在某些实施方式中，该组合物还包含药物载体。
本发明包括本文所述的任何疫苗组合物，例如用纳米颗粒(例如脂质纳米颗粒)进行递送的上述疫苗组合物。例如，本发明包括封装在脂质纳米颗粒中的本文所述的疫苗组合物。
本发明包括本文所述的组合物，该组合物包含和/或编码三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)和一个以上高度保守的SARS-CoV-2序列，SARS-CoV-2序列选自结构蛋白(例如核蛋白等)和非结构蛋白(例如Nsp4等)。在一些实施方式中，三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)序列通过添加T4纤维蛋白来源的折叠三聚体化结构域来进行修饰。在一些实施方式中，添加T4纤维蛋白来源的折叠三聚体化结构域通过多价显示增加免疫原性。
本发明还涉及生产本发明的泛冠状病毒重组疫苗组合物的方法。
例如，在一些实施方式中，该方法包括对至少一个保守的大序列进行选择，该大序列包含：一种以上冠状病毒B细胞表位；一种以上冠状病毒CD4+T细胞表位；以及一种以上冠状病毒CD8+T细胞表位。在其他实施方式中，该方法包括对至少两个保守的大序列进行选择，该大序列包含：一种以上冠状病毒B细胞表位；一种以上冠状病毒CD4+T细胞表位；以及一种以上冠状病毒CD8+T细胞表位。至少一个大序列来源于非刺突蛋白。该方法还包括合成包含所选大序列的抗原。在一些实施方式中，该方法包括对一个以上保守的大序列进行选择，该大序列包含：一种以上冠状病毒B细胞表位；一种以上冠状病毒CD4+T细胞表位；以及一种以上冠状病毒CD8+T细胞表位。至少一个大序列来源于非刺突蛋白。该方法还包括合成包含所选大序列的抗原。在一些实施方式中，该方法还包括将疫苗组合物引入药物载体。对一个以上保守的大序列进行选择的步骤在本文中公开。合成重组蛋白的方法为本领域普通技术人员熟知。疫苗组合物在本文中公开。在一些实施方式中，疫苗组合物为DNA、RNA、修饰的RNA、蛋白质(或肽)或它们的组合的形式。
在一些实施方式中，该方法包括对至少一个保守的大序列进行选择，该大序列包含：一种以上冠状病毒B细胞表位；一种以上冠状病毒CD4+T细胞表位；以及一种以上冠状病毒CD8+T细胞表位。至少一个大序列来源于非刺突蛋白。该方法还包括合成编码所选大序列的抗原递送系统。在一些实施方式中，该方法还包括将疫苗组合物引入药物载体。对一个以上保守的大序列进行选择的步骤在本文中公开。合成抗原递送系统的方法为本领域普通技术人员熟知。疫苗组合物在本文中公开。在一些实施方式中，疫苗组合物为DNA、RNA、修饰的RNA、蛋白质(或肽)或它们的组合的形式。
作为示例，选择或鉴定保守的大序列的步骤或方法可首先包括对特定数量的冠状病毒序列进行序列比对和分析，例如50个以上序列、100个以上序列、200个以上序列、300个以上序列、400个以上序列、500个以上序列、1000个以上序列、2000个以上序列、3000个以上序列、4000个以上序列、5000个以上序列、10000个以上序列、15000个以上序列、超过15000个序列等，以确定分析的序列组中的序列相似性或同一性。在一些实施方式中，用于比对的序列可包括人类序列和动物序列。在某些实施方式中，用于比对的序列包括：一种以上目前流行的SARS-CoV-2人类株系或变体；一种以上先前导致人类爆发的冠状病毒；一种以上从动物中分离的冠状病毒，所述动物选自蝙蝠、穿山甲、果子狸、貂、骆驼和其他容易感染冠状病毒的动物；和/或一种以上导致普通感冒的冠状病毒。在一些实施方式中，一种以上目前流行的SARS-CoV-2人类株系或变体选自：株系B.1.177；株系B.1.160；株系B.1.1.7；株系B.1.351；株系P.1；株系B.1.427/B.1.429；株系B.1.258；株系B.1.221；株系B.1.367；株系B.1.1.277；株系B.1.1.302；株系B.1.525；株系B.1.526；株系S:677H；以及株系S:677P。在一些实施方式中，一种以上导致普通感冒的冠状病毒选自：229Eα冠状病毒、NL63α冠状病毒、OC43β冠状病毒和HKU1β冠状病毒。在一些实施方式中，保守的大序列可被认为是比对中鉴定出的大序列中最高度保守的2个序列。在一些实施方式中，保守的大序列可被认为是比对中鉴定出的大序列的最高度保守的5个序列。在一些实施方式中，保守的大序列可被认为是比对中鉴定出的大序列的最高度保守的10个序列。在一些实施方式中，保守的大序列可被认为是比对中鉴定出的大序列中的最高度保守的15个序列。
本发明还涉及预防冠状病毒疾病的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的根据本发明的泛冠状病毒重组疫苗组合物，其中，该组合物在受试者中引发免疫反应并有助于预防冠状病毒疾病。
本发明还涉及预防性地在受试者中预防冠状病毒感染的方法。在一些实施方式中，该方法包括向受试者施用预防有效量的根据本发明的泛冠状病毒重组疫苗组合物，其中，该疫苗组合物可预防冠状病毒感染。
本发明还涉及在受试者体内引发免疫反应的方法，该方法包括向受试者施用根据本发明的组合物，其中，该疫苗组合物在受试者体内引发免疫反应。本发明还涉及方法，该方法包括：向受试者施用根据本发明的泛冠状病毒重组疫苗组合物，其中，该组合物可预防病毒在肺部、脑部和病毒复制所在的其他部位中复制。本发明还涉及方法，该方法包括：向受试者施用根据本发明的泛冠状病毒重组疫苗组合物，其中，该组合物可预防病毒在肺部、脑部和病毒复制所在的其他部位中的细胞因子风暴(cytokine storm)。本发明还涉及方法，该方法包括：向受试者施用根据本发明的泛冠状病毒重组疫苗组合物，其中，该组合物可预防肺部、脑部和病毒复制所在的其他部位中的炎症或炎症反应。本发明还涉及方法，该方法包括：向受试者施用根据本发明的泛冠状病毒重组疫苗组合物，其中，该组合物改善T细胞在肺部、脑部和病毒复制所在的其他部位中的归巢(homing)和保留(retention)。本发明还涉及在受试者中预防冠状病毒疾病的方法，该方法包括：向受试者施用根据本发明的泛冠状病毒重组疫苗组合物，其中，该组合物诱导记忆B细胞和T细胞。本发明还涉及延长由泛冠状病毒重组疫苗诱导的免疫反应和增加T细胞向肺部迁移的方法，该方法包括：共表达T细胞吸引趋化因子、促进T细胞增殖的组合物和根据本发明的泛冠状病毒重组疫苗。本发明还涉及延长泛冠状病毒疫苗诱导的进入肺部的记忆T细胞的保留和增加病毒特异性组织驻留记忆T细胞(TRM细胞)的方法，该方法包括：共表达T细胞吸引趋化因子、促进T细胞增殖的组合物和根据本发明的泛冠状病毒重组疫苗。本发明还涉及方法，该方法包括：向受试者施用根据本发明的泛冠状病毒重组疫苗组合物，其中，该组合物预防冠状病毒的突变和变体的发展。
为简洁起见，应注意前述方法中提到的疫苗组合物包括如前所述的疫苗组合物、下文描述的实施方式和附图中的实施方式。
在一些实施方式中，疫苗组合物通过静脉内途径(i.v.)、鼻内途径(i.n.)或舌下途径(s.l.)途径施用。
在一些实施方式中，疫苗组合物使用腺病毒或其他合适的递送系统来施用。
如前所述，本文的组合物可用于在受试者中预防冠状病毒疾病。本文的组合物可用于预防性地在受试者中预防冠状病毒感染。本文的组合物可用于在受试者体内引发免疫反应。在本文中，术语“受试者”可指人类、非人类灵长类动物、动物(例如小鼠、大鼠、猫、犬、其他易受冠状病毒感染的动物或其他用于临床前建模的动物)。本文的组合物可延长由泛冠状病毒重组疫苗组合物诱导的免疫反应，并增加T细胞向肺部的迁移。在某些实施方式中，本组合物诱导驻留记忆T细胞(Trm)。在一些实施方式中，疫苗组合物诱导针对冠状病毒疾病或感染的有效和强力的保护。在一些实施方式中，疫苗组合物诱导产生抗体(Ab)、CD4+T辅助(Th1)细胞和CD8+细胞毒性T细胞(CTL)。在一些实施方式中，促进T细胞增殖的组合物有助于促进长期免疫。在一些实施方式中，T细胞吸引趋化因子有助于将T细胞从循环拉入肺部。
本发明还涉及寡核苷酸组合物。例如，本发明包括序列表中公开的寡核苷酸。本发明还包括以抗原递送系统形式存在的寡核苷酸。本发明还包括编码本文公开的保守大序列的寡核苷酸。本发明还包括寡核苷酸组合物，该组合物包含编码根据本发明的任何疫苗组合物的一个以上寡核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸包含DNA。在一些实施方式中，寡核苷酸包含修饰的DNA。在一些实施方式中，寡核苷酸包含RNA。在一些实施方式中，寡核苷酸包含修饰的RNA。在一些实施方式中，寡核苷酸包含mRNA。在一些实施方式中，寡核苷酸包含修饰的mRNA。
本发明还涉及肽组合物。例如，本发明包括序列表中公开的肽。本发明还包括包含根据本发明的任何疫苗组合物的肽组合物。本发明还包括包含根据本发明的任何保守大序列的肽组合物。
为简洁起见，应注意前述寡核苷酸和肽组合物中提及的疫苗组合物包括如前所述的疫苗组合物、下文描述的实施方式和附图中的实施方式。
本发明还涉及包含SEQ ID NO：139至SEQ ID NO：147(表9)的泛冠状病毒重组疫苗组合物。
本发明还涉及与SEQ ID NO：139至SEQ ID NO：147(表9)具有至少99％同一性的泛冠状病毒重组疫苗组合物。
本发明还涉及一种方法，该方法包括：使用第一递送系统施用第一剂泛冠状病毒重组疫苗，以及使用第二递送系统施用第二剂疫苗，其中，第一递送系统和第二递送系统不同。在一些实施方式中，第一递送系统可包含RNA、修饰的mRNA或肽递送系统。在一些实施方式中，第二递送系统可包含RNA、修饰的mRNA或肽递送系统。在一些实施方式中，肽递送系统为腺病毒。在一些实施方式中，腺病毒递送系统为Ad26、Ad5、Ad35或它们的组合。在一些实施方式中，肽递送系统为水疱性口炎病毒(VSV)载体。在一些实施方式中，第二剂疫苗在施用第一剂疫苗14天后施用。
本发明还涉及一种方法，该方法包括：施用根据本发明的泛冠状病毒重组疫苗组合物；以及在施用泛冠状病毒重组疫苗组合物后施用至少一种T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，疫苗组合物通过RNA、修饰的mRNA或肽递送系统来施用。在一些实施方式中，T细胞吸引趋化因子通过RNA、修饰的mRNA或肽递送系统来施用。在一些实施方式中，肽递送系统为腺病毒。在一些实施方式中，腺病毒递送系统为Ad26、Ad5、Ad35或它们的组合。在一些实施方式中，肽递送系统为水疱性口炎病毒(VSV)载体。在一些实施方式中，T细胞吸引趋化因子在施用疫苗组合物8天后施用。在一些实施方式中，T细胞吸引趋化因子在施用疫苗组合物14天后施用。在一些实施方式中，T细胞吸引趋化因子在施用疫苗组合物30天后施用。在一些实施方式中，T细胞吸引趋化因子为CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11或它们的组合。
本发明还涉及一种方法，该方法包括：施用根据本发明的泛冠状病毒重组疫苗组合物；在施用泛冠状病毒重组疫苗组合物后施用至少一种T细胞吸引趋化因子；以及在施用T细胞吸引趋化因子后施用至少一种细胞因子。在一些实施方式中，疫苗组合物通过RNA、修饰的mRNA或肽递送系统来施用。在一些实施方式中，T细胞吸引趋化因子通过RNA、修饰的mRNA或肽递送系统来施用。在一些实施方式中，细胞因子通过RNA、修饰的mRNA或肽递送系统来施用。在一些实施方式中，肽递送系统为腺病毒。在一些实施方式中，腺病毒递送系统为Ad26、Ad5、Ad35或它们的组合。在一些实施方式中，肽递送系统为水疱性口炎病毒(VSV)载体。在一些实施方式中，T细胞吸引趋化因子在施用疫苗组合物14天后施用。在一些实施方式中，T细胞吸引趋化因子为CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11或它们的组合。在一些实施方式中，细胞因子在施用T细胞吸引趋化因子10天后施用。在一些实施方式中，细胞因子为IL-7、IL-15、IL2或它们的组合。
本发明还涉及一种方法，该方法包括：施用根据本发明的泛冠状病毒重组疫苗组合物；在施用泛冠状病毒重组疫苗组合物后施用一种以上T细胞吸引趋化因子；以及施用一种以上粘膜趋化因子。在一些实施方式中，疫苗组合物使用腺病毒施用。在一些实施方式中，T细胞吸引趋化因子通过RNA、修饰的mRNA或肽递送系统或其他递送系统来施用。在一些实施方式中，粘膜趋化因子通过RNA、修饰的mRNA或肽递送系统或其他递送系统来施用。在一些实施方式中，腺病毒为Ad26、Ad5、Ad35或它们的组合。在一些实施方式中，T细胞吸引趋化因子在施用疫苗组合物14天后施用。在一些实施方式中，T细胞吸引趋化因子为CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11或它们的组合。在一些实施方式中，粘膜趋化因子在施用T细胞吸引趋化因子10天后施用。在一些实施方式中，粘膜趋化因子为CCL25、CCL28、CXCL14或CXCL17或它们的组合。
为简洁起见，应注意前述方法中提到的疫苗组合物包括如前所述的疫苗组合物、下文描述的实施方式和附图中的实施方式。
如前所述，在一些实施方式中，疫苗组合物用于人类。在一些实施方式中，疫苗组合物用于动物，例如猫、犬等。在一些实施方式中，疫苗组合物包含人CXCL-11和/或人IL-7(或IL-15、IL-2)。在一些实施方式中，疫苗组合物包含动物CLCL-11和/或动物IL-7(或IL-15、IL-2)。
本发明包括rVSV-泛CoV疫苗组合物形式的疫苗组合物。本发明包括rAdV-泛CoV疫苗组合物形式的疫苗组合物。
本发明还包括用于本文的疫苗组合物的核酸。本发明还包括用于本文的疫苗组合物的载体。本发明还包括用于本文的疫苗组合物的融合蛋白。本发明还包括用于本文的疫苗组合物的免疫原性组合物。
本文的疫苗组合物可被设计为在18至55岁的成年人中引发高水平的病毒封闭抗体和病毒中和抗体以及CD4+T细胞和CD8+T细胞。本文的疫苗组合物可被设计为在55至65岁的成年人中引发高水平的病毒封闭抗体和病毒中和抗体以及CD4+T细胞和CD8+T细胞。本文的疫苗组合物可被设计为在65至85岁的成年人中引发高水平的病毒封闭抗体和病毒中和抗体以及CD4+T细胞和CD8+T细胞。本文的疫苗组合物可被设计为在85至100岁的成年人中引发高水平的病毒封闭抗体和病毒中和抗体以及CD4+T细胞和CD8+T细胞。本文的疫苗组合物可被设计为在12至18岁的儿童中引发高水平的病毒封闭抗体和病毒中和抗体以及CD4+T细胞和CD8+T细胞。本发明的疫苗组合物可被设计为在12岁以下的儿童中引发高水平的病毒封闭抗体和病毒中和抗体以及CD4+T细胞和CD8+T细胞。
本发明不限于疫苗组合物。例如，在某些实施方式中，一个以上保守的大序列被用于检测冠状病毒和/或诊断冠状病毒感染。
如前所述，在一些实施方式中，一个以上保守的大序列在人类和动物冠状病毒中高度保守。在一些实施方式中，保守的大序列为特定数量的冠状病毒序列的序列比对和分析中鉴定出的最高度保守的大序列之一。例如，保守的大序列可以为鉴定出的2个最高度保守的大序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的5个最高度保守的大序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的8个最高度保守的大序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的10个最高度保守的大序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的15个最高度保守的大序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的20个最高度保守的大序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的30个最高度保守的大序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的40个最高度保守的大序列。在一些实施方式中，保守的大序列(在一些实施方式中，一个以上保守的大序列)可以为鉴定出的5个最高度保守的大序列，其来源于SARS-CoV-2蛋白中的至少一种。在一些实施方式中，保守的大序列(在一些实施方式中，一个以上保守的大序列)可以为鉴定出的5个最高度保守的大序列，其来源于如下中的一种以上：一种以上目前流行的SARS-CoV-2人类株系或变体；一种以上先前导致人类爆发的冠状病毒；一种以上从动物中分离的冠状病毒，所述动物选自蝙蝠、穿山甲、果子狸、貂、骆驼和其他容易感染冠状病毒的动物；或一种以上导致普通感冒的冠状病毒。在一些实施方式中，一种以上目前流行的SARS-CoV-2人类株系或变体选自：株系B.1.177；株系B.1.160；株系B.1.1.7；株系B.1.351；株系P.1；株系B.1.427/B.1.429；株系B.1.258；株系B.1.221；株系B.1.367；株系B.1.1.277；株系B.1.1.302；株系B.1.525；株系B.1.526；株系S:677H；以及株系S:677P。在一些实施方式中，一种以上导致普通感冒的冠状病毒选自：229Eα冠状病毒、NL63α冠状病毒、OC43β冠状病毒和HKU1β冠状病毒。在一些实施方式中，疫苗组合物用于人类。在一些实施方式中，疫苗组合物用于动物。
本发明还涉及一种生产泛冠状病毒组合物的方法，该方法包括：对根据本发明的至少一个大序列进行选择；以及合成包含所选大序列的一种以上抗原。本发明还涉及一种生产泛冠状病毒组合物的方法，该方法包括：对至少一个保守的大序列进行选择；以及合成编码所选大序列的抗原递送系统。
本发明还包括一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，该组合物包含一个以上大序列，该一个以上大序列中的每一个均包含如下中的至少一种：全刺突蛋白或刺突蛋白的一部分；一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；以及一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
在一些实施方式中，一个以上保守表位在人类和动物冠状病毒中高度保守。在一些实施方式中，一个以上保守表位来源于SARS-CoV-2蛋白中的至少一种。在一些实施方式中，该组合物包含2至20种CD8+T细胞靶表位。在一些实施方式中，该组合物包含2至20种CD4+T细胞靶表位。在一些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自SEQ IDNO：58至SEQ ID NO：105(ORF1a1350-1365、ORF1ab5019-5033、ORF612-26、ORF1ab6088-6102、ORF1ab6420-6434、ORF1a1801-1815、S1-13、E26-40、E20-34、M176-190、N388-403、ORF7a3-17、ORF7a1-15、ORF7b8-22、ORF7a98-112和ORF81-15)。在一些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：106至SEQ ID NO：138(S287-317、S524-598、S601-640、S802-819、S888-909、S369-393、S440-501、S1133-1172、S329-363和S13-37)。
本发明还涉及一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，该组合物包含一个以上大序列，该一个以上大序列中的每一个均包含如下中的至少一种：一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位；一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；和/或一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位，其中，至少一个表位来源于非刺突蛋白。
在一些实施方式中，一个以上保守表位来源于SARS-CoV-2蛋白中的至少一种。在一些实施方式中，该组合物包含2至20种CD8+T细胞靶表位。在一些实施方式中，该组合物包含2至20种CD4+T细胞靶表位。在一些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：58至SEQ ID NO：105(ORF1a1350-1365、ORF1ab5019-5033、ORF612-26、ORF1ab6088-6102、ORF1ab6420-6434、ORF1a1801-1815、S1-13、E26-40、E20-34、M176-190、N388-403、ORF7a3-17、ORF7a1-15、ORF7b8-22、ORF7a98-112和ORF81-15)。
在一些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：106至SEQ ID NO：138(S287-317、S524-598、S601-640、S802-819、S888-909、S369-393、S440-501、S1133-1172、S329-363和S13-37)。
在一些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位选自SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：57(S2-10、S1220-1228、S1000-1008、S958-966、E20-28、ORF1ab1675-1683、ORF1ab2363-2371、ORF1ab3013-3021、ORF1ab3183-3191、ORF1ab5470-5478、ORF1ab6749-6757、ORF7b26-34、ORF8a73-81、ORF103-11和ORF105-13)。
本发明还涉及一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，该组合物包含编码一个以上大序列的抗原递送系统，该大序列包含如下中的至少一种：一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位；一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；和/或一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
在一些实施方式中，抗原递送系统为基于腺病毒的抗原递送系统。在一些实施方式中，基于腺病毒的抗原递送系统为Ad26、Ad5、Ad35或它们的组合。在一些实施方式中，抗原递送系统还编码T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，抗原递送系统还编码促进T细胞增殖的组合物。在一些实施方式中，抗原递送系统还编码分子佐剂。在一些实施方式中，大序列与肺特异性启动子可操作地连接。
在一些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位选自SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：57(S2-10、S1220-1228、S1000-1008、S958-966、E20-28、ORF1ab1675-1683、ORF1ab2363-2371、ORF1ab3013-3021、ORF1ab3183-3191、ORF1ab5470-5478、ORF1ab6749-6757、ORF7b26-34、ORF8a73-81、ORF103-11和ORF105-13)。在一些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：58至SEQ ID NO：105(ORF1a1350-1365、ORF1ab5019-5033、ORF612-26、ORF1ab6088-6102、ORF1ab6420-6434、ORF1a1801-1815、S1-13、E26-40、E20-34、M176-190、N388-403、ORF7a3-17、ORF7a1-15、ORF7b8-22、ORF7a98-112和ORF81-15)。在一些实施方式中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：106至SEQ ID NO：138(S287-317、S524-598、S601-640、S802-819、S888-909、S369-393、S440-501、S1133-1172、S329-363和S13-37)。
在一些实施方式中，部分刺突蛋白包含三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)。在一些实施方式中，全刺突蛋白或部分刺突蛋白具有完整的S1-S2切割位点。在一些实施方式中，刺突蛋白在氨基酸986位和987位处用脯氨酸取代而稳定。
本发明还涉及包含SEQ ID NO：139至SEQ ID NO：147中的一个的泛冠状病毒重组疫苗组合物。
本发明还包括本文的任何蛋白序列的相应核酸序列。本发明还包括本文的任何核酸序列的相应蛋白序列。
本文的实施方式可包括全刺突蛋白或刺突蛋白的一部分。全刺突蛋白和刺突蛋白的一部分不限于野生型或原始序列，并且可以包括具有一个以上修饰和/或突变(例如点突变、缺失等，包括本文所述的突变，例如用于提高稳定性的那些)的刺突蛋白或刺突蛋白的一部分。
本发明的实施方式如果不相互排斥，则可以自由地相互结合。
本文描述的任何特征或特征组合都包括在本发明的范围内，条件是：如从上下文、本说明书和本领域普通技术人员的知识中显而易见的那样，包括在任何此种组合中的特征不是相互不一致的。本发明的其他优点和方面在以下详细描述和权利要求中是显而易见的。
附图说明
通过结合附图给出的以下详细描述，本发明的特征和优点将变得明显，其中：
图1显示了大序列泛冠状病毒重组疫苗组合物的一个实例的示意图。重组疫苗组合物中的每个大序列可包含表位。CD8+T细胞表位用方形表示，CD4+T细胞表位用圆形表示，B细胞表位用菱形表示。每个形状(方形、圆形或菱形)可以代表各种不同的表位，并且不限于单一表位。多表位泛冠状病毒疫苗不限于所示的大序列的特定组合。大序列泛冠状病毒疫苗可以包含各种数量的大序列。
图2A显示了从人类和动物中分离的β冠状病毒株的基因组序列的进化比较。在SARS-CoV-2株(获自人类(Homo Sapiens(黑色)))以及获自如下的动物SARS样冠状病毒基因组序列(SL-CoV)序列之间进行系统发育分析：蝙蝠(Rhinolophus affinis，Rhinolophusmalayanus(红色))、穿山甲(Manis javanica(蓝色))、果子狸(Paguma larvata(绿色))和骆驼(Camelus dromedaries(棕色))。所包括的SARS-CoV/MERS-CoV株来自先前的爆发(获自人类(乌尔巴尼，MERS-CoV，OC43，NL63，229E，HKU1-基因型B)、蝙蝠(WIV16，WIV1，YNLF-31C，Rs672，重组株)、骆驼(Camelus dromedaries(KT368891.1，MN514967.1，KF917527.1，NC_028752.1))和果子狸(Civet007，A022，B039))。人SARS-CoV-2基因组序列的代表来自六大洲。
图2B显示了在来自六大洲报告的人SARS-CoV-2基因组序列以及获自蝙蝠(Rhinolophus affinis，Rhinolophus malayanus)和穿山甲(Manis javanica)的SARS-CoV-2基因组序列中进行的进化分析。
图3A显示，肺部、心脏、肾脏、肠道、脑部和睾丸表达ACE2受体并被SARS-CoV-2病毒靶定。SARS-CoV-2病毒通过刺突表面蛋白与血管紧张素转换酶2(ACE2)受体对接(dock)。
图3B显示了本发明中采用的系统生物学分析方法。
图4显示了SARS-CoV-2、普通感冒CoV株、MERS、SARS-CoV-乌尔巴尼和动物CoV与SARS-CoV-2武汉株(查询株系；hCoV-19/蝙蝠YN01)的序列同源性分析。发现5个片段SARS-CoV-2基因组高度保守：1bp至1580bp(片段1)、3547bp至12830bp(片段2)、17472bp至21156bp(片段3)、22584bp至24682bp(片段4)、以及26193bp至27421bp(片段5)。
