CN115998802A - 一种菊苣、覆盆子复合物的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物发酵技术领域，尤其涉及一种菊苣、覆盆子复合物的发酵方法。该方法包括如下步骤：按重量份数计，将30‑60份菊苣粉末和40～70份覆盆子粉末混合，混合后采用两次煎煮得到提取液；将得到的提取液和滤渣中加入发酵营养剂，调整pH值至7.0±0.5，得到发酵底物；将发酵底物蒸汽灭菌，得到菊苣复合物灭菌液；菊苣复合物灭菌液降温后接种双歧杆菌和乳酸杆菌预培养菌液进行发酵，发酵完成后进行稳定化灭活处理，得到菊苣复合物发酵液；将菊苣复合物发酵液过筛网滤除药渣，收集过滤液。本发明采用复合益生菌共生发酵，使中药和益生菌相互增益。本发明的菊苣复合物益生菌发酵制品对大鼠肝肾功能损伤有保护作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，尤其涉及一种菊苣、覆盆子复合物的发酵方法，该复合物具有改善肝肾功能损伤效果。
技术背景
肝脏和肾脏是人体最主要的代谢器官，共同参与了有害、有毒物质的代谢和排出。衰老、药物、糖尿病等都能造成肝肾的损伤。尤其是长期服用西药对于肝肾有很大的损伤，因为很多药物特别是口服药物需要肝肾进行代谢，会增加肝肾的负担。药物性肝肾损伤患者的用药问题是临床医师较为棘手的问题。
肾功能损伤疾病是一组以肾小球、肾小管损伤为特征为主的疾病，临床上表现为蛋白尿、水肿等。近年来，其发病率越来越高，严重危害着人们的身体健康，响着人们的生活质量。流行病学调查数据显示，慢性肾功能损伤患病率己经上升到12.5％。因此该病的预防与治疗便显得尤为重要。目前用于治疗慢性肾功能损伤的药物主要为降糖类药物、降脂类药物、降压类药物等，以西药为主。但是西药副作用大，停药后病程易反复。
肝损伤是人类最常见的疾病之一，它可以由多种因素引起，包括病毒感染、酒精中毒、自身免疫性疾病或药物诱导。到目前为止，现代医学并无治疗急性肝损伤的特异性药物。
综上所述，急需开发高效、安全的产品来保护肝肾功能损伤。
近些年，益生菌生物发酵技术不断引入中药炮制的应用之中，中药发酵后有如下优势：
1、增强药效、降低中药的毒性，不会给肝肾造成负担；
2、益生菌发酵能产生独特风味改善中药的苦涩味；
3、益生菌在代谢过程中可产生多种胞外酶，这些胞外酶可以降解纤维素等成分，而使植物细胞壁的结构破坏，间接提高了中药的疗效，同时益生菌代谢产物也具有特异性的功效，与中药成分配伍相得益彰、一举多得。
因此开发一种用于的中药组合物的益生菌发酵方法和制品具有重要的应用价值；尤其是从中药益生菌发酵物中获得对保护肝肾有益的成分将对临床意义重大。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明目的在于提供一种菊苣、覆盆子复合物的发酵方法：
本申请采用的技术方案为：一种菊苣、覆盆子复合物的发酵方法，
步骤1)：按重量份数计，将30-60份菊苣粉末和40～70份覆盆子粉末混合，混合后采用两次煎煮得到提取液；
步骤2)：将步骤1)得到的提取液和滤渣中加入发酵营养剂，调整pH至7.0±0.5，得到发酵底物；
步骤3)：将发酵底物蒸汽灭菌，得到菊苣复合物灭菌液；
步骤4)：将步骤3)中菊苣复合物灭菌液降温后接种双歧杆菌和乳酸杆菌预培养菌液进行发酵，发酵完成后进行稳定化灭活处理，得到菊苣复合物发酵液；
步骤5)：将菊苣复合物发酵液过筛网滤除药渣，收集过滤液。
