CN116004718A - 用于制备HLA/β2M复合物的重组载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于制备HLA/β2M复合物的重组载体及其制备方法和应用,涉及MHC‑多肽复合物的抗体的制备技术领域;本发明提供了一种用于制备HLA/β2M复合物的重组载体,在原始载体的NheI/AvrII酶切位点之间插入FOS亮氨酸拉链bZIP motif,在BsiWI/BlpI酶切位点之间插入JUN亮氨酸拉链bZIP motif,在AgeI/NheI酶切位点之间插入β2M基因序列,在特定的酶切位点之间插入HLA序列,最终制备的HLA/β2M复合物表达量高,最高达92.45mg/L。
Description
技术领域
本发明涉及MHC-多肽复合物的抗体的制备技术领域,特别涉及用于制备HLA/β2M复合物的重组载体及其制备方法和应用。
背景技术
在生物药的前沿研发领域,靶向肿瘤相关的胞内蛋白逐渐进入视野。由于抗体分子量的限制,抗体分子很难通过细胞膜直接靶向胞内抗原,现在常见的靶向胞内抗原的形式多为间接的方式,例如通过病毒载体、纳米微球、脂质体等将目的抗体导入细胞内表达,或者将目的抗体融合多肽介导内化进入等多种形式。
靶向胞内抗原也可以通过利用细胞的免疫监视机制来进行。一般来说,细胞内的抗原会被胞内的一些水解酶降解成特异性的短肽,这些短肽会被细胞呈递,以MHCI多肽复合物的形式出现在细胞表面。CD8+的T细胞能够通过TCR(抗原受体)识别这些肿瘤或者病毒相关的MHCI多肽复合物,并杀死恶性肿瘤细胞或者被病毒感染的细胞。因此,找到肿瘤相关的MHCI多肽复合物的抗体(TCRm Ab)或者TCR,便可以靶向胞内抗原,达到治疗的目的。在以MHCI多肽复合物的形式靶向胞内蛋白抗原的生物技术公司中,以Adaptimmune/Immunecore的TCR-T细胞疗法和Eureka(优瑞科)公司的CAR-T细胞疗法为代表。Adaptimmune/Immunecore是姐妹公司,两家公司以MHCI多肽复合物为靶点,利用其展示平台SPEAR筛选出高亲和力的突变型TCR。Eureka公司同样是针对MHCI多肽复合物,利用其展示平台E-ALPHA筛选出高亲和力抗体。以胞内蛋白抗原为靶点,靶向细胞表面的MHCI多肽复合物的细胞疗法广泛应用于非小细胞肺癌、胃癌和卵巢癌等实体瘤领域。此外,Juno、Kite等处于细胞治疗领域的领头羊企业也在该技术领域多有布局。
靶向胞内蛋白抗原,特别是靶向肿瘤抗原相关的MHCI多肽复合物将会是生物制品类新药研发的增量市场。在细胞治疗领域,血液类癌症细胞治疗效果显著,已上市两个药物;实体瘤类的药物研发进展缓慢。美国国家癌症研究所(NCI)对癌症抗原进行了罗列和评分,提供的肿瘤相关的抗原极具价值,以MHCI多肽复合物的形式靶向肿瘤相关的胞内蛋白抗原,将会为实体瘤的细胞治疗提供更多的选择。通过靶向胞内抗原来定位肿瘤细胞也为双特异抗体、抗体偶联药物等领域提供了新的靶点选择。
在精准治疗领域,可以结合高通量的基因测序技术检测肿瘤的突变抗原和新生抗原,还可以以MHCI多肽复合物或者MHCII多肽复合物的形式进行新肿瘤疫苗的开发,或者体外激活机体免疫细胞。美国食品和药物管理局(FDA)已授予实验性药物tebentafusp(IMCgp100)快速通道资格,用于既往未接受治疗的(初治)HLA-A*020阳性转移性葡萄膜黑色素瘤(UM)患者。之前,FDA已授予tebentafusp治疗UM的孤儿药资格。上述这些案例都说明;这些技术的研发和运用均具有极大的研发前景。
要获得重组表达的HLA-β2M复合物非常困难,HLA-β2M复合物存在许多翻译后修饰,真核细胞表达系统表达量非常低;大肠杆菌表达系统表达全是包涵体,复性回收率极低。目前最主要的方法是采用大肠杆菌重组表达分别纯化得到HLA和β2M的包含体,通过变性剂(如高浓度尿素或盐酸胍)变性,最后通过复性获得。众所周知的是,蛋白质的复性非常困难,没有固定套路可寻,往往是一个蛋白一种方法;且复性得率非常低,通常在数十μg/L左右。即使得到了复性复合物,复合物的活性也相对较低。
发明内容