图5显示了片段1(1bp至1580bp)的序列同源性分析，片段1包含ORF1a/b的部分。对查询序列(1-1580bp hCoV-19/蝙蝠YN01)进行针对所有SARS-CoV-2VOC、人CoV株以及来自蝙蝠、穿山甲和果子狸的CoV株的BLAST比对。发现28种变体/株系与该查询区域有明显的同源性。
图6显示了片段2(3547bp至12830bp)的序列同源性分析。对查询序列(3547-12830bp hCoV-19/蝙蝠YN01)进行针对所有SARS-CoV-2VOC、人CoV株以及来自蝙蝠、穿山甲和果子狸的CoV株的BLAST比对。发现30种变体/株系与该查询区域有明显的同源性。
图7显示了片段3(17472bp至21156bp)的序列同源性分析。对查询序列(17472-21156bp hCoV-19/蝙蝠YN01)进行针对所有SARS-CoV-2VOC、人CoV株以及来自蝙蝠、穿山甲和果子狸的CoV株的BLAST比对。发现29种变体/株系与该查询区域有明显的同源性。
图8显示了片段4(22584bp至24682bp)的序列同源性分析，片段4包含刺突蛋白。对查询序列(22584-24682bp hCoV-19/蝙蝠YN01)进行针对所有SARS-CoV-2VOC、人CoV株以及来自蝙蝠、穿山甲和果子狸的CoV株的BLAST比对。发现29种变体/株系与该查询区域有明显的同源性。
图9显示了片段5(26193bp至27421bp)的序列同源性分析。对查询序列(26193-27421bp hCoV-19/蝙蝠YN01)进行针对所有SARS-CoV-2VOC、人CoV株以及来自蝙蝠、穿山甲和果子狸的CoV株的BLAST比对。发现31种变体/株系与该查询区域有明显的同源性。
图10显示了用于筛选潜在SARS-CoV-2来源的人CD8+T细胞表位的保守度(conservancy)的序列同源性分析。图中显示了在81963种SARS-CoV-2株(目前在6大洲190个国家流行)、导致先前爆发的4个主要“普通感冒”冠状病毒(即hCoV-OC43、hCoV-229E、hCoV-HKU1-基因型B和hCoV-NL63)以及从蝙蝠、果子狸、穿山甲和骆驼分离的SL-CoV中的潜在CD8+T细胞表位的序列同源性比较。黄色突出显示的表位序列在目前流行的81963种SARS-CoV-2株中呈现高度同源性，并且在先前爆发的两个以上人SARS-CoV株以及从蝙蝠、果子狸、穿山甲和骆驼分离的SL-CoV株中呈现至少50％的保守度，如本文所述。HomoSapiens-黑色，蝙蝠(Rhinolophus affinis，Rhinolophus malayanus-红色)，穿山甲(Manis javanica-蓝色)，果子狸(Paguma larvata-绿色)和骆驼(Camelus dromedaries-棕色)。
图11A显示了高度保守的SARS-CoV-2来源的人CD8+T细胞表位与HLA-A*02:01分子的对接，例如27种高亲和力CD8+T细胞结合肽与HLA-A*02:01分子沟的对接。
图11B显示了通过蛋白质-肽分子对接分析确定的27种高亲和力CD8+T细胞表位肽与HLA-A*02:01分子的相互作用相似性得分汇总。黑色栏描述了具有高相互作用相似性得分的CD8+T细胞表位肽。
图12A显示，实验设计显示CD8+T细胞对COVID-19患者和未暴露健康个体中检测到的高度保守的SARS-CoV-2表位具有特异性：从HLA-A*02:01阳性COVID-19患者(n＝30)和对照组未暴露健康个体(n＝10)中分离PBMC，用27种SARS-CoV-2来源的CD8+T细胞表位(各自10μM)刺激PBMC过夜。使用ELISpot测定法对产生IFN-γ的细胞数量进行定量。
图12B显示了来自图12A的结果。虚线代表评估反应的相对幅度的阈值：平均SFC为25至50，对应于中等/中间反应，而平均SFC>50则被定义为强反应。
图12C显示了如下实验的结果：在mAb(对CD107a和CD107b具有特异性)、Golgi-Plug和Golgi-Stop的存在下，来自HLA-A*02:01阳性COVID-19患者的PBMC被进一步刺激另外5小时。然后用FACS测量四倍体(对刺突表位具有特异性)、CD107a/b和CD69以及TNF-表达。代表性的FACS图显示了用一组具有4种刺突CD8+T细胞表位肽进行初免后，四倍体+CD8+T细胞、CD107a/b+CD8+T细胞、CD69+CD8+T细胞和TNF-+CD8+T细胞的频率。四倍体+CD8+T细胞、CD107a/b+CD8+T细胞、CD69+CD8+T细胞和TNF-+CD8+T细胞的平均频率。
图13A显示了实验(在HLA-A*02:01/HLA-DRB1双重转基因小鼠中测试全基因组鉴定的人SARS-CoV-2CD8+T表位的免疫原性)的免疫和免疫学分析的时间线。在第0天和第14天，用4种SARS-CoV-2来源的人CD8+T细胞肽表位与PADRE CD4+T辅助表位的混合物(在明矾和CpG1826佐剂中递送)，对8组年龄匹配的HLA-A*02:01转基因小鼠(n＝3)进行皮下免疫。仅接受佐剂的小鼠作为阴性对照(模拟免疫)。
图13B显示了用于对脾来源的CD8+T细胞进行表征的门控策略。通过低前向散射(FSC)和低侧向散射(SSC)门控对淋巴细胞进行鉴定。通过绘制前向散射面积(FSC-A)与前向散射高度(FSC-H)来选择单细胞。然后通过CD8和CD3标志物的表达对CD8阳性细胞进行门控。
图13C显示了来自脾细胞(106个细胞/孔)的代表性的ELISpot图像(左图)和产生IFN-γ的细胞斑点的平均频率(右图)，这些脾细胞用10μM的10种免疫显性CD8+T细胞肽和1种亚显性CD8+T细胞肽(来自SARS-CoV-2结构和非结构蛋白的27种CD8+T细胞肽的总库)刺激48小时。每个ELISpot图像上面的数字表示每百万个脾细胞中产生IFN-γ的斑点形成的T细胞(SFC)的数量。
图13D显示了通过FACS测得的代表性的FACS图(左图)和IFN-γ和TNF-产生以及CD107a/b和CD69表达的平均频率(右图)，其针对10种免疫显性CD8+T细胞肽和1种亚显性CD8+T细胞肽(来自SARS-CoV-2结构和非结构蛋白的27种CD8+T细胞肽的总库)。数字表示在3只免疫小鼠中检测到的IFN-γ+CD8+T细胞、CD107+CD8+T细胞、CD69+CD8+T细胞和TNF-+CD8+T细胞的频率。
图14显示，SARS-CoV/SARS-CoV-2基因组编码两个大的非结构基因ORF1a(绿色)和ORF1b(灰色)，编码16种非结构蛋白(NSP1至NSP16)。基因组编码至少6种辅助蛋白(浅灰色阴影)，这些蛋白在数量、基因组组织、序列和功能方面为SARS-CoV/SARS-CoV-2所独有。显示了常见SARS-CoV、SARS-CoV-2和SL-CoV来源的人B细胞表位(蓝色)、CD4+T细胞表位(绿色)和CD8+T细胞表位(黑色)。本研究中使用的结构和非结构开放阅读框来自SARS-CoV-2-武汉-人-1株(NCBI登录号MN908947.3，SEQ ID NO：1)。使用本文所述的不同计算算法，针对人B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表位对SARS-CoV-2-武汉-人-1结构和非结构蛋白的氨基酸序列进行筛选。显示了全基因组范围内鉴定的SARS-CoV-2人B细胞表位(蓝色)、CD4+T细胞表位(绿色)、CD8+T细胞表位(黑色)，它们在人类和动物冠状病毒之间高度保守。
图15显示了高度保守的潜在SARS-CoV-2来源的人CD4+T细胞表位的鉴定，这些表位以高亲和力与HLA-DR分子结合：从来自SARS-CoV-2-武汉-人-1株(MN908947.3)全基因组序列的总共9594个潜在的HLA-DR限制性CD4+T细胞表位中，选择了16种以高亲和力与HLA-DRB1分子结合的表位。对人类和动物冠状病毒中这16种CD4+T细胞表位的保守度进行了分析。显示了81963个SARS-CoV-2株(目前在6大洲流行)、导致先前爆发的4种主要“普通感冒”冠状病毒(即hCoV-OC43、hCoV-229E、hCoV-HKU1和hCoV-NL63)以及从蝙蝠、果子狸、穿山甲和骆驼分离的SL-CoV中的16种CD4+T细胞表位的序列同源性比较。绿色突出显示的表位序列在目前流行的81963种SARS-CoV-2株中呈现高度同源性，并且在先前爆发的两个以上人SARS-CoV株以及从蝙蝠、果子狸、穿山甲和骆驼分离的SL-CoV株中呈现至少50％的保守度，如材料和方法中所述。Homo Sapiens-黑色，蝙蝠(Rhinolophus affinis，Rhinolophusmalayanus-红色)，穿山甲(Manis javanica-蓝色)，果子狸(Paguma larvata-绿色)和骆驼(Camelus dromedaries-棕色)。
图16A显示了高度保守的SARS-CoV-2CD4+T细胞表位与HLA-DRB1分子的分子对接。使用GalaxyPepDock服务器确定了16种CD4+T细胞表位(在人SARS-CoV-2株、先前的人SARS/MERS-CoV和蝙蝠SL-CoV中保守)与HLA-DRB1蛋白晶体结构(PDB登录号：4UQ3)的沟的分子对接。16种CD4+T细胞表位是混杂的，仅受HLA-DRB1*01:01、HLA-DRB1*11:01、HLA-DRB1*15:01、HLA-DRB1*03:01和HLA-DRB1*04:01等位基因限制。CD4+T细胞肽被显示为球状和棒状结构，HLA-DRB1蛋白晶体结构被显示为模板。预测精度由线性模型来估计，即正确预测的结合位点残基的比例与模板-靶标相似性(通过线性回归得到的蛋白质结构相似性得分(TM得分)和相互作用相似性得分(SInter)来衡量)的关系。SInter显示了CD8+T细胞肽的氨基酸与HLA-DRB1模板结构的氨基酸中的接触残基对齐的相似性。
图16B显示代表CD4+T细胞特异性表位(从蛋白质-肽分子对接分析中观察到)的相互作用相似性得分的直方图。
图17A显示了实验设计，该实验设计显示了CD4+T细胞对在COVID-19患者和未暴露的健康个体中检测到的高度保守的SARS-CoV-2表位具有特异性：分离来自HLA-DRB1阳性的COVID-19患者(n＝30)和未暴露的健康个体(n＝10)的PBMC，用16种SARS-CoV-2来源的CD4+T细胞表位(各自10μM)刺激48小时。使用ELISpot测定法对产生IFN的细胞数量进行定量。
图17B显示了来自图17A的结果。虚线代表评估反应的相对幅度的阈值：平均SFC为25至50，对应于中等/中间反应，而平均SFC>50则被定义为强反应。PBMC来自HLA-DRB1阳性的COVID-19患者。
图17C显示了在mAb(对CD107a和CD107b具有特异性)、Golgi-Plug和Golgi-Stop的存在下进一步刺激另外5小时的结果。然后通过FACS测量四倍体(对2种刺突表位具有特异性)、CD107a/b和CD69以及TNF-α的表达。代表性的FACS图显示了用一组具有2种刺突CD4+T细胞表位肽进行初免后，四倍体+CD4+T细胞、CD107a/b+CD4+T细胞、CD69+CD4+T细胞和TNF-+CD4+T细胞的频率。显示了四倍体+CD4+T细胞、CD107a/b+CD4+T细胞、CD69+CD4+T细胞和TNF-+CD4+T细胞的平均频率。
图18A显示了在HLA-A*02:01/HLA-DRB1双重转基因小鼠中测试全基因组鉴定的人SARS-CoV-2CD4+T表位的免疫原性的免疫和免疫学分析的时间线。在第0天和第14天，用4种SARS-CoV-2来源的人CD4+T细胞肽表位的混合物(在明矾和CpG1826佐剂中递送)，对4组年龄匹配的HLA-DRB1转基因小鼠(n＝3)进行皮下免疫。仅接受佐剂的小鼠作为阴性对照(模拟免疫)。
图18B显示了用于表征脾脏来源的CD4+T细胞的门控策略。通过CD4和CD3表达标志物对CD4阳性细胞进行门控。
图18C显示了用10μM的7种免疫显性CD4+T细胞肽和1种亚显性CD4+T细胞肽(来自SARS-CoV-2结构和非结构来源的16种CD4+T细胞肽的总库)刺激48小时后，脾细胞(106个细胞/孔)产生IFN-γ的细胞斑点的代表性ELISpot图像(左图)和平均频率(右图)。每百万个总细胞中形成产生IFN-γ的斑点的T细胞(SFC)的数量显示在每个ELISpot图像的顶部。
图18D显示了通过FACS测得的代表性的FACS图(左图)和平均频率(右图)，其显示了7种免疫显性CD4+T细胞肽和1种亚显性CD4+T细胞肽(来自SARS-CoV-2来源的16种CD4+T细胞肽的总库)的IFN-γ和TNF-α的产生以及CD107a/b和CD69的表达。数字表示在3只免疫小鼠中检测到的IFN-γ+CD4+T细胞、CD107+CD4+T细胞、CD69+CD4+T细胞和TNF-α+CD4+T细胞的百分比。
图19显示了刺突来源的B细胞表位在人类、蝙蝠、果子狸、穿山甲和骆驼冠状病毒株中的保守度。使用ClustalW对获自人类、蝙蝠、果子狸、穿山甲和骆驼的29种SARS冠状病毒株(SARS-CoV)进行多序列比对。这包括：7种人SARS/MERS-CoV株(SARS-CoV-2-武汉(MN908947.3)、SARS-HCoV-乌尔巴尼(AY278741.1)、CoV-HKU1-基因型B(AY884001)、CoV-OC43(KF923903)、CoV-NL63(NC005831)、CoV-229E(KY983587)、MERS(NC019843))；8种蝙蝠株SARS-CoV(蝙蝠-SL-CoV-WIV16(KT444582)、蝙蝠-SL-CoV-WIV1(KF367457.1)、蝙蝠-SL-CoV-YNLF31C(KP886808.1)、蝙蝠-SARS-CoV-RS672(FJ5886.1)、蝙蝠-CoV-RATG13(MN996532.1)、蝙蝠-CoV-YN01(EPIISL412976)、蝙蝠-CoV-YN02(EPIISL412977)、蝙蝠-CoV-19-ZXC21(MG772934.1)；3种果子狸SARS-CoV株(SARS-CoV-果子狸007(AY572034.1)、SARS-CoV-A022(AY686863.1)、SARS-CoV-B039(AY686864.1))；9种穿山甲SARS-CoV株(PCoV-GX-P2V(MT072864.1)、PCoV-GX-P5E(MT040336.1)、PCoV-GX-P5L(MT040335.1)、PCoV-GX-P1E(MT040334.1)、PCoV-GX-P4L(MT040333.1)、PCoV-MP789(MT084071.1)、PCoV-GX-P3B(MT072865.1)、PCoV-广东-P2S(EPIISL410544)、PCoV-广东(EPIISL410721))；4种骆驼SARS-CoV株(骆驼-CoV-HKU23(KT368891.1)、DcCoV-HKU23(MN514967.1)、MERS-CoV-吉达(KF917527.1)、利雅德/RY141(NC028752.1))；以及1种重组株(FJ211859.1)。蓝色突出显示的区域代表序列同源性。在两种以上SARS冠状病毒株中显示出至少50％的保守度或拥有受体结合结构域(RBD)特异性氨基酸的B细胞表位被选为候选表位。
图20A显示了SARS-CoV-2刺突糖蛋白来源的B细胞表位与人ACE2受体的对接，例如从SARS-CoV-2刺突糖蛋白鉴定出的22种B细胞表位与ACE2受体的分子对接。B细胞表位肽被显示为球状和棒状结构，而ACE2受体蛋白被显示为模板。S471-501和S369-393肽的表位拥有对受体结合结构域区域具有特异性的氨基酸残基。预测精度由线性模型来估计，即正确预测的结合位点残基的比例与模板-靶标相似性(通过线性回归得到的蛋白质结构相似性得分和相互作用相似性得分(SInter)来衡量)的关系。SInter显示了B细胞肽的氨基酸与ACE2模板结构的氨基酸中的接触残基对齐后的相似性。SInter得分越高表示ACE2分子和B细胞肽的结合亲和力更显著。
图20B显示了从蛋白质-肽分子对接分析中观察到的22种B细胞特异性表位的相互作用相似性得分汇总。具有高相互作用相似性得分的B细胞表位用黑色表示。
图21A显示了免疫和免疫学分析(用于测试显示IgG抗体在免疫的B6小鼠和恢复期COVID-19患者中对SARS-CoV-2刺突蛋白来源的B细胞表位具有特异性)的时间线。从SARS-CoV-2刺突蛋白中选出和在B6小鼠中测试的总共22种SARS-CoV-2来源的B细胞表位肽能够诱发抗体反应。在第0天和第14天，用4种或5种SARS-CoV-2来源的B细胞肽表位的混合物(在明矾和CpG1826佐剂中乳化)，对4组年龄匹配的B6小鼠(n＝3)进行皮下免疫。仅接受明矾/CpG1826佐剂的小鼠用作阴性对照(模拟免疫)。
图21B显示通过流式细胞仪测得的免疫小鼠脾脏中的产生IgG的CD3(-)CD138(+)B220(+)血浆B细胞的频率。例如，图21B显示了门控策略如下：淋巴细胞通过低前向散射(FSC)和低侧向散射(SSC)门控来进行鉴定。通过绘制前向散射面积(FSC-A)与前向散射高度(FSC-H)来选择单细胞。然后通过CD3(-)和B220(+)细胞的表达对B细胞进行门控，确定血浆B细胞上的CD138表达。
图21C显示了通过流式细胞仪测得的免疫小鼠脾脏中的产生IgG的CD3(-)CD138(+)B220(+)血浆B细胞的频率。例如，图15C显示了免疫小鼠脾脏中检测到的血浆B细胞的代表性FACS图(左图)和平均频率(右图)。血浆CD138(-)B220(+)B细胞的百分比显示在每个点图的左上方。
图21D显示了在第二次免疫后14天(即第28天)，通过ELISpot对免疫血清中SARS-CoV-2来源的B细胞表位特异性IgG反应(IgG(+)斑点的数量)进行定量。用小鼠Poly-S(免疫斑点)体外B细胞多克隆刺激4天后，产生抗肽特异性IgG的B细胞斑点(1×106个脾细胞/孔)的代表性ELISpot图像(左图)和平均频率(右图)。每个ELISpot图像的顶部/左侧显示了每50万个细胞中产生IgG的B细胞的数量。ELISA板涂有每种单独的免疫肽。
图21E显示了在减去从模拟接种小鼠测得的背景后，通过ELISA测量的B细胞表位特异性IgG浓度(μg/mL)，其为在肽免疫的B6小鼠中检测到的IgG的水平。虚线表示检测限。
图21F和图21G显示了在减去从健康非暴露个体(n＝10)测得的背景后，通过ELISA测量的B细胞表位特异性IgG浓度(μg/mL)，其为在22种刺突肽中各自检测到的IgG水平(n＝40)。黑条和灰条分别表示高免疫原性和中免疫原性的B细胞肽。虚线表示检测限。
图22显示了一个包含突变(包括6个脯氨酸突变)的全刺突蛋白的实例。这6个脯氨酸突变包括单点突变F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P。此外，刺突蛋白包含弗林蛋白酶切割位点的682-QQAQ-685突变(关于蛋白酶抗性)。在一些实施方式中，K986P突变和V987P突变使得预融合稳定。图22还显示了如下序列：MFVFLV LLPLVSS(SEQ ID NO：188)、ATGTTCGTTCCTGGTGCTGCCTGGTGAGCAGC(SE Q ID NO：175)、CAGCAGGCCCAG(SEQ ID NO：189)和CCCCCC(SEQ ID NO：190)。
图23显示了如何排列本文所述的组合物的大序列的非限制性实例。
图24显示了本发明的原型冠状病毒疫苗的示意图。本发明不限于如图所示的原型冠状病毒疫苗。
图25A显示了在人类中使用“初免/拉动(prime/pull)”方案递送本文所述疫苗组合物的方法的非限制性实例。该方法包括施用泛冠状病毒重组疫苗组合物，并在施用泛冠状病毒重组疫苗组合物后进一步施用至少一种T细胞吸引趋化因子(例如CXCL11)。
图25B显示了在人类中使用“初免/加强(prime/boost)”方案递送本文所述疫苗组合物的方法的非限制性实例。该方法包括使用第一递送系统施用第一组合物(例如第一剂泛冠状病毒重组疫苗组合物)，并进一步使用第二递送系统施用第二组合物(例如第二剂疫苗组合物)。在一些实施方式中，第一递送系统和第二递送系统不同。
图25C显示了在人类中使用“初免/拉动/保持(prime/pull/keep)”方案递送本文所述的疫苗组合物以增加和维持肺驻留B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量以防御SARS-CoV-2的方法的非限制性实例。该方法包括：施用泛冠状病毒重组疫苗组合物，以及在施用泛冠状病毒重组疫苗组合物后施用至少一种T细胞吸引趋化因子(例如CXCL11或CXCL17)。
图25D显示了在人类中使用“初免/拉动/加强(prime/pull/boost)”方案递送本文所述的疫苗组合物以增加和维持肺驻留B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量以防御SARS-CoV-2的方法的非限制性实例。该方法包括：施用泛冠状病毒重组疫苗组合物，以及在施用泛冠状病毒重组疫苗组合物后施用至少一种T细胞吸引趋化因子(例如CXCL11或CXCL17)。该方法还包括在施用T细胞吸引趋化因子(例如IL-7、IL-5或IL-2)后施用至少一种细胞因子。
图26A显示了在家畜(例如猫或犬)中使用“初免/拉动”方案递送本文所述疫苗组合物的方法的非限制性实例。该方法包括施用泛冠状病毒重组疫苗组合物，并在施用泛冠状病毒重组疫苗组合物后进一步施用至少一种T细胞吸引趋化因子(例如CXCL11)。
图26B显示了在家畜(例如猫或犬)中使用“初免/加强”方案递送本文所述疫苗组合物的方法的非限制性实例。该方法包括使用第一递送系统施用第一组合物(例如第一剂泛冠状病毒重组疫苗组合物)，并进一步使用第二递送系统施用第二组合物(例如第二剂疫苗组合物)。在一些实施方式中，第一递送系统和第二递送系统不同。
图26C显示了在家畜(例如猫或犬)中使用“初免/拉动/保持”方案递送本文所述的疫苗组合物以增加和维持肺驻留B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量以防御SARS-CoV-2的方法的非限制性实例。该方法包括：施用泛冠状病毒重组疫苗组合物，以及在施用泛冠状病毒重组疫苗组合物后施用至少一种T细胞吸引趋化因子(例如CXCL11或CXCL17)。
图26D显示了在家畜(例如猫或犬)中使用“初免/拉动/加强”方案递送本文所述的疫苗组合物以增加和维持肺驻留B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量以防御SARS-CoV-2的方法的非限制性实例。该方法包括：施用泛冠状病毒重组疫苗组合物，以及在施用泛冠状病毒重组疫苗组合物后施用至少一种T细胞吸引趋化因子(例如CXCL11或CXCL17)。该方法还包括在施用T细胞吸引趋化因子(例如IL-7、IL-5或IL-2)后施用至少一种细胞因子。
具体实施方式
术语
除非另有解释，本文使用的所有技术和科学术语与所公开的发明所属技术的普通技术人员通常理解的含义相同。除非上下文明确指出，否则单数术语“一个”、“一种”和“该”包括复数指称。同样地，除非上下文明确指出，否则表述“或”意在包括表述“和”。术语“包含”意味着除所提出的定义元素之外还可以存在其他元素。使用“包含”表示包括而不限于。换言之，术语“包含”意味着“主要包括，但不一定只包括”。此外，表述“包含”的变型，例如“包括”和“含有”，相应地具有相同含义。在一个方面，本文描述的技术(作为本发明的必要条件)与本文描述的组合物、方法及其各自成分有关，但对于包含未指明的元素是开放的，无论是否必要(“包含”)。
下面描述了用于实践和/或测试本公开的实施方式的合适方法和材料。此类方法和材料只是说明性的，并不意味着是限制性的。可以使用与本文描述的方法和材料相似或等同的其他方法和材料。例如，在各种一般性和更具体的参考文献中描述了本公开所涉及的本领域熟知的常规方法，这些方法包括例如：Sambrook等，Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第2版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989；Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版)，Cold Spring Harbor Press，2001；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates，1992(2000年增补)；Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology:ACompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(第4版)，Wiley&Sons，1999；Harlow和Lane，Antibodies:A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1990；Harlow和Lane,Using Antibodies:A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999，Gene Expression Technology(Methods in Enzymology，第185卷，D.Goeddel编辑，1991，Academic Press，圣地亚哥，加利福尼亚州)，Methods in Enzymology中的“Guide to Protein Purification”(M.P.Deutshcer编辑，1990，Academic Press,Inc.)；PCR Protocols:A Guide to Methodsand Applications(Innis等，1990，Academic Press，圣地亚哥，加利福尼亚州)，Cultureof Animal Cells:A Manual of Basic Technique(第2版)(R.I.Freshney，1987，Liss,Inc，纽约，纽约州)，Gene Transfer and Expression Protocols，第109-128页，E.J.Murray编辑，The Humana Press Inc.，克利夫顿，新泽西州)；以及Ambion1998Catalog(Ambion，奥斯汀，得克萨斯州)，其公开内容通过引用整体并入本文。
尽管与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于实践或测试所公开的技术，但下文描述了合适的方法和材料。这些材料、方法和实例仅是说明性的，而不意在是限制性的。
如本文所用，术语“免疫原性蛋白、多肽或肽”或“抗原”指具有免疫活性的多肽或其他分子(或多肽和其他分子的组合)，其一旦给宿主施用就能够引起针对该蛋白的体液和/或细胞类型的免疫反应。在实施方式中，蛋白片段具有与总蛋白基本上相同的免疫学活性。因此，根据本公开的蛋白质片段可以包含至少一种表位或抗原决定簇，或基本上由至少一种表位或抗原决定簇组成，或由至少一种表位或抗原决定簇组成。如本文所用，“免疫原性”蛋白质或多肽可包括蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。“免疫原性片段”指包含一个以上表位从而引发上述免疫学反应的蛋白质的片段。
合成抗原也包括在定义内，例如多表位、侧翼表位和其他重组或合成来源的抗原。用于本公开目标的免疫原性片段可以以具有分子的至少约1个氨基酸、至少约3个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约10至15个氨基酸或约15至25个氨基酸或更多氨基酸为特征。片段的长度没有关键上限，它可以包括几乎全长蛋白序列、或全长蛋白序列、或甚至包含至少一个蛋白质表位的融合蛋白。
如本文所用，术语“表位”指抗原或半抗原上特异性B细胞和/或T细胞应答的位点。该术语也可与“抗原决定簇”或“抗原决定簇位点”互换使用。识别相同表位的抗体可通过简单的免疫测定法(显示一种抗体阻止另一种抗体与靶抗原结合的能力)来鉴定。
如本文所用，对组合物或疫苗的“免疫学反应”指在宿主体内对感兴趣的组合物或疫苗产生的细胞和/或抗体介导的免疫反应。通常，“免疫学反应”包括但不限于以下一种以上效应：产生抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞，特异性地针对感兴趣的组合物或疫苗中包含的抗原。宿主可以表现出治疗性或保护性的免疫反应，因此对新感染的抵抗力将被增强和/或疾病的临床严重程度被降低。此种保护将通过受感染宿主通常表现出的症状减少或消失、恢复时间更快和/或受感染宿主的病毒滴度降低来证明。
