CN115998910A - 一种靶向ha的核素小分子蛋白探针及其应用 - Google Patents
一种靶向ha的核素小分子蛋白探针及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及核医学显像剂技术领域，更具体而言，涉及一种靶向HA的核素小分子蛋白探针及其应用。所述核素小分子蛋白探针前体来源于人重组CD44蛋白，通过缩合反应引入桥接结构‑L后，与双功能配体‑Ch形成共价连接结构‑L‑Ch共价连接标记放射性核素，所述‑L‑Ch可共价连接在人重组CD44蛋白的N端、C端或反应性侧链上。本发明核素小分子蛋白探针靶向HA识别动脉粥样硬化侵蚀斑块具有高靶本底比值、体内清除快、生物安全性高、易于放射性标记、成本低等优点，这对于冠脉AS侵蚀斑块的早期识别、进展监测及指导靶向治疗，继而进一步降低ACS发生率及冠心病的宏观防治均具有重大意义。
Description
技术领域
本发明涉及核医学显像剂技术领域，更具体而言，涉及一种靶向HA的核素小分子蛋白探针及其应用。
背景技术
冠心病是威胁全球人类健康的主要疾病之一，冠状动脉(简称冠脉)粥样硬化(atherosclerosis，AS)斑块进展、破裂及侵蚀，即易损斑块的形成，是引起冠心病心肌梗死等不良心脏事件的主要原因。
研究显示，斑块破裂继发血栓形成是ST段抬高型心肌梗死(ST-segmentelevation myocardial infraction，STEMI)发生的重要病理机制，破裂斑块常具较大脂质核、较薄纤维帽、大量炎症细胞浸润等组织学特征。针对破裂斑块的成像手段有CT血管成像、冠脉造影、血管内超声(intravenous ultrasound，IVUS)、光学相干断层成像(opticalcoherence tomography，OCT)及分子影像等，其中分子影像技术允许在体可视化细胞、分子或基因水平的生物学或病理特征优势巨大。在冠心病诊治方面，随着急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)防治意识的提高，斑块破裂所致的ACS已有明显下降趋势。
然而，60％的非ST段抬高型心肌梗死(non-ST segment elevation myocardialinfraction，NSTEMI)与斑块侵蚀相关，但对于侵蚀斑块目前临床尚无有效的诊治策略。究其原因是侵蚀斑块常发生于冠脉内皮表浅部位，局部无明显脂质核心形成且纤维帽常较完整，存在内皮细胞缺失及少量中性粒细胞浸润，却富含大量的透明质酸(hyaluronic caid，HA)及平滑肌细胞。基于上述侵蚀斑块的组织学特征，既往的可视化冠脉AS斑块的影像技术检测能力低下。虽然，分子影像技术基于特异性的分子探针可以活体显示特定生理或病理过程，但已研发的可视化冠脉AS斑块分子探针大多是靶向斑块内炎症、微钙化、新生血管等方面的检测，不合适用于侵蚀斑块的影像学检测。此外，现阶段临床研究提示OCT可能是检测侵蚀斑块有效的影像学手段，但其有创、组织穿透力差无法识别斑块内部特征等原因，削弱了其临床应用及研究意愿。
综上，临床近1/3的ACS由侵蚀斑块引起，正确识别及区分侵蚀斑块具有重要意义。侵蚀斑块常无明显血流阻塞性病变而被临床忽视，且更易出现在年轻女性及糖尿病人群中，因此基于分子影像研发可视化冠脉AS侵蚀斑块的分子探针是亟待解决的重大临床难题。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的一个方面的目的在于，提供一种靶向HA的核素小分子蛋白探针，所述核素小分子蛋白探针前体来源于人重组CD44蛋白，通过缩合反应引入桥接结构-L后，与双功能配体-Ch形成共价连接结构-L-Ch共价连接标记放射性核素，所述-L-Ch可共价连接在人重组CD44蛋白的N端、C端或反应性侧链上。
优选的，所述人重组CD44蛋白有21-220个氨基酸，分子量为49kDa，多肽氨基酸序列如下：QIDLNITCRF AGVFHVEKNG RYSISRTEAA DLCKAFNSTL PTMAQMEKAL SIGFETCRYGFIEGHVVIPR IHPNSICAAN NTGVYILTSN TSQYDTYCFN ASAPPEEDCT SVTDLPNAFD GPITITIVNRDGTRYVQKGE YRTNPEDIYP SNPTDDDVSS GSSSERSSTS GGYIFYTFST VHPIPDEDSP WITDSTDRIPPKSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK，所述蛋白C端带标签His tag，N端带标签GST tag。
