CN101792491B - 一种基于多串联表位的重组腺病毒hiv疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于多串联表位的重组腺病毒HIV疫苗及其制备方法，该疫苗是一种重组腺病毒HIV疫苗，以腺病毒作为载体，以改造隐性表位为基础的多串联的CTL表位基因作为目标基因片段构建重组腺病毒载体作为转染的外源性载体。本发明提供的疫苗克服HIV疫苗诱导CTL反应时HIV逃避CTL的识别缺陷，既能够产生中和HIV-1毒株的抗体，又可以诱导更加有效的HIV-1特异性CTL反应的HIV疫苗。

Description

一种基于多串联表位的重组腺病毒HIV疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及防御性和/或治疗性HIV疫苗，特别涉及一种基于多串联表位的重组腺病毒HIV疫苗及其制备方法。

背景技术

目前，据联合国AIDS规划署和WHO报告，全球大约有6千万人感染人类获得性免疫缺陷病毒(HIV)。现在已经进入AIDS大流行的第3个十年，仍然没有找到有效的HIV预防性疫苗，全球性HIV相关的疾病与死亡的负担正在以其它任何病原体都无法相比的速率增加，大多数人没有机会接受有效的抗病毒治疗而死于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，AIDS已经成为人类前所未有的最具毁灭性的疾病。

在我国HIV/AIDS的流行状况也不容乐观，已经从局部流行进入广泛流行的快速增长期，我国卫生部公布的2005年全国法定报告传染病疫情，数据中可以看出，艾滋病发病的死亡数，已占据甲、乙类传染病发病报告死亡数的第三位，超过了乙型肝炎致死的人数。

国际上HIV预防性疫苗的研制尚未取得实质性进展。越来越多的证据表明，在控制慢性、病毒性感染疾病中，细胞免疫尤其是以CD8⁺T细胞介导的细胞毒性T淋巴细胞反应(CTL)比抗体更为重要(Sparacio S，Zeilfelder U，Pfeiffer T，et al.Membrane fusion between retroviral particles：hostrangeextension and vaccine prospects.Virology，2000，271(2)：248-252.)。目前，也有很多的证据提示治疗性疫苗诱导的CTL反应能够比较有效地控制HIV-1感染(Shiver JW，Fu TM，Chen L，et al.Replication-incompetent adenoviralvaccine vector elicits effective anti-immunodeficiency-virus immunity.Nature，2002，415(6869)：331-335.)。而不幸的是，Barouch等在另一项研究中提示：HIV突变能够逃避疫苗诱导的细胞性免疫应答，进而逃避CTL的识别，导致部分免疫保护失败。研究中的一个被免疫动物的免疫优势Gag CTL表位的核苷酸突变引起了病毒逃避CTL的识别，从而不能抑制病毒的复制，导致疾病进展加快，最后死于艾滋病相关合并症(Barouch DH，Kunstman J，KurodaMJ，et al.Eventual AIDS vaccine failure in a rhesus monkey by viral escape fromcytotoxic T lymphocytes.Nature，2002，415(6869)：335-339.)。这提示HIV逃避CTL的识别将会成为诱导CTL反应的艾滋病疫苗的主要缺陷。

人们应该努力开发一种疫苗既能够产生中和不同HIV-1毒株的抗体，又可以诱导更加有效的HIV-1特异性CTL反应。人们期望这些疫苗能够减轻HIV感染者的病情，通过早期免疫艾滋病疫苗延长HIV感染者的寿命和改善他们的生活质量也许是目前人们所能够达到的目标。目前，还没有一种治疗性疫苗或免疫治疗制剂[如白细胞介素2(IL-2)]可被接受为感染者的标准治疗。

发明内容

本发明解决的在于提供一种基于多串联表位的重组腺病毒HIV疫苗及其制备方法，该疫苗能够激发多重免疫途径，用于预防和治疗HIV的感染。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种多串联表位，为由Ala-Ala-Tyr连接多个HIV的HLA限制性CTL表位，其中，包括以下表位：

Tyr-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Gly-Lys-Ile；

Tyr-Leu-Asn-Asn-Pro-Pro-Ile-Pro-Val；

Tyr-Leu-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu；

Tyr-Leu-S er-Leu-S er-Phe-Pro-Gln-Ile；

Tyr-Leu-Asp-Thr-Gly-Ala-Asp-Asp-Thr；

Tyr-Leu-S er-Gln-Ile-Ile-Glu-Gln-Leu；

Tyr-Leu-Gly-Glu-Arg-Ile-Val-Asp-Ile；

Tyr-Leu-Gln-Lys-Glu-Thr-Trp-Glu-Ala。

所述的多串联表位，其具体的氨基酸连接顺序如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的多串联表位，为了避免HIV的免疫优势表位突变而导致病毒逃避CTL的识别，选用更加保守的HIV的HLA低亲和性的的表位；而且对所选择的表位进行修饰，使得低亲和性表位改造为高亲和力表位；这样既保证了表位的保守性又使得表位能够被递呈；

更进一步将修饰后的多个HIV的HLA低亲和性的CTL表位通过Ala-Ala-Ty(甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸)间隔连接，以便于各表位保持独立性和能够有效呈递，进而刺激机体的免疫系统，引发多重的免疫效果，从而起到加强免疫原性和抗病毒变异的目的，弥补HIV突变引起了病毒逃避CTL的识别所不能激发的机体免疫。