如本文所用，术语“变体”指基本上相似的序列。对于多核苷酸，变体包括在天然多核苷酸的一个以上位点处的一个以上核苷酸的删除和/或添加和/或改变，和/或在天然多核苷酸的一个以上位点处的一个以上核苷酸的取代。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含自然产生的核苷酸序列或氨基酸序列。本公开的特定多核苷酸(例如参考多核苷酸)的变体也可通过比较变体多核苷酸编码的多肽和参考多核苷酸编码的多肽的序列同一性百分比来进行评估。“变体”蛋白指通过在天然蛋白的一个以上位点处删除或添加一个以上氨基酸和/或在天然蛋白的一个以上位点处取代一个以上氨基酸而衍生自天然蛋白的蛋白。本公开所包含的变体蛋白具有生物活性，即它们具有引发免疫反应的能力。
本文提到的HLA-DR/HLA-A*0201/hACE2三重转基因小鼠模型是用于临床前测试人COVID-19疫苗候选物的新型易感动物模型(来源于将ACE2转基因小鼠与独特的HLA-DR/HLA-A*0201双重转基因小鼠杂交)。ACE2转基因小鼠是一种hACE2转基因小鼠模型，其在肺部、心脏、肾脏和肠道表达人ACE2受体(Jackson Laboratory，巴尔港，缅因州)。HLA-DR/HLA-A*0201双重转基因小鼠是“人源化”的HLA双重转基因小鼠，其表达人白细胞抗原HLA-A*0201第I类和HLA DR*0101第II类以替代相应的小鼠MHC分子(被敲除)。选择HLA-A*0201单倍型是因为它在人群中具有高度代表性(>50％)，无论种族或民族。HLA-DR/HLA-A*0201/hACE2三重转基因小鼠模型是一种“人源化”转基因小鼠模型并具有如下三个优点：(1)对人SARS-CoV2感染易感；(2)出现与人COVID-19相似的症状；以及(3)出现针对人类表位的CD4+T细胞和CD8+T细胞反应。本发明的新型HLA-DR/HLA-A*0201/hACE2三重转基因小鼠模型可用于本发明的人类多表位COVID-19疫苗候选物的安全性、免疫原性和保护效力的临床前测试。
如本文所用，术语“治疗”或“医治”或“处理”指治疗性处理和预防性或预防措施，其中目标是预防或减缓疾病的发展，例如减缓病症发展或减少病况、疾病或病症(例如任何以器官或组织功能不足或不良为特征的疾病)的至少一种不利影响或症状。如果一种以上症状或临床标志物如本文所定义地减少，则治疗通常是“有效的”。此外，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。换言之，“治疗”不仅包括症状的改善或疾病标志物的减少，还包括在没有治疗的情况下预期的症状的停止或减缓进展或恶化。有益的或期望的临床结果包括但不限于一种以上症状的减轻、疾病程度的减轻、疾病状态的稳定(例如不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分还是全部)，无论可检测到或不可检测到。“治疗”也可以指与如果不接受治疗的预期生存期相比生存期被延长。“治疗”还包括改善疾病、减轻其并发症的严重程度、预防其显现、预防其复发、仅预防其恶化、减轻其中包括的炎症反应或影响前述任一项的治疗努力(即使此种治疗努力最终没有成功)。
如本文所用，术语“载体”或“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”指用于将组合物引入受试者的任何合适或有用的载体或赋形剂。药学上可接受的载体或赋形剂可以为但不限于常规赋形剂。例如，E.W.Martin，Remington's PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Co.(宾夕法尼亚州伊斯顿)，第15版(1975)和D.B.Troy编辑，Remington:The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott Williams&Wilkins，Baltimore,MD和Philadelphia,PA，第21版(2006)描述了适合于药物递送一种以上治疗性化合物或分子的组合物和制剂。载体(例如药物载体、药物赋形剂、药物组合物、药物分子等)是一般已知的可将分子、蛋白质、细胞和/或药物和/或其他合适材料送入人体的材料。一般而言，载体的性质将取决于所递送的成分的性质以及所采用的特定施用方式。除生物中性的载体之外，施用的药物组合物还可含有少量的非毒性辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等。描述药物载体的专利包括但不限于：美国专利号6,667,371；美国专利号6,613,355；美国专利号6,596,296；美国专利号6,413,536；美国专利号5,968,543；美国专利号4,079,038；美国专利号4,093,709；美国专利号4,131,648；美国专利号4,138,344；美国专利号4,180,646；美国专利号4,304,767；美国专利号4,946,931，其公开内容通过引用整体并入本文。例如，载体可以为固体、液体(例如溶液)、泡沫、凝胶等或它们的组合。在一些实施方式中，载体包括生物基质(例如生物纤维等)。在一些实施方式中，载体包括合成基质(例如合成纤维等)。在某些实施方式中，载体的一部分可以包含生物基质、一部分可以包含合成基质。
如本文所用，“冠状病毒”可指一组相关的病毒，例如但不限于严重急性呼吸系统综合症(SARS)、中东呼吸系统综合症(MERS)和严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)。所有冠状病毒均会导致哺乳动物呼吸道感染，范围从轻微到致命。本文描述了冠状病毒株的几个非限制性实例。
如本文所用，“严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV2)”是导致冠状病毒病19(COVID-19)的β冠状病毒。
“受试者”是个体，包括但不限于哺乳动物(例如人、马、猪、兔、犬、绵羊、山羊、非人类灵长类动物、牛、猫、豚鼠或啮齿动物)、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。该术语并不表示特定的年龄或性别。因此，意在包括成人和新生儿以及胎儿，无论男性或女性。患者“指患有某种疾病或病症的受试者。术语”患者“包括人类和兽类受试者。
术语“施用”和“给药”指向受试者提供药物制剂的方法。此类方法为本领域技术人员熟知，包括但不限于通过口服、肠胃外(例如静脉内和皮下)、肌肉注射、腹膜内注射、鞘内、经皮、体外、局部等来施用组合物。
组合物还可通过局部鼻内施用(鼻内地)或通过吸入剂施用。如本文所用，“局部鼻内施用”指通过一个或两个鼻腔将组合物递送到鼻子和鼻道中，并且可以包括通过喷洒机制(装置)或液滴机制(装置)或通过组合物的气溶胶进行递送。通过吸入剂施用组合物可通过鼻子或嘴，通过喷雾或液滴机制的递送。如本文所用，“吸入器”可以为喷雾装置或液滴装置，用于将包含疫苗组合物的组合物(在药学上可接受的载体中)递送至受试者的鼻腔和上和/或下呼吸道。也可通过气管内插管直接递送至呼吸系统的任何区域(例如肺部)。所需组合物的确切量将因受试者而异，取决于受试者的物种、年龄、体重和一般状况、被治疗疾病的严重程度、所使用的特定组合物、其施用方式等。因此，不可能为每种组合物规定精确的量。然而，本领域的普通技术人员可以根据本文的教导仅使用常规实验来确定合适的量。
组合物也可通过口腔递送或舌下递送施用。如本文所用，“口腔递送”可指其中化合物通过脸颊内粘膜递送的施用方法。在一些实施方式中，对于口腔递送，疫苗组合物被置于患者的牙龈和脸颊之间。如本文所用，“舌下递送”可指其中化合物通过舌头下粘膜递送的施用方法。在一些实施方式中，对于舌下递送，疫苗组合物在患者舌头下施用。
如果采用肠胃外施用组合物，一般以注射为特征。注射剂可以以常规形式制备，可以为液体溶液或悬浮液，或适合在注射前在液体中的悬浮液溶液的固体形式，或乳剂。最近修订的肠胃外施用方法涉及使用缓释或持续释放系统，从而保持恒定剂量。参见例如美国专利号3,610,795，其通过引用并入本文。
本发明的详细描述
在公开和描述本发明的化合物、组合物和/或方法之前，应理解本发明不限于具体合成方法或具体组合物，因为这些当然可以改变。还应理解，本文使用的术语只是为了描述特定的实施方式，而不意在是限制性的。如果本发明的实施方式不相互排斥，则可以自由地相互结合。
泛冠状病毒疫苗
本发明涉及预防性的泛冠状病毒疫苗、使用方法和生产所述疫苗的方法、预防冠状病毒感染的方法等。本发明还提供了测试所述疫苗的方法，例如，使用特定的动物模型和临床试验。本发明的疫苗组合物可以诱导针对冠状病毒疾病或感染的有效和强力的保护，例如通过诱导产生抗体(Ab)、CD4+T辅助(Th1)细胞和CD8+细胞毒性T细胞(CTL)。
本文的疫苗组合物(例如抗原)具有多个大序列，其可包含多种保守表位，这有助于为身体提供多种机会来产生免疫反应以预防感染。此外，本文的疫苗可被设计为对过去、现在和未来的冠状病毒爆发有效。
疫苗组合物包含多个大序列。在某些实施方式中，大序列为保守大序列，例如在人类冠状病毒和/或动物冠状病毒中高度保守的序列(例如从易受冠状病毒感染的动物中分离的冠状病毒)。
本发明描述了识别包括B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表位的保守大序列。例如，图1显示了具有多种保守大序列的预防性的泛冠状病毒疫苗的开发示意图，这些大序列包含多种B细胞表位、多种保守CD8+T细胞表位和多种CD4+T细胞表位。这些大序列来源于许多冠状病毒的序列分析。
用于确定保守大序列的冠状病毒可包括人SARS-CoV以及本文所述的动物(例如蝙蝠、穿山甲、果子狸、貂、骆驼等)CoV。作为示例，图2A和图2B显示了从人类和动物中分离的β冠状病毒株的基因组序列的进化比较。图2A显示了在SARS-CoV-2株(获自人类(HomoSapiens(黑色)))和获自如下的动物SARS样冠状病毒基因组序列(SL-CoV)序列之间进行的系统发育分析：蝙蝠(Rhinolophus affinis，Rhinolophus malayanus(红色))、穿山甲(Manis javanica(蓝色))、果子狸(Paguma larvata(绿色))和骆驼(Camelus dromedaries(棕色))。所包括的SARS-CoV/MERS-CoV株来自先前的爆发(获自人类(乌尔巴尼，MERS-CoV，OC43，NL63，229E，HKU1-基因型B)、蝙蝠(WIV16，WIV1，YNLF-31C，Rs672，重组株系)、骆驼(Camelus dromedaries(KT368891.1，MN514967.1，KF917527.1，NC_028752.1))和果子狸(果子狸007，A022，B039))。人SARS-CoV-2基因组序列的代表来自六大洲。图2B显示了在来自六大洲报告的人SARS-CoV-2基因组序列以及获自蝙蝠(Rhinolophus affinis，Rhinolophus malayanus)和穿山甲(Manis javanica)的SARS-CoV-2基因组序列中进行的进化分析。
此外，其他冠状病毒可用于确定符合分类为“关注的变体”或“感兴趣的变体”标准的保守大序列，包括人SARS-CoV以及动物(例如蝙蝠、穿山甲、果子狸、貂、骆驼等)CoV。看起来符合上述一个以上下述标准的冠状病毒变体可以被标记为“感兴趣的变体”或“调查中的变体”，以待对这些特性进行验证和确认。在一些实施方式中，标准可包括传播性增加、发病率增加、死亡率增加、“长COVID”风险增加、逃避诊断测试的能力、对抗病毒药物的敏感性降低(如果且当此种药物可用时)、对中和抗体的敏感性降低，无论治疗性(例如恢复期血浆或单克隆抗体)或在实验室实验中，逃避自然免疫的能力(例如导致再感染)、感染疫苗接种者的能力、特定病况(例如多系统炎症综合征或长程COVID)风险增加或对特定人口或临床群体(例如儿童或免疫力低下的人)的亲和力增加。一旦验证了感兴趣的变体，就会被监测组织(例如CDC)重新命名为“关注的变体”。
保守的大序列可来源于冠状病毒的结构蛋白(例如刺突糖蛋白、包膜蛋白、膜蛋白、核蛋白)或非结构蛋白(例如由ORF1a/b编码的16种NSP中的任一种)。
在一些实施方式中，大序列各自在如下中的一种或组合中高度保守：SARS-CoV-2人类株系、从蝙蝠分离的SL-CoV、从穿山甲分离的SL-CoV、从果子狸分离的SL-CoV，以及从骆驼分离的MERS株系。例如，在某些实施方式中，大序列各自在如下中的一种或组合中高度保守：至少50000种SARS-CoV-2人类株系、5种从蝙蝠分离的SL-CoV、5种从穿山甲分离的SL-CoV、3种从果子狸分离的SL-CoV，以及4种从骆驼分离的MERS株系。在某些实施方式中，大序列各自在如下中的一种或组合中高度保守：至少80000种SARS-CoV-2人类株系、5种从蝙蝠分离的SL-CoV、5种从穿山甲分离的SL-CoV、3种从果子狸分离的SL-CoV，以及4种从骆驼分离的MERS株系。在某些实施方式中，大序列各自在如下中的一种或组合中高度保守：在COVI-19疫情期间流行的至少50000种SARS-CoV-2人类株系、导致先前人类爆发的至少一种CoV、从蝙蝠分离的5种SL-CoV、从穿山甲分离的5种SL-CoV、从果子狸分离的3种SL-CoV，以及从骆驼分离的4种MERS株系。在某些实施方式中，大序列各自在目前流行的至少1种SARS-CoV-2人类株系、导致先前人类爆发的至少一种CoV、从蝙蝠分离的至少一种SL-CoV、从穿山甲分离的至少一种SL-CoV、从果子狸分离的至少一种SL-CoV和从骆驼分离的至少一种MERS株系中高度保守。在某些实施方式中，大序列各自在目前流行的至少1000种SARS-CoV-2人类株系、导致先前人类爆发的至少两种CoV、从蝙蝠分离的至少两种SL-CoV、从穿山甲分离的至少两种SL-CoV、从果子狸分离的至少两种SL-CoV，以及从骆驼分离的至少两种MERS株系中高度保守。在某些实施方式中，大序列各自在如下中的一种或组合中高度保守：目前流行的至少一种SARS-CoV-2人类株系、先前导致人类爆发的至少一种CoV、从蝙蝠分离的至少一种SL-CoV、从穿山甲分离的至少一种SL-CoV、从果子狸分离的至少一种SL-CoV，以及从骆驼分离的至少一种MERS株系。本发明不限于上述可用于鉴定保守大序列的冠状病毒株。
在某些实施方式中，一个以上保守大序列来源于一种以上目前流行的SARS-CoV-2人类株系或变体；一种以上先前导致人类爆发的冠状病毒；一种以上从动物中分离的冠状病毒，所述动物选自蝙蝠、穿山甲、果子狸、貂、骆驼和其他容易感染冠状病毒的动物；和/或一种以上导致普通感冒的冠状病毒。目前流行的SARS-CoV-2人类株系和变体可包括原始SARS-CoV-2株(SARS-CoV-2分离物武汉-人-1)和SARS-CoV-2的几种变体，包括但不限于：西班牙株系B.1.177；澳大利亚株系B.1.160；英国株系B.1.1.7；南非株系B.1.351；巴西株系P.1；加利福尼亚株系B.1.427/B.1.429；苏格兰株系B.1.258；比利时/荷兰株系B.1.221；挪威/法国株系B.1.367；挪威/丹麦/英国株系B.1.1.277；瑞典株系B.1.1.302；北美、欧洲、亚洲、非洲和澳大利亚株系B.1.525；以及纽约株系B.1.526。本发明不限于上述SARS-CoV-2的变体，还包括未来鉴定出的变体。一种以上导致普通感冒的冠状病毒可包括但不限于229E(α冠状病毒)、NL63(α冠状病毒)、OC43(β冠状病毒)、HKU1(β冠状病毒)等株系。
如本文所用，术语”保守“指在序列比对和分析中鉴定出的最高度保守的大序列中的大序列。例如，保守的大序列可以为鉴定出的2个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的3个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的4个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的5个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的6个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的7个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的8个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的9个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的10个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的15个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的20个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的25个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的30个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的40个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的50个最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的50％最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的60％最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的70％最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的80％最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的90％最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的95％最高度保守的序列。在一些实施方式中，保守的大序列可以为鉴定出的99％最高度保守的序列。本发明不限于上述阈值。
图3A显示了本发明中采用的系统生物学方法的一个实例。
在一些实施方式中，组合物包含一个以上大序列。在一些实施方式中，一个以上大序列包含一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位、一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位和一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位中的至少一种。
在其他实施方式中，疫苗组合物包含两个以上大序列。在一些实施方式中，两个以上大序列包含一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位、一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位和一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位中的至少一种。
在一些实施方式中，大序列包含一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位和一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位。在一些实施方式中，大序列包含一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位和一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位。在一些实施方式中，大序列包含一种以上保守的冠状病毒CD8+靶表位和一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位。在一些实施方式中，大序列包含一种以上保守的冠状病毒CD8+靶表位。在一些实施方式中，大序列包含一种以上保守的冠状病毒CD4+靶表位。在一些实施方式中，大序列包含一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位。
在一些实施方式中，疫苗组合物包含一种以上保守的冠状病毒CD8+靶表位。在一些实施方式中，疫苗组合物包含一种以上保守的冠状病毒CD4+靶表位。在一些实施方式中，疫苗组合物包含一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位。
如本文将讨论的，在某些实施方式中，疫苗组合物包含：全刺突蛋白；一种以上冠状病毒CD4+T细胞靶表位；以及一种以上冠状病毒CD8+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含：刺突蛋白的至少一部分(例如其中该部分包含三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD))；一种以上冠状病毒CD4+T细胞靶表位；以及一种以上冠状病毒CD8+T细胞靶表位。在一些实施方式中，一种以上冠状病毒CD4+T细胞靶表位和一种以上冠状病毒CD8+T细胞靶表位可以为大序列的形式。
大序列可以各自被接头隔开。在某些实施方式中，接头允许酶在大序列之间进行切割。本发明不限于特定的接头或特定长度的接头。作为示例，在某些实施方式中，一个以上大序列可被长度为2个氨基酸的接头隔开。在某些实施方式中，一个以上大序列可被长度为3个氨基酸的接头隔开。在某些实施方式中，一个以上大序列可被长度为4个氨基酸的接头隔开。在某些实施方式中，一个以上大序列可被长度为5个氨基酸的接头隔开。在某些实施方式中，一个以上大序列可被长度为6个氨基酸的接头隔开。在某些实施方式中，一个以上大序列可被长度为7个氨基酸的接头隔开。在某些实施方式中，一个以上大序列可被长度为8个氨基酸的接头隔开。在某些实施方式中，一个以上大序列可被长度为9个氨基酸的接头隔开。在某些实施方式中，一个以上大序列可被长度为10个氨基酸的接头隔开。在某些实施方式中，一个以上大序列可被长度为2至10个氨基酸的接头隔开。
接头为本领域普通技术人员熟知。接头的非限制性实例包括AAY、KK和GPGPG。
大序列可以来源于结构蛋白、非结构蛋白或它们的组合。例如，结构蛋白可包括刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)或核蛋白(N)。
在一些实施方式中，大序列来源于至少一种SARS-CoV-2蛋白。SARS-CoV-2蛋白可包括ORF1ab蛋白、刺突糖蛋白、ORF3a蛋白、包膜蛋白、膜糖蛋白、ORF6蛋白、ORF7a蛋白、ORF7b蛋白、ORF8蛋白、核衣壳蛋白和ORF10蛋白。ORF1ab蛋白提供非结构蛋白(Nsp)，例如Nsp1、Nsp2、Nsp3(木瓜样蛋白酶)、Nsp4、Nsp5(3C样蛋白酶)、Nsp6、Nsp7、Nsp8、Nsp9、Nsp10、Nsp11、Nsp12(RNA聚合酶)、Nsp13(5’RNA三磷酸酶)、Nsp14(鸟苷N7-甲基转移酶)、Nsp15(内切核糖核酸酶)和Nsp16(2’-O-核糖-甲基转移酶)。
SARS-CoV-2的基因组长度为29903个碱基对(bp)ssRNA(SEQ ID NO：1)。一般而言，266至21555bp的区域编码ORF1ab多肽；21563至25384bp的区域编码结构蛋白之一(刺突蛋白或表面糖蛋白)；25393至26220bp的区域编码ORF3a基因；26245至26472bp的区域编码包膜蛋白；26523至27191的区域编码膜糖蛋白(或膜蛋白)；27202至27387bp的区域编码ORF6基因；27394至27759bp的区域编码ORF7a基因；27894至28259bp的区域编码ORF8基因；28274至29533bp的区域编码核衣壳磷蛋白(或核衣壳蛋白)；以及29558至29674bp的区域编码ORF10基因。
大序列可包括T细胞表位，该T细胞表位受大量人类1类和2类HLA单倍型限制，而不受1类的HLA-0201或2类的HLA-DR限制。保守的大序列可以受人类HLA 1类和2类单倍型限制。在一些实施方式中，保守的表位受猫和犬MHC 1类和2类单倍型限制。
大序列
抗原可包含大序列，例如在人类和动物冠状病毒中高度保守的大序列。如本文所用，术语“大序列”指具有至少25个氨基酸或至少75个核苷酸的序列。大序列包含表位，例如本文所述的保守表位。
为了识别保守大序列，如此处和下文所述地进行序列比对和分析。
SARS-CoV-2和先前冠状病毒株的序列比较：我们进行了序列同源性分析，并比较了严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)分离物武汉-人-1，以完成SARS-CoV-2变体、普通感冒冠状病毒株(HKU1基因型B、CoV-OC43、CoV-NL63和CoV-229E)、SARS-CoV-乌尔巴尼、MERS以及来自蝙蝠(Rhinolophus affinis和R.Malayanus)、穿山甲(Manisjavanica)、果子狸(Paguma larvata)和骆驼(Camelus dromedarius和C.bactrianus)的冠状病毒株的序列的基因组。
人SARS-CoV-2变体基因组序列从GISAID数据库检索得到，代表了主要关注的变体(已知具有高度的传播性和致病性)。本研究使用的序列为：来自西班牙的20A.E U1(EPI_ISL_691726-hCoV-19-VOC-20A.EU1)、来自澳大利亚的20A.EU2(EPI_ISL_418799-hCoV-19-VOC-20A.EU2)、来自英格兰的B.1.1.7(EPI_ISL_581117-hCoV-19-VOC-B.1.1.7)、来自南非的B.1.351(EPI_ISL_660615-hCoV-19-VOC-B.1.351)、来自巴西的P.1(EPI_ISL_581117-hCoV-19-VOC-P.1)、来自加利福尼亚的CAL.20C(EPI_ISL_730092-hCoV-19-VOC-B.1.427/B.1.429)、来自苏格兰的B.1.258(EPI_ISL_858559-hCoV-19-VOC-B.1.258)、来自比利时/荷兰的B.1.221(EPI_ISL_734790-hCoV-19-VOC-B.1.221)、来自挪威/法国的B.1.367(EPI_ISL_541518-hCoV-19-VOC-B.1.367)、来自荷兰/丹麦/英国的B.1.1.277(EPI_ISL_500783-hCoV-19-VOC-B.1.1.277)、来自瑞典的B.1.1.302(EPI_ISL_717929-hCoV-19-VOC-B.1.1.302)。类似地，HKU1基因型B(AY884001)、CoV-OC43(K F923903)、CoV-NL63(NC_005831)、CoV-229E(KY983587)、SARS-CoV-乌尔巴尼(AY278741.1)和MERS(NC_019843)。
本分析中使用的蝙蝠CoV株包括株系RaTG13(MN996532.2)、Rs672/2006(FJ5886.1)、YNLF_31C(KP886808.1)、WIV1(KF367457.1)、WIV16(KT444582.1)、ZXC21(MG772934.1)、RmYN02(EPI_ISL_412977)、蝙蝠-RmYN01(EPI_ISL_412976)、MERS-蝙蝠-CoV/P.khulii/意大利/206645-63/2011(MG596803.1)。此外，代表穿山甲的5种基因组序列(MT040333.1-PCoV_GX-P4L、MT040334.1-PCoV_GX-P1E、M T040335.1-PCoV_GX-P5L、MT040336.1-PCoV_GX-P5E、MT072864.1-PCoV_GX-P2V、M T121216.1-PCoV-MP789)、3种果子狸特异性基因组序列(AY572034.1、AY686864.1、A Y686863.1)以及来自骆驼的4种CoV序列(NC_028752.1、KF917527.1、MN514967.1、KT368891.1)被序列同源性分析包括在内，旨在评估CoV基因组中不同结构和非结构蛋白的最保守区域。这些序列从美国国家生物技术信息中心(NCBI)或全球共享流感数据倡议(GISAID)获得。为了进行系统发育分析，SARS-CoV-2全基因组序列使用MEGAX用C LUSTAL W进行比对。使用在线NCBI BLAST将所有SARS-CoV-2序列与现有基因组进行比较。
