CN115993410A - 一种基于脂质代谢产物构建的癫痫发作预测模型及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于脂质代谢产物构建的癫痫发作预测模型，风险系数=‑0.729－0.005×LV8＋0.068×LV11，其中LV8为PC(16:0/19:5)经LC‑MS检测分析得到的质谱图归一化的峰面积，LV11为PS(39:2)经LC‑MS检测分析得到的质谱图归一化的峰面积，风险系数为0到1之间的数值，风险系数＝1为完全发病，风险系数＝0为不发病，风险系数越大，发病系数越高，参数LV8和LV11为相应的脂质峰信号强度进行总峰面积归一化处理后的数值。本发明并通过构建逻辑回归模型，得到根据这些脂质代谢产物预测癫痫发作的模型，该预测模型快捷，方便，准确度高达98.1%。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及基于脂质代谢产物构建的癫痫发作预测模型及其应用。
背景技术
癫痫(epilepsy)俗称“羊癫疯”或“羊角风”，是一种由神经元异常放电引起的第二大中枢神经系统疾病，通常表现为反复多次的癫痫发作，具体临床症状包括发呆愣神、口吐白沫、浑身抽搐，严重时可导致患者死亡，具有突发性、自发性和短暂性等特点。该病严重影响人民的生活质量。
反复的癫痫发作是癫痫患者的主要临床特征。现有的临床干预措施包括药物治疗、神经刺激治疗、手术治疗和饮食疗法等均为通过控制癫痫发作发挥治疗效应。因此，针对癫痫发作来确定生物标志物具有重要的价值。而目前对于癫痫发作的预测方法尚不成熟，而且费时费力，亟需寻找一些简便、有效的预测癫痫发作的生物标志物。
癫痫发作过程中往往伴有多种分子信号的激活及产物的变化。脂质代谢产物含量的变化是癫痫发作的重要特征。通常来说，脂质包括胆固醇、脂肪酸和甘油三酯等成分，是构成神经细胞的主要组分。近期多项研究证据表明与脂质代谢异常密切相关的新型细胞死亡类型(铁死亡)在癫痫发作中发挥着重要的作用。然而，迄今为止，尚未开发基于脂质代谢产物预测癫痫发作的数学模型。鉴于脂质代谢产物可以很方便地在血中检测，开发该模型可以通过验血快速方便地预测癫痫发作，具有重要的临床应用价值。
脂质组学作为一门新兴技术，能够大规模分析疾病中脂质含量的变化和生物学功能，现已广泛地应用于生物医学等多个领域。脂质组学可以通过液相色谱-质谱联用(LipidChromatography-Mass Spectrometer，LC-MS)技术将多种脂质分离和鉴定出来，并进一步研究脂质的生物学特性。
经检索，CN201780014371.7公开了用于检测癫痫发作和癫痫的生物标志物和方法，其包括以下步骤：使获得自哺乳动物受试者的血浆或血清样品与能够测量或检测可溶性ICAM-5(sICAM-5)的表达水平的诊断试剂接触；使所述获得自哺乳动物受试者的血浆或血清样品与能够测量或检测TARC的表达水平的诊断试剂接触；使所述获得自哺乳动物受试者的血浆或血清样品与能够测量或检测TNF-α的表达水平的诊断试剂接触；比较sICAM5、TARC和TNF-α的浓度与正常对照浓度；和诊断哺乳动物受试者中的癫痫。此方法与本申请的思路不同。
另外，我们还查到一些使用计算机算法或者影像资料进行癫痫预测的方法，都与本申请的研发思路不同。本发明旨在从脂质组学入手，提供一种基于脂质代谢产物构建的快捷、方便的癫痫发作的预测模型和应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明基于脂质组学提供了脂质代谢产物构建的癫痫发作预测模型及其应用，要求所建立的预测模型快捷，方便，准确度高。
本发明的技术方案是：
一种基于脂质代谢产物构建的癫痫发作预测模型，风险系数＝-0.729－0.005×LV8+0.068×LV11，其中LV8为PC(16:0/19:5)经LC-MS检测分析得到的质谱图归一化的峰面积，LV11为PS(39:2)经LC-MS检测分析得到的质谱图归一化的峰面积，风险系数为0到1之间的数值，风险系数＝1为完全发病，风险系数＝0为不发病，风险系数越大，发病系数越高，参数LV8和LV11为相应的脂质峰信号强度进行总峰面积归一化处理后的数值。PC(16:0/19:5)代表该磷脂酰胆碱分子包含2条脂肪酸链，分别为：16个碳数的饱和脂肪酸和19个碳数、5个不饱和双键的多不饱和脂肪酸。PC(16:0/19:5)为脂质代谢领域广泛认可的标准描述。