优选的，所述C端带标签为羧基保护基。
优选的，所述N端带标签为羟基保护基。
优选的，所述反应性侧链是指人重组CD44蛋白侧链上的反应性基团，包括氨基、羧基和具有类似性质的氨基酸。
优选的，所述-L为桥接基团，所述桥接基团为EDC(1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)、NH2-(PEG)n-COOH或寡肽。
优选的，所述-Ch为核素螯合基团，所述核素螯合基团为双功能螯合剂形成的基团，DOTA、NOTA、NODA、NODAGA、DOTP、TETA、ATSM、PTSM、EDTA、EC、HBEDCC、DTPA、SBAD、BAPEN、Df、DFO、TACN、NO2A/NOTAM、CB-DO2A、Cyclen、NOTA-AA、DO3A、DO3AP、HYNIC、MAS3、MAG3或异腈。
优选的，所述标记放射性核素为回旋加速器或其他类型发生器生产的诊断或治疗用放射性核素，包括68Ga、64Cu、89Zr、18F、90Y、111In、99mTc、11C、123I、125I和124I中的至少一种。
本发明的另一个方面的目的在于，提供一种靶向HA的核素小分子蛋白探针在制备核素成像诊断试剂中的应用。
优选的，所述核素成像诊断试剂为HA富集的血管内皮/细胞外基质的追踪试剂或靶向HA治疗疗效评价的成像试剂。
本发明所具有的有益效果如下：
本发明设计一种靶向HA的核素小分子蛋白探针，以小分子量人重组CD44蛋白作为前体蛋白，通过化学合成法在CD44前体蛋白上引入桥接结构ECD，对产物进行磺基化修饰后与双功能配体基团P-scn-Bn-NOTA螯合，使-L-Ch以共价连接方式结合在所述CD44前体蛋白的N端、C端或反应性侧链上，将放射性核素64Cu标记于双功能配体基团上，最终形成本发明所述小蛋白分子探针优选实施例64Cu-NOTA-CD44。使其靶向HA识别动脉粥样硬化侵蚀斑块具有高靶本底比值、体内清除快、生物安全性高、易于放射性标记、成本低等优点，这对于冠脉AS侵蚀斑块的早期识别、进展监测及指导靶向治疗，继而进一步降低ACS发生率及冠心病的宏观防治均具有重大意义。
本发明针对冠脉AS侵蚀斑块可视化分子影像探针极度匮乏现状，基于人重组CD44蛋白设计一类核素标记的小分子蛋白类探针，解决了短半衰期核素限制、特异性结合位点功能域保留等技术难题，创新性的提供了一种核素分子影像靶向HA可视化冠脉AS侵蚀斑块的影像诊断试剂，填补了冠脉AS侵蚀斑块可视化分子影像探针方面的空缺。
本发明所构建的分子探针靶向HA具有高亲和力、高特异性、体内外稳定性好、核素标记率及放射性化学纯度高、体内药代动力学特征良好，micro PET/CT成像显示它可以早期结合在动脉粥样硬化模型鼠侵蚀斑块病变处，具有高靶/本底比，且摄取水平与病理及代谢组学所示斑块危险程度一致性良好，可以早期识别及预警动脉粥样硬化不稳定斑块，为冠心病动脉粥样硬化的诊治提供新靶点及疗效评估手段。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明实施例CD44小分子蛋白合成NOTA-CD44前体蛋白反应流程图；
图2是本发明实施例NOTA-CD44前体蛋白与HA相互作用力BLI检测结果图；
图3是本发明实施例中纯化后64Cu-NOTA-CD44的Radio-iTLC检测结果图；
图4是本发明实施例中游离64Cu的Radio-iTLC检测结果图；
图5是本发明实施例注射64Cu-NOTA-CD44后0h时尿液标本Radio-iTLC检测结果图；
图6是本发明实施例注射64Cu-NOTA-CD44后1h时尿液标本Radio-iTLC检测结果图；
图7是本发明实施例注射64Cu-NOTA-CD44后3h时尿液标本Radio-iTLC检测结果图；
图8是本发明实施例注射64Cu-NOTA-CD44后6h时尿液标本Radio-iTLC检测结果图；