本发明中筛选的中药材菊苣是药食同源中药材，菊苣是维吾尔医习用药材，具有清热、解毒、消炎利尿、清肝利胆等疗效。据维吾尔族多部医药典籍记载维吾尔医习用菊苣水提取物治疗肝炎、胆囊炎等疾病，其中单方制剂的代表药物有清热卡森颗粒，复方制剂的代表药物有炎消迪娜儿糖浆、护肝布祖热颗粒及复方木尼孜其颗粒等。水溶性成分多糖作为菊苣的有效成分之一，含量也颇高。菊苣多糖对APAP引起的药物性肝损伤具有明显的修复和缓解氧化应激反应，其高剂量多糖则更能发挥其作用，缓解APAP造成的氧化产物水平的升高和肝组织病理变化。覆盆子也是药食同源中药材，覆盆子主入肝肾，具有益肾固精缩尿,养肝明目的功效，用于遗精滑精,遗尿尿频,阳痿早泄,目暗昏花等。二者配伍可肝肾同补、协同增效。
进一步地，所述步骤(1)中，将菊苣、覆盆子粉碎过20～40目筛；将30～60份菊苣粉末和40～70份覆盆子粉末混合10～30min，得到混合粉；
加入混合粉8～15倍质量的水浸泡1.0小时，煎煮，煮沸后保持沸腾1～3小时，分离出煎液；再加混合粉8～15倍质量的水煎煮，煮沸后保持微沸1～3小时，再次分离出煎液；合并煎液加水定容，混合粉与定容后煎液的质量体积比0.55g/mL。
进一步地，所述步骤(2)中所述发酵营养剂中各组分加入量为：葡萄糖5～15g/L、酵母膏1～5g/L、酵母粉0.5～2g/L、蛋白胨3～15g/L，营养素加入量为铁3～10mg/L、锌15～30mg/L、硒0.03～0.2mg/L、镁120～200mg/L、锰2～10mg/L、钾0.8～1.6g/L。
进一步地，所述步骤(2)中调整pH之前加入甜味剂，所述甜味剂为低聚果糖和/或三氯蔗糖；添加量为低聚果糖10～100g/L、三氯蔗糖0.01～0.1g/L。
进一步地，所述步骤(3)中，将所述发酵底物在温度为100～115℃条件下保温30～60min，得到菊苣复合物灭菌液。
进一步地，所述步骤(4)中双歧杆菌选自乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)或青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)一种或两种；
所述乳酸杆菌包括鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)；
以及植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)中的至少一种。
所述双歧杆菌预培养菌液接种量为菊苣复合物灭菌液体积百分比为0.2％～1.0％；所述乳杆菌预培养菌液接种量为菊苣复合物灭菌液体积百分比为0.2％～4％；
所述双歧杆菌预培养菌液与乳杆菌预培养菌液体积比为1：2～4；双歧杆菌预培养菌液和乳酸杆菌预培养菌液的活菌数为2×107CFU·mL-1。
本发明筛选的益生菌菌种为多种乳酸杆菌和双歧杆菌，经研究皆有益于机体代谢、保护肝肾的功效；同时益生菌发酵中药过程中产生的氨基酸、生物素、微量元素等成分，这些有益菌的代谢产物可保留在产品中，为患者提供更丰富的营养支持。将多种乳酸杆菌和双歧杆菌相结合，采用复合益生菌共生发酵对菊苣复合物进行活性成分获取，旨在增强益生菌对菊苣生物转化的效果,发挥多菌种协同作用,加强复合益生菌菊苣发酵制品的保护肝肾的功效,提高其临床应用效果。
进一步地，其特征在于：所述步骤(4)中的发酵温度为25～40℃，保持双歧杆菌和乳酸杆菌的总菌体数不低于1.5×108cfu/ml，发酵时间为25～50h，当pH达到3.5～4.1时，停止发酵；然后95～100℃下灭菌10～40min，得到菊苣复合物发酵液。
进一步地，所述步骤(5)中将菊苣复合物发酵液过筛网滤除药渣后收集滤液，并水洗滤渣；将水洗液再次过筛网，收集滤液，将两次的滤液合并，离心分离后收集上清液，得到澄清的菊苣复合物发酵液，灌装得到成品。