基于上述多串联表位，本发明构建了一种重组腺病毒HIV疫苗，该疫苗是将包含目的片段p24MEG的载体整合到腺病毒的基因组；

所述含目的片段p24MEG是将HIV-1的p24基因部分序列与表达权利要求1所述的多串联表位的核苷酸序列MEG连接。

所述的MEG其具体的序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的HIV的p24基因部分序列其具体的序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的载体为腺病毒穿梭载体。

所述的包含目的片段p24MEG的载体为，包含目的片段p24MEG和标记片段GFP的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-p24MEG。

所述的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-p24MEG通过多克隆位点将连接有GFP的目的片段p24MEG连接到pAdxsi载体上。

本发明提供的重组腺病毒HIV疫苗，是以腺病毒作为具体的携带载体和佐剂，目的片段p24MEG被表达后，机体针对p24MEG蛋白所包含的表位被识别、递呈之后能够激发特异性的抗体，同时引起免疫细胞的刺激和免疫因子的诱生；

由于p24作为载体支架分子使得多串联的HIV表位能够被有效的递呈，进而刺激机体免疫系统，引发包括特异性抗体的体液免疫应答；

由于是HLA限制性的多表位的串联，抗原递呈之后，能够激发CD8⁺T细胞介导的细胞毒性T淋巴细胞反应；而且采用修饰后的低亲和性表位在不改变表位肽和TCR结合的特异性的同时，增加“肽-MHC”的亲和性却可以激发针对天然低亲和性表位的免疫应答，并产生高活性的CTL。

该疫苗是一种既能够产生中和不同HIV-1毒株的抗体，又可以诱导更加有效的HIV-1特异性CTL反应的疫苗。

本发明还公开了重组腺病毒pAdxsi-GFP-p24MEG疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)将SEQ ID NO.2所示的MEG片段和SEQ ID NO.3所示的p24基因部分序列连接后，通过KpnI/EcoRI双酶切位点克隆入穿梭载体pShuttle-GFP-CMV，得到重组穿梭载体pShuttle-GFP-p24MEG；

2)重组穿梭载体pShuttle-GFP-p24MEG被I-CeuI/I-SceI双酶切后得到GFP-p24MEG片段，然后将其克隆入同样被I-CeuI/I-SceI双酶切的pAdxsi载体上，得到重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-p24MEG；

3)将PacI内切酶线性化的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-p24MEG脂质体法转染，得到重组腺病毒；

4)包含重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-p24MEG的腺病毒大量扩增后，细胞反复冻融后得到混悬液，离心收取包含重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-p24MEG的重组腺病毒的上清液；

5)将上清液分别通过不连续密度梯度离心、连续密度梯度离心和透析分离纯化，得到纯化的重组腺病毒液，即为重组腺病毒pAdxsi-GFP-p24MEG疫苗。

所述的MEG片段和p24基因部分序列连接为：用包含KpnI/BamHI双酶切黏性末端的p24-651基因片段和包含BamHI/EcoRI双酶切黏性末端的MEG片段，以及包含KpnI/EcoRI双酶切双酶切黏性末端中间载体用T₄DNA连接酶连接。

本发明对于重组腺病毒pAdxsi-GFP-p24MEG疫苗的动物免疫试验验证表明：

1、本发明构建的重组腺病毒HIV疫苗能够有效诱导机体产生抗体；

2、本发明构建的重组腺病毒HIV疫苗能够显著提高刺激特异性淋巴细胞增殖；

3、本发明构建的重组腺病毒HIV疫苗能够显著诱导IL-2，IFN-r等细胞免疫因子的产生。

4、本发明构建的重组腺病毒HIV疫苗能够显著诱导效应细胞对靶细胞的杀伤，显示较高的CTL活性。

附图说明

图1为重组穿梭载体pShuttle-GFP-p24MEG的双酶切鉴定电泳图；

图2为pAdxsi载体的质粒图谱；

图3为重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-p24MEG的xhoI酶切鉴定电泳图，

图4为PCR法鉴定重组腺病毒中的p24MEG片段结果图；

图5为ELISA法检测重组腺病毒pAdxsi-GFP-p24MEG免疫小鼠后不同时间诱导特异性抗体产生的直方图，横坐标：免疫后周数，0-12周，纵坐标：OD_490nm(波长)吸光度；

图6为pAdxsi-GFP-p24MEG特异性淋巴细胞增殖实验，横坐标的各个免疫组分别为：生理盐水对照组，腺病毒空病毒对照组，重组腺病毒pAdxsi-GFP-p24MEG组，纵坐标：增殖刺激指数(stimulation index，SI)＝实验组OD/对照组OD表示；

图7为pAdxsi-GFP-p24MEG免疫后细胞因子IFN-gamma诱生实验，横坐标：pAdxsi-GFP-p24MEG免疫后诱生细胞因子IFN-gamma的浓度，纵坐标的各个免疫组分别为：生理盐水对照组，腺病毒空病毒对照组，重组腺病毒pAdxsi-GFP-p24MEG组；

图8为pAdxsi-GFP-p24MEG免疫后细胞因子IL-2诱生实验，横坐标：pAdxsi-GFP-p24MEG免疫后诱生细胞因子IL-2的浓度；纵坐标的各个免疫组分别为：生理盐水对照组，腺病毒空病毒对照组，重组腺病毒pAdxsi-GFP-p24MEG组；