PS(39:2)代表该磷脂酰丝氨酸分子包含39个碳数和2个不饱和键的脂肪酸。PS(39:2)为脂质代谢领域广泛认可的标准描述。本专利申请实施例中涉及的其他脂质代谢产物的描述请参照此解释。
优选的，所述预测模型的建立方法，包括以下步骤：
(1)LC-MS检测分析正常人群和癫痫人群的多种脂质代谢产物；
(2)筛选出正常人群和癫痫人群的差异脂质代谢产物，得到16种差异脂质代谢产物，筛选差异脂质代谢产物的标准是：(a)OPLS-DA模型中变量权重值(Variableimportance of projection，简称为VIP)>1；(b)Splot图中横坐标covariance p的绝对值大于0.1并且纵坐标correlationp(cor)的绝对值大于0.5；
(3)建立多元线性回归分析预测模型，具体预测模型为：风险系数＝-0.729－0.005×LV8+0.068×LV11，其中LV8为PC(16:0/19:5)经LC-MS检测分析得到的质谱图归一化的峰面积，LV11为PS(39:2)经LC-MS检测分析得到的质谱图归一化的峰面积，风险系数为0到1之间的数值，风险系数＝1为完全发病，风险系数＝0为不发病，风险系数越大，发病系数越高，参数M8和M11为相应的脂质峰信号强度进行总峰面积归一化处理后的数值。
优选的，通过LC/MS检测分析正常人群与癫痫人群的多种脂质代谢产物的分析条件如下：
(1)色谱条件如下：
流动相A：乙腈:水＝5:5-6:4(v/v，含10mM-15mM甲酸铵，0.1％甲酸)；
流动相B：异丙醇:乙腈＝8:2-9:1(v/v，含10mM-15mM甲酸铵，0.1％甲酸)；
洗脱梯度：0-3min 25-30％B，3-5min 30％-62％B，5-15min 62％-82％B，15-16.5min82％-99％B，18-18.1min 99％-30％B，流速：0.3-0.4mL/min；进样量：4-5μL，此处百分比为B相占A+B相的体积比例；
(2)质谱条件如下：
正离子：加热器温度280-320℃，鞘气流速40-50arb，辅助气流速13-15arb，吹扫气流速0.8-1arb，喷雾电压3.0-3.5KV，毛细管温度310-320℃,S-Lens RF Level 45-50％；MS1扫描范围:120-1800；负离子：加热器温度270-310℃，鞘气流速40-50arb，辅助气流速13-15arb，吹扫气流速0.8-1arb，喷雾电压3.0-3.5KV，毛细管温度310-320℃,S-Lens RFLevel 45-50％；MS1扫描范围：120-1800。
实施例中较优的LC-MS检测分析的条件为：
(1)色谱条件如下：
流动相A：乙腈:水＝6:4(v/v，含10mM甲酸铵，0.1％甲酸)；
流动相B：异丙醇:乙腈＝9:1(v/v，含10mM甲酸铵，0.1％甲酸)；
洗脱梯度：0-3min 30％B，3-5min 30％-62％B，5-15min 62％-82％B，15-16.5min82％-99％B，18-18.1min 99％-30％B，流速：0.35mL/min；进样量：5μL，此处百分比为B相占A+B相的体积比例；
(2)质谱条件如下：
正离子：加热器温度300℃，鞘气流速45arb，辅助气流速15arb，吹扫气流速1arb，喷雾电压3.5KV，毛细管温度320℃,S-Lens RF Level 50％；MS1扫描范围:120-1800；负离子：加热器温度300℃，鞘气流速45arb，辅助气流速15arb，吹扫气流速1arb，喷雾电压3.1KV，毛细管温度320℃,S-Lens RF Level 50％；MS1扫描范围：120-1800。
本发明还提供了所述预测模型作为预测癫痫发作的生物标记物或者检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了用于预测癫痫发作的生物标记物，选自以下两种脂质代谢产物中的一种或几种，所述两种化合物分别为：PC(16:0/19:5)、PS(39:2)。