进一步地，所述步骤(5)中菊苣复合物发酵液和水洗液依次过100～200目和200～400目筛网。
进一步地，所述离心分离时的转速为6000-10000rpm/min。
本发明的优点为：
1.筛选药食同源中草药为原料，既可以保护、改善肝肾功能，同时由于其自身食品的安全属性，不会给肝肾造成负担。
2.将菊苣、覆盆子饮片粉碎后进行水煎煮提取以后再进行发酵，与粉碎后不经水煎煮直接进行发酵的方法比，提取以后的发酵液溶出成分更多，发酵菌株更能有效发酵转化中药成分。
3.将菊苣复合物提取液合并药渣同时发酵，与撇弃药渣比，药渣含有很多营养成分和活性物质，同时可以作为发酵液的碳源、氮源，能更全面的获取菊苣、覆盆子中的有效成分。
4.将菊苣复合物提取液合并药渣同时发酵，发酵过程中产生的多种酶可以降解药渣，同时降低近一半的药渣量，绿色环保又经济。
5.将多种特定种类的益生菌应用于菊苣复合物的发酵液中，益生菌发酵过程中产生的多种胞外酶，可以裂解药用植物的细胞壁，降低多糖等对有效成分的包裹作用，析出更多的生物碱、黄酮、糖苷、鞣花酸等，同时经过益生菌的发酵，将不能被人体直接吸收利用的大分子有效活性物质降解成小分子。大大提高中药成分的利用率和生理活性，同时降低中药材的毒性，更有利于保护、改善肝肾功能。
6.将多种乳酸杆菌和双歧杆菌相结合，采用复合益生菌共生发酵，不同益生菌食用后可以定向阻止病原菌对肠道的入侵和定植，抑制病原菌抗感染，维持肠道的微生态平衡，预防和抑制肿瘤的发生，增强机体的免疫力，促进代谢消化，合成氨基酸和维生素，降低胆固醇，降低血糖，抑制内毒素的生产，促进尿酸排泄，保护肝肾功能等。因此，将多种乳酸杆菌和双歧杆菌相结合共生发酵应用于菊苣复合物发酵对人体更有益。
7.将多种特定种类的益生菌共生应用于菊苣复合物提取液的发酵比单纯的双歧杆菌或乳酸杆菌具有更独特的风味，从而改善菊苣复合物提取液令人不愉悦的苦涩味，提高患者服用本品的依从性。
8.本发明所用益生菌菌种皆是源自2022年卫计委发布关于《可用于食品的菌种名单》和《可用于婴幼儿食品的菌种名单》更新公告中，均可应用至食品中。本发明中其他添加其他辅料也皆选择食品原料或添加剂，所以安全性有保障，不增加肝肾代谢负担。
9.工艺简单易操作，生产用时短。
附图说明
图1为本发明实验例1动物实验中各组血浆肌酐值；
图2为本发明实验例1动物实验中各组血浆尿素氮含量值；
图3为本发明实验例1动物实验中各组血浆尿酸含量值；
图4为本发明实验例1动物实验中各组肾体比。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。
本发明各实施例所采用的菌种来源于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(中国，武汉)或中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)(中国，北京)或者从正常人的粪便或肠粘膜组织中分离得到这些细菌菌株。
实施例1：菊苣、覆盆子复合物的发酵方法，包括如下步骤：
(1)原料提取预处理：将100kg菊苣饮片、120kg覆盆子饮片粉碎打粉后过20目筛，按照配方比例分别精确称量菊苣粉、覆盆子粉混合20min，得到的菊苣复合物粉加水煎煮，先加菊苣复合物粉10倍质量水浸泡1.0小时，煎煮，煮沸后保持沸腾2小时，分离出煎液；再加菊苣复合物粉10倍质量水煎煮，煮沸后保持沸腾2小时，再次分离出煎液；合并煎液加水定容，菊苣复合物粉与定容后煎液的质量体积比为0.55g/mL，合并药渣煎液，得到菊苣复合物提取液。