图9是本发明实施例注射64Cu-NOTA-CD44后24h时尿液标本Radio-iTLC检测结果图；
图10是本发明实施例64Cu-NOTA-CD44的体外稳定性测试结果图；
图11是本发明实施例64Cu-NOTA-CD44药物代谢动力学二室模型拟合曲线图；
图12是本发明实施例64Cu-NOTA-CD44在正常C57小鼠体内分布结果图；
图13是本发明实施例64Cu-NOTA-CD44在ApoE-/-动脉粥样硬化模型小鼠micro PET/CT显像图；
图14是本发明实施例AS模型组ApoE-/-小鼠腹主动脉与心血池的64Cu-NOTA-CD44摄取对比统计图；
图15是本发明实施例正常对照组C57小鼠腹主动脉与心血池的64Cu-NOTA-CD44摄取对比统计图；
图16是本发明实施例AS模型组ApoE-/-小鼠与正常对照组C57小鼠腹主动脉的64Cu-NOTA-CD44摄取对比统计图；
图17是本发明实施例AS模型组ApoE-/-小鼠与正常对照组C57小鼠腹主动脉/心血池(TBRmax)的64Cu-NOTA-CD44摄取对比统计图；
图18是本发明实施例ApoE-/-动脉粥样硬化模型小鼠腹主动脉病理染色结果示意。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于此描述的方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例
以小分子量人重组CD44蛋白作为前体蛋白，通过化学合成法在CD44前体蛋白上引入桥接结构ECD，对产物进行磺基化修饰后与双功能配体基团P-scn-Bn-NOTA螯合，使-L-Ch以共价连接方式结合在所述CD44前体蛋白的N端、C端或反应性侧链上，将放射性核素64Cu标记于双功能配体基团上，最终形成本发明所述小蛋白分子探针优选实施例64Cu-NOTA-CD44。
步骤1.分子探针前体NOTA-CD44的制备
1.1从人重组CD44蛋白数据库中筛选出合适的小分子CD44蛋白，所述人重组CD44蛋白为21-220个氨基酸，分子量为49kDa，多肽氨基酸序列如下：QIDLNITCRF AGVFHVEKNGRYSISRTEAA DLCKAFNSTL PTMAQMEKAL SIGFETCRYG FIEGHVVIPR IHPNSICAAN NTGVYILTSNTSQYDTYCFN ASAPPEEDCT SVTDLPNAFD GPITITIVNR DGTRYVQKGE YRTNPEDIYP SNPTDDDVSSGSSSERSSTS GGYIFYTFST VHPIPDEDSP WITDSTDRIPP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK，所述蛋白C端带标签His tag，N端带标签GST tag，所述C端带标签为羧基保护基，所述N端带标签为羟基保护基。将所得CD44蛋白用pH9.0的0.1M碳酸氢钠缓冲液于4℃搅拌透析过夜，每隔4h进行一次更换透析液，直至所获CD44蛋白溶液浓度为1mg/ml；
1.2在1mg/ml的CD44蛋白溶液中加入浓度为1mM的EDC试剂0.15mg，搅拌溶解后，室温下反应2h；
1.3反应结束后加入0.55mg的NHS，搅拌溶解，室温下静置15min；
1.4取10mg P-scn-Bn-NOTA加入MES缓冲液200ul，配置成总浓度1mM的工作液，备用；
1.5将适量的CD44蛋白溶液(分子量40-50kDa)与P-scn-Bn-NOTA缓冲液按照摩尔比例1：5比例溶解至蒸馏水中，室温下反应2h，每隔4h更换缓冲液并透析至累计时间8h，收集NOTA-CD44溶液样品并制备其冻干粉，CD44小分子蛋白合成NOTA-CD44前体蛋白反应流程图如图1所示。
步骤2.NOTA-CD44前体蛋白与HA间相互作用力检测
使用Octet平台(Octet RE96E，fortebio)基于生物膜干涉技术(Bio-LayerInterferometry，BLI)检测不同分子量HA与前体蛋白NOTA-CD44之间的相互作用力。
2.1 CD44蛋白生物素化：取40uL NOTA-CD44前体蛋白溶液，按照摩尔比1：2加入生物素化试剂，室温反应1h，反应结束后用重力脱盐柱除去多余生物素，用pH7.4的PBS洗脱，用于后续固化；