针对以上现有技术的不足,本发明提供了一种用于制备HLA/β2M复合物的重组载体及其制备方法和应用。MHCI类分子中HLA分子与β2M分子有相互作用,且β2M能稳定HLA的结构。本发明通过对原始载体进行改造,在原始载体中引入FOS/JUN亮氨酸拉链,使得原癌基因FOS和转录因子JUN两个蛋白通过亮氨酸拉链形成非常牢固的异源二聚体,实现了HLA/β2M复合物的高效表达。具体通过以下技术实现。
一种用于制备HLA/β2M复合物的重组载体,在原始载体的NheI/AvrII酶切位点之间插入FOS亮氨酸拉链bZIP motif序列,在BsiWI/BlpI酶切位点之间插入JUN亮氨酸拉链bZIP motif序列,在AgeI/NheI酶切位点之间插入β2M基因序列;
所述FOS亮氨酸拉链bZIP motif序列如SEQ ID NO.1所示,所述JUN亮氨酸拉链bZIP motif序列如SEQ ID NO.2所示,所述β2M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地,在所述重组载体的PmeI/BsiWI酶切位点之间还插入了相应的HLA序列。
需要说明的是,插入BLA基因序列的酶切位点可以根据实际需要进行调整,因此不需要特别说明,例如可以选用PmeI/BsiWI双酶切位点。根据BLA蛋白的氨基酸序列的不同,也有相应不同的编码BLA蛋白的基因序列,因此还可以根据实际需要插入不同的BLA蛋白的基因序列。
优选地,所述原始载体为pTRIOZ-hIgG1K载体。
本发明还提供了一种上述重组载体的制备方法,包括以下步骤:
S1、取原始载体用限制性内切酶NheI和AvrII进行双酶切,回收载体;以FOS亮氨酸拉链bZIP motif质粒为模板进行PCR扩增,回收100bp的片段,将FOS亮氨酸拉链bZIP motif序列插入到NheI/AvrII酶切位点之间,得到第一重组载体;所述第一重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;
S2、取步骤S1所得的所述第一重组载体,用限制性内切酶BsiWI和BlpI进行双酶切,回收载体;以JUN亮氨酸拉链bZIP motif质粒为模板进行PCR扩增,回收100bp的片段,将JUN亮氨酸拉链bZIP motif序列插入到BsiWI/BlpI酶切位点之间上,得到第二重组载体;所述第二重组载体的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示;
S3、取步骤S2所得的所述第二重组载体,用限制性内切酶AgeI和NheI进行双酶切,回收载体;以β2M基因序列为模板进行PCR扩增,回收400bp的片段,将其插入到AgeI/NheI酶切位点之间,最终制得所述用于制备HLA/β2M复合物的重组载体;制备HLA/β2M复合物的重组载体的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
优选地,上述方法的步骤S1中,PCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO.7所示,反向引物序列如SEQ ID NO.8所示。
优选地,上述方法的步骤S2中,PCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO.9所示,反向引物序列如SEQ ID NO.10所示。
优选地,上述方法的步骤S3中,PCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO.11所示,反向引物序列如SEQ ID NO.12所示。
优选地,上述方法的步骤S4具体为:。
本发明还提供了一种采用上述方法制备的HLA/β2M复合物在制备诊断癌症的试剂,或制备治疗癌症的药物中的应用。
本发明还提供了一种含有上述方法制备的HLA/β2M复合物的癌症诊断检测试剂盒。
本发明提供的HLA/β2M复合物,基于HLA蛋白的差异,可以与不同的多肽结合。因此,本发明提供的HLA/β2M复合物可以作为一种工具,应用于需要使其与某种多肽特异性结合的各个技术领域。基于目前的研究成果,如果结合的是癌变细胞的特异性多肽,HLA/β2M/多肽复合物就可以有效刺激T细胞,从而杀死癌细胞,起到癌症治疗作用。
与现有技术相比,本发明的有益之处在于:本发明通过在原始载体中引入FOS/JUN亮氨酸拉链,使得原癌基因FOS和转录因子JUN两个蛋白通过亮氨酸拉链形成非常牢固的异源二聚体,这种异源二聚体结构稳定,从而实现了HLA/β2M复合物的高效表达。通过利用近60个不同HLA的序列,构建相应的重组载体,采用转染CHJO细胞表达等方式,最终制备的HLA/β2M复合物的表达量均非常高,均超过1mg/L;最高的表达量高达92.45mg/L。
附图说明
图1为实施例1中步骤S3电泳回收的400bp片段(即pATX-β2M-FOS-JUN质粒)的电泳图;
图2为实施例2中制备的pATX-β2M-FOS-HLA-A*02:01-JUN质粒的结构示意图;
图3为实施例2中回收的HLA-A*02:01/β2M复合物的SDS-PAGE电泳图;
图4为实施例3中回收的HLA-A*03:01:01:01/β2M复合物的SDS-PAGE电泳图;
图5为实施例4中回收的HLA-G/β2M复合物的SDS-PAGE电泳图;
图6为实施例5中回收的HLA-A*11:01/β2M复合物的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
以下实施例中,所有进行PCR扩增的PCR体系均如下表1所示。
表1 PCR扩增体系
项目 | 体积 |
模板 | 1μL |
上游引物 | 1μL |
下游引物 | 1μL |
2xMix | 25μL |
超纯水 | 22μL |
PCR扩增程序为:先95℃反应5min;然后95℃反应30s,55℃反应30s,72℃反应30s,循环30次;再72℃延伸5min;12℃保温至样品取出。
实施例1:用于制备HLA/β2M复合物的重组载体的制备
本实施例所提供的用于制备HLA/β2M复合物的重组载体采用以下方法制备而成。
S1、取pTRIOZ-hIgG1K质粒(采购自Invivogen公司,即原始载体),用限制性内切酶NheI和AvrII进行双酶切,利用1%琼脂糖凝胶回收7kb大小的片段;
再以FOS亮氨酸拉链bZIP motif质粒(如SEQ ID NO.13所示)为模板进行PCR扩增,用于将FOS亮氨酸拉链bZIP motif序列(如SEQ ID NO.1所示)插入到NheI/AvrII酶切位点之间;扩增引物对的序列如下,
正向引物(如SEQ ID NO.7所示):
5’-gtagatatcacgtcatgaaagctagcggcggcggcggcggcctgac-3’;
反向引物(如SEQ ID NO.8所示):
5’-gtcattggggaaacctgctcctaggtcagtggtggtggtggtggtggctgccgcc-3’;
PCR扩增程序为:先95℃反应5min;然后95℃反应30s,55℃反应30s,72℃反应30s,循环30次;再72℃延伸5min;12℃保温至样品取出;
用1%琼脂糖凝胶回收100bp的片段,经过测序验证得到第一重组载体,即pTRIOZ-hIgG1K-FOS质粒;pTRIOZ-hIgG1K-FOS质粒的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示;
S2、取步骤S1所得的所述第一重组载体pTRIOZ-hIgG1K-FOS,用限制性内切酶BsiWI和BlpI进行双酶切,利用1%琼脂糖凝胶回收6.7kb大小的片段;以JUN亮氨酸拉链bZIP motif质粒(如SEQ ID NO.14所示)为模板进行PCR扩增,用于将JUN亮氨酸拉链bZIPmotif序列(如SEQ ID NO.2所示)插入到BsiWI/BlpI酶切位点之间上;扩增引物对的序列如下,
正向引物(如SEQ ID NO.9所示):
5’-caagtttaaacaccatggaacgtacgggcggcggcggcggccgcat-3’;
反向引物(如SEQ ID NO.10所示):
5’-atgtctggccagctaggtccctctacttctcgaactgggggtggct-3’;
PCR扩增程序为:先95℃反应5min;然后95℃反应30s,55℃反应30s,72℃反应30s,循环30次;再72℃延伸5min;12℃保温至样品取出;
用1%琼脂糖凝胶回收100bp的片段,经过测序验证得到第二重组载体,即pATX-FOS-JUN质粒;pATX-FOS-JUN质粒的核苷酸序列如下SEQ ID NO.5所示;
S3、取步骤S2所得的所述第二重组载体pATX-FOS-JUN,用限制性内切酶AgeI和NheI进行双酶切,用1%琼脂糖凝胶回收7.3kb的片段;以合成的β2M基因序列(如SEQ IDNO.3所示)为模板,将其插入到AgeI/NheI酶切位点之间,扩增引物对的序列如下,
正向引物(如SEQ ID NO.11所示):
5’-aaccaccgctaattcaaagcaaccggtgccgccaccatgagcagaagcgtggcc-3’;
反向引物(如SEQ ID NO.12所示):
5’-ggtcaggccgccgccgccgcccatgtctcgatcccacttaacg-3’;
PCR扩增程序为:先95℃反应5min;然后95℃反应30s,55℃反应30s,72℃反应30s,循环30次;再72℃延伸5min;12℃保温至样品取出;
用1%琼脂糖凝胶回收400bp的片段,如图1所示,经过测序验证制得用于制备HLA/β2M复合物的重组载体,即pATX-β2M-FOS-JUN质粒;所述pATX-β2M-FOS-JUN质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在随后的实施例2-5中,针对不同种类的HLA蛋白,将相应的HLA蛋白的核苷酸序列插入到上述pATX-β2M-FOS-JUN质粒载体的PmeI/BsiWI位点之间,制备得到能直接用于制备HLA/β2M复合物的pATX-β2M-FOS-HLA-JUN质粒。
实施例2:HLA-A*02:01/β2M复合物的制备
HLA-A*02:01蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示,相应的HLA-A*02:01的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。以自行合成的含有HLA-A*02:01核苷酸序列的质粒(SEQ IDNO.17)为模板进行扩增,用1%琼脂糖凝胶回收1kb的片段;再将SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列插入到载体的PmeI/BsiWI位点之间,经过测序验证,制备得到pATX-β2M-FOS-HLA-A*02:01-JUN质粒,质粒结构如图2所示;扩增引物对的序列如下。
正向引物(如SEQ ID NO.18所示):
5’-ccaccggcgaggcgcgccaagtttaaacgccgccaccatggccgtgatgg-3’;
反向引物(如SEQ ID NO.19所示):
5’-cgatgcggccgccgccgccgcccacgatggcgatggtgggctgg-3’;
PCR扩增程序为:先95℃反应5min;然后95℃反应30s,55℃反应30s,72℃反应30s,循环30次;再72℃延伸5min;12℃保温至样品取出;
采用上述质粒制备HLA-A*02:01/β2M复合物,具体制备方法如下:
1、质粒抽提:使用ThermoFisher PureLinkTM HiPure质粒大提试剂盒(货号:K210007),按说明书抽提质粒;
2、转染:转染,使用FreeStyleTM MAX Transfection试剂(ThermoFisher,货号:16447100),按照说明书进行细胞培养和转染,转染300mL CHO细胞,转染后第6天收集培养上清纯化;
3、采用Ni-TED树脂(品牌:Roche,货号:5893801001)从收集的培养上清纯化目标HLA/β2M复合物,收集洗脱液共9ml;
4、采用Bradford蛋白浓度测定法进行洗脱液蛋白浓度测定,试剂盒品牌:ThermoFisher,货号:23200,测得洗脱液蛋白浓度为0.715mg/mL;纯化出来的HLA-A*02:01/β2M复合物的SDS-PAGE电泳图如图3所示。
经过最终计算,将上述构建好的质粒转染CHO细胞,表达量达到21.45mg/L。
实施例3:HLA-A*03:01:01:01/β2M复合物的制备
HLA-A*03:01:01:01蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示,相应的HLA-A*03:01:01:01蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。以申请人自行合成的含有HLA-A*03:01:01:01核苷酸序列的质粒(如SEQ ID NO.22所示)为模板进行扩增,用1%琼脂糖凝胶回收1kb的片段;再将HLA-A*03:01:01:01蛋白的核苷酸序列插入到载体的PmeI/BsiWI位点之间,经过测序验证,制备得到pATX-β2M-FOS-HLA-A*03:01:01:01-JUN质粒。采用上述质粒制备HLA-A*03:01:01:01/β2M复合物,具体制备方法与实施例2的方法相同,扩增引物对的序列如下。
正向引物(如SEQ ID NO.23所示):
5’-ccaccggcgaggcgcgccaagtttaaacgccgccaccatggctgtgatggca-3’;
反向引物(如SEQ ID NO.24所示):
5’-cgatgcggccgccgccgccgcccacgatggggattgtgggctgg-3’;
纯化出来的HLA-A*03:01:01:01/β2M复合物的SDS-PAGE电泳图如图4所示。经过最终计算,将上述构建好的质粒转染CHO细胞,最终制备的HLA-A*03:01:01:01/β2M复合物的表达量达到54.30mg/L。
实施例4:HLA-G/β2M复合物的制备
HLA-G蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示,相应的HLA-G蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。以申请人自行合成的含有上述HLA-G蛋白的核苷酸序列的质粒(如SEQID NO.27所示)为模板进行扩增,用1%琼脂糖凝胶回收1kb的片段;再将HLA-G蛋白的核苷酸序列插入到载体的PmeI/BsiWI位点之间,经过测序验证,制备得到pATX-β2M-FOS-HLA-G-JUN质粒。采用上述质粒制备HLA-G/β2M复合物,具体制备方法与实施例2的方法相同,扩增引物对的序列如下。
正向引物(如SEQ ID NO.28所示):
5’-gaggcgcgccaagtttaaacgccgccaccatggctgtgatggccccccgga-3’;
反向引物(如SEQ ID NO.29所示):
5’-cgatgcggccgccgccgccgcccacgattgggatagttggcagg-3’。
纯化出来的HLA-G/β2M复合物的SDS-PAGE电泳图如图5所示。经过最终计算,最终制备的HLA-G/β2M复合物的表达量达到1mg/L。
实施例5:HLA-A*11:01/β2M复合物的制备
HLA-A*11:01蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示,相应的HLA-A*11:01蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示。以申请人自行合成的含有上述HLA-A*11:01蛋白的核苷酸序列的质粒(如SEQ ID NO.32所示)为模板进行扩增,用1%琼脂糖凝胶回收1kbp的片段;将上述核苷酸序列插入到载体的PmeI/BsiWI位点之间,经过测序验证,制备得到pATX-β2M-FOS-HLA-A*11:01-JUN质粒。采用上述质粒制备HLA-A*11:01/β2M复合物,具体制备方法与实施例2的方法相同,扩增引物对的序列如下。
正向引物(如SEQ ID NO.33所示):
5’-gaggcgcgccaagtttaaacgccgccaccatggctgtgatggcaccccgg-3’;
反向引物(如SEQ ID NO.34所示):
5’-cgatgcggccgccgccgccgcccacgatggggattgtgggcaag-3’;。
纯化出来的HLA-A*11:01/β2M复合物的SDS-PAGE电泳图如图6所示。经过最终计算,最终制备的HLA-A*11:01/β2M复合物的表达量达到92.45mg/L。
最终,本发明的申请人针对共计57个HLA的核苷酸序列,将其分别插入进pATX-β2M-FOS-JUN质粒中,构建获得相应的重组载体;并转染CHO细胞重组表达,经检测,这些重组载体相应的复合物表达量均超过1mg/L,最高的到达92.45mg/L,具有非常高的表达量。这说明本发明通过改造载体,引入FOS/JUN亮氨酸拉链,实现了HLA/β2M复合物在CHO细胞中高表达。与常规不加FOS/JUN亮氨酸拉链的复合物表达相比,大大提高了表达量。与融合了人源IgG1Fc标签的HLA-Fc/β2M复合物表达(申请人自行进行试验获得,表达量为0.12mg/L)相比,表达量也实现的数量级的提升。