图9为pAdxsi-GFP-p24MEG免疫后特异性CTL杀伤实验，横坐标：效应细胞和靶细胞数目的比值，纵坐标：不同效靶下的杀伤效率。

具体实施方式

为了克服HIV疫苗诱导CTL反应时HIV逃避CTL的识别缺陷；本发明提供的疫苗是是一种重组腺病毒HIV疫苗，以腺病毒作为载体和佐剂，以多串联的CTL表位作为目标基因片段构建重组载体作为转染的外源性载体。该疫苗既能够产生中和HIV-1毒株的抗体，又可以诱导更加有效的HIV-1特异性CTL反应的HIV疫苗。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、多串联的HIV的HLA限制性CTL表位

1)采用超基序、蛋白酶解预测相结合的办法筛选HIV的HLA-A*0201限制性、低亲和性的CTL表位

首先，进入SYFPEITHI主页(http://www.syfpeithi.de/scripts/MHCServer.dll/home.htm)，对HIV基因组的Gag和pol基因区(Gag和pol抗原是HIV病毒重要的结构和功能蛋白)的HLA-A*0201限制性表位进行远程预测，选出HIV-1(本发明在在进行表位预测选用更为常见的HIV-1作为具体的分型)的Gag和pol抗原中预测评分小于18的表位肽；这是因为低亲和力表位多为保守序列，不易发生突变；

其次，以HLA限制性CTL表位结合力预测软件(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla-bind/)作为工具，进一步选择亲和力评分小于6的九肽进入下一步筛选过程；

然后，对Gag和pol抗原进行蛋白酶体降解位点预测，具体以(http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP和http://www.paproc.de)作为检测，以0.5切割可能性的阈值。

以在上述预测结果中均出现的肽为最终候选的HLA限制性的CTL表位肽，所选择的表位是保守性高的低亲和性的表位。

2)对候选表位肽的氨基酸修饰

对最终候选表位肽进行氨基酸修饰，修饰肽的方法是将表位肽的第一位氨基酸残基改为酪氨酸残基(Tyr)，第二位的氨基酸残基改造为亮氨酸残基(Leu)；并对改造后的表位肽按照上述1)所述标准进行超基序分析(http://www.syfpeithi.de/scripts/MHCServer.dll/home.htm)和亲和性评分(http://bimas.cit.nih.gov/molbio/hla-bind和http://www.immuneepitope.org)。

超基序分析显示改造后表位的分值均高于改造前，且高于18分，绝大多数大于21分(21分为常规判断高亲和力表位的标准)，两种亲和力评分软件分析也显示亲和力比改造前有明显升高。

3)综合预测和改造方法得出修饰后HIV-1的gag和pol抗原为如表1所示：

表1筛选的用于多串联的HIV的HLA限制性CTL表位

序号	表位位置	最终候选表位	氨基酸修饰后表位
				1	gag429-437	RQANFLGKI	YLANFLGKI

2	gag249-257	MTNNPPIPV	YLNNPPIPV
				3	gag259-267	EIYKRWIIL	YLYKRWIIL
4	pol52-60	TVSLSFPQI	YLSLSFPQI
				5	pol80-88	LLDTGADDT	YLDTGADDT
6	pol673-681	LVSQIIEQL	YLSQIIEQL
				7	pol911-919	SAGERIVDI	YLGERIVDI
8	pol548-556	PIQKETWEA	YLQKETWEA

4)多个HIV的HLA限制性CTL表位的串联连接

氨基酸修饰后各表位间用丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸(Ala-Ala-Tyr)分隔连接，以便于各表位保持独立性和能够有效呈递；由于各个表位是能够独立递呈，因此这8个表位的串联连接不需要特定连接的顺序。

2、包含多串联的HLA限制性CTL表位的重组载体的构建

1)多串联CTL表位基因的合成

本发明具体以下面所述的顺序串联表1所公开的8个氨基酸修饰的CTL表位，对于表位串联的顺序也可以是其他形式的；

具体串联顺序为：采用gag-pol的连接方式，即首先是来自gag的表位之后是来自pol的表位，本发明具体公开SEQ ID NO.1所示的序列，并以此作为后续构建重组疫苗的基础；

将上述多表位串联转化翻译为核苷酸序列，并在其5′和3′端分别引入BamH I和EcoRI酶切位点，靠近5′端引入linker序列Gly4Ser3(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ser-Ser)；总共361bp的序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中，第3-8bp为BamH I酶切位点，第354-359bp为EcoRI酶切位点；

合成上述核苷酸序列后，通过BamH I和EcoRI酶切位点克隆入p^GEM-T-easy载体，将重组后的载体记作T-MEG；双酶切-电泳鉴定，并送至上海生工公司测序，证明T-MEG载体中目标片段MEG序列无误，多表位串联的片段MEG克隆成功。

2)疫苗支架分子HIV-1p24的序列合成

HIV的衣壳蛋白p24是高度保守的核心蛋白，存在大量T、B细胞优势抗原表位，能诱导不同病毒株的交叉免疫应答；同时，p24蛋白能够独立形成颗粒样结构，是进行HIV疫苗设计的重要候选抗原。我国研究人员使用p24抗原联合若干HIV优势表位构建的DNA疫苗，较好的诱导了小鼠体内的免疫应答.(宋英今，金宁，张立树，李子建，金洪涛，郎守民.治疗性HIV-1重组DNA疫苗的构建与免疫效果评价.中国生物制品学杂志.2005，18(2)：126-128)