(2)配料：在上述菊苣复合物提取液中加入葡萄糖5kg、酵母膏1.3kg、酵母粉0.5kg、蛋白胨3kg。加入营养素化合物包括硫酸亚铁·7H2O 10g、硫酸锌·7H2O36g、亚硒酸钠·5H2O 200mg、硫酸镁·7H2O 600g、硫酸锰·H2O 4g、磷酸二氢钾850g和磷酸氢二钾·3H2O 850g，定容至2000L。调整pH值至7.0,得菊苣复合物益生菌发酵中药底物。在调节pH值之前，添加甜味剂低聚果糖30kg、三氯蔗糖60g。
(3)灭菌：将所述菊苣复合物益生菌发酵底物在温度为100～115℃条件下保温40min，得到菊苣复合物灭菌液。
(4)发酵：当上述菊苣复合物灭菌液温度降至39℃时，同时接种青春双歧杆菌、乳双歧杆菌预培养菌液的量分别为菊苣复合物灭菌液的体积百分比为0.3％，鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌、植物乳杆菌预培养菌液的总接种量为菊苣复合物灭菌液的体积百分比1.2％,鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌、植物乳杆菌三种菌液的体积百分比相同。30℃持续发酵时间为42h后。显微镜直接计数法检测发酵菌总菌体数高于1.5×108cfu/ml、pH达到4.0时，停止发酵。95～100℃下灭菌20min，得到菊苣复合物发酵液。
(5)澄清处理：将菊苣复合物发酵液分别过140目的筛网，收集过滤液；并用滤渣质量3倍的水洗滤渣，将水洗液再过270目的筛网，收集过滤液，合并两次的过滤液，以8000rpm/min的转速离心分离后收集上清液，得到澄清的菊苣复合物发酵滤液。
(6)分装：在无菌洁净环境下将菊苣复合物发酵滤液分装为100ml的菊苣复合物发酵制品。
实施例2：菊苣、覆盆子复合物的发酵方法，包括如下步骤：
(1)原料提取预处理：原料提取预处理：将100kg菊苣饮片、120kg覆盆子饮片粉碎打粉后过20目筛，按照配方比例分别精确称量菊苣粉、覆盆子粉混合20min，得到的菊苣复合物粉加水煎煮，先加菊苣复合物粉10倍质量水浸泡1.0小时，煎煮，煮沸后保持沸腾3小时，分离出煎液；再加菊苣复合物粉10倍质量水煎煮，煮沸后保持沸腾3小时，再次分离出煎液；合并煎液加水定容，菊苣复合物粉与定容后煎液的质量体积比为0.55g/mL，合并药渣煎液，得到菊苣复合物提取液。
(2)配料：在上述菊苣复合物提取液中加入葡萄糖6kg、酵母膏1kg、酵母粉0.6kg、蛋白胨4kg。加入营养素化合物包括硫酸亚铁·7H2O 10g、硫酸锌·7H2O36g、亚硒酸钠·5H2O 200mg、硫酸镁·7H2O 600g、硫酸锰·H2O 4g、磷酸二氢钾850g和磷酸氢二钾·3H2O850g，
定容至2000L。调整pH值至7.0,得菊苣复合物益生菌发酵中药底物。在调节pH值之前，添加甜味剂低聚果糖50kg、三氯蔗糖40g。
(3)灭菌：将所述菊苣复合物益生菌发酵底物在温度为100～115℃条件下保温20min，得到菊苣复合物灭菌液。
(4)发酵：当上述菊苣复合物灭菌液温度降至37℃时，同时接种青春双歧杆菌预培养菌液的量为菊苣复合物灭菌液的体积百分比为0.4％，鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌、清酒乳杆菌预培养菌液的总接种量为菊苣复合物灭菌液的体积百分比1.5％,鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌、清酒乳杆菌三种菌液的体积百分比相同。35℃持续发酵时间为42h后。显微镜直接计数法检测发酵菌总菌体数高于1.5×108cfu/ml、pH达到4.0时，停止发酵。95～100℃下灭菌30min，得到菊苣复合物发酵液。