本发明还提供了检测一个或多个脂质代谢产物的试剂在制备用于预测癫痫发作试剂或者试剂盒中的应用，所述一个或多个脂质代谢产物选自PC(16:0/19:5)、PS(39:2)中的一种或几种。
与现有技术相比，本发明的优势是：
本发明提供了与癫痫发作相关的脂质代谢产物，并通过构建逻辑回归模型，得到根据这些脂质代谢产物预测癫痫发作的模型，该预测模型简单，使用方便，准确度高达98.1％。
本预测模型中，脂质代谢产物PC(16:0/19:5)和PS(39:2)与癫痫发作相关指标有显著相关性。PC(16:0/19:5)与脑电图棘波数目(相关系数R＝-0.7,p＝0.015)和脑电发作强度(相关系数R＝-0.78，p＝0.0041)有显著负相关性；PS(39:2)与脑电图棘波数目(相关系数R＝0.85,p＝0.00097)和脑电发作强度(相关系数R＝0.92，p<2.2×10-16)有显著正相关性(图7)。因此，脂质代谢产物PC(16:0/19:5)、PS(39:2)以及本发明的预测模型可以用于预测癫痫发作的试剂或者试剂盒中。
以下结合附图和具体实施方式对本发明的详细结构作进一步描述。
附图说明
图1为癫痫发作小鼠模型制作的评价结果图，适合评估癫痫发作组和正常对照组两组之间的癫痫发作差异。
图2为脂质组学质控图，适合于分析癫痫发作组和正常对照组两组之间的差异脂质代谢产物，其中图2A为PLS-DA模型图，图2B为OPLS-DA模型图。
图3为脂质代谢产物分类和变化图，其中图3A为纳入分析的552种脂质代谢产物分类图；图3B为纳入分析的552种脂质代谢产物分类及其FoldChange的变化图；图3C图为有差异的56种脂质代谢产物分类及其FoldChange的变化图。
图4为56个差异脂质代谢产物聚类热图。
图5为S-PLOT图和最终16种脂质代谢产物的基本信息图，其中图5A为S-PLOT图，图5B为基于筛选条件得到最终16种脂质代谢产物的基本信息图。
图6为200次置换检验结果图。
图7为最终确定的2种差异脂质代谢产物与癫痫发作评估指标(癫痫样棘波和发作强度)的相关性的结果图，其中图7A为PC(16:0/19:5)与癫痫样棘波数目的相关性图；图7B为PC(16:0/19:5)与癫痫发作强度的相关性图；图7C为PS(39:2)与癫痫样棘波数目的相关性；图7D为PS(39:2)与癫痫发作强度的相关性图。其中，癫痫发作强度为每天的发作强度，单位为μV2×103；癫痫样棘波数目为每10分钟的棘波数目；相关系数R为计算的Spearman回归系数。
具体实施方式
实施例1
动物模型：选取8周龄C57小鼠(湖南斯莱克景达公司提供)。
分组实验：癫痫发作组和正常对照组各6只，其中癫痫发作组给予海马内立体定位注射海人酸，对照组给予海马内立体定位注射磷酸缓冲盐。
癫痫发作评分：各组小鼠在手术完成苏醒后，记录90分钟内的癫痫发作等级。参照Racine评分标准评估癫痫发作等级。Racine评分具体细则为：0级，无反应；1级，耳朵和面部抽搐；2级，全身轴向痉挛性抽搐；3级，肌阵痉挛和教养；4级，侧翻，狂跑，狂跳；5级，全身性强直阵挛发作；6级，死亡。若观察到3级及以上的癫痫发作，则认为癫痫发作模型构建成功。根据Racine评分绘制90分钟内的发作折线图(图1A)，癫痫发作次数绘制柱状图(图1B)。实验结果表明，癫痫发作组从10分钟起具有显著性差异(P＜0.05)，且癫痫发作组中的每只动物均具有3级及以上的癫痫发作，证明癫痫发作模型构建成功，适合用于后续研究。
脂质组学检测：实验步骤如下：取30mg脑组织，加入内标(LysoPC-17:0,0.1mg/mL，甲醇配置)20μL及300μL甲醇-水(V:V＝1:1)。然后加入两个钢珠，在-20℃放置2min预冷，随后放入研磨机(60Hz)研磨2min。随后加入300μL氯仿，涡旋30s，超声提取10min，-20℃静置20min。4℃离心10min(转速为12000rpm)，取200μL下层溶液(氯仿层)装入新的离心管中。在取完下层溶液的离心管中继续加入300μL氯仿-甲醇＝2:1(V/V)(含0.1mM BHT)，漩涡震荡30s，冰水浴中超声提取10min。-20℃静置20min后，4℃离心10min(转速为12000rpm)，取200μL下层溶液(氯仿层)跟之前的200μL合并，共计400μL。取200μL装入LC-MS进样小瓶中挥干，LC-MS进样小瓶中的脂质残渣用300μL异丙醇-甲醇＝1:1(V/V)复溶(涡旋30s，超声3min)，将溶液转移至1.5mL的离心管中，-20℃静置2h。4℃离心10min(转速为12000rpm)，取150μL上清液装入带内衬管的LC-MS进样小瓶中，用于LC-MS分析。色谱和质谱条件下文有详细说明。