SARS-CoV-2序列保守性的测定：使用核苷酸BLAST(BLASTN)算法，将每种武汉-人-1(GeneBank：NC_045512.2)特定结构蛋白(刺突糖蛋白(YP_009724390.1)、膜蛋白(YP_009724393.1)、包膜蛋白(YP_009724392.1)、核衣壳磷蛋白(YP_009724397.2))和非结构蛋白(ORF1a/b多聚蛋白(YP_009724389.1)、ORF3a(YP_009724391.1)、ORF6(YP_009724394.1)、ORF7a(YP_009724395.1)、ORF7b(YP_009725318.1)、ORF8(YP_009724396.1)和ORF10(YP_009725255.1))序列与SARS-CoV和MERS-CoV的共有蛋白序列以及最近亲缘交叉物种CoV株系的蛋白序列进行比较，计算武汉-人-1蛋白与它们的比较靶标的配对同一性。
此外，由于本发明对各CoV株系中高度相似的序列感兴趣，因此进行了MEGABLAST。对于每个被查询的序列，确定查询覆盖度、E值、同一性百分比。针对一种蝙蝠CoV株系RmYN01(早先发现其与SARS-CoV-2在系统发育上相似度较低，但与SARS-CoV-乌尔巴尼有更多的基因相似性)得到的查询同源性被用作确定各CoV株系同源性序列的标准。该策略有助于找出不同CoV之间遗传上更保守的区域。该序列的查询覆盖度为59％，与SARS-CoV-2基因组序列相比的同一性百分比为78.73％。它有5个匹配区域，这些区域在其他CoV中也显示出了序列同源性。跨越1bp至1580bp的匹配区域1(片段)显示出与nsp1(前导蛋白)、nsp2和nsp3的序列同源性，而跨越3547bp至7096bp的匹配区域2(片段2)显示出与ORF1a/b的多个亚基(例如3CLpro、nsp6、nsp7、nsp8、nsp9、nsp10、RNA依赖型RNA聚合酶、解旋酶、nsp14、nsp15和nsp16)的序列同源性。有趣的是，跨越ORF1a/b的非注释区域17472bp至21156bp的一个主要区域(片段3)也显示出了序列同一性。第四段序列同一性跨越22584bp至24682bp(片段4)，覆盖了刺突糖蛋白的一部分，重要的是它也覆盖了SARS-CoV-2的主要受体结合结构域。同源序列的最后一段(26193bp至27421bp；片段5)与ORF3a、包膜蛋白、膜蛋白、ORF6和ORF7a的特定区域显示出同一性百分比。
在一些实施方式中，发现来自SARS-CoV-2武汉株的5个片段高度保守：(1bp至1580bp(片段1)、3547bp至12830bp(片段2)、17472bp至21156bp(片段3)、22584bp至24682bp(片段4)和26193bp至27421bp(片段5)。接下来，对每个片段均进行了另一轮序列同源性分析。
在一些实施方式中，疫苗组合物包含一个大序列。在一些实施方式中，疫苗组合物包含一个以上大序列。在一些实施方式中，疫苗组合物包含两个以上大序列。在一些实施方式中，疫苗组合物包含三个以上大序列。在一些实施方式中，疫苗组合物包含：四个以上大序列。在一些实施方式中，疫苗组合物包含5个以上大序列，例如，5个、6个、7个、8个等。
在一些实施方式中，大序列来源于由SARS-CoV-2表达的全蛋白序列。在其他实施方式中，大序列来源于由SARS-CoV-2表达的部分蛋白序列。在一些实施方式中，所述蛋白质的大序列包含B细胞表位和T细胞表位，这些表位受大量(例如3至10种)不同的单倍型限制，这些单倍型涵盖了100％群体(无论种族和民族)的人类1类和2类HLA单倍型，因此它们仅不受1类的HLA-0201或2类的HLA-DR1限制。
如前所述，大序列在人类和动物冠状病毒中可能是高度保守的。在一些实施方式中，大序列来源于如下中的一种或组合：一种以上目前流行的SARS-CoV-2人类株系或变体；一种以上先前导致人类爆发的冠状病毒；一种以上从动物中分离的冠状病毒，所述动物选自蝙蝠、穿山甲、果子狸、貂、骆驼和其他容易感染冠状病毒的动物；和/或一种以上导致普通感冒的冠状病毒。
如前所述，目前流行的SARS-CoV-2人类株系或变体可包括：株系B.1.177；株系B.1.160；株系B.1.1.7；株系B.1.351；株系P.1；株系B.1.427/B.1.429；株系B.1.258；株系B.1.221；株系B.1.367；株系B.1.1.277；株系B.1.1.302；株系B.1.525；株系B.1.526；株系S:677H；以及株系S:677P。导致普通感冒的冠状病毒可选自：229Eα冠状病毒、NL63α冠状病毒、OC43β冠状病毒和HKU1β冠状病毒。
大序列可以来源于结构蛋白、非结构蛋白或它们的组合。大序列可选自ORF1ab蛋白、刺突糖蛋白(例如RBD)、ORF3a蛋白、包膜蛋白、膜糖蛋白、ORF6蛋白、ORF7a蛋白、ORF7b蛋白、ORF8蛋白、核衣壳蛋白和/或ORF10蛋白。注意，ORF1ab蛋白包含非结构蛋白(Nsp)1、Nsp2、Nsp3、Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp7、Nsp8、Nsp9、Nsp10、Nsp11、Nsp12、Nsp13、Nsp14、Nsp15和Nsp16。
在一些实施方式中，大序列包含来自世界上大多数国家流行的超过150000种CoV株系的保守片段(表1，图4)。在一些实施方式中，片段1包含碱基对1至1580。在一些实施方式中，片段1可包含蛋白质Nsp1、Nsp2和Nsp3以及未注释区域(图5)。在一些实施方式中，片段2包含碱基对3547至12830。在一些实施方式中，片段2可包含蛋白质Nsp5、Nsp6、Nsp7、Nsp8、Nsp9、Nsp10、Nsp11、Nsp12、Nsp13、Nsp14、Nsp15、Nsp16以及未注释区域(图6)。在一些实施方式中，片段3包含碱基对17472至21156。在一些实施方式中，片段3包含未注释区域(图7)。在一些实施方式中，片段4包含碱基对22584至24682。在一些实施方式中，片段4包含刺突糖蛋白(图8)。在一些实施方式中，片段5包含碱基对26193至27421。在一些实施方式中，片段5包含蛋白质ORF3a、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、ORF6、ORF7a以及未注释区域(图9)。
表1
Figure GDA0004134896980000431
Figure GDA0004134896980000441
Figure GDA0004134896980000451
Figure GDA0004134896980000461
Figure GDA0004134896980000471
在一些实施方式中，大序列不限于上述保守片段。
在某些实施方式中，大序列包含刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分(例如RBD)、核蛋白或核蛋白的一部分、膜蛋白或膜蛋白的一部分，和/或ORF1a/b或ORF1a/b的一部分(参见表9，SEQ ID NO：139)。在某些实施方式中，大序列包含刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分(例如RBD)，核蛋白或核蛋白的一部分，以及ORF1a/b或ORF1a/b的一部分。在进一步实施方式中，大序列包含刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分(例如RBD)以及核衣壳蛋白或核衣壳蛋白的一部分(参见表9，SEQ ID NO：140)。
如本文将讨论的，在某些实施方式中，疫苗组合物包含：全刺突蛋白；一种以上冠状病毒CD4+T细胞靶表位；以及一种以上冠状病毒CD8+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含：刺突蛋白的至少一部分(例如其中该部分包含三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD))；一种以上冠状病毒CD4+T细胞靶表位；以及一种以上冠状病毒CD8+T细胞靶表位。在一些实施方式中，一种以上冠状病毒CD4+T细胞靶表位和一种以上冠状病毒CD8+T细胞靶表位为大序列的形式。
在一些实施方式中，大序列来源于全长刺突糖蛋白。在其他实施方式中，大序列来源于刺突糖蛋白的一部分。在一些实施方式中，刺突蛋白的跨膜锚具有完整的S1-S2切割位点。在一些实施方式中，刺突蛋白处于其稳定构象。在一些实施方式中，刺突蛋白通过在S2亚基的中心螺旋顶部的氨基酸986位和987位处用脯氨酸取代而稳定。在一些实施方式中，该组合物包含SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)。在一些实施方式中，该组合物包含三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)。在一些实施方式中，三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)序列通过添加T4纤维蛋白来源的折叠三聚体化结构域来进行修饰。在一些实施方式中，添加T4纤维蛋白来源的折叠三聚体化结构域通过多价显示增加免疫原性。
在一些实施方式中，刺突蛋白包含Tyr-489和Asn-487(例如Tyr-489和Asn-487有助于与ACE-2上的Tyr 83和Gln-24相互作用)。在一些实施方式中，刺突蛋白包含Gln-493(例如Gln-493有助于与ACE-2上的Glu-35和Lys-31相互作用)。在一些实施方式中，刺突蛋白包含Tyr-505(例如Tyr-505有助于与ACE-2上的Glu-37和Arg-393相互作用)。在一些实施方式中，该组合物包含S1-S2切割位点中的突变682-RRAR-685→682-QQAQ-685。
在一些实施方式中，包含大序列的刺突蛋白包含至少一个脯氨酸取代。在一些实施方式中，包含大序列的刺突蛋白包含至少两个脯氨酸取代。例如，脯氨酸取代可以在K986位和V987位。
序列的非限制性实例在表2中公开。
表2
Figure GDA0004134896980000491
Figure GDA0004134896980000501
Figure GDA0004134896980000511
Figure GDA0004134896980000521
Figure GDA0004134896980000531
如前所述，大序列中的每一个均被接头隔开。在一些实施方式中，接头为相同接头。在一些实施方式中，一个以上接头不同。例如，在一些实施方式中，每个大序列使用不同接头。如前所述，接头的非限制性实例包括T2A、E2A、P2A等。
如前所述，在某些实施方式中，疫苗递送系统包含腺病毒(例如但不限于Ad5、Ad26、Ad35等)和载体(例如脂质纳米颗粒、聚合物、肽等)。
CD8+表位
本文描述了鉴定潜在CD8+T细胞表位和筛选潜在CD8+T细胞表位的保守度的方法的实例。本发明不限于所公开的特定软件系统，本领域的普通技术人员可以使用其他软件系统来实现此类方法。本发明不限于本文所使用的特定单倍型。例如，本领域的普通技术人员可以选择替代分子(例如HLA分子)进行分子对接研究。
图10显示了用于筛选潜在CD8+T细胞表位的保守度的序列同源性分析，例如在81963种SARS-CoV-2株(目前在6大洲190个国家流行)、导致先前爆发的4种主要“普通感冒”冠状病毒(例如hCoV-OC43、hCoV-229E、hCoV-HKU1-基因型B和hCoV-NL63)，以及从蝙蝠、果子狸、穿山甲和骆驼分离的SL-CoV中进行潜在CD8+T细胞表位的序列同源性比较。黄色突出显示的表位序列在目前流行的81963种SARS-CoV-2株中呈现高度同源性，并且在先前爆发的两个以上人SARS-CoV株中以及从蝙蝠、果子狸、穿山甲和骆驼分离的SL-CoV株中呈现至少50％的保守度。
根据分析，27种CD8+T细胞表位被选为高度保守表位。图11A和图11B显示了保守表位与HLA-A*02:01分子沟的对接，以及通过蛋白质-肽分子对接分析确定的相互作用得分。
图12A、图12B和图12C显示，在COVID-19患者和未暴露的健康个体中检测到对本文公开的几种高度保守SARS-CoV-2表位具有特异性的CD8+T细胞。图13A、图13B、图13C和图13D显示了鉴定的SARS-CoV-2CD8+T细胞表位的免疫原性。
上文讨论的CD8+T细胞靶表位包括S2-10、S1220-1228、S1000-1008、S958-966、E20-28、ORF1ab1675-1683、ORF1ab2363-2371、ORF1ab3013-3021、ORF1ab3183-3191、ORF1ab5470-5478、ORF1ab6749-6757、ORF7b26-34、ORF8a73-81、ORF103-11和ORF105-13。图14显示了这些表位的全基因组位置。因此，在某些实施方式中，疫苗组合物可包含选自如下的一种以上CD8+T细胞表位：S2-10、S1220-1228、S1000-1008、S958-966、E20-28、ORF1ab1675-1683、ORF1ab2363-2371、ORF1ab3013-3021、ORF1ab3183-3191、ORF1ab5470-5478、ORF1ab6749-6757、ORF7b26-34、ORF8a73-81、ORF103-11、ORF105-13或它们的组合。下表3描述了上述表位区域的序列。
表3
<![CDATA[CD8<sup>+</sup>T细胞表位]]> 表位序列 SEQ ID NO：
<![CDATA[ORF1ab<sub>84-92</sub>]]> VMVELVAEL 2
<![CDATA[ORF1ab<sub>1675-1683</sub>]]> YLATALLTL 3
<![CDATA[ORF1ab<sub>2210-2218</sub>]]> CLEASFNYL 4
<![CDATA[ORF1ab<sub>2363-2371</sub>]]> WLMWLIINL 5
<![CDATA[ORF1ab<sub>3013-3021</sub>]]> SLPGVFCGV 6
<![CDATA[ORF1ab<sub>3183-3191</sub>]]> FLLNKEMYL 7
<![CDATA[ORF1ab<sub>3732-3740</sub>]]> SMWALIISV 8
<![CDATA[ORF1ab<sub>4283-4291</sub>]]> YLASGGQPI 9
<![CDATA[ORF1ab<sub>5470-5478</sub>]]> KLSYGIATV 10
<![CDATA[ORF1ab<sub>6419-6427</sub>]]> YLDAYNMMI 11
<![CDATA[ORF1ab<sub>6749-6757</sub>]]> LLLDDFVEI 12
<![CDATA[S<sub>2-10</sub>]]> FVFLVLLPL 13
<![CDATA[S<sub>691-699</sub>]]> SIIAYTMSL 14
<![CDATA[S<sub>958-966</sub>]]> ALNTLVKQL 15
<![CDATA[S<sub>976-984</sub>]]> VLNDILSRL 16
<![CDATA[S<sub>1000-1008</sub>]]> RLQSLQTYV 17
<![CDATA[S<sub>1220-1228</sub>]]> FIAGLIAIV 18
<![CDATA[E<sub>20-28</sub>]]> FLAFVVFLL 19
<![CDATA[E<sub>26-34</sub>]]> FLLVTLAIL 20
<![CDATA[E<sub>26-34</sub>]]> FLLNKEMYL 21
<![CDATA[M<sub>52-60</sub>]]> IFLWLLWPV 22
<![CDATA[M<sub>89-97</sub>]]> GLMWLSYFI 23
<![CDATA[ORF6<sub>3-11</sub>]]> HLVDFQVTI 24
<![CDATA[ORF7b<sub>26-34</sub>]]> IIFWFSLEL 25
<![CDATA[ORF8a<sub>31-39</sub>]]> YVVDDPCPI 26
<![CDATA[ORF8a<sub>73-81</sub>]]> YIDIGNYTV 27
<![CDATA[ORF10<sub>3-11</sub>]]> YINVFAFPF 28
<![CDATA[ORF10<sub>5-13</sub>]]> NVFAFPFTI 29
本发明不限于上述CD8+T细胞表位。例如，本发明还包括上述CD8+T细胞表位的变体，例如上述CD8+T细胞表位被截短一个氨基酸的序列(实例显示在表4中)。
表4
Figure GDA0004134896980000561
Figure GDA0004134896980000571
本发明不限于上述CD8+T细胞表位。
在某些实施方式中，疫苗组合物包含1至10种CD8+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含2至10种CD8+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含2至15种CD8+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含2至20种CD8+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含2至30种CD8+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含2至15种CD8+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含2至5种CD8+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含5至10种CD8+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含5至15种CD8+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含5至20种CD8+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含5至25种CD8+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含5至30种CD8+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含10至20种CD8+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含10至30种CD8+T细胞靶表位。
CD4+表位
本文描述了鉴定潜在CD4+T细胞表位和筛选潜在CD4+T细胞表位的保守度的方法实例。本发明不限于所公开的特定软件系统，本领域的普通技术人员可以使用其他软件系统来实现此类方法。本发明并不局于本文所使用的特定单倍型。例如，本领域的普通技术人员可以选择替代分子(例如HLA分子)进行分子对接研究。
图15显示了高度保守的潜在SARS-CoV-2来源的人CD4+T细胞表位的鉴定，这些表位以高亲和力与HLA-DR分子结合。从来自SARS-CoV-2-武汉-人-1株(MN908947.3)全基因组序列的总共9594个潜在的HLA-DR限制性CD4+T细胞表位中，选择了16种以高亲和力与HLA-DRB1分子结合的表位。对人类和动物冠状病毒中这16种CD4+T细胞表位的保守度进行了分析。显示了81963个SARS-CoV-2株(目前在6大洲流行)、导致先前爆发的4种主要“普通感冒”冠状病毒(即hCoV-OC43、hCoV-229E、hCoV-HKU1和hCoV-NL63)以及从蝙蝠、果子狸、穿山甲和骆驼分离的SL-CoV中的16种CD4+T细胞表位的序列同源性比较。绿色突出显示的表位序列在目前流行的81963种SARS-CoV-2株中呈现高度同源性，并且在先前爆发的两个以上人SARS-CoV株中以及从蝙蝠、果子狸、穿山甲和骆驼分离的SL-CoV株中呈现至少50％的保守度。
根据分析，16种CD4+T细胞表位被选为高度保守表位。图16A和图16B显示了保守表位与HLA-A*02:01分子沟的对接，以及通过蛋白质-肽分子对接分析确定的相互作用得分。
图17A、图17B和图17C显示，在COVID-19患者和未暴露的健康个体中检测到对本文公开的几种高度保守SARS-CoV-2表位具有特异性的CD4+T细胞。图18A、图18B、图18C和图18D显示了鉴定的SARS-CoV-2CD4+T细胞表位的免疫原性。
上文讨论的CD4+T细胞靶表位包括ORF1a1350-1365、ORF1ab5019-5033、ORF612-26、ORF1ab6088-6102、ORF1ab6420-6434、ORF1a1801-1815、S1-13、E26-40、E20-34、M176-190、N388-403、ORF7a3-17、ORF7a1-15、ORF7b8-22、ORF7a98-112和ORF81-15。图14显示了这些表位的全基因组位置。因此，在某些实施方式中，疫苗组合物可包含一种以上选自如下的CD4+T细胞靶表位：ORF1a1350-1365、ORF1ab5019-5033、ORF612-26、ORF1ab6088-6102、ORF1ab6420-6434、ORF1a1801-1815、S1-13、E26-40、E20-34、M176-190、N388-403、ORF7a3-17、ORF7a1-15、ORF7b8-22、ORF7a98-112、ORF81-15或它们的组合。下表5描述了上述表位区域的序列。
表5
<![CDATA[CD4<sup>+</sup>T细胞表位]]> 表位序列 SEQ ID NO：
<![CDATA[ORF1a<sub>1350-1365</sub>]]> KSAFYILPSIISNEK 58
<![CDATA[ORF1a<sub>1801-1815</sub>]]> ESPFVMMSAPPAQYE 59
<![CDATA[ORF1ab<sub>5019-5033</sub>]]> PNMLRIMASLVLARK 60
<![CDATA[ORF1ab<sub>6088-6102</sub>]]> RIKVQMLSDTLKNL 61
<![CDATA[ORF1ab<sub>6420-6434</sub>]]> LDAYNMMISAGFSLW 62
<![CDATA[S<sub>1-13</sub>]]> MFVFLVLLPLVSS 63
<![CDATA[E<sub>20-34</sub>]]> FLAFVVFLLVTLAIL 64
<![CDATA[E<sub>26-40</sub>]]> FLLVTLAILTALRLC 65
<![CDATA[M<sub>176-190</sub>]]> LSYYKLGASQRVAGD 66
<![CDATA[ORF6<sub>12-26</sub>]]> AEILLIIMRTFKVSI 67
<![CDATA[ORF7a<sub>1-15</sub>]]> MKIILFLALITLATC 68
<![CDATA[ORF7a<sub>3-17</sub>]]> IIFLALITLATCEL 69
<![CDATA[ORF7a<sub>98-112</sub>]]> SPIFLIVAAIVFITL 70
<![CDATA[ORF7b<sub>8-22</sub>]]> DFYLCFLAFLLFLVL 71
<![CDATA[ORF8b<sub>1-15</sub>]]> MKFLVFLGIITTVAA 72
<![CDATA[N<sub>388-4031</sub>]]> KQQTVTLLPAADLDDF 73
本发明不限于上述CD4+T细胞表位。例如，本发明还包括上述CD4+T细胞表位的变体，例如上述CD4+T细胞表位被截短一个以上氨基酸或延长一个以上氨基酸的序列(实例显示在表6中)。
表6
Figure GDA0004134896980000591
Figure GDA0004134896980000601
本发明不限于上述CD4+T细胞表位。
在某些实施方式中，疫苗组合物包含1至10种CD4+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含2至10种CD4+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含2至15种CD4+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含2至20种CD4+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含2至30种CD4+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含2至15种CD4+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含2至5种CD4+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含5至10种CD4+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含5至15种CD4+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含5至20种CD4+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含5至25种CD4+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含5至30种CD4+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含10至20种CD4+T细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含10至30种CD4+T细胞靶表位。
B细胞表位
本文描述了鉴定潜在B细胞表位和筛选潜在B细胞表位的保守度的方法的实例。本发明不限于所公开的特定软件系统，本领域的普通技术人员可以使用其他软件系统来实现此类方法。
图19显示了刺突来源的B细胞表位在人类、蝙蝠、果子狸、穿山甲和骆驼冠状病毒株中的保守度。使用ClustalW对获自人类、蝙蝠、果子狸、穿山甲和骆驼的29种SARS冠状病毒株(SARS-CoV)进行多序列比对。这包括：7种人SARS/MERS-CoV株(SARS-CoV-2-武汉(MN908947.3)、SARS-HCoV-乌尔巴尼(AY278741.1)、CoV-HKU1-基因型B(AY884001)、CoV-OC43(KF923903)、CoV-NL63(NC005831)、CoV-229E(KY983587)、MERS(NC019843))；8种蝙蝠株系SARS-CoV(蝙蝠-SL-CoV-WIV16(KT444582)、蝙蝠-SL-CoV-WIV1(KF367457.1)、蝙蝠-SL-CoV-YNLF31C(KP886808.1)、蝙蝠-SARS-CoV-RS672(FJ5886.1)、蝙蝠-CoV-RATG13(MN996532.1)、蝙蝠-CoV-YN01(EPIISL412976)、蝙蝠-CoV-YN02(EPIISL412977)、蝙蝠-CoV-19-ZXC21(MG772934.1)；3种果子狸SARS-CoV株(SARS-CoV-果子狸007(AY572034.1)、SARS-CoV-A022(AY686863.1)、SARS-CoV-B039(AY686864.1))；9种穿山甲SARS-CoV株(PCoV-GX-P2V(MT072864.1)、PCoV-GX-P5E(MT040336.1)、PCoV-GX-P5L(MT040335.1)、PCoV-GX-P1E(MT040334.1)、PCoV-GX-P4L(MT040333.1)、PCoV-MP789(MT084071.1)、PCoV-GX-P3B(MT072865.1)、PCoV-广东-P2S(EPIISL410544)、PCoV-广东(EPIISL410721))；4种骆驼SARS-CoV株(骆驼-CoV-HKU23(KT368891.1)、DcCoV-HKU23(MN514967.1)、MERS-CoV-吉达(KF917527.1)、利雅德/RY141(NC028752.1))；以及1种重组株(FJ211859.1)。蓝色突出显示的区域代表序列同源性。在两种以上SARS冠状病毒株中显示出至少50％的保守度或拥有受体结合结构域(RBD)特异性氨基酸的B细胞表位被选为候选表位。