(5)澄清处理：将菊苣复合物发酵液分别过120目的筛网，收集过滤液；并用滤渣质量4倍的水洗滤渣，将水洗液再过325目的筛网，收集过滤液，合并两次的过滤液，以6000rpm/min的转速离心分离后收集上清液，得到澄清的菊苣复合物发酵滤液。
(6)分装：在无菌洁净环境下将菊苣复合物发酵滤液分装为50ml的菊苣复合物发酵制品。
实施例3：菊苣、覆盆子复合物的发酵方法
(1)原料提取预处理：将100kg菊苣饮片、120kg覆盆子饮片粉碎打粉后过20目筛，按照配方比例分别精确称量菊苣粉、覆盆子粉混合20min，得到的菊苣复合物粉加水煎煮，先加菊苣复合物粉10倍质量水浸泡1.0小时，煎煮，煮沸后保持沸腾1小时，分离出煎液；再加菊苣复合物粉10倍质量水煎煮，煮沸后保持沸腾3小时，再次分离出煎液；合并煎液加水定容，菊苣复合物粉与定容后煎液的质量体积比为0.55g/mL，合并药渣煎液，得到菊苣复合物提取液。
(2)配料：在上述菊苣复合物提取液中加入葡萄糖5kg、酵母膏1.2kg、酵母粉0.5kg、蛋白胨4kg。加入营养素化合物包括硫酸亚铁·7H2O 10g、硫酸锌·7H2O 36g、亚硒酸钠·5H2O 200mg、硫酸镁·7H2O 600g、硫酸锰·H2O 4g、磷酸二氢钾850g和磷酸氢二钾·3H2O 850g，定容至2000L。调整pH值至7.0,得菊苣复合物益生菌发酵中药底物。在调节pH值之前，添加甜味剂低聚果糖30kg、三氯蔗糖70g。
(3)灭菌：将所述菊苣复合物益生菌发酵底物在温度为100～115℃条件下保温40min，得到菊苣复合物灭菌液。
(4)发酵：当上述菊苣复合物灭菌液温度降至39℃时，同时接种青春双歧杆菌、乳双歧杆菌预培养菌液的量分别为菊苣复合物灭菌液的体积百分比为0.3％，鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种乳杆菌预培养菌液的总接种量为菊苣复合物灭菌液的体积百分比2.0％,鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种乳杆菌四种菌液的体积百分比相同。37℃持续发酵时间为45h后。显微镜直接计数法检测发酵菌总菌体数高于1.5×108cfu/ml、pH达到3.5～4.1时，停止发酵。95～100℃下灭菌20min，得到菊苣复合物发酵液。
(5)澄清处理：将菊苣复合物发酵液分别过200目的筛网，收集过滤液；并用滤渣质量2.5倍的水洗滤渣，将水洗液再过200目的筛网，收集过滤液，合并两次的过滤液，以8000rpm/min的转速离心分离后收集上清液，得到澄清的菊苣复合物发酵滤液。
(6)分装：在无菌洁净环境下将菊苣复合物发酵滤液分装为50ml的菊苣复合物发酵制品。
实施例4：菊苣、覆盆子复合物的发酵方法，包括如下步骤：
(1)原料提取预处理原料提取预处理：将95kg菊苣饮片、125kg覆盆子饮片粉碎打粉后过20目筛，按照配方比例分别精确称量菊苣粉、覆盆子粉混合20min，得到的菊苣复合物粉加水煎煮，先加菊苣复合物粉10倍质量水浸泡1.0小时，煎煮，煮沸后保持沸腾1小时，分离出煎液；再加菊苣复合物粉10倍质量水煎煮，煮沸后保持沸腾3小时，再次分离出煎液；合并煎液加水定容，菊苣复合物粉与定容后煎液的质量体积比为0.55g/mL，合并药渣煎液，得到菊苣复合物提取液。