差异脂质代谢产物分析：
差异脂质代谢产物筛选的原则：差异脂质代谢产物筛选的原则：(1)OPLS-DA模型中变量权重值以VIP>1为准；(2)Splot图中横坐标covariance p的绝对值大于0.1并且纵坐标correlationp(cor)的绝对值大于0.5。
利用SPSS 22.0中的逐步多元线性回归分析进一步筛选关键脂质代谢产物，并拟合癫痫发作预测模型。结果共筛选到了6个重要的脂质代谢产物，表1展示了它们在拟合过程中的covariance p和correlation p值。基于以下条件评价各个模型的拟合优度：(1)方差膨胀系数(variance inflation factor，简称为VIF)小于10，它是衡量多元线性回归模型中共线性严重程度的一种度量；(2)显著性p值小于0.05。
模型评估；
利用200次置换检验(Permutation Test)评估模型的可信度。置换检验是一种用来评价模型准确性的随机排序方法，用来避免监督性学习方法获得分类不是偶然的，我们给出了对模型5的响应排序检验结果。对模型5进行了200次响应排序检验，即固定X变量矩阵(LV8和LV11)，将分类Y变量(风险系数)进行随机排列200次，建立对应的模型以获取随机模型的R2和Q2值。通过考察所有样品对应R2、Q2值所组成的拟合直线在Y坐标轴的截距，表示模型的可靠性和过拟合程度。通常Q2截距值应明显小于模型变量预测度，并小于0.05。如图6所示，Y轴截距Q2Y－intercept＝-0.47，小于0.05，提示模型可信度较高。
本发明建模方法的详细步骤(实施例中所有百分含量均为体积百分含量)：
步骤1，LC-MS检测技术获得数据，原始数据的提取、对齐与归一化；对两组组织样本，分为癫痫发作组6个样本和正常对照组6个样本。样本经过LC-MS检测获得数据文件。色谱条件如下：Nexera UPLC仪器，色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3(100mm×2.1mm,1.8μm)；流动相A：乙腈:水＝6:4(v/v，含10mM甲酸铵，0.1％甲酸)；：流动相B：异丙醇:乙腈＝9:1(v/v，含10mM甲酸铵，0.1％甲酸)；洗脱梯度：0-3min 30％B，3-5min 30％-62％B，5-15min 62％-82％B，15-16.5min 82％-99％B，18-18.1min 99％-30％B，流速：0.35mL/min；进样量：5μL。此处百分比为B相占A+B相的体积比例。
质谱条件如下：加热电喷雾电离(HESI)正离子和负离子模式进行检测，经NexeraUPLC(Shimadzu,Kyoto,Japan)分离后采用Q Exactive(Thermo ScientificTM)进行质谱分析。正离子：加热器温度300℃，鞘气流速45arb，辅助气流速15arb，吹扫气流速1arb，喷雾电压3.5KV，毛细管温度320℃,S-Lens RF Level 50％。MS1扫描范围:120-1800；负离子：加热器温度300℃，鞘气流速45arb，辅助气流速15arb，吹扫气流速1arb，喷雾电压3.1KV，毛细管温度320℃,S-Lens RF Level 50％。MS1扫描范围：120-1800。
在进行统计分析前，对所有峰信号强度(峰面积)进行总峰面积归一化处理，即用每个峰信号强度转化成在该谱图中的相对强度。数据被归一化以后，乘以10000。对提取到的数据，删除缺失值(0值)>50％的离子峰，并将0值以最小值的一半替换。面积归一化处理方法为现有方法。
步骤2，PLS-DA模型和OPLS-DA模型建立；
偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)是一种有监督的判别统计方法，该方法运用偏最小二乘回归建立代谢物表达量与样本分组之间的关系模型，来实现对样品类别的预测。PLS-DA加入分组变量，可弥补PCA方法的不足，参数R2X(cum)能对模型有效性进行评判。PLS-DA除参数R2X(cum)之外，还包括解释率R2Y(cum)和预测率Q2(cum)，两者越接近1，说明PLS-DA模型能更好地解释和预测两组样本之间的差异，代表模型预测能力越好。我们建立的PLS-DA模型中，质量参数为R2X＝0.591，R2Y＝0.997，Q2＝0.942，其中R2Y和Q2接近1，说明模型预测能力好。如图2A所示，PLS-DA模型完成了良好的分组，癫痫发作组数据与正常对照组组数据区分明显，该模型适合于癫痫发作组和正常对照组之间的差异性脂质代谢产物区分。
正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)是PLS-DA的一种衍生运算分析方法。OPLS-DA是有监督的判别分析统计方法。该方法在PLS-DA的基础上进行修正，滤除与分类信息无关的噪音，提高模型的解析能力和有效性，最大化地凸显模型内部不同组别之间的差异。我们建立了OPLS-DA模型，该模型质量参数为R2X＝0.591，R2Y＝0.997，Q2＝0.859。其中，R2Y与Q2的值越接近，表示模型的预测能力越好(一般认为小于0.2为优)。我们建立的模型中R2Y-Q2小于0.2，说明模型质量好。如图2B所示，OPLS-DA模型完成了良好的分组，癫痫发作组数据与正常对照组组数据区分明显，该模型适合于癫痫发作组和正常对照组之间的差异性脂质代谢产物区分。
步骤3，差异脂质代谢产物分析；
共检测到556种脂质代谢产物，全部脂质代谢产物分类及其FoldChange表达差异见图3A和图3B。为进一步筛选差异脂质代谢产物，采用多维分析和单维分析相结合的办法，来筛选组间差异脂质代谢产物。OPLS-DA分析中，VIP可用来衡量各脂质代谢产物的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，挖掘具有生物意义的差异脂质代谢产物，进一步利用t检验验证组间差异代谢物是否具有显著性。筛选的标准为OPLS-DA模型第一主成分的VIP值>1，T检验的p值<0.05。差异脂质代谢产物的分类及其FoldChange表达差异见图3C。
纳入下一步分析的脂质代谢产物共计56种，分别是：
甘油二酯(18:0/20:4)；磷酸神经酰胺(d18:1/30:3)；磷脂酰肌醇(18:0/18:1)；磷脂酰肌醇(18:0/20:4)；磷脂酰丝氨酸(18:1/18:1)；磷脂酰丝氨酸(22:4/22:6)；磷脂酰丝氨酸(37:1)；磷脂酰丝氨酸(39:2)；磷脂酰丝氨酸(40:7)；磷脂酰丝氨酸(41:4)；磷脂酰乙醇(42:6)；磷脂酰乙醇胺(16:1/18:1)；磷脂酰乙醇胺(18:1/18:1)；磷脂酰乙醇胺(18:1/18:2)；磷脂酰乙醇胺(18:1/20:4)；磷脂酰乙醇胺(18:1/22:6)；磷脂酰乙醇胺(18:1p/20:1)；磷脂酰乙醇胺(18:2/22:6)；磷脂酰乙醇胺(36:0e)；磷脂酰乙醇胺(39:4e)；磷脂酰乙醇胺(43:3e)；卵磷脂(16:0/19:5)；卵磷脂(30:0)；卵磷脂(32:0)；卵磷脂(34:2)；卵磷脂(34:3)；卵磷脂(36:3)；卵磷脂(37:7)；卵磷脂(38:5)；卵磷脂(38:6)；卵磷脂(38:6p)；卵磷脂(40:1)；卵磷脂(40:2)；卵磷脂(40:5e)；卵磷脂(40:8)；葡萄糖神经酰胺(d17:0/24:1)；葡萄糖神经酰胺(d42:1)；葡萄糖神经酰胺(d42:2+O)；鞘氨醇(d18:0)；鞘磷脂(d18:1/22:0)；鞘磷脂(d18:1/23:0)；鞘磷脂(d18:1/24:0)；鞘磷脂(d18:1/24:1)；鞘磷脂(d34:1)；鞘磷脂(d36:2)；鞘磷脂(d38:1)；溶血磷脂酰胆碱(17:0)；溶血磷脂酰胆碱(18:0)；溶血磷脂酰胆碱(18:1)；溶血磷脂酰乙醇胺(18:0)；溶血磷脂酰乙醇胺(22:6)；神经酰胺(d18:0/18:0)；神经酰胺(d18:1/18:0)；神经酰胺(d20:1/18:0)；心磷脂(21:0/22:6/18:0/18:0)；脂肪酸(22:6)；