根据分析，22种B细胞表位被选为高度保守表位。图20A和图20B显示了保守的表位与ACE2受体的对接，以及通过蛋白质-肽分子对接分析确定的相互作用得分。图21A、图21B、图21C、图21D、图21E、图21F和图21G显示了鉴定的SARS-CoV-2B细胞表位的免疫原性。
上文讨论的B细胞靶表位包括S287-317、S524-598、S601-640、S802-819、S888-909、S369-393、S440-501、S1133-1172、S329-363、S59-81和S13-37。图2B显示了这些表位的全基因组位置。因此，在某些实施方式中，疫苗组合物可包括一种以上选自如下的B细胞靶表位：S287-317、S524-598、S601-640、S802-819、S888-909、S369-393、S440-501、S1133-1172、S329-363、S59-81和S13-37。在一些实施方式中，B细胞表位为全刺突蛋白。在一些实施方式中，B细胞表位为刺突蛋白的一部分。下表7描述了上述表位区域的序列。
表7
Figure GDA0004134896980000621
本发明不限于上述B细胞表位。例如，本发明还包括上述B细胞表位的变体，例如上述B细胞表位被截短一个以上氨基酸或延长一个以上氨基酸的序列(实例显示在表8中)。
表8
Figure GDA0004134896980000631
如前所述，在一些实施方式中，B细胞表位为全刺突蛋白的形式。在一些实施方式中，B细胞表位为刺突蛋白的一部分的形式。在一些实施方式中，刺突蛋白的跨膜锚具有完整的S1-S2切割位点。在一些实施方式中，刺突蛋白处于其稳定构象。在一些实施方式中，刺突蛋白通过在S2亚基的中心螺旋顶部的氨基酸986位和987位处用脯氨酸取代而稳定。在一些实施方式中，该组合物包含三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)。在一些实施方式中，三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)序列通过添加T4纤维蛋白来源的折叠三聚体化结构域来进行修饰。在一些实施方式中，添加T4纤维蛋白来源的折叠三聚体化结构域通过多价显示增加免疫原性。图22显示了包含一个以上突变的刺突蛋白的非限制性实例。
在一些实施方式中，刺突蛋白包含Tyr-489和Asn-487(例如Tyr-489和Asn-487有助于与ACE-2上的Tyr 83和Gln-24相互作用)。在一些实施方式中，刺突蛋白包含Gln-493(例如Gln-493有助于与ACE-2上的Glu-35和Lys-31相互作用)。在一些实施方式中，刺突蛋白包含Tyr-505(例如Tyr-505有助于与ACE-2上的Glu-37和Arg-393相互作用)。在一些实施方式中，该组合物包含S1-S2切割位点中的突变682-RRAR-685→682-QQAQ-685。
在一些实施方式中，组合物包含至少一个脯氨酸取代。在一些实施方式中，该组合物包含至少两个脯氨酸取代。例如，脯氨酸取代可以在K986位和V987位。
在某些实施方式中，疫苗组合物包含1至10种B细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含2至10种B细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含2至15种B细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含2至20种B细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含2至30种B细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含2至15种B细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含2至5种B细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含5至10种B细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含5至15种B细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含5至20种B细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含5至25种B细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含5至30种B细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含10至20种B细胞靶表位。在某些实施方式中，疫苗组合物包含10至30种B细胞靶表位。
对于某些实施方式，所选表位可以为在结合测定(例如与HLA分子结合)中达到特定得分的那些表位。例如，在一些实施方式中，所选表位在ELISA结合测定(例如特定针对HLA-DR/肽组合、HLA-A*0201/肽组合等的ELISA结合测定)中的IC50得分为250以下，或在不同结合测定中的IC50得分的等价得分为250以下。结合测定为本领域普通技术人员熟知。
大序列排列
组合物的大序列可以以各种布局排列(参见图23)。在一些实施方式中，大序列可被排列为使得：刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分(例如RBD)，之后是ORF1a/b蛋白或ORF1a/b蛋白的一部分，之后是核蛋白或核蛋白的一部分。在一些实施方式中，大序列可被排列为使得：刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分(例如RBD)，之后是ORF1a/b蛋白或ORF1a/b蛋白的一部分，之后是核蛋白或核蛋白的一部分，之后是膜蛋白(M)或膜蛋白(M)的一部分。
在一些实施方式中，大序列可被排列为使得：ORF1a/b蛋白或ORF1a/b蛋白的一部分，之后是核蛋白(N)或核蛋白(N)的一部分。在一些实施方式中，大序列可被排列为使得：ORF1a/b蛋白或ORF1a/b蛋白的一部分，之后是核蛋白(N)或核蛋白(N)的一部分，之后是膜蛋白(M)或膜蛋白(M)的一部分。
在一些实施方式中，大序列可被排列为使得：刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分(例如RBD)，之后是片段1或片段1的一部分。在一些实施方式中，大序列可被排列为使得：刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分(例如RBD)，之后是片段2或片段2的一部分。在一些实施方式中，大序列可被排列为使得：刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分(例如RBD)，之后是片段4或片段4的一部分。在一些实施方式中，大序列可被排列为使得：刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分(例如RBD)，之后是片段5或片段5的一部分。在进一步实施方式中，大序列可被排列为使得：刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分(例如RBD)，之后是片段1或片段1的一部分，之后是片段5或片段5的一部分。
在一些实施方式中，大序列可被排列为使得：刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分(例如RBD)，之后是核衣壳蛋白或核衣壳蛋白的一部分。在一些实施方式中，大序列可被排列为使得：刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分(例如RBD)，之后是ORF1ab蛋白或ORF1ab蛋白的一部分，之后是ORF3蛋白或ORF3蛋白的一部分，之后是包膜蛋白或包膜蛋白的一部分，之后是ORF6蛋白或ORF6蛋白的一部分，之后是ORF7a蛋白或ORF7a蛋白的一部分。在一些实施方式中，大序列可被排列为使得：刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分(例如RBD)，之后是膜蛋白或膜蛋白的一部分，之后是包膜蛋白或包膜蛋白的一部分，之后是Nsp3蛋白或Nsp3蛋白的一部分，之后是Nsp5蛋白或Nsp5蛋白的一部分，之后是Nsp12蛋白或Nsp12蛋白的一部分。
在一些实施方式中，大序列可被排列为使得：刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分(例如RBD)，之后是1个大序列。在一些实施方式中，大序列可被排列为使得：刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分(例如RBD)，之后是2个大序列。在一些实施方式中，大序列可被排列为使得：刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分(例如RBD)，之后是3个大序列。在一些实施方式中，大序列可被排列为使得：刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分(例如RBD)，之后是4个大序列。在一些实施方式中，大序列可被排列为使得：刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分(例如RBD)，之后是5个大序列。
在一些实施方式中，大序列可被排列为使得：刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分(例如RBD)，之后是一个大序列；两者均各自由启动子驱动，或两者均由单个启动子驱动但被接头隔开，如图x、y和z中所示。
疫苗候选物
如前所述，本发明提供了包含抗原的疫苗组合物，该抗原具有一个以上大序列、两个以上大序列、三个以上大序列、四个以上大序列或五个以上大序列。在一些实施方式中，大序列包含至少一种B细胞表位和至少一种CD4+T细胞表位、至少一种B细胞表位和至少一种CD8+T细胞表位、至少一种CD4+T细胞表位和至少一种CD8+T细胞表位，或至少一种B细胞表位、至少一种CD4+T细胞表位和至少一种CD8+T细胞表位。
表9和图24显示了本文所述的疫苗组合物的实例。本发明不限于表9中的实例。
表9
Figure GDA0004134896980000661
Figure GDA0004134896980000671
Figure GDA0004134896980000681
Figure GDA0004134896980000691
Figure GDA0004134896980000701
Figure GDA0004134896980000711
Figure GDA0004134896980000721
Figure GDA0004134896980000731
Figure GDA0004134896980000741
Figure GDA0004134896980000751
Figure GDA0004134896980000761
Figure GDA0004134896980000771
Figure GDA0004134896980000781
Figure GDA0004134896980000791
Figure GDA0004134896980000801
Figure GDA0004134896980000811
Figure GDA0004134896980000821
Figure GDA0004134896980000831
Figure GDA0004134896980000841
Figure GDA0004134896980000851
Figure GDA0004134896980000861
Figure GDA0004134896980000871
Figure GDA0004134896980000881
Figure GDA0004134896980000891
Figure GDA0004134896980000901
Figure GDA0004134896980000911
Figure GDA0004134896980000921
Figure GDA0004134896980000931
Figure GDA0004134896980000941
Figure GDA0004134896980000951
Figure GDA0004134896980000961
Figure GDA0004134896980000971
Figure GDA0004134896980000981
Figure GDA0004134896980000991
Figure GDA0004134896980001001
Figure GDA0004134896980001011
Figure GDA0004134896980001021
Figure GDA0004134896980001031
Figure GDA0004134896980001041
Figure GDA0004134896980001051
Figure GDA0004134896980001061
Figure GDA0004134896980001071
Figure GDA0004134896980001081
Figure GDA0004134896980001091
Figure GDA0004134896980001101
如上所述，本发明不限于表9中的实例。在一些实施方式中，疫苗候选物可包括本文所述的各种元件(例如启动子、蛋白质、佐剂)。
表10显示了可用于产生本文所述的疫苗组合物的蛋白质的非限定实例。在一些实施方式中，下文列出的蛋白质可以以多种组合方式排列。在一些实施方式中，这些蛋白质可以直接连接在一起。在其他实施方式中，蛋白质通过接头连接在一起。
表10显示了刺突蛋白的非限制性实例。
表10
Figure GDA0004134896980001111
Figure GDA0004134896980001121
Figure GDA0004134896980001131
Figure GDA0004134896980001141
Figure GDA0004134896980001151
Figure GDA0004134896980001161
Figure GDA0004134896980001171
Figure GDA0004134896980001181
Figure GDA0004134896980001191
Figure GDA0004134896980001201
Figure GDA0004134896980001211
Figure GDA0004134896980001221
分子佐剂和T细胞增强因子
在某些实施方式中，疫苗组合物包含分子佐剂和/或一种以上T细胞增强组合物。佐剂和/或增强组合物可有助于改善疫苗组合物的免疫原性和/或长期记忆。分子佐剂的非限制性实例包括CpG，例如CpG聚合物和鞭毛蛋白。
在一些实施方式中，疫苗组合物包含T细胞吸引趋化因子。T细胞吸引趋化因子有助于将T细胞从血液循环中拉到合适组织，例如肺部、心脏、肾脏和脑部。T细胞吸引趋化因子的非限制性实例包括CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCL25、CCL28、CXCL14、CXCL17或它们的组合。
在一些实施方式中，疫苗组合物包含促进T细胞增殖的组合物。促进T细胞增殖的组合物的非限制性实例包括IL-7、IL-15、IL-2或它们的组合。
在一些实施方式中，疫苗组合物包含促进T细胞在肺部归巢的组合物。促进T细胞归巢的组合物的非限制性实例包括CCL25、CCL28、CXCL14、CXCL17或它们的组合。
在某些实施方式中，分子佐剂和/或T细胞吸引趋化因子和/或促进T细胞增殖的组合物用与大序列不同的抗原递送系统递送。
表11显示了可用于产生本文所述疫苗组合物的T细胞增强因子的非限制性实例。
表11
Figure GDA0004134896980001231
Figure GDA0004134896980001241
Figure GDA0004134896980001251
在优选实施方式中，本文所述的T细胞增强组合物(例如CXCL9、CXCL10、IL-7、IL-2)可被整合至与疫苗组合物不同的递送系统中。在一些实施方式中，本文所述的T细胞增强组合物(例如CXCL9、CXCL10、IL-7、IL-2)可被整合至与疫苗组合物相同的递送系统中。
在某些实施方式中，疫苗组合物包含标签。例如，在一些实施方式中，疫苗组合物包含His标签。本发明不限于His标签，还包括其他标签，例如本领域普通技术人员已知的标签，例如荧光标签(例如GFP、YFP等)等。
抗原递送系统
本发明还涉及以抗原递送系统形式存在的疫苗组合物。任何合适的抗原递送系统均可以考虑用于递送本文所述的抗原。本发明不限于本文所述的抗原递送系统。
在某些实施方式中，抗原递送系统用于疫苗组合物的靶向递送，例如用于靶向病毒复制所在的身体组织。
在某些实施方式中，抗原递送系统包含腺病毒(例如但不限于Ad5、Ad26、Ad35等)和载体(例如脂质纳米颗粒、聚合物、肽等)。在其他实施方式中，抗原递送系统包含水疱性口炎病毒(VSV)载体。
本发明不限于基于腺病毒载体的抗原递送系统。在某些实施方式中，抗原递送系统包括基于腺相关病毒载体的抗原递送系统，例如但不限于腺相关病毒载体9型(AAV9血清型)、AAV8型(AAV8血清型)等。在某些实施方式中，所使用的腺相关病毒载体是趋向性的，例如趋向于肺部、脑部、心脏和肾脏，例如表达ACE2受体的人体组织(图3A)。例如，已知AAV9为趋神经的，这将有助于疫苗组合物在脑部中表达。
在抗原递送系统中，一个以上大序列与启动子可操作地连接。在某些实施方式中，一个以上大序列与通用启动子可操作地连接。例如，在某些实施方式中，一个以上大序列与CMV启动子可操作地连接。在某些实施方式中，一个以上大序列与CAG、EFIA、EFS、CBh、SFFV、MSCV、mPGK、hPGK、SV40、UBC或其他合适的启动子可操作地连接。
在一些实施方式中，一个以上大序列与组织特异性启动子(例如肺特异性启动子)可操作地连接。例如，抗原可以与SpB启动子或CD144启动子可操作地连接。
如上所述，在某些实施方式中，疫苗组合物包含分子佐剂。在某些实施方式中，分子佐剂与通用启动子可操作地连接，例如如上所述。在某些实施方式中，分子佐剂与组织特异性启动子(例如肺特异性启动子，例如SpB或CD144)可操作地连接。
如上所述，在某些实施方式中，疫苗组合物包含T细胞吸引趋化因子。在某些实施方式中，T细胞吸引趋化因子与通用启动子可操作地连接，例如如上所述。在某些实施方式中，T细胞吸引趋化因子与组织特异性启动子(例如肺特异性启动子，例如SpB或CD144)可操作地连接。
如所讨论的，在某些实施方式中，疫苗组合物包含用于促进T细胞增殖的组合物。在某些实施方式中，用于促进T细胞增殖的组合物与通用启动子可操作地连接，例如如上所述。在某些实施方式中，用于促进T细胞增殖的组合物与组织特异性启动子(例如肺特异性启动子，例如SpB或CD144)可操作地连接。
表12显示了可用于产生本文所述疫苗组合物的启动子的非限制性实例。
表12
Figure GDA0004134896980001271
Figure GDA0004134896980001281
Figure GDA0004134896980001291
在某些实施方式中，T细胞吸引趋化因子和促进T细胞增殖的组合物由相同启动子驱动(例如T细胞吸引趋化因子和促进T细胞增殖的组合物被合成为肽)。在某些实施方式中，T细胞吸引趋化因子和促进T细胞增殖的组合物由不同启动子驱动。在某些实施方式中，抗原、T细胞吸引趋化因子和促进T细胞增殖的组合物由相同启动子驱动。在某些实施方式中，抗原、T细胞吸引趋化因子和促进T细胞增殖的组合物由不同启动子驱动。在某些实施方式中，T细胞吸引趋化因子和促进T细胞增殖的组合物由相同启动子驱动，一个以上大序列由不同启动子驱动。
在一些实施方式中，抗原递送系统在T细胞吸引趋化因子和促进T细胞增殖的组合物之间包含一个以上接头。在某些实施方式中，在一个以上表位之间使用接头。接头使得不同的分子(例如趋化因子)可以被切割。例如，在一些实施方式中，在IL-7(或IL-2)和CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCL25、CCL28、CXCL14、CXCL17等之间设置接头。在一些实施方式中，在IL-15和CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCL25、CCL28、CXCL14、CXCL17等之间设置接头。在一些实施方式中，在抗原或大序列和另一种成分(例如IL-15、IL-7、CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCL25、CCL28、CXCL14、CXCL17等)之间设置接头。接头的非限制性实例为T2A、E2A、P2A(参见表13)等。组合物可以在每个开放阅读框之间具有不同接头。
表13
Figure GDA0004134896980001301
本发明包括编码本文中任何疫苗组合物或其部分(例如分子佐剂、T细胞增强因子等)的mRNA序列。本发明还包括编码本文中任何疫苗组合物或其部分的修饰mRNA序列。本发明还包括编码本文中任何疫苗组合物或其部分的DNA序列。
在某些实施方式中，本文的疫苗组合物的核酸被化学修饰。在一些实施方式中，其中的疫苗组合物的核酸是未修饰的。在一些实施方式中，开放阅读框中的全部或部分尿嘧啶具有化学修饰。在一些实施方式中，化学修饰在尿嘧啶的5位。在一些实施方式中，化学修饰为N1-甲基假尿苷。在一些实施方式中，开放阅读框中的全部或部分尿嘧啶在尿嘧啶的5位上具有N1-甲基假尿苷。
在某些实施方式中，本文的疫苗组合物的开放阅读框编码一种抗原或表位。在一些实施方式中，本文的疫苗组合物的开放阅读框编码两种以上抗原或表位。在一些实施方式中，本文的疫苗组合物的开放阅读框编码五种以上抗原或表位。在一些实施方式中，本文的疫苗组合物的开放阅读框编码十种以上抗原或表位。在一些实施方式中，本文的疫苗组合物的开放阅读框编码50种以上抗原或表位。
方法
在一些实施方式中，该方法包括确定一个以上保守的大序列，这些大序列来源于冠状病毒序列(例如SARS-CoV-2、变体、普通感冒冠状病毒、先前已知的冠状病毒株、动物冠状病毒等)。该方法可包括：对至少一个保守的大序列进行选择，合成包含所选保守的大序列的抗原(或多种抗原)。该方法可包括合成编码包含所选保守的大序列的抗原的核苷酸组合物(例如DNA、修饰的DNA、mRNA、修饰的mRNA、抗原递送系统等)。在一些实施方式中，该方法还包括产生包含抗原、核苷酸组合物和/或抗原递送系统和药物载体的疫苗组合物。在一些实施方式中，大序列包含本文所述的一个以上保守表位，例如一个以上保守的B细胞靶表位和/或一个以上保守的CD4+T细胞靶表位和/或一个以上保守的CD8+T细胞靶表位。
在一些实施方式中，大序列中的每一个均在如下中的两种或组合中保守：至少两种目前流行的SARS-CoV-2人类株系，至少一种先前导致人类爆发的冠状病毒，至少一种从蝙蝠分离的冠状病毒，至少一种从穿山甲分离的冠状病毒，至少一种从果子狸分离的冠状病毒，至少一种从水貂分离的冠状病毒株，以及至少一种从骆驼或任何其他容易感染冠状病毒的动物中分离的冠状病毒株。
如前所述，本文所述的组合物(例如抗原、疫苗组合物、抗原递送系统、趋化因子、佐剂等)可用于在受试者中预防冠状病毒疾病。在一些实施方式中，本文所述的组合物(例如抗原、疫苗组合物、抗原递送系统、趋化因子、佐剂等)可用于预防性地在受试者中预防冠状病毒感染。在一些实施方式中，本文所述的组合物(例如抗原、疫苗组合物、抗原递送系统、趋化因子、佐剂等)可在受试者体内引发免疫反应。在一些实施方式中，本文所述的组合物(例如抗原、疫苗组合物、抗原递送系统、趋化因子、佐剂等)可延长由多表位泛冠状病毒疫苗组合物诱导的免疫反应并增加T细胞向肺部的迁移。
在受试者中预防冠状病毒疾病的方法可包括：向受试者施用治疗有效量的根据本发明的泛冠状病毒疫苗组合物。在一些实施方式中，该组合物在受试者体内引发免疫反应。在一些实施方式中，该组合物诱导记忆B细胞和T细胞。在一些实施方式中，该组合物诱导驻留记忆T细胞(Trm)。在一些实施方式中，该组合物预防病毒复制，例如在病毒正常复制所在的区域，例如肺部、脑部、心脏和肾脏。在一些实施方式中，该组合物预防细胞因子风暴，例如在病毒正常复制所在的区域，例如肺部、脑部、心脏和肾脏。在一些实施方式中，该组合物预防炎症或炎症反应，例如在病毒正常复制所在的区域，例如肺部、脑部、心脏和肾脏。在一些实施方式中，该组合物改善T细胞的归巢和保留，例如在病毒正常复制所在的区域，例如肺部、脑部、心脏和肾脏。
预防性地在受试者中预防冠状病毒感染的方法可包括：向受试者施用预防有效量的根据本发明的泛冠状病毒疫苗组合物。在一些实施方式中，该组合物在受试者体内引发免疫反应。在一些实施方式中，该组合物诱导记忆B细胞和T细胞。在一些实施方式中，该组合物诱导驻留记忆T细胞(Trm)。在一些实施方式中，该组合物预防病毒复制，例如在病毒正常复制所在的区域，例如肺部、脑部、心脏和肾脏。在一些实施方式中，该组合物预防细胞因子风暴，例如在病毒正常复制所在的区域，例如肺部、脑部、心脏和肾脏。在一些实施方式中，该组合物预防炎症或炎症反应，例如在病毒正常复制所在的区域，例如肺部、脑部、心脏和肾脏。在一些实施方式中，该组合物改善T细胞的归巢和保留，例如在病毒正常复制所在的区域，例如肺部、脑部、心脏和肾脏。
在受试者体内引发免疫反应的方法可包括：向受试者施用根据本发明的疫苗组合物，其中，该组合物在受试者体内引发免疫反应。在一些实施方式中，该组合物诱导记忆B细胞和T细胞。在一些实施方式中，该组合物诱导驻留记忆T细胞(Trm)。在一些实施方式中，该组合物预防病毒复制，例如在病毒正常复制所在的区域，例如肺部、脑部、心脏和肾脏。在一些实施方式中，该组合物预防细胞因子风暴，例如在病毒正常复制所在的区域，例如肺部、脑部、心脏和肾脏。在一些实施方式中，该组合物预防炎症或炎症反应，例如在病毒正常复制所在的区域，例如肺部、脑部、心脏和肾脏。在一些实施方式中，该组合物改善T细胞的归巢和保留，例如在病毒正常复制所在的区域，例如肺部、脑部、心脏和肾脏。
延长由本发明的疫苗组合物诱导的免疫反应并增加T细胞向特定组织(例如肺部、脑部、心脏、肾脏等)迁移的方法可包括：共表达T细胞吸引趋化因子、促进T细胞增殖的组合物和根据本发明的疫苗组合物(例如抗原)。
延长由本发明的疫苗组合物诱导的记忆T细胞在肺部的保留并增加病毒特异性组织驻留记忆T细胞(TRM细胞)的方法可包括：共表达T细胞吸引趋化因子、促进T细胞增殖的组合物和根据本发明的疫苗组合物(例如抗原)。
疫苗组合物可通过标准手段施用，例如通过静脉内途径(i.v.)、鼻内途径(i.n.)或舌下途径(s.l.)。
在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用第二(例如加强)剂。第二剂可包含相同疫苗组合物或不同疫苗组合物。可以施用额外剂的一种以上疫苗组合物。
连续疫苗递送方法