为了选择具有颗粒样结构HIV p24蛋白作为外源抗原表位的支架载体系统，以使所选抗原优势表位能够充分展现在其表面，获得更佳的免疫效果；本发明以HIV-1p24蛋白作为疫苗的支架分子，将HIV-1p24的部分基因序列整合到多表位连接片段MEG上。

HIV-1p24基因的克隆具体为：

根据HIV-1标准株p24片段基因序列设计特异性引物，正向引物引入Kpn I酶切位点，反向引物引入BamH I酶切位点；其特异性的引物设计为：

正向引物P1：gcggtaccat gcctagaact ttaaatgcat g    31；

反向引物P2：gcggatccca agactcttgc tttatgtc        28；

PCR模板为puc19/HIV-1(HIV标准株)，以引物P1、P2扩增编码HIV-1核心蛋白p24基因的序列，PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性50sec，60℃复性50sec，72℃延伸60sec，共进行35个循环，末次循环72℃延伸10min；扩增后的651bp序列如SEQ ID NO.3所示；

将PCR产物用琼脂糖凝胶回收，并将其记作p24-651；将p24-651基因通过Kpn I酶切位点、BamH I酶切位点克隆入P^GEM-T-easy载体，将重组后的载体记作T-p24；双酶切-电泳鉴定，观察有无目的片段，并送至上海生工公司测序，后证明T-p24载体中目标片段p24-651序列无误，疫苗支架分子的基因片段p24克隆成功。

3)多串联CTL表位基因与疫苗支架分子基因p24-651的拼接

用KpnI/BamHI双酶切T-p24，获得p24-651基因片段；以BamHI和EcoRI双酶切T-MEG，获得MEG片段，将p24-651、MEG和经KpnI和EcoRI双酶切的真核载体pCDNA3.1(+)用T₄DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α；

蓝白筛选后挑取阳性克隆，将重组质粒记作pcDNA3.1(+)/p24MEG；并对重组质粒用双酶切鉴定，将酶切鉴定得到的阳性克隆，送TaKaRa公司进行核苷酸序列测定，后证明目标片段p24MEG序列无误，连接有支架分子基因p24的多串联CTL表位基因片段克隆成功。

4)包含p24MEG片段的重组穿梭载体pShuttle-GFP-p24MEG的构建

a、重组穿梭载体pShuttle-GFP-CMV酶切

将pShuttle-GFP-CMV重组穿梭载体用KpnI/EcoRI酶切，然后CIP(碱性磷酸酶)去磷酸化处理(酶切体系及反应条件如表2所示)，然后加样至1％的琼脂糖凝胶，电泳(100V，45min)，在紫外灯下切下目的片段(5.1kb)，用DNA凝胶回收与纯化试剂盒(柱离心型)回收5.1kb的载体片段；

表2KpnI/EcoRI酶切体系及CIP反应条件

载体质粒DNA	2ug
		10×Buffer	5.0μL
10×BSA	5.0μL
		KpnI(NEB，10U/μL)	1.5μL
EcoRI(NEB，20U/μL)	1.5μL
		ddH2O	补齐至50.0μL
总体积	50.0μL
		37℃	3-4小时
CIP	0.5μL
		37℃	0.5小时

b、pcDNA3.1(+)/p24MEG载体酶切

将pcDNA3.1(+)/p24MEG进行Kpnl/EcoRI酶切处理(50μL的酶切体系，其中10U/μL的KpnI酶1μL，10U/μL的EcoRI酶1μL，37℃3-4小时)，酶切结束后，用DNA纯化试剂盒(柱离心型)回收1012bp的片段，得到含有相应粘性末端(KpnI/EcoRI)的p24MEG片段；

c、酶切片段连接，构建重组穿梭载体pShuttle-GFP-p24MEG

将酶切处理好的pShuttle-GFP-CMV重组穿梭载体载体片段和插入片段p24MEG用T₄DNA连接酶进行连接，取3μL连接产物转化化学感受态细胞DH5a菌株，涂布到卡那抗性固体培养基平皿筛选培养。

挑取若干单克隆菌落，接种到LB培养基(卡那抗性液体培养基)中，37℃、摇床中300rpm振荡培养过夜；然后提取质粒，进行重组穿梭载体质粒酶切鉴定，50μL酶切鉴定体系及反应条件如表3所示：

表3KpnI/EcoRI双酶切体系

提取的重组穿梭质粒DNA	1μL
		10×Buffer	1μL
10×BSA	1μL
		KpnI（NEB，10U/μL)	0.3ul
EcoRI（NEB，20U/μL)	0.3μL
		ddH2O	补齐至10μL
总体积	10μL
		37℃	1-2小时

酶切鉴定结果如图1所示，其中，泳道M为Marker，从上到下依次为：8kb，7kb，6kb，5kb，4kb，3kb，2kb，1.6kb，1kb，517bp，396bp，230bp；在泳道1～4可以清楚看到分离到了1kb的目标片段p24MEG；酶切完成后加样至1％的琼脂糖凝胶电泳，阳性克隆将得到：1kb的目标片段p24MEG、5.1kb的pShuttle-GFP重组穿梭载体酶切片段；至此重组穿梭载体pShuttle-GFP-p24MEG构建成功。