英文简称为：PC(34:2)；PC(32:0)；PS(37:1)；PE(18:1/20:4)；PE(16:1/18:1)；PC(36:3)；PC(16:0/19:5)；PI(18:0/20:4)；PS(39:2)；PC(38:5)；PEt(42:6)；PE(18:1p/20:1)；PE(18:1/18:2)；PE(43:3e)；PE(36:0e)；PC(30:0)；PC(40:1)；PE(18:1/18:1)；PS(41:4)；PE(18:2/22:6)；PC(40:5e)；PE(18:1/22:6)；PC(38:6)；PE(39:4e)；CL(21:0/22:6/18:0/18:0)；LPE(22:6)；PS(40:7)；PC(34:3)；PI(18:0/18:1)；LPC(17:0)；LPE(18:0)；PC(38:6p)；LPC(18:0)；PS(18:1/18:1)；PS(22:4/22:6)；LPC(18:1)；PC(40:2)；PC(37:7)；PC(40:8)；So(d18:0)；SM(d18:1/24:1)；CerG1(d42:2+O)；Cer(d18:1/18:0)；SM(d36:2)；SM(d18:1/22:0)；SM(d18:1/24:0)；CerP(d18:1/30:3)；CerG1(d42:1)；Cer(d18:0/18:0)；CerG1(d17:0/24:1)；SM(d38:1)；Cer(d20:1/18:0)；SM(d34:1)；SM(d18:1/23:0)；FA(22:6)；DG(18:0/20:4)。图4展示了差异脂质代谢物在癫痫发作组和正常对照组中的相对含量。
其中，字母所代表的含义如下：
CL，cardiolipin，心磷脂或双磷脂酰甘油
PC，phosphatidylcholine，磷脂酰胆碱或卵磷脂
PE，phosphatidylethanolamine，磷脂酰乙醇胺
PEt，phosphatidylethanol,磷脂酰乙醇
PI，phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇
PS，phosphatidylserine，磷脂酰丝氨酸
LPC，lysophosphatidylcholine，溶血磷脂酰胆碱
LPE，Lysophosphatidyl ethanolamine，溶血磷脂酰乙醇胺
DG，diacylglycerol，甘油二酯
Cer，ceramide，神经酰胺
CerP，ceramide phosphate，磷酸神经酰胺
CerG1，glucosylceramide，葡萄糖神经酰胺
SM，sphingomyelin，鞘磷脂
So，sphingosine，鞘氨醇
FA，fatty acyl，脂肪酰基类
为进一步筛选预测癫痫发作的脂质代谢产物，对56个差异脂质代谢产物进行筛选：(1)OPLS-DA模型中变量权重值以VIP>1为准；(2)Splot图中横坐标covariance p的绝对值大于0.1并且纵坐标correlation p(cor)的绝对值大于0.5；然后利用逐步多元回归分析获得基于脂质组学筛选的差异脂质代谢产物并拟合预测模型。OPLS-DA的S-plot图，横坐标表示主成分与脂质代谢产物的协方差，纵坐标表示主成分与脂质代谢产物的相关系数。由于特征值与相关性同正同负，因此可视化的图中所有的点全部分布在第一和第三象限，类似于S形，被称为Splot。越靠近右上角和左下角的脂质代谢产物表示其差异越显著。本研究中共筛选得到16种差异脂质代谢产物：L1(PC(34:2))，L2(PC(30:0))，L3(So(d18:0))，L4(PC(37:7))，L5(PE(18:1/20:4))，L6(PE(16:1/18:1))，L7(PC(36:3))，L8(PC(16:0/19:5))，L9(PI(18:0/20:4))，L10(SM(d18:1/24:0))，L11(PS(39:2))，L12(PC(38:5))，L13(FA(22:6))，L14(PEt(42:6))，L15(PE(18:1p/20:1))，L16(DG(18:0/20:4))，具体见图5B。