在一些实施方式中，本发明涉及递送疫苗以在受试者中诱导异源免疫的方法(例如初免/加强，参见图25B和图26B)。在一些实施方式中，该方法包括使用第一递送系统施用第一剂泛冠状病毒疫苗组合物。在进一步实施方式中，该方法包括使用第二递送系统施用第二剂疫苗组合物。在一些实施方式中，第二组合物在施用第一组合物8天后施用。在一些实施方式中，第二组合物在施用第一组合物9天后施用。在一些实施方式中，第二组合物在施用第一组合物10天后施用。在一些实施方式中，第二组合物在施用第一组合物11天后施用。在一些实施方式中，第二组合物在施用第一组合物12天后施用。在一些实施方式中，第二组合物在施用第一组合物13天后施用。在一些实施方式中，第二组合物在施用第一组合物14天后施用。在一些实施方式中，第二组合物在施用第一组合物14至30天后施用。在一些实施方式中，第二组合物在施用第一组合物30至60天后施用。在其他实施方式中，第一递送系统和第二递送系统不同。在一些实施方式中，肽疫苗组合物在施用第一剂疫苗组合物14天后施用。在一些实施方式中，肽疫苗组合物在施用第一剂疫苗组合物30天或60天后施用。
在一些实施方式中，第一递送系统或第二递送系统包含mRNA、修饰的mRNA或肽载体。在其他实施方式中，肽载体包括腺病毒载体或腺相关病毒载体。
在一些实施方式中，本发明涉及递送疫苗以在受试者中诱导异源免疫的方法(即初免/拉动，参见图25A和图26A)。在一些实施方式中，该方法包括施用泛冠状病毒疫苗组合物。在进一步实施方式中，该方法包括在施用泛冠状病毒疫苗组合物后施用至少一种T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物8天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物9天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物10天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物11天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物12天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物13天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物14天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物14至30天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物30至60天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用最终剂疫苗组合物8至14天后施用T细胞吸引趋化因子组合物。在一些实施方式中，在施用最终剂疫苗组合物30或60天后施用细胞吸引趋化因子组合物。
本发明还涉及一种新型“初免、拉动和加强”策略。在其他实施方式中，本发明涉及一种增加和维持肺驻留B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量以防御SARS-CoV-2的方法(图25D和图26D)。在一些实施方式中，该方法包括施用泛冠状病毒疫苗组合物。在其他实施方式中，该方法包括在施用泛冠状病毒疫苗组合物后施用至少一种T细胞吸引趋化因子。在进一步实施方式中，该方法包括在施用T细胞吸引趋化因子后施用至少一种细胞因子。在一些实施方式中，在施用泛冠状病毒组合物14天后施用T细胞吸引趋化因子。在其他实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子10天后施用细胞因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物8天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物9天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物10天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物11天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物12天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物13天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物14天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物14至30天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物30至60天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子后8天施用细胞因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子9天后施用细胞因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子10天后施用细胞因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子11天后施用细胞因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子12天后施用细胞因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子13天后施用细胞因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子14天后施用细胞因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子14至30天后施用细胞因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子30至60天后施用细胞因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子8至14天后施用细胞因子组合物。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子30或60天后施用细胞因子组合物。
本发明还涉及一种新型“初免、拉动和保持”策略(图25C和图26C)。在进一步实施方式中，本发明涉及一种增加和维持肺驻留B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量以防御SARS-CoV-2的方法。在一些实施方式中，该方法包括施用泛冠状病毒疫苗组合物。在其他实施方式中，该方法包括在施用泛冠状病毒疫苗组合物后施用至少一种T细胞吸引趋化因子。在进一步实施方式中，该方法包括在施用T细胞吸引趋化因子后施用至少一种粘膜趋化因子。在一些实施方式中，在施用泛冠状病毒组合物14天后施用T细胞吸引趋化因子。在其他实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子10天后施用粘膜趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物8天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物9天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物10天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物11天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物12天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物13天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物14天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物14至30天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用疫苗组合物30至60天后施用T细胞吸引趋化因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子8天后施用粘膜趋化因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子9天后施用粘膜趋化因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子10天后施用粘膜趋化因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子11天后施用粘膜趋化因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子12天后施用粘膜趋化因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子13天后施用粘膜趋化因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子14天后施用粘膜趋化因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子14至30天后施用粘膜趋化因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子30至60天后施用粘膜趋化因子。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子8至14天后施用粘膜趋化因子组合物。在一些实施方式中，在施用T细胞吸引趋化因子30或60天后施用粘膜细胞因子组合物。
在一些实施方式中，粘膜趋化因子可包括CCL25、CCL28、CXCL14、CXCL17或它们的组合。在一些实施方式中，T细胞吸引趋化因子可包括CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11或它们的组合。在一些实施方式中，细胞因子可包括IL-15、IL-2、IL-7或它们的组合。
在一些实施方式中，本文所述疫苗组合物的效力(或有效性)大于60％。在一些实施方式中，本文的疫苗组合物的效力(或有效性)大于70％。在一些实施方式中，本文所述疫苗组合物的效力(或有效性)大于80％。在一些实施方式中，本文的疫苗组合物的效力(或有效性)大于90％。在一些实施方式中，本文所述疫苗组合物的效力(或有效性)大于95％。
疫苗效力可通过使用标准分析进行评估(参见Weinberg等，J infection Dis.，2010年6月1日，201(11):1607-1610)。例如，疫苗效力可通过双盲、随机、临床对照试验来测量。疫苗效力可被表示为未接种疫苗(ARU)和接种疫苗(ARV)的研究队列之间疾病发作率(AR)的比例降低，并且可使用以下公式由接种疫苗组的疾病相对风险(RR)来计算：效力＝(ARU-ARV)/ARU×100；以及效力＝(1-RR)×100。
同样，疫苗有效性也可通过使用标准分析进行评估(参见Weinberg等，Jinfection Dis.，2010年6月1日，201(11):1607-1610)。疫苗有效性是对疫苗(可能已经被证明具有高疫苗效力)如何在群体中减少疾病的评估。此种量度可以评估在自然现场条件下(而不是在受控临床试验中)疫苗接种计划的益处和不良影响的净平衡(而不仅仅是疫苗本身)。疫苗有效性与疫苗效力(效价)成正比，但也受到群体中目标群组免疫效果的影响，以及受到影响住院、门诊就诊或费用的“现实世界”结果的其他非疫苗相关因素的影响。例如，可以使用回顾性病例对照分析，其中比较一组感染病例和合适对照之间的疫苗接种率。疫苗有效性可被表示为比率差，其中使用优势比(OR，odds ratio)表示尽管接种了疫苗但仍发生了感染：有效性＝(1-OR)×100。
在一些实施方式中，疫苗可使受试者对冠状病毒免疫长达1年。在一些实施方式中，疫苗可使受试者对冠状病毒免疫长达2年。在一些实施方式中，疫苗可使受试者对冠状病毒免疫超过1年、超过2年、超过3年、超过4年，或5至10年。
在一些实施方式中，受试者是年龄为20岁至50岁(例如约20岁、25岁、30岁、35岁、40岁、45岁或50岁)的中青年受试者。
在一些实施方式中，受试者是约60岁、约70岁，或更大(例如约60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁或90岁)的老年受试者。
在一些实施方式中，受试者为约5岁以下。例如，受试者的年龄可为约1岁至约5岁(例如约1岁、2岁、3岁、4岁或5岁)，或约6个月至约1岁(例如约6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月)。在一些实施方式中，受试者为约12个月以下(例如12个月、11个月、10个月、9个月、8个月、7个月、6个月、5个月、4个月、3个月、2个月或1个月)。在一些实施方式中，受试者为约6个月以下。
在一些实施方式中，受试者足月(例如约37周至42周)出生。在一些实施方式中，受试者早产，例如在妊娠约36周以下时(例如在妊娠约36周、35周、34周、33周、32周、31周、30周、29周、28周、27周、26周或25周时)出生。例如，受试者可能在妊娠约32周以下时出生。在一些实施方式中，受试者在妊娠约32周至约36周时早产。在此类受试者中，疫苗可在生命后期施用，例如在约6个月至约5岁或更大年龄时施用。
在一些实施方式中，施用疫苗时受试者已怀孕(例如在妊娠的第一、第二或第三个三个月(trimester))。
在一些实施方式中，受试者患有慢性肺病(例如慢性阻塞性肺病(COPD)或哮喘)或有患此疾病的风险。慢性阻塞性肺病的两种形式包括慢性支气管炎和肺气肿，前者涉及伴有粘液的长期咳嗽，后者涉及肺部长期受损。因此，施用疫苗的受试者可能患有慢性支气管炎或肺气肿。
在一些实施方式中，受试者曾暴露于冠状病毒。在一些实施方式中，受试者感染了冠状病毒。在一些实施方式中，受试者有被冠状病毒感染的风险。
在一些实施方式中，受试者免疫功能不全(免疫系统受损，例如患有免疫紊乱或自身免疫紊乱)。
药物载体
在某些实施方式中，疫苗组合物还包含药物载体。药物载体为本领域普通技术人员熟知。例如，在某些实施方式中，药物载体选自水、醇、天然油或硬化油、天然蜡或硬化蜡、碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、高岭土、滑石、乳糖及它们的组合。在一些实施方式中，药物载体可包括脂质纳米颗粒、腺病毒载体或腺相关病毒载体。在一些实施方式中，使用基于腺相关病毒载体的抗原递送系统来构建疫苗组合物。
本文还提供了配制在纳米颗粒(例如脂质纳米颗粒)中的上述段落中任一项的疫苗。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径为50nm至200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒为脂质纳米颗粒。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、PEG修饰的脂质、固醇和非阳离子脂质。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为约20％至60％的阳离子脂质、0.5％至15％的PEG修饰的脂质、25％至55％的固醇和25％的非阳离子脂质。在一些实施方式中，阳离子脂质为可电离的阳离子脂质，非阳离子脂质为中性脂质，固醇为胆固醇。在一些实施方式中，阳离子脂质选自2,2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)。
尽管已显示和描述了本发明的优选实施方式，但对于本领域技术人员而言显而易见的是，可以在不超过所附权利要求书的范围的情况下对其进行修改。因此，本发明的范围仅由如下权利要求来限定。在一些实施方式中，本专利申请中提出的附图按比例(包括角度、尺寸比例等)绘制。在一些实施方式中，附图仅仅是代表性的，并且权利要求不受附图尺寸限制。在一些实施方式中，本文使用短语“包含”描述的发明的描述包括可被描述为“基本上由……组成”或“由……组成”的实施方式，因此满足使用短语“基本上由……组成”或“由……组成”来要求保护本发明的一个以上实施方式的书面描述要求。

Claims (255)

1.一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，所述组合物包含一个以上大序列，其中，一个以上大序列中的每一个均包含如下中的至少一种：
a)一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位；
b)一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；和/或
c)一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；
其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
2.一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，所述组合物包含两个以上大序列，其中，两个以上大序列中的每一个均包含如下中的至少一种：
a)一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位；
b)一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；和/或
c)一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；
其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
3.一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，所述组合物包含：全刺突蛋白；以及如下中的一种或两种：
a)一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；和/或
b)一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；
其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
4.一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，所述组合物包含：至少一部分刺突蛋白，所述刺突蛋白的一部分包含三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)；以及如下中的一种或两种：
(a)一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；
(b)一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；
其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
5.一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，所述组合物包含：全刺突蛋白；一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；以及一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
6.一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，所述组合物包含：至少一部分刺突蛋白，所述刺突蛋白的一部分包含三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)；一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；以及一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中，所述非刺突蛋白为ORF1ab蛋白、ORF3a蛋白、包膜蛋白、膜糖蛋白、ORF6蛋白、ORF7a蛋白、ORF7b蛋白、ORF8蛋白、核衣壳蛋白和ORF10蛋白。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中，一个以上大序列在人类和动物冠状病毒中高度保守。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中，一个以上大序列来源于SARS-CoV-2蛋白中的至少一种。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中，一个以上大序列来源于如下中的一种以上：一种以上目前流行的SARS-CoV-2人类株系或变体；一种以上先前导致人类爆发的冠状病毒；一种以上从动物中分离的冠状病毒，所述动物选自蝙蝠、穿山甲、果子狸、貂、骆驼和其他容易感染冠状病毒的动物；或一种以上导致普通感冒的冠状病毒。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中，一种以上目前流行的SARS-CoV-2人类株系或变体选自：株系B.1.177；株系B.1.160；株系B.1.1.7；株系B.1.351；株系P.1；株系B.1.427/B.1.429；株系B.1.258；株系B.1.221；株系B.1.367；株系B.1.1.277；株系B.1.1.302；株系B.1.525；株系B.1.526；株系S:677H；以及株系S:677P。
12.根据权利要求10所述的组合物，其中，一种以上导致普通感冒的冠状病毒选自：229Eα冠状病毒、NL63α冠状病毒、OC43β冠状病毒和HKU1β冠状病毒。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中，保守的表位选自关注的变体或感兴趣的变体。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中，一个以上大序列来源于由SARS-CoV-2表达的全蛋白序列。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中，一个以上大序列来源于由SARS-CoV-2表达的部分蛋白序列。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中，一个以上保守的大序列来源于全长刺突糖蛋白。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中，一个以上保守的大序列来源于部分刺突糖蛋白。
18.根据权利要求16或17所述的组合物，其中，所述刺突蛋白在氨基酸986位和987位处具有两个连续的脯氨酸取代。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的组合物，其中，所述刺突糖蛋白在包含Tyr-83、Tyr-489、Gln-24和Asn-487的氨基酸位置处具有单个氨基酸取代。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中，一个以上大序列包含刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分、核蛋白或核蛋白的一部分、膜蛋白或膜蛋白的一部分以及ORF1a/b或ORF1a/b的一部分。
21.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中，一个以上大序列包含刺突糖蛋白(S)或刺突糖蛋白(S)的一部分、核蛋白或核蛋白的一部分以及ORF1a/b或ORF1a/b的一部分。
22.根据权利要求16至19中任一项所述的组合物，其中，所述刺突糖蛋白的一部分为RBD。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中，一个以上大序列选自：ORF1ab蛋白、刺突糖蛋白、ORF3a蛋白、包膜蛋白、膜糖蛋白、ORF6蛋白、ORF7a蛋白、ORF7b蛋白、ORF8蛋白、核衣壳蛋白和ORF10蛋白。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中，ORF1ab蛋白包含非结构蛋白(Nsp)1、Nsp2、Nsp3、Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp7、Nsp8、Nsp9、Nsp10、Nsp11、Nsp12、Nsp13、Nsp14、Nsp15和Nsp16。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的组合物，其中，所述一个以上大序列包含T细胞表位，所述T细胞表位受大量人类1类和2类HLA单倍型限制，且不受1类的HLA-0201或2类的HLA-DR限制。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的组合物，其中，所述大序列来源于结构蛋白、非结构蛋白或它们的组合。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中，所述一个以上大序列来源于选自如下的蛋白：SEQ ID NO：182至SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：148至SEQ ID NO：159、SEQ IDNO：186至SEQ ID NO：187和SEQ ID NO：191至SEQ ID NO：196。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自：刺突糖蛋白、包膜蛋白、ORF1ab蛋白、ORF7a蛋白、ORF8a蛋白、ORF10蛋白或它们的组合。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自：S2-10、S1220-1228、S1000-1008、S958-966、E20-28、ORF1ab1675-1683、ORF1ab2363-2371、ORF1ab3013-3021、ORF1ab3183-3191、ORF1ab5470-5478、ORF1ab6749-6757、ORF7b26-34、ORF8a73-81、ORF103-11和ORF105-13。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：29。
31.根据权利要求1至29中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：30至SEQ ID NO：57。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自：刺突糖蛋白、包膜蛋白、膜蛋白、核衣壳蛋白、ORF1a蛋白、ORF1ab蛋白、ORF6蛋白、ORF7a蛋白、ORF7b蛋白、ORF8蛋白或它们的组合。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自：ORF1a1350-1365、ORF1ab5019-5033、ORF612-26、ORF1ab6088-6102、ORF1ab6420-6434、ORF1a1801-1815、S1-13、E26-40、E20-34、M176-190、N388-403、ORF7a3-17、ORF7a1-15、ORF7b8-22、ORF7a98-112和ORF81-15。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：58至SEQ ID NO：73。