(2)配料：在上述菊苣复合物提取液中加入葡萄糖5.5kg、酵母膏1kg、酵母粉0.5kg、蛋白胨3.5kg。加入营养素化合物包括硫酸亚铁·7H2O 10g、硫酸锌·7H2O 36g、亚硒酸钠·5H2O 200mg、硫酸镁·7H2O 600g、硫酸锰·H2O 4g、磷酸二氢钾850g和磷酸氢二钾·3H2O 850g，定容至2000L，调整pH值至7.0,得菊苣益生菌发酵中药底物。在调节pH值之前，添加甜味剂低聚果糖90kg、三氯蔗糖40g。
(3)灭菌：将所述菊苣复合物益生菌发酵底物在温度为100～115℃条件下保温40min，得到菊苣复合物灭菌液。
(4)发酵：当上述菊苣复合物灭菌液温度降至39℃时，同时接种青春双歧杆菌、乳双歧杆菌预培养菌液的量分别为菊苣复合物灭菌液的体积百分比为0.3％，鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和罗伊氏乳杆菌预培养菌液的总接种量为菊苣复合物灭菌液的体积百分比1.2％,鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和罗伊氏乳杆菌三种菌液的体积百分比相同。35℃持续发酵时间为48h后。显微镜直接计数法检测发酵菌总菌体数高于1.5×108cfu/ml、pH达到3.5～4.1时，停止发酵。95～100℃下灭菌20min，得到菊苣复合物发酵液。
(5)澄清处理：将菊苣复合物发酵液分别过120目的筛网，收集过滤液；并用滤渣质量3倍的水洗滤渣，将水洗液再过230目的筛网，收集过滤液，合并两次的过滤液，以6000rpm/min的转速离心分离后收集上清液，得到澄清的菊苣复合物发酵滤液。
(6)分装：在无菌洁净环境下将菊苣复合物发酵滤液分装为100ml的菊苣复合物发酵制品。
实验例1：对大鼠肾功能损伤保护作用评价
本试验选取6-8周龄的雄性SD大鼠(辽宁长生生物技术股份有限公司)70只，适应性培养一周，以正常饲料(辽宁长生生物技术股份有限公司)喂养。随机选取10只作为正常对照，其余60只大鼠构造为肾损伤(慢性肾衰竭CRF)模型。CRF模型组60只大鼠按照体重随机分组，分为：实施例1菊苣复合物益生菌发酵制品低剂量组5倍8.3ml·kg-1，中剂量组10倍16.7ml·kg-1，高剂量组15倍25ml·kg-1，阳性对照组海昆肾喜胶囊(长龙生化药业股份有限公司)300mg·kg-1，均以生理盐水溶解、稀释口服灌胃四周，模型对照组每天以生理盐水灌胃。
试验结果：
1.血浆指标
1.1血浆CRE(血浆肌酐)含量
模型对照组的CRE含量与正常组比较显著的升高，而实验各组的CRE与模型对照组比较则显著性的降低；并且菊苣复合物益生菌发酵制品中剂量和高剂量实验组，对血浆CRE的改善水平优于阳性药物组(海昆肾喜胶囊组)。结果如图1所示。(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001)1.2血浆BUN(血浆尿素氮)含量
模型对照组与正常对照组比较，显著性的升高，而实验各组的BUN的含量，与模型对照组比较，显著降低；菊苣复合物益生菌发酵制品药物组与阳性药物组没有显著差异。说明实验药物组和阳性药物组均有效降低了CRF模型大鼠的血浆BUN含量，结果如图2所示。(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001)
1.3血浆中UA(血浆尿酸含量)的含量
模型对照组与正常对照组比较，显著性的升高，而实验各组的BUN的含量，与模型对照组比较，显著降低；菊苣复合物益生菌发酵制品药物组与阳性药物组没有显著差异。说明实验药物组和阳性药物组均有效降低了CRF模型大鼠的血浆BUN含量。结果如图3所示，(*P<0.05；**P<0.01)
2.大鼠肾脏变化
模型对照组与正常对照组比较，肾体比显著提高；各个实验组大鼠的肾体比，与模型对照组比较显著性降低，并且菊苣复合物益生菌发酵制品实验药物组和阳性药物组之间，没有显著差异；说明实验对照组相比对于大鼠的肾体比来说有近乎相同的效果。结果如图4所示，(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001)
实验结论：
肾损伤(慢性肾衰竭CRF)SD模型评价表明，菊苣复合物益生菌发酵制品具有肾损伤保护作用。
实验例2：对大鼠肝功能损伤保护作用评价
本试验将SD大鼠分为6组:空白对照组、模型对照组、联苯双酯阳性对照组(0.2g·kg-1)、实施例1菊苣复合物益生菌发酵制品低剂量组5倍8.3ml·kg-1，中剂量组10倍16.7ml·kg-1，高剂量组15倍25ml·kg-1，连续灌胃大鼠30d，正常对照组及CCl4肝损伤模型组灌胃给予蒸馏水。测定检测血清中ALT，AST活性及肝组织中SOD，MDA水平。
试验结果：
1.对CCl4肝损伤大鼠血清转氨酶的影响
与正常组比较，模型组大鼠血清中ALT、AST活性显著升高(P<0.01)，提示化学性肝损伤造模成功。与模型组比较，菊苣复合物益生菌发酵制品各剂量组治疗后大鼠血清中ALT、AST活性显著降低。其中，高、中剂量组的效果与阳性对照组相当，说明菊苣复合物益生菌发酵制品对化学性肝损伤具有明显的保护作用。如表1所示：
表1：大鼠肝脏功能比较
与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01
2.对CCl4肝损伤大鼠肝组织SOD、MDA的含量的影响
与正常组比较，模型组大鼠肝组织中SOD显著下降，MDA的含量显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，菊苣复合物益生菌发酵制品动物肝脏组织中SOD的水平显著升高，而MDA的水平则明显下降，并表现出明显的剂量依赖关系。其中，菊苣复合物益生菌发酵制品高剂量组大鼠肝组织匀浆中SOD、MDA的含量与阳性组相近，说明菊苣复合物益生菌发酵制品对于化学性肝损伤的脂质过氧化损伤具有明显的保护作用，如表2所示。
表2：组大鼠肝脏MDA、SOD比较
与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01,***P＜0.05实验结论：
本实验研究结果表明，菊苣复合物益生菌发酵制品能显著改善化学性肝损伤大鼠的肝细胞功能，明显降低肝组织MDA的含量、提高SOD的活力。其中菊苣复合物益生菌发酵制品对于肝损伤具有显著的降酶保肝的效应。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。
Claims (10)
1.一种菊苣、覆盆子复合物的发酵方法，其特征在于：
步骤1)：按重量份数计，将30-60份菊苣粉末和40～70份覆盆子粉末混合，混合后采用两次煎煮得到提取液；
步骤2)：将步骤1)得到的提取液和滤渣中加入发酵营养剂，调整pH至7.0±0.5，得到发酵底物；
步骤3)：将发酵底物蒸汽灭菌，得到菊苣复合物灭菌液；
步骤4)：将步骤3)中菊苣复合物灭菌液降温后接种双歧杆菌和乳酸杆菌预培养菌液进行发酵，发酵完成后进行稳定化灭活处理，得到菊苣复合物发酵液；
步骤5)：将菊苣复合物发酵液过筛网滤除药渣，收集过滤液。
2.根据权利要求1所述的菊苣、覆盆子复合物的发酵方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，将菊苣、覆盆子粉碎过20～40目筛；将30-60份菊苣粉末和40～70份覆盆子粉末混合10～30min，得到混合粉；