利用SPSS 22.0中的逐步多元线性回归分析进一步筛选关键脂质代谢产物，并拟合癫痫发作预测模型。结果共筛选到了6个重要的脂质代谢产物，表1展示了它们在拟合过程中的covariance p和correlation p值。基于以下条件评价各个模型的拟合优度：(1)VIF值小于10；(2)显著性p值小于0.05。模型5中全部参数均有显著性差异且VIF值均小于10，证明模型5中的2个脂质代谢产物具有最佳预测能力，并且根据拟合的预测模型，癫痫发作预测的准确度高达98.1％(见表2)。
表1筛选的6个差异脂质代谢产物的covariance p和correlation p值
表2基于筛选的6种差异脂质代谢产物拟合的癫痫发作预测模型结果
模型1：风险系数＝-0.013×LV5－0.004×LV8－0.004×LV9+0.011×LV10+0.054×LV11+0.008×LV12；
模型2：风险系数＝-0.005×LV8+0.062×LV11(注：变量L9、L10、L12在多重线性模型中无差异，略去)；
模型3：风险系数＝-0.005×LV8+0.063×LV11(注：变量L9、L10在多重线性模型中无差异，略去)；
模型4：风险系数＝-0.005×LV8+0.064×LV11(注：变量L9在多重线性模型中无差异，略去)；
模型5：风险系数＝-0.729－0.005×LV8+0.068×LV11；
LV1代表PC(34:2)的归一化峰面积(与变量L1对应)，LV2代表PC(30:0)的归一化峰面积(与变量L2对应)，LV3代表So(d18:0)的归一化峰面积(与变量L3对应)，LV4代表PC(37:7)的归一化峰面积(与变量L4对应)，LV5代表PE(18:1/20:4)的归一化峰面积(与变量L5对应)，LV6代表PE(16:1/18:1)的归一化峰面积(与变量L6对应)，LV7代表PC(36:3)的归一化峰面积(与变量L7对应)，LV8代表PC(16:0/19:5)的归一化峰面积(与变量L8对应)，LV9代表PI(18:0/20:4)的归一化峰面积(与变量L9对应)，LV10代表SM(d18:1/24:0)的归一化峰面积(与变量L10对应)，LV11代表PS(39:2)的归一化峰面积(与变量L11对应)，LV12代表PC(38:5)的归一化峰面积(与变量L12对应)，LV13代表FA(22:6)的归一化峰面积(与变量L13对应)，LV14代表PEt(42:6)的归一化峰面积(与变量L14对应)，LV15代表PE(18:1p/20:1)的归一化峰面积(与变量L15对应)，LV16代表DG(18:0/20:4)的归一化峰面积(与变量L16对应)。
步骤4，模型评估；
为防止模型过拟合，利用200次置换检验(Permutation Test)评估模型的可信度。置换检验是一种用来评价模型准确性的随机排序方法，用来避免监督性学习方法获得分类不是偶然的，我们给出了对模型5的响应排序检验结果。对模型5进行了200次响应排序检验，即固定X变量矩阵(LV8和LV11)，将分类Y变量(风险系数)进行随机排列200次，建立对应的模型以获取随机模型的R2和Q2值。通过考察所有样品对应R2、Q2值所组成的拟合直线在Y坐标轴的截距，表示模型的可靠性和过拟合程度。通常Q2截距值应明显小于模型变量预测度，并小于0.05。如图6所示，Y轴截距Q2Y－intercept＝-0.47，小于0.05，提示模型可信度较高。
为了验证2个关键的差异脂质代谢产物与癫痫发作的关系，使用Spearman回归系数评估脂质代谢产物含量与癫痫样棘波数目和癫痫发作强度的关系。PC(16:0/19:5)与癫痫样棘波数目(相关系数R＝-0.7,p＝0.015)和癫痫发作强度(相关系数R＝-0.78,p＝0.0041)有显著负相关性；PS(39:2)与癫痫样棘波数目(相关系数R＝0.85,p＝0.00097)和癫痫发作强度(相关系数R＝0.92，p<2.2×10-16)有显著正相关性(图7)。