35.根据权利要求1至33中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：74至SEQ ID NO：105。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位选自刺突糖蛋白。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位选自：S287-317、S524-598、S601-640、S802-819、S888-909、S369-393、S440-501、S1133-1172、S329-363和S13-37。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的组合物，其中，一种以上冠状病毒B细胞靶表位选自SEQ ID NO：106至SEQ ID NO：116。
39.根据权利要求1至37中任一项所述的组合物，其中，一种以上冠状病毒B细胞靶表位选自SEQ ID NO：117至SEQ ID NO：138。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位为大序列的形式。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中，所述大序列为全长刺突糖蛋白。
42.根据权利要求40所述的组合物，其中，所述大序列为部分刺突糖蛋白。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的组合物，其中，所述大序列中的每一个均被接头隔开。
44.根据权利要求43所述的组合物，其中，所述接头的长度为2至10个氨基酸。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含T细胞吸引趋化因子。
46.根据权利要求45所述的组合物，其中，所述T细胞吸引趋化因子为CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11或它们的组合。
47.根据权利要求1至46中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含促进T细胞增殖的组合物。
48.根据权利要求47所述的组合物，其中，所述促进T细胞增殖的组合物为IL-7、IL-2或IL-15。
49.根据权利要求1至49中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含分子佐剂。
50.根据权利要求50所述的组合物，其中，所述分子佐剂为CpG。
51.根据权利要求54所述的组合物，其中，所述分子佐剂为CpG聚合物。
52.根据权利要求50所述的组合物，其中，所述分子佐剂为鞭毛蛋白。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的组合物，其中，所述重组疫苗组合物包含标签。
54.根据权利要求53所述的组合物，其中，所述标签为His标签。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含药物载体。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的组合物，其中，所述组合物用于在受试者中预防冠状病毒疾病。
57.根据权利要求1至56中任一项所述的组合物，其中，所述组合物用于预防性地在受试者中预防冠状病毒感染。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的组合物，其中，所述组合物在受试者体内引发免疫反应。
59.根据权利要求1至58中任一项所述的组合物，其中，所述组合物延长由多表位泛冠状病毒重组疫苗组合物诱导的免疫反应，并增加T细胞向肺部的迁移。
60.根据权利要求1至59中任一项所述的组合物，其中，所述刺突蛋白的跨膜锚具有完整的S1-S2切割位点。
61.根据权利要求1至60中任一项所述的组合物，其中，所述刺突蛋白处于其稳定构象。
62.根据权利要求1至61中任一项所述的组合物，其中，所述刺突蛋白通过在S2亚基的中心螺旋顶部的氨基酸986位和987位处用脯氨酸取代而稳定。
63.根据权利要求1至62中任一项所述的重组疫苗组合物，其中，所述组合物包含全长刺突蛋白。
64.根据权利要求1至62中任一项所述的重组疫苗组合物，其中，所述组合物包含全长刺突蛋白或部分刺突蛋白。
65.根据权利要求1至64中任一项所述的组合物，其中，所述刺突蛋白包含Tyr-489和Asn-487。
66.根据权利要求1至65中任一项所述的组合物，其中，所述刺突蛋白包含Gln-493。
67.根据权利要求1至66中任一项所述的组合物，其中，所述刺突蛋白包含Tyr505。
68.根据权利要求1至67中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)序列。
69.根据权利要求68所述的组合物，其中，所述三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)序列通过添加T4纤维蛋白来源的折叠三聚体化结构域来进行修饰。
70.根据权利要求69所述的组合物，其中，添加T4纤维蛋白来源的折叠三聚体化结构域通过多价显示增加免疫原性。
71.根据权利要求1至70中任一项所述的组合物，其中，保守的表位选自关注的变体和感兴趣的变体。
72.根据权利要求1至71中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含S1-S2切割位点中的突变682-RRAR-685→682-QQAQ-685。
73.根据权利要求1至72中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含至少一种脯氨酸取代。
74.根据权利要求1至72中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含至少两种脯氨酸取代。
75.根据权利要求73至74中任一项所述的组合物，其中，所述脯氨酸取代位于K986位和V987位。
76.根据权利要求1至75中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含K986P突变和V987P突变。
77.根据权利要求1至83中任一项所述的组合物，其中，所述刺突蛋白或刺突蛋白的一部分包含SEQ ID NO：195。
78.根据权利要求1至83中任一项所述的组合物，其中，所述刺突蛋白或刺突蛋白的一部分包含SEQ ID NO：191或SEQ ID NO：192中的一个。
79.根据权利要求1至83中任一项所述的组合物，其中，所述刺突蛋白或刺突蛋白的一部分包含SEQ ID NO：186至SEQ ID NO：187和SEQ ID NO：191至SEQ ID NO：196中的一个。
80.一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，所述组合物包含编码一个以上大序列的抗原递送系统，其中，一个以上大序列中的每一个均包含如下中的至少一种：
a)一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位；
b)一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；和/或
c)一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；
其中，至少一种表位来自非刺突蛋白。
81.一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，所述组合物包含编码两个以上大序列的抗原递送系统，其中，两个以上大序列中的每一个均包含如下中的至少一种：
a)一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位；
b)一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；和/或
c)一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；
其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
82.一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，所述组合物包含抗原递送系统，所述抗原递送系统编码：全刺突蛋白；以及如下中的一种或两种：
a)一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；和/或
b)一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；
其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
83.一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，所述组合物包含抗原递送系统，所述抗原递送系统至少编码：刺突蛋白的一部分，所述刺突蛋白的一部分包含三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)；以及如下中的一种或两种：
(c)一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；
(d)一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；
其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
84.一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，所述组合物包含抗原递送系统，所述抗原递送系统编码：全刺突蛋白；一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；以及一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
85.一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，所述组合物包含抗原递送系统，所述抗原递送系统至少编码：刺突蛋白的一部分，所述刺突蛋白的一部分包含三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)；一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；以及一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
86.根据权利要求80至85中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含两个以上大序列。
87.根据权利要求80至86中任一项所述的组合物，其中，所述递送系统为腺病毒系统。
88.根据权利要求87所述的组合物，其中，所述腺病毒递送系统为Ad26、Ad5、Ad35或它们的组合。
89.根据权利要求80至88中任一项所述的组合物，其中，一个以上大序列与通用启动子可操作地连接。
90.根据权利要求89所述的组合物，其中，所述通用启动子为CMV启动子或CAG启动子。
91.根据权利要求80至88中任一项所述的组合物，其中，一个以上大序列与肺特异性启动子可操作地连接。
92.根据权利要求91所述的组合物，其中，所述肺特异性启动子为SpB或CD144。
93.根据权利要求80至92中任一项所述的组合物，其中，所述抗原递送系统还编码T细胞吸引趋化因子。
94.根据权利要求93所述的组合物，其中，所述T细胞吸引趋化因子为CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11或它们的组合。
95.根据权利要求93至94中任一项所述的组合物，其中，所述T细胞吸引趋化因子与肺特异性启动子可操作地连接。
96.根据权利要求93至94中任一项所述的组合物，其中，所述T细胞吸引趋化因子与通用启动子可操作地连接。
97.根据权利要求80至96中任一项所述的组合物，其中，所述抗原递送系统还编码促进T细胞增殖的组合物。
98.根据权利要求97所述的组合物，其中，所述促进T细胞增殖的组合物为IL-7、IL-2或IL-15。
99.根据权利要求97至98中任一项所述的组合物，其中，所述促进T细胞增殖的组合物与肺特异性启动子可操作地连接。
100.根据权利要求97至98中任一项所述的组合物，其中，所述促进T细胞增殖的组合物与通用启动子可操作地连接。
101.根据权利要求93至100中任一项所述的组合物，其中，所述T细胞吸引趋化因子和所述促进T细胞增殖的组合物由相同启动子驱动。
102.根据权利要求80至101中任一项所述的组合物，其中，所述疫苗还编码包含T细胞吸引趋化因子和促进T细胞增殖的组合物的肽。
103.根据权利要求102所述的组合物，其中，所述肽与肺特异性启动子可操作地连接。
104.根据权利要求102所述的组合物，其中，所述肽与通用启动子可操作地连接。
105.根据权利要求80至104中任一项所述的组合物，其中，所述抗原递送系统还编码分子佐剂。
106.根据权利要求105所述的组合物，其中，所述分子佐剂为CpG。
107.根据权利要求106所述的组合物，其中，所述分子佐剂为CpG聚合物。
108.根据权利要求105所述的组合物，其中，所述分子佐剂为鞭毛蛋白。
109.根据权利要求105至108中任一项所述的组合物，其中，所述分子佐剂与启动子可操作地连接。
110.根据权利要求109所述的组合物，其中，所述启动子为肺特异性启动子或通用启动子。
111.根据权利要求80至110中任一项所述的组合物，其中，一个以上大序列在人类和动物冠状病毒中高度保守。
112.根据权利要求80至111中任一项所述的组合物，其中，一个以上大序列来源于SARS-CoV-2蛋白中的至少一种。
113.根据权利要求80至112中任一项所述的组合物，其中，一个以上大序列来源于如下中的一种以上：(a)一种以上目前流行的SARS-CoV-2人类株系或变体；(b)一种以上先前导致人类爆发的冠状病毒；(c)一种以上从动物中分离的冠状病毒，所述动物选自蝙蝠、穿山甲、果子狸、貂、骆驼和其他容易感染冠状病毒的动物；或(d)一种以上导致普通感冒的冠状病毒。
114.根据权利要求113所述的组合物，其中，一种以上目前流行的SARS-CoV-2人类株系或变体选自：株系B.1.177；株系B.1.160；株系B.1.1.7；株系B.1.351；株系P.1；株系B.1.427/B.1.429；株系B.1.258；株系B.1.221；株系B.1.367；株系B.1.1.277；株系B.1.1.302；株系B.1.525；株系B.1.526；株系S:677H；以及株系S:677P。
115.根据权利要求113所述的组合物，其中，一种以上导致普通感冒的冠状病毒选自：229Eα冠状病毒、NL63α冠状病毒、OC43β冠状病毒和HKU1β冠状病毒。
116.根据权利要求80至115中任一项所述的组合物，其中，所述大序列中的每一个均被接头隔开。
117.根据权利要求116所述的组合物，其中，所述接头的长度为2至10个氨基酸。
118.根据权利要求80至117中任一项所述的组合物，其中，所述重组疫苗组合物包含标签。
119.根据权利要求118所述的组合物，其中，所述标签为His标签。
120.根据权利要求80至119中任一项所述的组合物，其中，所述大序列来源于结构蛋白、非结构蛋白或它们的组合。
121.根据权利要求80至120中任一项所述的组合物，其中，所述靶表位来源于选自如下的SARS-CoV-2蛋白：ORF1ab蛋白、刺突糖蛋白、ORF3a蛋白、包膜蛋白、膜糖蛋白、ORF6蛋白、ORF7a蛋白、ORF7b蛋白、ORF8蛋白、核衣壳蛋白和ORF10蛋白。
122.根据权利要求121所述的组合物，其中，来源于刺突糖蛋白的靶表位为RBD。
123.根据权利要求121所述的组合物，其中，来源于刺突糖蛋白的靶表位为NTD。
124.根据权利要求121所述的组合物，其中，来源于刺突糖蛋白的靶表位包含RBD区域和NTD区域。
125.根据权利要求121至124中任一项所述的组合物，其中，来源于刺突糖蛋白的靶表位被中和抗体和封闭抗体识别。
126.根据权利要求121至124中任一项所述的组合物，其中，来源于刺突糖蛋白的靶表位诱导中和抗体和封闭抗体。
127.根据权利要求121至124中任一项所述的组合物，其中，来源于刺突糖蛋白的靶表位诱导识别且中和病毒的中和抗体和封闭抗体。
128.根据权利要求121至124中任一项所述的组合物，其中，来源于刺突糖蛋白的靶表位诱导识别刺突蛋白的中和抗体和封闭抗体。
129.根据权利要求121所述的组合物，其中，ORF1ab蛋白包含非结构蛋白(Nsp)1、Nsp2、Nsp3、Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp7、Nsp8、Nsp9、Nsp10、Nsp11、Nsp12、Nsp13、Nsp14、Nsp15和Nsp16。
130.根据权利要求80至129中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自：刺突糖蛋白、包膜蛋白、ORF1ab蛋白、ORF7a蛋白、ORF8a蛋白、ORF10蛋白或它们的组合。
131.根据权利要求80至130中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自：S2-10、S1220-1228、S1000-1008、S958-966、E20-28、ORF1ab1675-1683、ORF1ab2363-2371、ORF1ab3013-3021、ORF1ab3183-3191、ORF1ab5470-5478、ORF1ab6749-6757、ORF7b26-34、ORF8a73-81、ORF103-11和ORF105-13。
132.根据权利要求80至131中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：29。
133.根据权利要求80至131中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：30至SEQ ID NO：57。
134.根据权利要求80至133中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自：刺突糖蛋白、包膜蛋白、膜蛋白、核衣壳蛋白、ORF1a蛋白、ORF1ab蛋白、ORF6蛋白、ORF7a蛋白、ORF7b蛋白、ORF8蛋白或它们的组合。
135.根据权利要求80至134中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自：ORF1a1350-1365、ORF1ab5019-5033、ORF612-26、ORF1ab6088-6102、ORF1ab6420-6434、ORF1a1801-1815、S1-13、E26-40、E20-34、M176-190、N388-403、ORF7a3-17、ORF7a1-15、ORF7b8-22、ORF7a98-112和ORF81-15。
136.根据权利要求80至135中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：58至SEQ ID NO：73。
137.根据权利要求80至135中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：74至SEQ ID NO：105。
138.根据权利要求80至136中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位选自刺突糖蛋白。
139.根据权利要求80至137中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位选自：S287-317、S524-598、S601-640、S802-819、S888-909、S369-393、S440-501、S1133-1172、S329-363和S13-37。
140.根据权利要求80至138中任一项所述的组合物，其中，一种以上冠状病毒B细胞靶表位选自SEQ ID NO：106至SEQ ID NO：116。
141.根据权利要求80至138中任一项所述的组合物，其中，一种以上冠状病毒B细胞靶表位选自SEQ ID NO：117至SEQ ID NO：138。
142.根据权利要求80至141中任一项所述的组合物，其中，所述大序列中的每一个均被接头隔开。
143.根据权利要求80至141中任一项所述的组合物，其中，所述大序列中的两个以上被接头隔开。
144.根据权利要求142或143所述的组合物，其中，所述接头的长度为2至10个氨基酸。
145.根据权利要求142至144中任一项所述的组合物，其中，所述接头包含T2A。
146.根据权利要求142至144中任一项所述的组合物，其中，所述接头选自T2A、E2A和P2A。
147.根据权利要求80至146中任一项所述的组合物，其中，每个开放阅读框之间设置不同接头。
148.根据权利要求80至147中任一项所述的组合物，其中，所述重组疫苗组合物包含标签。
149.根据权利要求148所述的组合物，其中，所述标签为His标签。
150.根据权利要求80至149中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含药物载体。
151.根据权利要求80至150中任一项所述的组合物，其中，所述组合物用于在受试者中预防冠状病毒疾病。
152.根据权利要求80至151中任一项所述的组合物，其中，所述组合物用于预防性地在受试者中预防冠状病毒感染。
153.根据权利要求80至152中任一项所述的组合物，其中，所述组合物在受试者体内引发免疫反应。
154.根据权利要求80至153中任一项所述的组合物，其中，所述组合物延长由多表位泛冠状病毒重组疫苗组合物诱导的免疫反应，并增加T细胞向肺部的迁移。
155.根据权利要求80至154中任一项所述的组合物，其中，所述疫苗构建体用于人类。
156.根据权利要求155所述的组合物，其中，所述重组疫苗组合物包含人CXCL-11和IL-7或IL-2或IL-15。
157.根据权利要求1至154中任一项所述的组合物，其中，所述疫苗构建体用于动物。
158.根据权利要求60所述的组合物，其中，所述重组疫苗组合物包含动物CXCL-11和IL-7或IL-2或IL-15。
159.根据权利要求157或158所述的组合物，其中，所述动物为猫和犬。
160.根据权利要求1至159中任一项所述的组合物，其中，所述组合物用作疫苗。
161.根据权利要求1至160中任一项所述的组合物，其中，所述组合物用作预防和治疗冠状病毒感染和疾病的免疫治疗。
162.一种rVSV-泛CoV重组疫苗组合物，所述组合物根据权利要求1至161中任一项所述。
163.一种rAdV-泛CoV重组疫苗组合物，所述组合物根据权利要求1至161中任一项所述。
164.一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，所述组合物包含SEQ ID NO：139至SEQ ID NO：147中的任一项。
165.一种在受试者中预防冠状病毒疾病的方法，所述方法包括：向受试者施用治疗有效量的权利要求1至164中任一项所述的泛冠状病毒重组疫苗组合物，其中，所述组合物在受试者体内引发免疫反应。
166.一种预防性地在受试者中预防冠状病毒感染的方法，所述方法包括：向受试者施用预防有效量的权利要求1至164中任一项所述的泛冠状病毒重组疫苗组合物。
167.一种在受试者体内引发免疫反应的方法，所述方法包括：向受试者施用权利要求1至164中任一项所述的组合物。
168.一种方法，所述方法包括：向受试者施用权利要求1至164中任一项所述的泛冠状病毒重组疫苗组合物，其中，所述组合物预防病毒在肺部、脑部和病毒复制所在的其他部位中复制。
169.一种方法，所述方法包括：向受试者施用权利要求1至164中任一项所述的泛冠状病毒重组疫苗组合物，其中，所述组合物预防肺部、脑部和病毒复制所在的其他部位中的细胞因子风暴。
170.一种方法，所述方法包括：向受试者施用权利要求1至164中任一项所述的泛冠状病毒重组疫苗组合物，其中，所述组合物预防肺部、脑部和病毒复制所在的其他部位中的炎症或炎症反应。
171.一种方法，所述方法包括：向受试者施用权利要求1至164中任一项所述的泛冠状病毒重组疫苗组合物，其中，所述组合物改善T细胞在肺部、脑部和病毒复制所在的其他部位中的归巢和保留。
172.一种在受试者中预防冠状病毒疾病的方法，所述方法包括：向受试者施用权利要求1至164中任一项所述的泛冠状病毒重组疫苗组合物，其中，所述组合物诱导记忆B细胞和T细胞。
173.根据权利要求172所述的方法，其中，所述组合物诱导驻留记忆T细胞(Trm)。
174.一种延长由泛冠状病毒疫苗诱导的免疫反应和增加T细胞向肺部迁移的方法，所述方法包括：共表达T细胞吸引趋化因子、促进T细胞增殖的组合物和权利要求1至164中任一项所述的泛冠状病毒重组疫苗组合物。
175.一种延长泛冠状病毒疫苗诱导的进入肺部的记忆T细胞的保留和增加病毒特异性组织驻留记忆T细胞(TRM细胞)的方法，所述方法包括：共表达T细胞吸引趋化因子、促进T细胞增殖的组合物和权利要求1至164中任一项所述的泛冠状病毒重组疫苗组合物。
176.一种方法，所述方法包括：向受试者施用权利要求1至164中任一项所述的泛冠状病毒重组疫苗组合物，其中，所述组合物预防冠状病毒的突变和变体的发展。
177.根据权利要求165至176中任一项所述的方法，其中，所述疫苗通过静脉内途径(i.v.)、鼻内途径(i.n.)或舌下途径(s.l.)施用。
178.根据权利要求165至177中任一项所述的方法，其中，所述重组疫苗组合物诱导针对冠状病毒疾病或感染的有效和强力的保护。
179.根据权利要求165至178中任一项所述的方法，其中，所述重组疫苗组合物诱导抗体(Ab)、CD4+T辅助细胞(Th1)和CD8+细胞毒性T细胞(CTL)的产生。
180.根据权利要求165至179中任一项所述的方法，其中，T细胞吸引趋化因子、促进T细胞增殖的组合物和泛冠状病毒疫苗中的一种以上与启动子可操作地连接。
181.根据权利要求180所述的方法，其中，所述启动子为肺特异性启动子。
182.根据权利要求181所述的方法，其中，所述肺特异性启动子为SP-B或CD144。
183.根据权利要求180所述的方法，其中，所述启动子为通用启动子。
184.根据权利要求183所述的方法，其中，所述启动子为人巨细胞病毒即刻早期增强子/启动子(CMV)。
185.根据权利要求165至185中任一项所述的方法，其中，所述促进T细胞增殖的组合物为IL-7、IL-2或IL-15。
186.根据权利要求165至186中任一项所述的方法，其中，所述促进T细胞增殖的组合物有助于促进长期免疫。
187.根据权利要求165至187中任一项所述的方法，其中，所述T细胞吸引趋化因子为CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11或它们的组合。
188.根据权利要求165至188中任一项所述的方法，其中，所述T细胞吸引趋化因子有助于将T细胞从循环拉入肺部。
189.一种方法，所述方法包括：
a.使用第一递送系统施用第一剂权利要求1至164中任一项所述的泛冠状病毒疫苗组合物；以及
b.使用第二递送系统施用第二剂；
其中，第一递送系统和第二递送系统不同。
190.根据权利要求189所述的方法，其中，所述第一递送系统包含RNA、修饰的mRNA或肽递送系统。
191.根据权利要求189或190所述的方法，其中，所述第二递送系统包含RNA、修饰的mRNA或肽递送系统。
192.根据权利要求189所述的方法，其中，所述肽递送系统为腺病毒或腺相关病毒。
193.根据权利要求190所述的方法，其中，所述腺病毒递送系统为Ad26、Ad5、Ad35或它们的组合。
194.根据权利要求190所述的方法，其中，所述腺相关病毒递送系统为AAV8或AAV9。
195.根据权利要求189至194中任一项所述的方法，其中，第二剂疫苗在施用第一剂疫苗14天后施用。
196.一种方法，所述方法包括：
a)施用权利要求1至164中任一项所述的泛冠状病毒重组疫苗组合物；以及
b)在施用所述泛冠状病毒重组疫苗组合物后施用至少一种T细胞吸引趋化因子。
197.根据权利要求196所述的方法，其中，所述重组疫苗组合物通过RNA、修饰的mRNA或肽递送系统来施用。
198.根据权利要求196或197所述的方法，其中，所述T细胞吸引趋化因子通过RNA、修饰的mRNA或肽递送系统来施用。