加入混合粉8～15倍质量的水浸泡1.0小时，煎煮，煮沸后保持沸腾1～3小时，分离出煎液；再加混合粉8～15倍质量的水煎煮，煮沸后保持微沸1～3小时，再次分离出煎液；合并煎液加水定容，混合粉与定容后煎液的质量体积比0.55g/mL。
3.根据权利要求1所述的菊苣、覆盆子复合物的发酵方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述发酵营养剂中各组分加入量为：葡萄糖5～15g/L、酵母膏1～5g/L、酵母粉0.5～2g/L、蛋白胨3～15g/L，营养素加入量为铁3～10mg/L、锌15～30mg/L、硒0.03～0.2mg/L、镁120～200mg/L、锰2～10mg/L、钾0.8～1.6g/L。
4.根据权利要求3所述的菊苣、覆盆子复合物的发酵方法，其特征在于：
所述步骤(2)中调整pH之前加入甜味剂，所述甜味剂为低聚果糖和/或三氯蔗糖；添加量为低聚果糖10～100g/L、三氯蔗糖0.01～0.1g/L。
5.根据权利要求3所述的菊苣、覆盆子复合物的发酵方法，其特征在于：
所述步骤(3)中，将所述发酵底物在温度为100～115℃条件下保温30～60min，得到菊苣灭菌液。
6.根据权利要求1所述的菊苣、覆盆子复合物的发酵方法，其特征在于：
所述步骤(4)中双歧杆菌选自乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)或青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)一种或两种；
所述乳酸杆菌包括鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)和干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)；
以及植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)、清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)中的至少一种；
所述双歧杆菌预培养菌液接种量为菊苣复合物灭菌液体积百分比为0.2％～1.0％；所述乳杆菌预培养菌液接种量为菊苣复合物灭菌液体积百分比为0.2％～4％；
所述双歧杆菌预培养菌液与乳杆菌预培养菌液体积比为1：2～4；双歧杆菌预培养菌液和乳酸杆菌预培养菌液的活菌数为2×107CFU·mL-1。
7.根据权利要求1或6所述的菊苣、覆盆子复合物的发酵方法，其特征在于：其特征在于：所述步骤(4)中的发酵温度为25～40℃，保持双歧杆菌和乳酸杆菌的总菌体数不低于1.5×108cfu/ml，发酵时间为25～50h，当pH达到3.5～4.1时，停止发酵；然后95～100℃下灭菌10～40min，得到菊苣复合物发酵液。
8.根据权利要求1所述的菊苣、覆盆子复合物的发酵方法，其特征在于：
所述步骤(5)中将菊苣复合物发酵液过筛网滤除药渣后收集滤液，并水洗滤渣；将水洗液再次过筛网，收集滤液，将两次的滤液合并，离心分离后收集上清液，得到澄清的菊苣复合物发酵滤液，灌装得到成品。
9.根据权利要求8所述的菊苣、覆盆子复合物的发酵方法，其特征在于：
所述步骤(5)中菊苣复合物发酵液和水洗液依次过100～200目和200～400目筛网。
10.根据权利要求8所述的菊苣、覆盆子复合物的发酵方法，其特征在于：所述离心分离时的转速为6000-10000rpm/min。
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