5)将重组穿梭载体pShuttle-GFP-p24MEG转移到pAdxsi载体上，构建重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-p24MEG

a、用I-CeuI/I-SceI双酶切处理pAdxsi载体(pAdxsi载体的质粒图谱如图2所示)，并做CIP去磷酸化处理，酶切及反应条件如表4所示：

表4I-CeuI/I-SceI双酶切及CIP体系

载体质粒DNA	3-4μg
		10×Buffer	5μL
10×BSA	5μL
		I-CeuI(NEB，5U/μL)	2μL
I-SceI(NEB，5U/μL)	2μL
		ddH2O	补齐至50μL
总体积	50μL
		37℃	3-4小时
CIP	0.5μL
		37℃	0.5小时

酶切反应完成后，再加入10％SDS，75℃灭活10min后用乙醇沉淀法回收pAdxsi载体；

b、I-CeuI/I-SceI双酶切处理穿梭载体pShuttle-GFP-p24MEG(酶切反应条件参照上述pAdxsi载体的酶切)，酶切反应完成后，琼脂糖凝胶电泳回收约3.8kb的GFP-p24MEG片段；

c、pAdxsi-GFP-p24MEG载体的连接

将双酶切后回收的pAdxsi载体片段和插入片段GFP-p24MEG，在22℃条件下用5Weiss u/μL的T₄DNA连接酶进行连接；然后取3μL连接产物转化化学感受态细胞DH5a菌株，涂布到氨卞抗性固体培养基平皿；

挑取若干单克隆菌落，接种到氨卞抗性液体培养基中培养过夜，提取质粒并进行XhoI酶切鉴定(20U/μL的XhoI限制性酶37℃反应1-2小时)20U/μL，根据重组后腺病毒载体的序列分析携带目的基因表达框的阳性克隆被XhoI酶切后电泳图谱如图3所示，其中，泳道M为Marker，从上到下依次为14.5K/11.7K/3.6kb/2.66K/2.47K/1.45K/0.6K；泳道1～4为阳性克隆，其片段依次为14.5K/11.7K/3.6kb/2.66K/2.47K/1.45K/0.6K，其中，目的片段GFP-p24MEG为2.2K，这表明阳性克隆已经表达了转入的重组腺病毒载体。

3、包含p24MEG目的片段的重组腺病毒的构建、培养及纯化

1)大量制备重组质粒pAdxsi-GFP-p24MEG

将重组菌体处于对数生长期的LB培养液2ml加入100mL含100ug/mlAmp的LB培养基中，37℃、300rpm震荡摇菌过夜；大提质粒试剂盒提取pAdxsi-GFP-p24MEG质粒。

2)重组腺病毒载体的包装，收毒及扩增

a、铺细胞：

转染前一天，将人胚肾293细胞接种于六孔板中，每孔5×10⁵个细胞，培养基为DMEM+10％ Hyclone胎牛血清，置37℃含5％CO₂的培养箱中培养过夜；

b、重组腺病毒载体病毒质粒pAdxsi-GFP-p24MEG的线性化：

转染前，将鉴定正确的携带目的基因的腺病毒质粒pAdxsi-GFP-p24MEG用PacI内切酶线性化，酶切反应体系及条件如表5所示：

表5PacI酶切体系

pAdxsi-p24MEG	5ug
		10×Buffer	5.0μL
PacI(NEB，20U/μL)	1μL
		ddH2O	补齐至50μL
总体积	50.0μL
		37℃	3-4小时

c、转染：

转染前一天，将293细胞接种于六孔板中，每孔5×105个细胞，培养基为DMEM+10％Hyclon胎牛血清，置37℃含5％CO₂的培养箱中培养过夜。

转染当天换液，用新鲜的含10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至底面积的80-90％时，取重组腺病毒载体质粒pAdxsi-GFP-p24MEG，用Lipofectamine2000脂质体按其所附说明书进行转染。

具体步骤为：

每个转染孔加入线性化的重组腺病毒载体质粒pAdxsi-p24MEG 5ug，用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min；

取10ul的脂质体用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min；

将两者混和，室温避光放置30min，然后将混合物加入到细胞中；

转染6小时后，更换新鲜的细胞培养液，每天观察细胞出毒迹象；

d、第一代毒种收毒：

每天观察细胞出毒迹象，出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑；待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒，即收取重组腺病毒；

将六孔板中两个孔的所有细胞及培养液收于15ml离心管中，放入-80℃冰箱保存；

e、冻融：

取一个能够容纳离心管架子的冰盒，放入干冰和酒精的混合物，打开恒温水浴锅至37℃，在干冰酒精及37℃水浴反复冻融三次后，3000转/分钟离心5分钟，收集含腺病毒的上清液，弃沉淀；

该上清即为pAdxsi-p24MEG第一代毒种(P1)，作为随后大量病毒扩增的毒种；

f、扩增：

从第一代毒种(P1)重组腺病毒上清(约3ml)中取2ml感染一个75cm的细胞培养瓶的人肾293细胞(细胞密度保证90％以上)；

余下的重组腺病毒上清放入外旋的冻存管中-80℃保留，做为毒种保留；

g、第二代毒种收毒：

重组腺病毒扩增两天后，待所有细胞脱落底面即可进行收毒，将细胞连同培养液一同收入15ml离心管中，2000转离心5分钟弃掉上清，加入1ml STbuffer(培养液+10％血清+2.5％甘油)，震荡混匀后-80℃保存待用；

依据前面的冻融方法，冻融三次，取上清进行下一代扩增或于-80℃保存。

h、腺病毒大量扩增：

按每个75cm²方瓶中接种4×10⁶的人肾293细胞，接种6个75cm²培养瓶，培养过夜，待细胞生长满至90％时，将P2代病毒(除取少量留毒种外)全部接种培养瓶内，24小时后显微镜下观察发现有60％细胞病变，46小时后细胞完全病变；

收获病变细胞混悬液后，2000rpm离心5分钟，离心，弃上清，加入6mlST buffer(培养液+10％血清+2.5％甘油)，震荡混匀，于-80℃和37℃间冻融三次，3000rpm离心5min取上清，按同样方法接种于另外40个75cm²方瓶中，46小时完全病变；

细胞和ST buffer(DMEM培养液+10％血清+2.5％甘油)3次冻融后即成为混悬液，将混悬液3000rpm离心，弃上清，细胞沉淀用ST buffer重悬，经反复冻融后保存于-80℃保存待用；

3)腺病毒的纯化：

a、不连续密度梯度离心

将离心机预冷到4℃，慢慢将8ml CsCl1.4(秤取53gCsCl加87ml 10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶解后过滤，4℃保存)加入离心管中，继续缓慢加入10ml CsCl1.2(秤取26.8gCsCl加92ml 10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶解后过滤，4℃保存)，在其上部缓慢加入约20ml的重组腺病毒重悬溶液(不够20ml用10mMTris补齐)；

将离心管配平之后，100000×g(24000rpm in SW31)离心90分钟，4℃，减速度为0；离心结束后，吸弃离心管上部的废液，并用75％酒精擦拭离心管的管壁，用胶布贴住将要穿刺的部位(防止穿刺时管裂)，用5ml针管配1.22(18G)的针头在蓝白色条带下方穿刺吸出重组腺病毒溶液(针头开口向上)用至少一倍体积的TE(100ml Tris·Cl(1mol/L，pH8.0)和10ml 1mol/LEDTA(pH8.0)加水定容至1L)稀释所收集的重组病毒溶液

b、连续密度梯度离心

慢慢将12ml CsCl1.4加入离心管中，继续缓慢加入14ml CsCl1.2，在其上部非常缓慢的加入8-10ml稀释好的重组病毒溶液，将离心管配平，100000×g(24000rpm in SW31)16-20小时，4℃，减速度为0；

离心结束后，吸弃离心管上部的废液并用75％酒精擦拭离心管的管壁，用胶布贴住将要穿刺的部位(防止穿刺时管裂)，用5ml针管配0.8(20G)的针头吸出蓝白条带(方法同上)或在离心管下部扎孔使液体自然流下来，收集蓝白色条带即可(可以减少CsCl混入)。

c、透析

将所吸出的重组腺病毒液注射入PIERCE透析卡(Pirpce公司)中进行透析，每次用200×体积的透析buffer，透析三次，间隔一小时换一次液，透析结束后，将重组腺病毒分装，-80℃保存病毒。

4)纯化病毒的滴度测定及检测

a、重组腺病毒的OD260测定，并按照VP/ml＝OD260×1.1×10¹²，计算得到每ml制品中的病毒颗粒数为0.3×10¹²VP/ml；

b、测定重组腺病毒的OD260/OD280比值，反应制备的重组腺病毒的纯度，正常范围为1.2～1.3之间；

c、提取重组腺病毒的基因组，以P1、P2作为引物对用PCR法鉴定重组腺病毒是否携带目的基因p24MEG；结果如图4所示，其中，M为Marker，泳道1检测到了p24片段，说明重组腺病毒是否携带目的基因p24MEG。

d、用经典方法测定重组腺病毒制品的TCID50值为TCID50＝10^-6.5/100μl。

5)纯化得到的整合了目的片段p24MEG基因的重组腺病毒，称为重组腺病毒pAdxsi-p24MEG，即为本发明所提供的基于多串联表位的重组腺病毒HIV疫苗。

4、对于多串联表位的重组腺病毒HIV疫苗的效果验证

1)重组腺病毒pAdxsi-p24MEG免疫HHD-2小鼠疫苗诱导的免疫应答水平检测

a、动物免疫

实验共分3组，每组5只HHD-2小鼠：

第一组用重组腺病毒pAdxsi-p24MEG免疫，剂量为10⁸pfu/0.2mL/只，肌肉接种，3周后加强一次；

第二组和第三组分别为普通腺病毒对照组和生理盐水对照组，免疫方式均同重组腺病毒免疫组；

免疫前尾部取血分离血清，第一次免疫后两周开始尾部取血分离血清，间隔两周取一次，-20℃冻存备检；末次免疫结束8周后，测定淋巴细胞增殖刺激指数、CTL效应以及IFN-γ和IL-2水平。

b、免疫小鼠一般状况

各组免疫小鼠均存活到处死前，小鼠没有出现其他明显异常，生长良好。

c、免疫小鼠体液免疫检测

1)ELISA法检测血清中融合蛋白p24MEG的特异性抗体测定

用纯化的p24MEG融合蛋白作为包被抗原，0.1μg  (100μl每孔)，4℃过夜；用含0.05％Tween 20的PBS洗5次，1％BSA封闭4℃过夜；PBS洗5次后，待检血清用含0.05％Tween 20的PBS做1∶100稀释，每孔100μl，37℃放置1h；PBS洗5次，加入1∶10000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，37℃放置1h；PBS洗5次，加入TMB显色，OD₄₉₀处测吸光度；

结果如图5所示：免疫重组腺病毒pAdxsi-p24MEG后，小鼠特异性抗体抗p24MEG产生，在6～8周时达到高峰，然后迅速下降，抗体水平较腺病毒载体对照和生理盐水对照有显著差异(P＜0.05；P＜0.01)；

说明本发明构建的重组腺病毒HIV疫苗能够诱导机体产生抗体(抗p24MEG即对HIV产生比较有效的保护作用)；腺病毒载体免疫组以及生理盐水对照组均未能诱生特异性抗体产生。

d、免疫小鼠的细胞免疫检测

1)特异性淋巴细胞增殖实验

免疫小鼠后第12周，取小鼠脾脏置钢网上研磨成单细胞悬液，淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，用RPMI-1640完全培养基调整细胞浓度为5×10⁶个/mL，置96孔培养板中培养，每孔200μL，同时每孔加入p24MEG纯化蛋白(25mg/L溶于PBS)，对照组不加蛋白，调零孔不加脾细胞；

置5％CO₂孵箱中37℃培养68h后，每孔加入20μL MTT(5mg/mL，溶于PBS，pH7.2，过滤处菌)，继续培养4h后终止培养，弃尽上清，每孔加入DMSO 150μL，震荡10分钟，测OD_490nm值，结果用增殖刺激指数(stimulation index，SI)＝实验组OD/对照组OD表示；

结果如图6所示，重组腺病毒免疫小鼠的特异性淋巴细胞增值指数为2.6，该指数表示淋巴细胞免疫后再次接触免疫原的刺激后增殖情况；腺病毒免疫小鼠的特异性淋巴细胞增值指数为1.2，生理盐水对照组淋巴细胞的增殖刺激指数为0.8；分析表明：重组腺病毒显著高于腺病毒免疫组和生理盐水对照组(P＜0.01)，另外，腺病毒免疫组较生理盐水对照组有显著差异(P＜0.01)，也说明腺病毒自身作为一种佐剂，能引起淋巴细胞增殖。

2)细胞因子的诱生及其测定

用RPMI-1640完全培养液将各组免疫小鼠脾细胞调整至5×10⁶/mL，加入24孔板中培养，800μL/孔，分别加入p24MEG纯化蛋白10μg/孔，对照组不加蛋白；

置5％CO₂孵箱中37℃培养42h，收集培养液，5,000rpm离心5min，取上清，-20℃冻存备检；

IFN-γ及IL-2含量的测定，参照试剂盒说明书进行(夹心ELISA法)。

(1)绘制标准曲线：将IFN-γ及IL-2的标准品稀释成2,000.00pg/L、1,000pg/L、500pg/L、250pg/L、125pg/L、62.5pg/L的浓度梯度，加入96孔板中，100μL/孔。设空白对照，37℃孵育60min，洗涤液洗涤3次后，加生物素化抗小鼠IFN-γ或IL-2抗体抗体，100μL/孔，空白对照除外，37℃孵育60min。洗涤液洗涤3次后，加入OPD底物100μL/孔，避光15min，加入终止液100μL/孔，于450nm测OD值，根据标准品浓度对应的OD值绘制标准曲线。

(2)样品检测：取上述诱导的脾细胞培养上清加入微板中，100μL/孔，与上述相同的方法进行检测，并利用绘制的标准曲线计算各样品中所含IFN-γ及IL-2浓度。

(3)结果检测如图7、8所示，分析表明，重组腺病毒组和普通腺病毒对照组IFN-γ和IL-2水平均高于对照组(P＜0.01)，且重组腺病毒免疫组高于普通腺病毒组(P＜0.05)；提示重组腺病毒pAdxsi-p24MEG疫苗能够诱导有效的细胞免疫应答。

f、免疫小鼠的特异性CTL杀伤实验

免疫小鼠后第12周分离免疫小鼠脾脏淋巴细胞，调整细胞浓度为1×10⁷个/mL，置于96孔培养板中用RPMI 1640完全培养基培养，加入p24MEG纯化蛋白至终浓度为10μmol/L，继续培养2d，作为效应细胞；C1R-AD细胞作为靶细胞。

按不同的效靶比进行CTL杀伤实验，乳酸脱氢酶实验检测CTL的细胞毒活性，并按下面的公式计算杀伤率：

细胞杀伤率＝(实验组平均A值-自然释放对照组平均A值)/(最大释放对照组平均A值-自然释放对照组平均A值)×100％。

CTL活性检测结果如图9所示，重组腺病毒组的平均杀伤活性达到48％，普通腺病毒组和生理盐水组分别为17.6％和9.0％。重组腺病毒诱导的CTL活性在效靶比为100∶1时达到最高，为65.3％，显著高于生理盐水组(10.1％)和普通腺病毒组(22.8％)。

核苷酸序列表

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>一种基于多串联表位的重组腺病毒HIV疫苗及其制备方法

<160>3

<210>1

<211>96

<212>PRT

<213>人工合成

<400>1

Tyr-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Gly-Lys-Ile-Ala-Ala-Tyr-Ala-Ala-Tyr-Tyr-Leu-Asn-Asn-Pro

1                5                  10                  15                   20

Pro-Ile-Pro-Val-Ala-Ala-Tyr-Tyr-Leu-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Ala-Ala-Tyr-Tyr

                25                  30                  35                   40

Leu-Ser-Leu-Ser-Phe-Pro-Gln-Ile-Ala-Ala-Tyr-Tyr-Leu-Asp-Thr-Gly-Ala-Asp-Asp-Thr

                45                  50                  55                   60

Ala-Ala-Tyr-Tyr-Leu-Ser-Gln-Ile-Ile-Glu-Gln-Leu-Ala-Ala-Tyr-Tyr-Leu-Gly-Glu-Arg

                65                  70                  75                   80

Ile-Val-Asp-Ile-Ala-Ala-Tyr-Tyr-Leu-Gln-Lys-Glu-Thr-Trp-Glu-Ala

                85                  90                  95

<210>2

<211>361

<212>DNA

<213>人工合成的MEG片段

<400>2

gcggatccgg cggaggcggt agtgggggtg gtggctctgg gggcggcggt agcgctgcct     60

actatctagc aaacttcctg ggtaagattg ccgcgtatta cctgaacaat ccgccgatcc    120

ctgttgcggc atattaccta tataaacgtt ggatcatcct cgctgcctat tatctgtcct    180

tgctgtttcc acagattgct gcgtactatc tatcacagat tattgaacaa ctggcagcct    240

attatctgca gaaagaaacc tgggaagcag ctgcctacta tcttgacacc ggagcggatg    300

atactgcggc ctattaccta ggcgagcgca ttgtggatat agcggcgtac  taactcgagg    360

c                                                                     361

<210>3

<211>651

<212>DNA

<213>HIV的p24基因

<400>2

atgcctagaa ctttaaatgc atgggtaaaa gtagtagaag agaaggcttt cagcccagaa     60

gtaataccca tgttttcagc attatcagaa ggagccaccc cacaagattt aaacaccatg    120

ctaaacacag tggggggaca tcaggcagcc atgcaaatgt taaaagagac catcaatgag    180

gaagctgcag aatgggatag attgcatcca gtgcaggcag ggcctgttgc accaggccag    240

atgagagaac caaggggaag tgacatagca ggaactacta gtacccttca ggaacaaata    300

ggatggatga caaataatcc acctatccca gtaggagaaa tctataaaag atggataatc    360

ctgggattaa ataaaatagt aagaatgtat agcccttcca gcattttgga cataaaacaa    420

ggaccaaagg aaccctttag agactatgta gaccggttct ataaaactct aagagccgag    480

caagcttcac aggaggtaaa aaattggatg acagaaacct tgttggtcca aaatgcaaac    540

ccagattgta aaactatatt aaaagcattg ggaccaggag ctacactaga agaaatgatg    600

acagcatgtc agggagtggg aggacccgga cataaagcaa gagtcttgta a             651

Claims (6)

1.一种多串联表位，其特征在于，该多串联表位由Ala-Ala-Tyr连接多个HIV的HLA限制性CTL表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种基于多串联表位的重组腺病毒HIV疫苗，其特征在于，该疫苗是将包含目的片段p24MEG的载体整合到腺病毒的基因组；

所述目的片段p24MEG是将HIV-1的p24基因部分序列与表达多串联表位的核苷酸序列MEG连接；

所述MEG的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述HIV的p24基因部分序列如SEQ ID NO.3所示。

3.如权利要求2所述的基于多串联表位的重组腺病毒HIV疫苗，其特征在于，所述的载体是腺病毒穿梭载体。

4.如权利要求2所述的基于多串联表位的重组腺病毒HIV疫苗，其特征在于，所述包含目的片段p24MEG的载体是重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-p24MEG，包含目的片段p24MEG和标记片段GFP。

5.如权利要求4所述的基于多串联表位的重组腺病毒HIV疫苗，其特征在于，所述的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-p24MEG通过多克隆位点将连接有GFP的目的片段p24MEG连接到pAdxsi载体上。

6.一种权利要求5所述的基于多串联表位的重组腺病毒HIV疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将SEQ ID NO.2所示的MEG片段和SEQ ID NO.3所示的p24基因部分序列连接后，通过KpnI/EcoRI双酶切位点克隆入穿梭载体pShuttle-GFP-CMV，得到重组穿梭载体pShuttle-GFP-p24MEG；

2)重组穿梭载体pShuttle-GFP-p24MEG被I-CeuI/I-SceI双酶切后得到GFP-p24MEG片段，然后将其克隆入同样被I-CeuI/I-SceI双酶切的pAdxsi载体上，得到重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-p24MEG；

3)将PacI内切酶线性化的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-p24MEG脂质体法转染，得到重组腺病毒；

4)包含重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-p24MEG的腺病毒大量扩增后，细胞反复冻融后得到混悬液，离心收取包含重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-p24MEG的重组腺病毒的上清液；

5)将上清液分别通过不连续密度梯度离心、连续密度梯度离心和透析分离纯化，得到纯化的重组腺病毒液，即为重组腺病毒pAdxsi-GFP-p24MEG疫苗。

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