以上所述为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围不局限于此，任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种基于脂质代谢产物构建的癫痫发作预测模型，风险系数=-0.729－0.005×LV8＋0.068×LV11，其中LV8为PC(16:0/19:5)经LC-MS检测分析得到的质谱图归一化的峰面积，LV11为PS(39:2)经LC-MS检测分析得到的质谱图归一化的峰面积，风险系数为0到1之间的数值，风险系数＝1为完全发病，风险系数＝0为不发病，风险系数越大，发病系数越高，参数LV8和LV11为相应的脂质峰信号强度进行总峰面积归一化处理后的数值。
2.根据权利要求1所述基于脂质代谢产物构建的癫痫发作预测模型，其特征是，所述LC-MS检测分析的条件为：
(1)色谱条件如下：
流动相A：乙腈:水=5:5-6:4，v/v，含10mM-15mM甲酸铵，0.1%甲酸；
流动相B：异丙醇:乙腈=8:2-9:1，v/v，含10mM-15mM甲酸铵，0.1%甲酸；
洗脱梯度：0-3min 25-30%B，3-5min 30%-62%B，5-15min 62%-82%B，15-16.5min 82%-99%B，18-18.1min 99%-30%B，流速：0.3-0.4mL/min；进样量：4-5μL，此处百分比为B相占A+B相的体积比例；
(2)质谱条件如下：
正离子：加热器温度280-320°C，鞘气流速40-50arb，辅助气流速13-15arb，吹扫气流速0.8-1arb，喷雾电压3.0-3.5KV，毛细管温度310-320°C, S-Lens RF Level 45-50%；MS1扫描范围：120-1800；负离子：加热器温度270-310°C，鞘气流速40-50arb，辅助气流速13-15arb，吹扫气流速0.8-1arb，喷雾电压3.0-3.5KV，毛细管温度310-320°C, S-Lens RFLevel 45-50%；MS1扫描范围：120-1800。
3.根据权利要求2所述基于脂质代谢产物构建的癫痫发作预测模型，其特征是，所述LC-MS检测分析的条件为：
(1)色谱条件如下：
流动相A：乙腈:水=6:4，v/v，含10mM甲酸铵，0.1%甲酸；
流动相B：异丙醇:乙腈=9:1，v/v，含10mM甲酸铵，0.1%甲酸；
洗脱梯度：0-3min 30%B，3-5min 30%-62%B，5-15min 62%-82%B，15-16.5min 82%-99%B，18-18.1min 99%-30%B，流速：0.35mL/min；进样量：5μL，此处百分比为B相占A+B相的体积比例；
(2)质谱条件如下：
正离子：加热器温度300°C，鞘气流速45arb，辅助气流速15arb，吹扫气流速1arb，喷雾电压3.5KV，毛细管温度320°C, S-Lens RF Level 50%；MS1扫描范围：120-1800；负离子：加热器温度300°C，鞘气流速45arb，辅助气流速15arb，吹扫气流速1arb，喷雾电压3.1KV，毛细管温度320°C，S-Lens RF Level 50%；MS1扫描范围：120-1800。
4.权利要求1-3任意一项所述预测模型作为预测癫痫发作的生物标记物或者检测试剂盒中的应用。
5.PC(16:0/19:5)和/或PS(39:2)作为基于脂质代谢产物预测癫痫发作生物标记物的应用。
6.PC(16:0/19:5)和/或PS(39:2)的检测试剂在制备用于预测癫痫发作的试剂或者检测试剂盒中的应用。
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| CN202211474793.1A CN115993410A (zh) | 2022-11-23 | 2022-11-23 | 一种基于脂质代谢产物构建的癫痫发作预测模型及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
| US20090305323A1 (en) * | 2005-10-24 | 2009-12-10 | Kaddurah-Daouk Rima F | Lipidomics approaches for central nervous system disorders |
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