2.2HA稀释：用PBST(PBS+0.02％Tween20)将HA稀释成500uM，体积为200uL，用于后续检测；
2.3 SSA固化CD44检测HA：传感器预湿后，以200uL PBST/孔作为对照，将不同浓度的HA稀释至200uL/孔应用于流动相中，12h后放置SSA芯片(厂家：Fortebio，货号：18-5057)，设定并运行检测程序；
2.4数据分析：使用ForteBio Data Analysis10.0软件进行数据分析，分析结果显示前体蛋白NOTA-CD44与低分子量HA(约250kDa，据权威报道AS侵蚀斑块富含此水平低分子量的HA)之间存在明显的相互作用结合力，亲和力常数KD(Kd/Ka)＝9.60E-03(亲和力常数越小说明相互作用越强)，NOTA-CD44前体蛋白与HA相互作用力BLI检测结果图如图2所示，结果如下表1所示。
表1.NOTA-CD44前体蛋白与HA相互作用力BLI检测结果
步骤3.正电子放射性核素64Cu标记及质控
3.1取步骤1制备的NOTA-CD44蛋白溶液冻干粉100ug，将其稀释于2M200ul的NaAc缓冲溶液(pH＝5.5)中，室温下震荡混匀；
3.2加入固体靶回旋加速器生产的64Cu-CuCl2溶液74MBq，室温下反应30min；
3.3采用Sep-Pak Light C18纯化柱进行纯化，获得的靶向HA的64Cu-NOTA-CD44小蛋白分子探针，经Radio-iTLC测定64Cu-NOTA-CD44的比移值(Flow rate，Rf)为0.08-0.21，结果如下表2所示，分析图如图3所示，游离64Cu的Rf为0.38-0.57，结果如下表3所示，分析图如图4所示，余未见其他杂质的放射性浓聚，测定的产品放射化学纯度可达95％以上。
表2.纯化后64Cu-NOTA-CD44的Radio-iTLC检测数据表
表3.游离64Cu的Radio-iTLC检测数据表
步骤4.64Cu-NOTA-CD44体内稳定性及毒性评价
4.1取正常C57小鼠，经尾静脉注射1.11MBq的放射性药物；
4.2于注射放射性药物后10min、30min、1h、3h、6h、1d、3d处死小鼠，按压腹部取尿液；
4.3取200uL尿液，加入400uL的无水乙腈，离心分离后，取上清液进样，进行Radio-iTLC检测，观察上述结果中探针所处的放射峰位置，并计算其百分比，检测结果如图5-9所示。
此部分实验结果显示，在注射放射性药物的3h开始即可观察微量单一的小杂峰出现，但产品的放射峰仍可达到92.445％；随时间推移注射后6h产品后面出现较明显的杂峰，此时产品放射峰已下降至77.55％，表明此时体内开始出现少量产品的生物分解；在注射后的24h除产品放射峰外出现较多杂乱的放射峰，此时产品在体内的生物降解量较前明显增加，但仍可见相对明显的产品放射峰，约占54.89％。
步骤5.64Cu-NOTA-CD44体外稳定性评价
体外稳定性研究使用Radio-iTLC方法，分析64Cu标记的放射性药物在生理盐水和1％PBS缓冲液中的稳定性，具取体如下：
5.1将放射性药生理盐水和1％PBS缓冲液分别孵育不同时间；
5.2生理性盐水中体外稳定性在既定时间可用纯水稀释后，直接将1.11MBq的放射性药物加入上述溶液后，分别于30min、1h、3h、7h、10h、15h、24h、36h、72h取样，进行Radio-iTLC分析；
5.3在1％PBS缓冲液(pH＝7.4)中体外稳定性研究同上；
体外研究结果显示64Cu标记的探针直至在生理盐水和1％PBS缓冲液中孵育24h之后，经Radio-iTLC检测开始出现少量64Cu解离，但其放化纯度仍可维持80％以上，证实该探针体外环境下标记产物具有较好的稳定性，检测结果如图10所示。
步骤6.64Cu-NOTA-CD44体内药物代谢动力学特征
6.1取正常C57小鼠，经尾静脉注射0.37MBq的放射性药物；
6.2分别于注射后5min、10min、15min、30min、1h、3h、6h、12h、24h、36h、72h时经眼眶静脉取血，称重并利用γ计数器检测放射性计数；
6.3设置1％的marker作为参比，计算单克血液的百分注射剂量率，记为％ID/g，利用GraphPad Prism9.2.0软件进行非线性拟合回归分析，研究其药物代谢动力学特点；