199.根据权利要求196至198中任一项所述的方法，其中，所述肽递送系统为腺病毒或腺相关病毒。
200.根据权利要求199所述的方法，其中，所述腺病毒递送系统为Ad26、Ad5、Ad35或它们的组合。
201.根据权利要求199所述的方法，其中，所述腺相关病毒递送系统为AAV8或AAV9。
202.根据权利要求196至201中任一项所述的方法，其中，在施用所述重组疫苗组合物14天后施用所述T细胞吸引趋化因子。
203.根据权利要求196至202中任一项所述的方法，其中，所述T细胞吸引趋化因子为CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11或它们的组合。
204.一种方法，所述方法包括：
a)施用权利要求1至164中任一项所述的泛冠状病毒重组疫苗组合物；
b)在施用所述泛冠状病毒重组疫苗组合物后施用至少一种T细胞吸引趋化因子；以及
c)在施用所述T细胞吸引趋化因子后施用至少一种细胞因子。
205.根据权利要求204所述的方法，其中，所述重组疫苗组合物通过RNA、修饰的mRNA或肽递送系统来施用。
206.根据权利要求204至205中任一项所述的方法，其中，所述T细胞吸引趋化因子通过RNA、修饰的mRNA或肽递送系统来施用。
207.根据权利要求204至206中任一项所述的方法，其中，所述细胞因子通过RNA、修饰的mRNA或肽递送系统来施用。
208.根据权利要求204至207中任一项所述的方法，其中，所述肽递送系统为腺病毒或腺相关病毒。
209.根据权利要求208所述的方法，其中，所述腺病毒递送系统为Ad26、Ad5、Ad35或它们的组合。
210.根据权利要求208所述的方法，其中，所述腺相关病毒递送系统为AAV8或AAV9。
211.根据权利要求204至210中任一项所述的方法，其中，在施用所述重组疫苗组合物14天后施用所述T细胞吸引趋化因子。
212.根据权利要求204至211中任一项所述的方法，其中，所述T细胞吸引趋化因子为CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11或它们的组合。
213.根据权利要求204至212中任一项所述的方法，其中，在施用所述T细胞吸引趋化因子10天后施用所述细胞因子。
214.根据权利要求16所述的方法，其中，所述细胞因子为IL-7、IL-15或它们的组合。
215.一种方法，所述方法包括：
a)施用权利要求1至164中任一项所述的泛冠状病毒重组疫苗组合物；
b)在施用所述泛冠状病毒重组疫苗组合物后施用一种以上T细胞吸引趋化因子；以及
c)施用一种以上粘膜趋化因子。
216.根据权利要求215所述的方法，其中，所述重组疫苗组合物使用修饰的RNA、腺相关病毒或腺病毒来施用。
217.根据权利要求215至216中任一项所述的方法，其中，所述T细胞吸引趋化因子通过RNA、修饰的mRNA或肽递送系统来施用。
218.根据权利要求215至216中任一项所述的方法，其中，所述粘膜趋化因子通过RNA、修饰的mRNA或肽递送系统来施用。
219.根据权利要求218所述的方法，其中，所述腺相关病毒为AAV8或AAV9。
220.根据权利要求218所述的方法，其中，所述腺病毒为Ad26、Ad5、Ad35或它们的组合。
221.根据权利要求215至220中任一项所述的方法，其中，在施用所述重组疫苗组合物14天后施用所述T细胞吸引趋化因子。
222.根据权利要求215至221中任一项所述的方法，其中，所述T细胞吸引趋化因子为CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11或它们的组合。
223.根据权利要求215至222中任一项所述的方法，其中，在施用所述T细胞吸引趋化因子10天后施用所述粘膜趋化因子。
224.根据权利要求215至223中任一项所述的方法，其中，所述粘膜趋化因子为CCL25、CCL28、CXCL14、CXCL17或它们的组合。
225.根据权利要求215至224中任一项所述的方法，其中，所述重组疫苗组合物通过两剂施用。
226.根据权利要求215至225中任一项所述的方法，其中，剂的间隔约3周。
227.一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，所述组合物包含一个以上大序列，所述一个以上大序列中的每一个均包含如下中的至少一种：
a)全刺突蛋白或刺突蛋白的一部分；
b)一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；以及
c)一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；
其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
228.根据权利要求227所述的组合物，其中，一个以上保守表位在人类和动物冠状病毒中高度保守。
229.根据权利要求227至228中任一项所述的组合物，其中，一个以上保守表位来源于SARS-CoV-2蛋白中的至少一种。
230.根据权利要求227至229中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含2至20种CD8+T细胞靶表位。
231.根据权利要求227至230中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含2至20种CD4+T细胞靶表位。
232.根据权利要求227至231中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：58至SEQ ID NO：105(ORF1a1350-1365、ORF1ab5019-5033、ORF612-26、ORF1ab6088-6102、ORF1ab6420-6434、ORF1a1801-1815、S1-13、E26-40、E20-34、M176-190、N388-403、ORF7a3-17、ORF7a1-15、ORF7b8-22、ORF7a98-112和ORF81-15)。
233.根据权利要求227至232中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：106至SEQ ID NO：138(S287-317、S524-598、S601-640、S802-819、S888-909、S369-393、S440-501、S1133-1172、S329-363和S13-37)。
234.一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，所述组合物包含一个以上大序列，所述一个以上大序列中的每一个均包含如下中的至少一种：
a)一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位；
b)一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；和/或
c)一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；
其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
235.根据权利要求234所述的组合物，其中，一个以上保守表位来源于SARS-CoV-2蛋白中的至少一种。
236.根据权利要求234至235中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含2至20种CD8+T细胞靶表位。
237.根据权利要求234至236中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含2至20种CD4+T细胞靶表位。
238.根据权利要求234至237中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：58至SEQ ID NO：105(ORF1a1350-1365、ORF1ab5019-5033、ORF612-26、ORF1ab6088-6102、ORF1ab6420-6434、ORF1a1801-1815、S1-13、E26-40、E20-34、M176-190、N388-403、ORF7a3-17、ORF7a1-15、ORF7b8-22、ORF7a98-112和ORF81-15)。
239.根据权利要求234至238中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：106至SEQ ID NO：138(S287-317、S524-598、S601-640、S802-819、S888-909、S369-393、S440-501、S1133-1172、S329-363和S13-37)。
240.根据权利要求234至239中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位选自SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：57(S2-10、S1220-1228、S1000-1008、S958-966、E20-28、ORF1ab1675-1683、ORF1ab2363-2371、ORF1ab3013-3021、ORF1ab3183-3191、ORF1ab5470-5478、ORF1ab6749-6757、ORF7b26-34、ORF8a73-81、ORF103-11和ORF105-13)。
241.一种泛冠状病毒重组疫苗组合物，所述组合物包含编码一个以上大序列的抗原递送系统，所述大序列包含如下中的至少一种：
a)一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位；
b)一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位；和/或
c)一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位；
其中，至少一种表位来源于非刺突蛋白。
242.根据权利要求241所述的组合物，其中，所述抗原递送系统为基于腺病毒的抗原递送系统。
243.根据权利要求242所述的组合物，其中，所述基于腺病毒的抗原递送系统为Ad26、Ad5、Ad35或它们的组合。
244.根据权利要求241至243中任一项所述的组合物，其中，所述抗原递送系统还编码T细胞吸引趋化因子。
245.根据权利要求241至244中任一项所述的组合物，其中，所述抗原递送系统还编码促进T细胞增殖的组合物。
246.根据权利要求241至245中任一项所述的组合物，其中，所述抗原递送系统还编码分子佐剂。
247.根据权利要求241至246中任一项所述的组合物，其中，所述表位与肺特异性启动子可操作地连接。
248.根据权利要求241至247中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒B细胞靶表位选自SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：57(S2-10、S1220-1228、S1000-1008、S958-966、E20-28、ORF1ab1675-1683、ORF1ab2363-2371、ORF1ab3013-3021、ORF1ab3183-3191、ORF1ab5470-5478、ORF1ab6749-6757、ORF7b26-34、ORF8a73-81、ORF103-11和ORF105-13)。
249.根据权利要求241至248中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD4+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：58至SEQ ID NO：105(ORF1a1350-1365、ORF1ab5019-5033、ORF612-26、ORF1ab6088-6102、ORF1ab6420-6434、ORF1a1801-1815、S1-13、E26-40、E20-34、M176-190、N388-403、ORF7a3-17、ORF7a1-15、ORF7b8-22、ORF7a98-112和ORF81-15)。
250.根据权利要求241至249中任一项所述的组合物，其中，一种以上保守的冠状病毒CD8+T细胞靶表位选自SEQ ID NO：106至SEQ ID NO：138(S287-317、S524-598、S601-640、S802-819、S888-909、S369-393、S440-501、S1133-1172、S329-363和S13-37)。
251.根据权利要求241至250中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含刺突蛋白或部分刺突蛋白。
252.根据权利要求251所述的组合物，其中，所述部分刺突蛋白包含三聚体化的SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)。
253.根据权利要求251至252中任一项所述的组合物，其中，所述全刺突蛋白或部分刺突蛋白具有完整的S1-S2切割位点。
254.根据权利要求251至253中任一项所述的组合物，其中，所述刺突蛋白在氨基酸986位和987位处用脯氨酸取代而稳定。
255.一种包含SEQ ID NO：139至SEQ ID NO：147中一个的泛冠状病毒重组疫苗组合物。
CN202180042301.9A 2020-04-14 2021-04-14 大序列泛冠状病毒疫苗组合物 Pending CN116033920A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063009907P 2020-04-14 2020-04-14
US63/009,907 2020-04-14
US202063084421P 2020-09-28 2020-09-28
US63/084,421 2020-09-28
PCT/US2021/027355 WO2021211760A1 (en) 2020-04-14 2021-04-14 Large sequence pan-coronavirus vaccine compositions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116033920A true CN116033920A (zh) 2023-04-28

Family

ID=78084328

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180042301.9A Pending CN116033920A (zh) 2020-04-14 2021-04-14 大序列泛冠状病毒疫苗组合物

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20230226173A1 (zh)
EP (3) EP4135762A4 (zh)
JP (1) JP2023521837A (zh)
KR (1) KR20230002571A (zh)
CN (1) CN116033920A (zh)
AU (1) AU2021254768A1 (zh)
CA (1) CA3178834A1 (zh)
IL (1) IL297335A (zh)
WO (3) WO2021211749A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114591401A (zh) * 2021-05-18 2022-06-07 深圳市因诺转化医学研究院 SARS-CoV-2编码蛋白来源的T细胞表位多肽HLVDFQVTI及其应用

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB202307565D0 (en) 2020-04-22 2023-07-05 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2022013609A1 (en) * 2020-07-13 2022-01-20 Immunovaccine Technologies, Inc. Sars-cov-2 vaccine compositions and methods of preparation and use
EP4333868A1 (en) * 2021-05-04 2024-03-13 King Abdullah University Of Science And Technology Immuogenic compositions of mutant sars-cov-2 n protein and gene and methods of use thereof
WO2023283642A2 (en) * 2021-07-09 2023-01-12 Modernatx, Inc. Pan-human coronavirus concatemeric vaccines
EP4366765A1 (en) * 2021-07-09 2024-05-15 Atossa Therapeutics, Inc. Compositions and methods to increase coronavirus immune response
WO2023044542A1 (en) * 2021-09-24 2023-03-30 The University Of Adelaide Sars cov-2 vaccine
CN114395017A (zh) * 2021-10-29 2022-04-26 中国科学院深圳先进技术研究院 SARS-CoV-2病毒样颗粒的制备方法及其应用
EP4176898A1 (en) * 2021-11-08 2023-05-10 Charité - Universitätsmedizin Berlin Pan sars-cov2 vaccine antigen
CN114181320B (zh) * 2021-12-09 2023-04-25 新疆医科大学第一附属医院 一种针对新冠原始株和变异株的重组多表位疫苗rSMEV及其应用
CN114478716B (zh) * 2021-12-28 2024-05-28 梅州市人民医院(梅州市医学科学院) 一种多肽组合及其在新型冠状病毒抗体检测中的应用
WO2023159082A2 (en) * 2022-02-15 2023-08-24 Ohio State Innovation Foundation Nanotechnology based intranasal vaccine for covid-19 comprising chitosan
WO2023240148A2 (en) * 2022-06-07 2023-12-14 The Regents Of The University Of California Hybrid flu-coronavirus vaccine
US11878055B1 (en) 2022-06-26 2024-01-23 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2024011163A1 (en) * 2022-07-06 2024-01-11 Georgia State University Research Foundation, Inc. Coronavirus vaccines and methods of use thereof
WO2024064965A2 (en) * 2022-09-23 2024-03-28 Advanced Rna Vaccine (Arv) Technologies, Inc. Nucleic acid-based universal vaccine and methods of use thereof
WO2024074634A1 (en) * 2022-10-06 2024-04-11 BioNTech SE Rna compositions targeting claudin-18.2
CN116041540A (zh) * 2022-11-18 2023-05-02 中山大学 一种增强新冠突变株疫苗广谱性的方法及新冠广谱疫苗
CN117330750A (zh) * 2023-12-01 2024-01-02 北京生物制品研究所有限责任公司 一种筛选新冠病毒早期毒种的方法和制造疫苗的方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005012337A2 (en) * 2003-07-15 2005-02-10 Crucell Holland B.V. Antigenic peptides of sars coronavirus and uses thereof
KR101206206B1 (ko) * 2003-07-22 2012-11-29 크루셀 홀란드 비.브이. 사스-코로나바이러스에 대한 결합분자 및 그것의 용도
CA2561245C (en) * 2004-04-09 2013-06-18 Wyeth Synergistic attenuation of vesicular stomatitis virus, vectors thereof and immunogenic compositions thereof
US8394386B2 (en) * 2004-04-28 2013-03-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Sequential delivery of immunogenic molecules via adenovirus and adeno-associated virus-mediated administrations
JP2008545180A (ja) * 2005-05-12 2008-12-11 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド Ｔ細胞エピトープの全自動選択システムおよび方法
EP2368569A3 (en) * 2006-01-18 2012-05-02 University Of Chicago Compositions and methods related to staphylococcal bacterium proteins
DK2134742T3 (da) * 2007-02-27 2012-08-06 Wyeth Llc Immunogene sammensætninger til behandling og forebyggelse af infektioner hos dyr
WO2009117134A2 (en) * 2008-03-21 2009-09-24 National Institutes Of Health Aerosolized genetic vaccines and methods of use
EP2358757B1 (en) * 2008-11-18 2018-09-12 Beth Israel Deaconess Medical Center Antiviral vaccines with improved cellular immunogenicity
KR102019728B1 (ko) * 2009-04-17 2019-09-09 글로브이뮨 암에 대한 병용 면역요법 조성물 및 방법
CN101792491B (zh) * 2009-11-05 2012-07-25 中国人民解放军第四军医大学 一种基于多串联表位的重组腺病毒hiv疫苗及其制备方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114591401A (zh) * 2021-05-18 2022-06-07 深圳市因诺转化医学研究院 SARS-CoV-2编码蛋白来源的T细胞表位多肽HLVDFQVTI及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20230226173A1 (en) 2023-07-20
WO2021211748A1 (en) 2021-10-21
EP4135765A1 (en) 2023-02-22
EP4135762A1 (en) 2023-02-22
WO2021211749A1 (en) 2021-10-21
KR20230002571A (ko) 2023-01-05
CA3178834A1 (en) 2021-10-21
EP4135765A4 (en) 2024-05-08
JP2023521837A (ja) 2023-05-25
EP4135762A4 (en) 2024-05-15
EP4135764A1 (en) 2023-02-22
EP4135764A4 (en) 2024-05-08
AU2021254768A1 (en) 2022-11-17
WO2021211760A1 (en) 2021-10-21
IL297335A (en) 2022-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN116033920A (zh) 大序列泛冠状病毒疫苗组合物
US11911462B2 (en) Nucleic acid vaccine against the SARS-CoV-2 coronavirus
US20230190915A1 (en) T cell epitopes and related compositions useful in the prevention, diagnosis, and treatment of covid-19
Díaz et al. In silico prediction and ex vivo evaluation of potential T-cell epitopes in glycoproteins 4 and 5 and nucleocapsid protein of genotype-I (European) of porcine reproductive and respiratory syndrome virus
TW202140794A (zh) 疫苗及其誘導對sars-cov2之免疫反應之用途
Olech The genetic variability of small-ruminant lentiviruses and its impact on tropism, the development of diagnostic tests and vaccines and the effectiveness of control programmes
Zhang Covid-19: from basics to clinical practice
US20230173060A1 (en) Large sequence pan-coronavirus vaccine compositions
US20230192777A1 (en) Epitopic vaccine for african swine fever virus
KR101845571B1 (ko) 전통적 돼지열에 대한 마커 백신
WO2023240159A2 (en) Sars-cov-2 multi-antigen universal vaccines
US20230086390A1 (en) Anti COVID-19 Therapies targeting nucleocapsid and spike proteins
JP2023510544A (ja) ヘルペスウイルス糖タンパク質ｄと融合したｂ型肝炎ウイルス抗原をコードするアデノウイルスベクター及びその使用方法
WO2023126882A1 (en) Denv ediii-ns1 consensus sequence-based dengue dna vaccine
WO2018146257A1 (en) Hepatitis e virus vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination