CN116019889A - 一种和胃止痛合剂及其制备以及评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药制剂技术领域，具体涉及一种和胃止痛合剂及其制备以及评价方法。和胃止痛合剂包括以下原料：醋北柴胡、陈皮、麸炒枳壳、白芍、醋延胡索、酒川芎、炒栀子、醋香附、香橼、郁金和炙甘草。制备过程包括：将药材原料混合煎煮两次，合并煎煮液并进行过滤；再浓缩为浸膏，浸膏经过静置，再进行第二次过滤，加入辅料获得合剂。药品质量评价方法包括对醋延胡索、醋北柴胡和炙甘草的薄层色谱鉴别和对芍药苷的高效液相色谱法测定。本技术方案克服了现有技术中的疏肝理气以及和胃降逆类药物治疗效果有限的技术问题，工艺简单且产品质量稳定，产品用于疏肝理气以及和胃止痛，具有较好的推广应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及中药制剂技术领域，具体涉及一种和胃止痛合剂及其制备以及评价方法。
背景技术
肝气犯胃型胃痛临床表现为胃脘胀闷，攻撑作痛，脘痛连胁，嗳气频繁，每因恼怒等情志因素而痛作或加重，苔多薄白，脉沉弦。患者往往有情志不遂或精神刺激的病史。
纤维电子胃镜检查己成为目前公认的诊断胃病的最常见、最准确的检查方法，广泛应用于临床。借助电子胃镜通过观察胃黏膜的形态、色泽、病理变化等，进行胃内望诊，研究探讨它们与中医证候的相关性，从而使中医辨证有据可依，治疗有法可循，提高胃脘痛临床辨治疗效。肝气犯胃、寒湿、食滞、胃热型胃院痛患者镜下胃黏膜表现为充血明显。在慢性胃炎患者中，肝胃气滞型患者胃肠黏膜多表现为充血水肿、糜烂和出血等。肝气犯胃证胃痛在镜下多呈现胃黏膜炎症状态，局部的体液免疫被破坏，说明胃院痛的发病可能与人体的免疫功能有关，而西医的肝是合成白蛋白，增强人体免疫的重要器官，从这一角度佐证了胃痛治肝的必要。
大量实验研究亦证实疏肝类药物对胃肠道有明显的调节作用，现有技术研究表明柴胡、枳壳合煎剂和四逆散都能明显增强胃排空和小肠推动功能；木香能加速胃排空钡剂时间，促进胃动素的释放。但是，现有技术中的用于肝气犯胃所致的胃痛的药物尚不能满足实际应用需求，治疗效果有限，需要对此类功能药物进行进一步研究，以开发出能够功效更为显著的疏肝理气以及和胃降逆类药物，以有效消除消化道局部炎症、促进胃排空、保护胃黏膜。
发明内容
本发明意在提供一种和胃止痛合剂，以解决现有技术中的疏肝理气以及和胃降逆类药物治疗效果有限的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种和胃止痛合剂，以重量份计，包括以下原料：醋北柴胡100-140份、陈皮100-140份、麸炒枳壳80-100份、白芍80-100份、醋延胡索80-100份、酒川芎80-100份、炒栀子80-100份、醋香附80-120份、香橼80-100份、郁金80-100份和炙甘草20-40份。
本方案还提供了一种和胃止痛合剂的制备方法，包括以下依次进行的步骤：将药材原料混合煎煮二次，合并煎煮液并进行第一次过滤获得第一滤液；将第一滤液浓缩为浸膏，浸膏经过10℃静置60min，再进行第二次过滤获得第二滤液。
本方案还提供一种和胃止痛合剂的评价方法，包括对醋延胡索、醋北柴胡和炙甘草的薄层色谱鉴别和对芍药苷的高效液相色谱法测定。
进一步，第一次过滤和第二次过滤均使用200目筛。
进一步，将第一滤液浓缩为浸膏的方式为减压浓缩，温度条件为50-75℃；所述浸膏的相对密度为1.07。
通过控制减压浓缩的条件，可以适当提升成品中标志性成分芍药苷的含量。其中，70℃进行减压浓缩为最佳条件。
进一步，在第二滤液中加入水以及苯甲酸钠获得和胃止痛合剂。
进一步，将原料混合煎煮二次的过程为：将药材原料混合；第一次煎煮加入药材原料总质量12倍的水，煮沸后煎煮1.0小时，第二次煎煮加入药材原料总质量10倍的水，煮沸后煎煮0.5小时。
进一步，所述药材原料由醋北柴胡120g、陈皮120g、麸炒枳壳90g、白芍90g、醋延胡索90g、酒川芎90g、炒栀子90g、醋香附100g、香橼90g、郁金90g和炙甘草30g组成。
进一步，对醋延胡索进行薄层色谱鉴别过程如下：采用由体积比为9∶2的甲苯和丙酮组成的混合液作为展开剂，展开后进行碘吸附处理，置于365nm紫外灯下视检；
对醋北柴胡进行薄层色谱鉴别过程如下：采用由体积比为8：2：1的乙酸乙酯、乙醇和水组成的混合液作为展开剂，展开后喷以由体积比为1：25：25的50％香草醛硫酸溶液、甲醇和冰醋酸组成的混合液，加热至斑点显色清晰后观察；
对炙甘草的薄层色谱鉴别方法如下：采用由体积比为20:5:0.5的三氯甲烷、甲醇和水组成的混合液作为展开剂，展开后喷以1％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰后观察。
进一步，高效液相色谱法的色谱条件如下：C18色谱柱；流动相为体积比为14:86的乙腈和0.1％磷酸溶液的混合液；检测波长为230nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；
高效液相色谱法测试的供试品的制备方法如下：取和胃止痛合剂10ml，加乙醇20ml，进行功率240W、频率40kHz的超声处理30分钟，放冷后3000r/min离心5分钟，取上清液定容于50ml量瓶，摇匀，即得。
本技术方案的有益效果如下：
(1)提供了一种新型的具有疏肝理气以及和胃降逆的功效的中药合剂，可以有效消除消化道局部炎症、促进胃排空、保护胃黏膜。
(2)本方案的合剂相对于传统的中药饮片服用方法，大大简化了制备工艺，适合于推广应用。
(3)开发了一套适应于本方案的和胃止痛合剂的检测方法，包括薄层色谱鉴别和高效液相色谱鉴别。本技术方案提供的和胃止痛合剂相对于现有技术是一种新型药物，尚无一套能够有效表征产品质量的检测和评价方法。发明人经过大量实验，建立了一套针对合剂的薄层色谱鉴别方法和基于芍药苷的高效液相色谱检测方法。
(4)在建立检测方法之后，发明人继续摸索了提升和胃止痛合剂的质量的方法。发现适当的减压浓缩温度条件以及对浸膏进行低温放置，可以显著提升合剂中标志性成分含量，并同时提升合剂澄清度，减少沉淀的产生，改善药物外观。
附图说明
图1为实施例1的对照品的芍药苷HPLC典型色谱图。
图2为实施例1的和胃止痛合剂的芍药苷HPLC典型色谱图。
图3为实施例1的阴性供试品的芍药苷HPLC典型色谱图。
图4为实施例1的芍药苷的标准曲线。
图5为实验例1的醋北柴胡的薄层色谱鉴别结果(方法一)。
图6为实验例1的醋北柴胡的薄层色谱鉴别结果(方法二)。
图7为实验例1的炙甘草的薄层色谱鉴别结果(方法一)。
图8为实验例1的炙甘草的薄层色谱鉴别结果(方法二)。
图9为实验例1的醋延胡索的薄层色谱鉴别结果(方法一)。
图10为实验例1的醋延胡索的薄层色谱鉴别结果(方法二)。
图11为实验例2的柴胡皂苷类的HPLC典型色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
实施例1：
(1)和胃止痛合剂的制备
本品处方所用药材均为《中国药典》2020年版一部收载品种，分别按标准进行了鉴定、分析，结果各药材均符合本制剂要求，具体如下：
醋北柴胡：本品为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurumscorzonerifolium Willd.的干燥根。取北柴胡片，照醋炙法(通则0213)炒干。
陈皮：本品为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟果皮。
酒川芎：本品为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎。
醋香附：本品为莎草科植物莎草Cyperus rotundus L.的干燥根茎。取香附片(粒)，照醋炙法(通则0213)炒干。
白芍：本品为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根。
麸炒枳壳：本品为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实。取枳壳片，照麸炒法(通则0213)炒至色变深。
香橼：本品为芸香科植物枸橼Citrus medica L.或香圆Citrus wilsonii Tanaka的干燥成熟果实。
醋延胡索：本品为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥块茎。取净延胡索，照醋炙法(通则0213)炒干，或照醋煮法(通则0213)煮至醋吸尽，切厚片或用时捣碎。
炒栀子：本品为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实。取净栀子，照清炒法(通则0213)炒至黄褐色。
郁金：本品为姜科植物温郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling、姜黄CurcumaLonga L.、广西莪术Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或蓬莪术Curcumaphaeocaulis Val.的干燥块根。
炙甘草：本品为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhizainflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎。
和胃止痛合剂的配方具体如下：
以质量份计，醋北柴胡100-140份；陈皮100-140份；麸炒枳壳80-100份；白芍80-100份；醋延胡索80-100份；酒川芎80-100份；炒栀子80-100份；醋香附80-120份；香橼80-100份；郁金80-100份；炙甘草20-40份。
以质量份计，本实施例具体配方为：醋北柴胡120g；陈皮120g；麸炒枳壳90g；白芍90g；醋延胡索90g；酒川芎90g；炒栀子90g；醋香附100g；香橼90g；郁金90g；炙甘草30g。
制备工艺具体如下：
以上十一味，醋北柴胡、陈皮、酒川芎、醋香附、白芍、麸炒枳壳、香橼、醋延胡索、炒栀子、郁金、炙甘草按配方量混合，煎煮二次，第一次加投料总质量12倍量饮用水，煮沸后煎煮1.0小时，第二次加投料总质量10倍量饮用水，煮沸后煎煮0.5小时，煎液过滤(300目)，滤液50℃条件下减压浓缩至相对密度约为1.07(50℃)的浸膏，室温(25±2℃)静置30min，过滤(300目)。滤液加入适量纯化水和苯甲酸钠3g，煮沸，加纯化水使成1000ml，获得和胃止痛合剂。采用本方案制备获得的成品的芍药苷含量为0.13mg/mL(三批取样检测的平均值)。
(2)成品检测
按照上述方法生产三批产品，分别命名为：第一批、第二批、第三批。
(2.1)性状
性状测试结果参见表1，本品应为棕褐色的液体，味微苦、微酸，久置有少量沉淀。
表1：性状观察结果
(2.2)鉴别
(2.2.1)炙甘草的薄层色谱鉴别：取本品40ml，加乙醚40ml，加热回流0.5小时，放冷，弃去醚液，加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液。另取甘草苷对照品，加70％乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(20:5:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷1％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点。
采用上述炙甘草的薄层鉴别方法，结果证明，该方法可靠，准确，重现性好，故将其鉴别方法纳入本制剂质量标准草案中炙甘草的薄层色谱鉴别项下。鉴别结果如表2。
表2：炙甘草的鉴别
(2.2.2)醋北柴胡的薄层色谱鉴别：取本品20ml，加甲醇30ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次(20ml，10ml)，洗液弃去，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次20ml，弃去洗液，分取正丁醇液，浓缩至干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取柴胡对照药材lg，加水75ml，煎煮2次，每次30分钟，合并煎液，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇-水(8：2：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以50％香草醛硫酸溶液-甲醇-冰醋酸(1：25：25)的混合溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显两个相同颜色的红色斑点。
采用上述醋北柴胡的薄层鉴别方法，结果证明，该方法可靠，准确，重现性好，故将其鉴别方法纳入醋北柴胡的薄层色谱鉴别项下。鉴别结果如表3。
表3：醋北柴胡的鉴别
(2.2.3)醋延胡索的薄层色谱鉴别：取本品20ml，加甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取延胡索对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮(9∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中约3分钟后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
采用上述醋延胡索的薄层鉴别方法，结果证明，该方法可靠，准确，重现性好，故将其鉴别方法纳入醋延胡索的薄层色谱鉴别项下。鉴别结果如表4。
表4：醋延胡索的鉴别
(2.3)检查
取样品适量，照相对密度测定法(通则0601)进行测定，结果参见表5。
表5：相对密度实验结果
取样品适量，照pH值测定法(通则0631)进行测定，结果参见表6。
表6：pH试验结果
(2.4)微生物限度
根据非无菌产品微生物限度检查(通则1105、1106)项下的要求，对本产品的微生物限度检查方法进行方法学验证，结果表明，本产品可以按照常规方法检查。在上述方法验证的基础上对三批样品进行了微生物限度检查。结果：三批供试品的微生物限度均符合药典规定。
(2.5)含量测定
以白芍中的芍药苷(对照品购自中国食品药品检定研究院)作为含量测定指标，照高效液相色谱法(通则0512)测定。设备采用赛默飞Vanquish高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技公司)。色谱条件为：色谱柱：C18 SN 20302229(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.1％磷酸溶液(14:86)；检测波长：230nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃。在上述条件下芍药苷和样品中其他组分色谱峰达到基线分离，为使定量分析准确，在系统适应性试验中规定理论板数按芍药苷计算应不低于3000。同时取不含白芍的阴性供试品(制备方法同“(1)和胃止痛合剂的制备”，只是不加入白芍饮片)进样，结果表明，阴性供试品在芍药苷色谱峰相应位置无色谱峰出现。供试品的制备方式如下：取和胃止痛合剂10ml，加乙醇20ml，超声处理(功率240W，频率40kHz)30分钟，放冷，离心5分钟(3000r/min)，取上清液至50ml量瓶，摇匀即得。对照品、样品(采用“(1)和胃止痛合剂的制备”的方法制备获得的产品)及阴性供试品的典型色谱图分别见图1、图2和图3。
别称取芍药苷对照品适量，置于50ml量瓶中，加甲醇适量使溶解，并用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别对照品0.6ml、0.8ml、1.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml置于20ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。取上述对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积。结果见表7，标准曲线见图4。
表7：芍药苷线性关系考察
以上数据以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，按照最小二乘法进行回归，结果芍药苷进样量在0.1266144-1.266144μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：y＝20.985x+0.0333(R2＝1.000)。
精密度试验：精密吸取和胃止痛合剂供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，重复进样6次，分别记录峰面积，计算各色谱峰的RSD值。其RSD＝1.3％，表明仪器精密度良好，结果见表8。
表8：精密度试验结果
稳定性试验：取和胃止痛合剂，按供试品溶液的制备方法制备，室温下分别在0h，2h，4h，8h，12h，24h取样进行测定，计算芍药苷峰面积的RSD值。其RSD＝1.9％，表明供试品溶液24小时内稳定性良好，结果见表9。
表9：稳定性试验结果
重复性试验：取同一批样品，按供试品溶液的制备方法制备6份，按拟定的含量测定方法测定芍药苷的峰面积，其RSD＝3.0％，表明本方法重复性良好，结果见表10。
表10：重复性试验结果
回收率试验：精密吸取已知含量的样品(含量：0.1056mg)6份各10mL，加入乙醇溶液10ml，再分别加入芍药苷对照品乙醇溶液10ml，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，测定，计算回收率。根据下式计算回收率(式(1))，结果见表11。本方法平均加样回收率为96.12％，在90-108％之间，且RSD＝3.0％，故本方法具有良好的回收率。
表11：加样回收率试验结果
实验例1：薄层层析条件筛选
(1)醋北柴胡的薄层色谱鉴别
供试品溶液的制备：取本品20ml，加甲醇30ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次(20ml，10ml)，洗液弃去，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次20ml，弃去洗液，分取正丁醇液，浓缩至干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
对照药材溶液的制备：取柴胡对照药材lg(中国食品药品检定研究院)，加水75ml，煎煮2次，每次30分钟，合并煎液，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为对照药材溶液。
阴性对照溶液的制备：取缺醋北柴胡的取余药味按样品制备工艺制成阴性样品，同法制成醋北柴胡阴性对照溶液。
方法一：照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷：甲醇：水(17:3；2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％对二氨基苯甲醛乙醇(1→10)溶液，加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点。图像参见图5(从左往右依次为阴性样品、样品、对照药材)。
方法二：照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇-水(8：2：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以50％香草醛硫酸溶液-甲醇-冰醋酸(1：25：25)的混合溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点。图像参见图6。
根据图5和图6的对比，在方法二中，样品、对照药材皆显色清晰，且样品显色斑点能与对照药材显色斑点上有一致斑点，且比移值Rf符合药典比移值限度要求。比移值(Rf)系指从基线至展开斑点中心的距离与从基线至展开剂前沿的距离的比值。除另有规定外，杂质检查时，各杂质斑点的比移值Rf以在0.2-0.8之间为宜。方法一的部分斑点的比移值不符合中国药典的要求。图5为不可行方法，图6为本技术方案采取的方法。在图6中，中间样品点对比右边标准品点，在相应的位置上，显示相同颜色的斑点。
(2)炙甘草的薄层色谱鉴别
供试品溶液的制备：取本品40ml，加乙醚40ml，加热回流0.5小时，放冷，弃去醚液，加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：取甘草苷对照品(中国药品生物制品检定所)，加70％乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备：取缺甘草的其余药味按样品制备工艺制成阴性样品，同法制成甘草阴性对照溶液。
方法一：照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸-水(15:1.3:1:2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点。图像参见图7(从左往右依次为阴性样品、样品、对照品)。
方法二：照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(20:5:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷1％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，应显相同的荧光斑点。图像参见图8(从左往右依次为阴性样品、样品、对照品)。
方法二相对于方法一，方法二的薄层条件适用性更好，偏差处理性更可控。从图7中可知，在方法一的条件下，对于甘草不具有相应的化学结构变化，所以在图上显示阴性对照和样品很相近，不能够用于鉴别甘草药材。采用方法二的条件，在图8的薄层图中，中间样品点对比右边标准品点，在相应的位置上，显示相同颜色的斑点。
(3)醋延胡索的薄层色谱鉴别
供试品溶液的制备：取本品20ml，加甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材1g(中国食品药品检定研究院)，同法制成对照药材溶液。
对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品(成都普思生物科技有限公司)，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备：取缺延胡索的其余药味按样品制备工艺制成阴性样品，同法制成延胡索阴性对照溶液。
方法一：照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮(9∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中约3分钟后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的荧光斑点。图像参见图9(从左往右依次为阴性样品、样品、对照药材、对照品)。
方法二：照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一2％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以正己烷-三氯甲烷-甲醇(10∶6:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中约3分钟后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的荧光斑点。图像参见图10(从左往右依次为阴性样品、样品、对照药材、对照品)。
根据图9和图10的对比，在方法二中，阴性对照、样品、对照药材、对照品皆显色清晰，且样品显色斑点能与对照药材、对照品显色斑点上有一致斑点，且比移值Rf符合药典比移值限度要求。图10为不可行方法，图9为本技术方案采取的方法。在图9中，第二道的样品点对比右边标准品点和标准药材点，在相应的位置上，显示相同颜色的斑点。图10的部分斑点的比移值不符合中国药典的要求，且难以观察出样品、右边标准品、标准药材的相同色斑，无法实现药材的鉴别。
实验例2：标志性成分筛选
本研究尝试选用君药柴胡中的指标成分柴胡皂苷类作为评价指标，理论上柴胡用量大，为配方中的主要成分，本领域技术人员倾向于使用君药柴胡的柴胡皂苷类作为本药物的标志性成分。但在测定中该样品峰面积响应值很小，峰型较差，峰面积太小，见图11(A：柴胡皂苷a和柴胡皂苷d标准品；B：本方案制备的和胃止痛合剂)。所以，在本技术方案中最终选择了芍药苷作为标志性成分，用以评价产品质量。
实验例3：制备工艺优化尝试
在建立上述的和胃止痛合剂的制备工艺以及质量检测方法后，发明人进一步考虑进行工艺优化，以提升产品中标志性成分的含量以及产品质量。
试验1：制备方式同实施例1，不同点在于：为了减少杂质含量，提升合剂的澄清度，对浓缩后相对密度为1.07的浸膏采用了300目过滤的方式，由于过滤的目数过大，会导致功效成分的损失，并且过滤速度非常慢，严重影响了生产速度。发明人尝试了将过滤目数降低为200目，获得的成品中，芍药苷的含量得到了显著提升，但是成品的澄清度受到影响，成品的澄清度较实施例1差，经过久置成品中出现大量沉淀。成品放置三十天之后(60℃环境加速试验)，观察沉淀产生量，用“+”-“+++++”表示沉淀量。
试验2：合剂的制备方法具体如下：
醋北柴胡、陈皮、酒川芎、醋香附、白芍、麸炒枳壳、香橼、醋延胡索、炒栀子、郁金、炙甘草按配方量混合，煎煮二次，第一次加投料总质量12倍量饮用水，煮沸后煎煮1.0小时，第二次加投料总质量10倍量饮用水，煮沸后煎煮0.5小时，煎液过滤(200目)，滤液50℃条件下减压浓缩至相对密度约为1.07(50℃)的浸膏，10℃静置60min，过滤(200目)。滤液加入适量纯化水和苯甲酸钠3g，煮沸，加纯化水使成1000ml，获得和胃止痛合剂，为棕褐色的较为澄清的液体，和实施例1的成品一致，并同时测量芍药苷含量。成品放置三十天之后(60℃环境加速试验)，观察沉淀产生量，用“+”-“+++++”表示沉淀量。
试验3：合剂的制备方法具体如下：
醋北柴胡、陈皮、酒川芎、醋香附、白芍、麸炒枳壳、香橼、醋延胡索、炒栀子、郁金、炙甘草按配方量混合，煎煮二次，第一次加投料总质量12倍量饮用水，煮沸后煎煮1.0小时，第二次加投料总质量10倍量饮用水，煮沸后煎煮0.5小时，煎液过滤(200目)，滤液50℃条件下减压浓缩至相对密度约为1.07(50℃)的浸膏，10℃静置30min，过滤(200目)。滤液加入适量纯化水和苯甲酸钠3g，煮沸，加纯化水使成1000ml，获得和胃止痛合剂，为棕褐色的较为澄清的液体，和实施例1的成品一致，并同时测量芍药苷含量。成品放置三十天之后(60℃环境加速试验)，观察沉淀产生量，用“+”-“+++++”表示沉淀量。
试验4：合剂的制备方法具体如下：
醋北柴胡、陈皮、酒川芎、醋香附、白芍、麸炒枳壳、香橼、醋延胡索、炒栀子、郁金、炙甘草按配方量混合，煎煮二次，第一次加投料总质量12倍量饮用水，煮沸后煎煮1.0小时，第二次加投料总质量10倍量饮用水，煮沸后煎煮0.5小时，煎液过滤(200目)，滤液50℃条件下减压浓缩至相对密度约为1.07(50℃)的浸膏，4℃静置60min，过滤(200目)。滤液加入适量纯化水和苯甲酸钠3g，煮沸，加纯化水使成1000ml，获得和胃止痛合剂，为棕褐色的较为澄清的液体，和实施例1的成品一致，并同时测量芍药苷含量。成品放置三十天之后(60℃环境加速试验)，观察沉淀产生量，用“+”-“+++++”表示沉淀量。
试验5：合剂的制备方法具体如下：
醋北柴胡、陈皮、酒川芎、醋香附、白芍、麸炒枳壳、香橼、醋延胡索、炒栀子、郁金、炙甘草按配方量混合，煎煮二次，第一次加投料总质量12倍量饮用水，煮沸后煎煮1.0小时，第二次加投料总质量10倍量饮用水，煮沸后煎煮0.5小时，煎液过滤(200目)，滤液50℃条件下减压浓缩至相对密度约为1.07(50℃)的浸膏，2℃静置60min，过滤(200目)。滤液加入适量纯化水和苯甲酸钠3g，煮沸，加纯化水使成1000ml，获得和胃止痛合剂，为棕褐色的较为澄清的液体，和实施例1的成品一致，并同时测量芍药苷含量。成品放置三十天之后(60℃环境加速试验)，观察沉淀产生量，用“+”-“+++++”表示沉淀量。
试验6：
醋北柴胡、陈皮、酒川芎、醋香附、白芍、麸炒枳壳、香橼、醋延胡索、炒栀子、郁金、炙甘草按配方量混合，煎煮二次，第一次加投料总质量12倍量饮用水，煮沸后煎煮1.0小时，第二次加投料总质量10倍量饮用水，煮沸后煎煮0.5小时，煎液过滤(200目)，滤液65℃条件下减压浓缩至相对密度约为1.07(60℃)的浸膏，10℃静置60min，过滤(200目)。滤液加入适量纯化水和苯甲酸钠3g，煮沸，加纯化水使成1000ml，获得和胃止痛合剂，为棕褐色的较为澄清的液体，并同时测量芍药苷含量，和实施例1的成品一致，并同时测量芍药苷含量。成品放置三十天之后(60℃环境加速试验)，观察沉淀产生量，用“+”-“+++++”表示沉淀量。
试验7：
醋北柴胡、陈皮、酒川芎、醋香附、白芍、麸炒枳壳、香橼、醋延胡索、炒栀子、郁金、炙甘草按配方量混合，煎煮二次，第一次加投料总质量12倍量饮用水，煮沸后煎煮1.0小时，第二次加投料总质量10倍量饮用水，煮沸后煎煮0.5小时，煎液过滤(200目)，滤液75℃条件下减压浓缩至相对密度约为1.07(70℃)的浸膏，10℃静置60min，过滤(200目)。滤液加入适量纯化水和苯甲酸钠3g，煮沸，加纯化水使成1000ml，获得和胃止痛合剂，为棕褐色的较为澄清的液体，和实施例1的成品一致，并同时测量芍药苷含量。成品放置三十天之后(60℃环境加速试验)，观察沉淀产生量，用“+”-“+++++”表示沉淀量。
试验8：
醋北柴胡、陈皮、酒川芎、醋香附、白芍、麸炒枳壳、香橼、醋延胡索、炒栀子、郁金、炙甘草按配方量混合，煎煮二次，第一次加投料总质量12倍量饮用水，煮沸后煎煮1.0小时，第二次加投料总质量10倍量饮用水，煮沸后煎煮0.5小时，煎液过滤(200目)，滤液75℃条件下减压浓缩至相对密度约为1.07(70℃)的浸膏，室温静置30min，过滤(200目)。滤液加入适量纯化水和苯甲酸钠3g，煮沸，加纯化水使成1000ml，获得和胃止痛合剂。成品的澄清度较实施例1差，经过久置成品中出现大量沉淀。成品放置三十天之后(60℃环境加速试验)，观察沉淀产生量，用“+”-“+++++”表示沉淀量。
其中，为了保证对比试验的平行性，实施例1和试验1-8均采用同一批药材，每组实验重复五次。
表12：标志性成分含量测量结果(“+”表示沉淀量，越多表示沉淀量越大；#表示相对于实施例1，t检验，p＜0.05；*表示相对于试验1，t检验，p＜0.05；$表示相对于试验2，t检验，p＜0.05)
由上述试验结果可知，试验1在煎液过滤和浸膏过滤的时候，使用200目筛网，相对于实施例1，过滤效率有所提升，且成品中的标志性成分芍药苷的含量上升，但是，成品的澄清度不理想，放置三十天后，成品中产生大量的沉淀。试验8将减压浓缩的温度上调至75℃，增加减压浓缩的温度对于提升成品中芍药苷的含量有一定的帮助，但是，成品的澄清度不理想，放置三十天后，成品中产生大量的沉淀。
为了解决沉淀问题，发明人尝试加入将浸膏低温放置处理的步骤。在50℃减压浓缩的条件下，分别进行10℃、4℃和2℃的低温静置处理(试验2、试验4和试验5)。发现采用4℃和2℃的低温静置处理条件，会对成品的芍药苷含量产生较为显著的负面影响，但是，10℃的低温静置处理条件，对成品的芍药苷含量的下调作用并不显著。并且，进行10℃、4℃和2℃的低温静置处理，均可以有效防止合剂中沉淀的产生。为了节约工艺时间，发明人尝试将10℃低温静置处理的时间调整为30min，发现久置后的成品中的沉淀会一定程度上增加。所以，低温静置处理(10℃60min)为最佳处理条件。
为了进一步提升成品中的标志性成分含量，发明人尝试了将减压浓缩的温度提升(试验6和试验7)，发现在提升减压浓缩温度之后，成品久置后的沉淀量也不会有显著的提升，但是，成品中芍药苷的含量得到了有效提升。
综上所述，浸膏的低温放置对防止合剂中产生沉淀有非常显著的作用。但是，低温放置的过程会一定程度上影响功效成分芍药苷在成品中的含量，所以低温静置的温度和时间条件的选择对提升产品质量非常关键。经过大量试验，发现10℃条件下静置60min，不会显著降低成品芍药苷的含量，同时避免了成品中沉淀量的增加(试验1和试验2相对比)，此条件获得了预料不到的技术效果。浸膏的静置温度采用更低的温度会显著降低成品中芍药苷的含量；采用更高的温度，会导致成品中的沉淀量增加。另外,减压浓缩的温度较高的时候(例如75℃)，对于提升成品的标志性成分芍药苷含量非常有帮助。所以，在后续工艺中，宜采用75℃减压浓缩获得浸膏以及浸膏在10℃条件下静置60min的条件。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种和胃止痛合剂，其特征在于：以重量份计，包括以下原料：醋北柴胡100-140份、陈皮100-140份、麸炒枳壳80-100份、白芍80-100份、醋延胡索80-100份、酒川芎80-100份、炒栀子80-100份、醋香附80-120份、香橼80-100份、郁金80-100份和炙甘草20-40份。
2.根据权利要求1所述的一种和胃止痛合剂的制备方法，其特征在于：包括以下依次进行的步骤：将药材原料混合煎煮二次，合并煎煮液并进行第一次过滤获得第一滤液；将第一滤液浓缩为浸膏，浸膏经过10℃静置60min，再进行第二次过滤获得第二滤液。
3.根据权利要求2所述的一种和胃止痛合剂的制备方法，其特征在于：第一次过滤和第二次过滤均使用200目筛。
4.根据权利要求3所述的一种和胃止痛合剂的制备方法，其特征在于：将第一滤液浓缩为浸膏的方式为减压浓缩，温度条件为50-75℃；所述浸膏的相对密度为1.07。
5.根据权利要求4所述的一种和胃止痛合剂的制备方法，其特征在于：在第二滤液中加入水以及苯甲酸钠获得和胃止痛合剂。
6.根据权利要求5所述的一种和胃止痛合剂的制备方法，其特征在于：将原料混合煎煮二次的过程为：将药材原料混合；第一次煎煮加入药材原料总质量12倍的水，煮沸后煎煮1.0小时，第二次煎煮加入药材原料总质量10倍的水，煮沸后煎煮0.5小时。
7.根据权利要求6所述的一种和胃止痛合剂的制备方法，其特征在于：所述药材原料由醋北柴胡120g、陈皮120g、麸炒枳壳90g、白芍90g、醋延胡索90g、酒川芎90g、炒栀子90g、醋香附100g、香橼90g、郁金90g和炙甘草30g组成。
8.根据权利要求1所述的一种和胃止痛合剂的评价方法，其特征在于：包括对醋延胡索、醋北柴胡和炙甘草的薄层色谱鉴别和对芍药苷的高效液相色谱法测定。
9.根据权利要求8所述的一种和胃止痛合剂的评价方法，其特征在于：
对醋延胡索进行薄层色谱鉴别过程如下：采用由体积比为9∶2的甲苯和丙酮组成的混合液作为展开剂，展开后进行碘吸附处理，置于365nm紫外灯下视检；
对醋北柴胡进行薄层色谱鉴别过程如下：采用由体积比为8：2：1的乙酸乙酯、乙醇和水组成的混合液作为展开剂，展开后喷以由体积比为1：25：25的50％香草醛硫酸溶液、甲醇和冰醋酸组成的混合液，加热至斑点显色清晰后观察；
对炙甘草的薄层色谱鉴别方法如下：采用由体积比为20:5:0.5的三氯甲烷、甲醇和水组成的混合液作为展开剂，展开后喷以1％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰后观察。
10.根据权利要求9所述的一种和胃止痛合剂的评价方法，其特征在于：高效液相色谱法的色谱条件如下：C18色谱柱；流动相为体积比为14:86的乙腈和0.1％磷酸溶液的混合液；检测波长为230nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；
高效液相色谱法测试的供试品的制备方法如下：取和胃止痛合剂10ml，加乙醇20ml，进行功率240W、频率40kHz的超声处理30分钟，放冷后3000r/min离心5分钟，取上清液定容于50ml量瓶，摇匀，即得。
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