实验结果显示64Cu-NOTA-CD44在体内代谢符合二室模型，在血循环中快速分布及清除，其分布相和清除相的半衰期分别为0.90h和11.46h，通过GraphPad Prism软件拟合得到的二室模型公式为Ct＝-0.03+5.79×e-0.77t+8.07×e-0.06t如图11所示。上述结果表明64Cu-NOTA-CD44在体内分布符合小分子蛋白在体代谢特征，适用于临床显像。
步骤7.64Cu-NOTA-CD44在正常C57小鼠体内分布
7.1取正常C57小鼠，经尾静脉注射1.11MBq的64Cu标记的放射性药物；
7.2分别在注射后的1h、3h、6h、1d及3d处死小鼠，取血液、心脏、肝脏、脾脏、双肺、肾脏、胃、肠道、肌肉、骨骼及脑等脏器和组织，称重并利用γ计数器测定其放射性计数；
7.3设置1％的marker作为参比，计算每克组织百分注射剂量率，记为％ID/g，观察放射性药物在正常C57小鼠体内的分布特点。
实验结果显示注射药物经由肾脏清除，注射1h后膀胱内即可观察到大量的放射性聚集且直至注射后24h均可以观察到此表现，此外放射性药物在肝脏、脾脏、血液及肺组织中存在相对较高的放射性，且随时间推移不同程度降低；注射药物后探针快速在体内分各脏器分布，3～6h时探针基本达到分布和清除的平衡阶段，24h内各脏器的放射性药物摄取水平基本保持稳定，注射药物24h后膀胱等脏器组织中放射性含量明显下降至较低水平，如图12所示。上述研究结果表明产品静脉注射后可快速在体内分布达平衡态，经由肾脏快速清除，24h内各脏器摄取水平相对稳定，临床显像时间窗较长，符合长半衰期小分子蛋白探针的体内分布特点。
步骤8.ApoE-/-动脉粥样硬化模型小鼠64Cu-NOTA-CD44micro PET/CT显像及半定量分析
64Cu-NOTA-CD44micro PET/CT成像研究在正常C57小鼠及高脂饮食的ApoE-/-动脉粥样硬化模型小鼠中进行。
8.1取不同周龄C57及ApoE-/-小鼠，经尾静脉注射64Cu标记的放射性药物11.1MBq，在注射后1h、3h、6h、12h、24h、36h及72h分别进行体内及腹主动脉体外micro PET/CT显像，如图13所示；
8.2实验小鼠注射放射性药物后，经异氟烷麻醉后进行micro PET/CT静态显像，通过CTAC法进行PET图像重建，勾画感兴趣区(ROI)，测定腹主动脉、心血池及主要脏器或组织ROI内的放射性计数(MBq/ml)，并根据以下公式计算相应组织或脏器的SUV(g/ml)、TBRmax；
研究结果显示，ApoE-/-小鼠与C57小鼠腹主动脉(abd.aorta，AA)及心血池(bloodpool，BP)的探针摄取水平均随时间推移而降低：ApoE-/-实验组在1h、3h及6h时间点AA的SUV值均明显高于C57对照组(15.27±1.72vs.9.58±4.06，11.29±2.20vs.7.06±1.96，7.64±1.63vs.3.52±0.37，P<0.001)，但1d及3d组间比较未见上述差异；ApoE-/-实验组不同时间点AA的SUV水平均明显高于同组BP，且在3h、6h及1d时ApoE-/-实验组的TBRmax(AA/BP)高于C57对照组(6h：2.45±0.41vs.0.93±0.32，1d：2.93±0.50vs.0.94±0.13，P<0.001)，如图14-17所示。实验结果表明，对于本发明所述小分子蛋白探针，使用长半衰期放射性核素如64Cu进行标记，其显像最佳时间窗长、动脉粥样硬化病变靶组织比值高，且与SUV值相比，动脉粥样硬化病变与心血池的TBRmax值更能帮助发现阳性病变。
步骤9.ApoE-/-动脉粥样硬化模型小鼠腹主动脉斑块病理染色及免疫组化
8周龄雄性ApoE-/-小鼠高脂饮食饲养至不同周龄，分批处死后进行病理及免疫组化研究，具体如下：
9.1取ApoE-/-小鼠麻醉后开胸，充分暴露心脏并取血，左心室充分灌注PBS及10％甲醛溶液，分离实验动物头臂静脉、主动脉弓及腹主动脉，并对标本进行石蜡包埋、切片；
9.2使用S-P方法对切片进行免疫组化分析，使用苏木精-伊红(HE)染色检测标本斑块浸润情况，使用茜素红染色检测标本钙化情况，使用阿利新蓝染色检测标本透明质酸浸润情况，使用CD68免疫组化检测斑块内巨噬细胞浸润情况，染色结果如图18所示。