以上具体实施方式详细描述了本发明的实施,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于制备HLA/β2M复合物的重组载体,其特征在于,在原始载体的NheI/AvrII酶切位点之间插入FOS亮氨酸拉链bZIP motif序列,在BsiWI/BlpI酶切位点之间插入JUN亮氨酸拉链bZIP motif序列,在AgeI/NheI酶切位点之间插入β2M基因序列;
所述FOS亮氨酸拉链bZIP motif序列如SEQ ID NO.1所示,所述JUN亮氨酸拉链bZIPmotif序列如SEQ ID NO.2所示,所述β2M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的重组载体,其特征在于,还在所述重组载体的PmeI/BsiWI酶切位点之间插入相应的HLA序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组载体,其特征在于,所述原始载体为pTRIOZ-hIgG1K载体。
4.一种权利要求1所述的重组载体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、取原始载体用限制性内切酶NheI和AvrII进行双酶切,回收载体;以FOS亮氨酸拉链bZIP motif质粒为模板进行PCR扩增,回收100bp的片段,将FOS亮氨酸拉链bZIP motif序列插入到NheI/AvrII酶切位点之间,得到第一重组载体;所述第一重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;
S2、取步骤S1所得的所述第一重组载体,用限制性内切酶BsiWI和BlpI进行双酶切,回收载体;以JUN亮氨酸拉链bZIP motif质粒为模板进行PCR扩增,回收100bp的片段,将JUN亮氨酸拉链bZIP motif序列插入到BsiWI/BlpI酶切位点之间,得到第二重组载体;所述第二重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;
S3、取步骤S2所得的所述第二重组载体,用限制性内切酶AgeI和NheI进行双酶切,回收载体;以β2M基因序列为模板进行PCR扩增,回收400bp的片段,将其插入到AgeI/NheI酶切位点之间,最终制得所述用于制备HLA/β2M复合物的重组载体;制备HLA/β2M复合物的重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
5.根据权利要求4所述的重组载体的制备方法,其特征在于,步骤S1中,PCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO.7所示,反向引物序列如SEQ ID NO.8所示。
6.根据权利要求4所述的重组载体的制备方法,其特征在于,步骤S2中,PCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO.9所示,反向引物序列如SEQ ID NO.10所示。
7.根据权利要求4所述的重组载体的制备方法,其特征在于,步骤S3中,PCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO.11所示,反向引物序列如SEQ ID NO.12所示。
8.一种采用权利要求1或2所述的重组载体制备的HLA/β2M复合物。
9.一种权利要求8所述的HLA/β2M复合物在制备诊断癌症的试剂,或制备治疗癌症的药物中的应用。
10.一种含有权利要求8所述的HLA/β2M复合物的癌症诊断检测试剂盒。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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