实验结果显示8周龄雄性ApoE-/-小鼠高脂饲养12周时即可观察到动脉粥样硬化斑块的形成，饲养20周时HE染色可见大量且明显的动脉粥样硬化斑块形成于腹主动脉管壁，部分斑块阿利新蓝染色提示大量HA浸润且与体外micro PET/CT提示的斑块部位一致，提示本发明所述探针可靶向HA检测动脉粥样硬化侵蚀斑块；另体外腹主动脉探针高摄取部位存在不同程度的茜素红染色及CD68免疫组化阳性表现，提示该探针可在部分动脉粥样硬化炎症斑块内摄取。
以上所述仅为本发明优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明还可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种靶向HA的核素小分子蛋白探针，其特征在于：所述核素小分子蛋白探针前体来源于人重组CD44蛋白，通过缩合反应引入桥接结构-L后，与双功能配体-Ch形成共价连接结构-L-Ch共价连接标记放射性核素，所述-L-Ch可共价连接在人重组CD44蛋白的N端、C端或反应性侧链上。
2.根据权利要求1所述的一种靶向HA的核素小分子蛋白探针，其特征在于：所述人重组CD44蛋白有21-220个氨基酸，分子量为49kDa，多肽氨基酸序列如下：QIDLNITCRFAGVFHVEKNG RYSISRTEAA DLCKAFNSTL
PTMAQMEKAL SIGFETCRYG FIEGHVVIPR IHPNSICAAN NTGVYILTSN
TSQYDTYCFN ASAPPEEDCT SVTDLPNAFD GPITITIVNR DGTRYVQKGEYRTNPEDIYPSNPTDDDVSS GSSSERSSTS GGYIFYTFST VHPIPDEDSP
WITDSTDRIPP KSCDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK，所述蛋白C端带标签His tag，N端带标签GST tag。
3.根据权利要求2所述的一种靶向HA的核素小分子蛋白探针，其特征在于：所述C端带标签为羧基保护基。
4.根据权利要求2所述的一种靶向HA的核素小分子蛋白探针，其特征在于：所述N端带标签为羟基保护基。
5.根据权利要求1所述的一种靶向HA的核素小分子蛋白探针，其特征在于：所述反应性侧链是指人重组CD44蛋白侧链上的反应性基团，包括氨基、羧基和具有类似性质的氨基酸。
6.根据权利要求1所述的一种靶向HA的核素小分子蛋白探针，其特征在于：所述-L为桥接基团，所述桥接基团为EDC(1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)、NH2-(PEG)n-COOH或寡肽。
7.根据权利要求1所述的一种靶向HA的核素小分子蛋白探针，其特征在于：所述-Ch为核素螯合基团，所述核素螯合基团为双功能螯合剂形成的基团，DOTA、NOTA、NODA、NODAGA、DOTP、TETA、ATSM、PTSM、EDTA、EC、HBEDCC、DTPA、SBAD、BAPEN、Df、DFO、TACN、NO2A/NOTAM、CB-DO2A、Cyclen、NOTA-AA、DO3A、DO3AP、HYNIC、MAS3、MAG3或异腈。
8.根据权利要求1所述的一种靶向HA的核素小分子蛋白探针，其特征在于：所述标记放射性核素为回旋加速器或其他类型发生器生产的诊断或治疗用放射性核素，包括68Ga、64Cu、89Zr、18F、90Y、111In、99mTc、11C、123I、125I和124I中的至少一种。
9.一种靶向HA的核素小分子蛋白探针的应用，其特征在于：权利要求1-8任一项所述权利要求核素小分子蛋白探针在制备核素成像诊断试剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的一种靶向HA的核素小分子蛋白探针的应用，其特征在于：所述核素成像诊断试剂为HA富集的血管内皮/细胞外基质的追踪试剂或靶向HA治疗疗效评价的成像试剂。
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