KR20140043782A

KR20140043782A - 알츠하이머병의 증가된 위험도를 진단하는 방법

Info

Publication number: KR20140043782A
Application number: KR1020147000722A
Authority: KR
Inventors: 마테이 오레식; 힐카 소이니넨; 투리아 하이오틸라이넨
Original assignee: 테크놀로지안 투트키무스케스쿠스 브이티티; 유니버시티 오브 이스턴 핀란드
Priority date: 2011-06-10
Filing date: 2012-06-08
Publication date: 2014-04-10
Also published as: EP2718729A1; US20140165700A1; FI20115576A0; WO2012168561A1; JP2014521928A

Abstract

본 발명은 대사산물의 농도를 측정하고 이를 건강한 피검체의 개별적인 평균 농도와 비교함에 의해 알츠하이머병으로 진행될 피검체의 증가된 위험도를 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 경도 인지 장애를 지닌 피검체가 갖는 알츠하이머병으로 진행될 증가된 위험도는 침습성 기법 없이 진단될 수 있다.

Description

알츠하이머병의 증가된 위험도를 진단하는 방법{METHOD OF DIAGNOSING ON INCREASED RISK OF ALZHEIMER'S DISEASE}

본 발명은 알츠하이머병으로 진행될 피검체의 증가된 위험도를 조기에 진단하는 방법에 관한 것이다.

알츠하이머병 (AD)은 이러한 질환에 걸린 환자가 수 백만명이고 집단의 연령이 증가함에 따라 해마다 진단되는 새로운 환자의 수가 증가하고 있어 선진국의 보건 시스템 및 경제에 있어 커지고 있는 문제이다. 경도 인지 장애 (MCI)는 정상적 노화 및 AD 사이의 전이 상으로서 고려된다. MCI를 지닌 피검체는 주로 기억 기능에서의 인지 손상을 나타내고, 아직 일상 생활의 활동을 유지하고 있으며, AD 또는 임의의 다른 치매 질병의 기준을 충족하지 않는다. MCI는, 비록 상태가 심지어 다시 정상 인지로의 개선을 포함하는 여러 가능한 결과를 지니며 이질적일지라도, AD 발생의 증가된 위험도를 부여한다. 따라서, 최근 연구는 안정성 MCI (S-MCI)로부터 AD (진행성 MCI, P-MCI)가 발생할 MCI 피검체 및 건강한 노령 대조군 피검체를 구별짓는 특징을 확인하기 위한 바이오마커를 수득하는데 집중되어 왔다.

공개 WO 2003/050528호는 뇌 조직 또는 뇌척수액에서 설파티드 수준의 감소가 알츠하이머병의 존재와 확실히 관련된다고 설명한다. 그러나, 관념적으로, AD 바이오마커는 (1) 질환-관련 생물학적 프로세스를 반영할 것이고 (2) 혈액 검사와 같이 비침습적으로 측정될 수 있다. 근원적인 발병 요인에 민감한 분자 마커는 질환 조기 검출 및 진단을 돕는 것뿐 아니라, 후속하여 질환 모니터 및 치료 반응을 촉진하는데 높은 관련성을 지닐 것이다. AD를 예측하는 잠재적인 마커를 확인하고자 하는 두 독립적인 혈장 프로테오믹 연구에서 유망하지만 겹치지 않는 결과가 수득되었다. 대사체학(metabolomic)은 세포, 조직, 및 바이오유체에서 소형 분자 (즉, 대사산물)의 전반적인 연구를 전공으로 하는 학문이다. 대사산물 중 특수한 그룹의 농도 변화는 유전변이, 식이, 면역계 상태 또는 장내 미생물과 같은 병원성 관련 인자에 민감할 수 있으므로, 이들의 연구는 유전적 및 환경적 인자 둘 모두의 영향을 받는 복잡한 표현형을 특성화하기 위한 강력한 도구가 될 수 있다. 지난 수년간, 다수의 상이한 대사산물을 포괄적 그리고 정량적으로 조사할 수 있게 하는 기법이 개발되어 왔다.

대사산물 중에서, 지질은, 단백질을 처리하는 모든 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)이 막횡단 단백질이기 때문에 가장 관심을 받았다. 지질은 세포막의 주요 구성요소이고, 이들의 조성은 막 유동성, 토폴로지, 막결합 단백질의 이동성 또는 활성을 유지하고, 정상적인 세포 생리학을 확보하는데 중요하다. 구조적 및 기능적으로 다양한 지질의 전반적인 프로파일을 포함하는 질환-관련 "지질체(lipidome)"의 연구는 수 백개의 분자 지질을 동시에 프로파일링하는 연구를 정밀하고도 민감하게 수행할 기회를 제공한다. 소위 지질체학적(lipidomic) 접근은 질환-관련 마커에 관한 정보를 제공할 뿐 아니라, 추가로 세포 지질 항상성의 제어를 지지하는 메커니즘에 관한 실마리를 제공할 수 있다.

그러나, 알츠하이머병으로 진행될 피검체의 위험도를 조기 진단하는 문제가 여전히 남아 있다. 바람직하게는, 상기 진단은 비침습적이고, 사용하기 쉬우며, 비용 효율적이어야 한다. 본 발명은 이러한 요구를 충족한다.

본 발명의 목적 및 개요

본 발명의 목적은 알츠하이머병으로 진행될 증가된 위험도를 갖는 피검체를 조기 진단하는데 이용하기 쉬운 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 건강한 피검체로부터 알츠하이머병의 매우 초기 단계에 있는 환자를 용이하고 침습성 단계 없이 확인하는 방법을 제공한다. 초기 단계 알츠하이머병을 갖는 피검체에서 수득된 값에 비해 정상인 피검체에서 수득된 값들간에 사실상 어떠한 중첩도 나타나지 않는다.

본 발명의 양태는 알츠하이머병이 진행될 피검체의 증가된 위험도를 진단하는 방법이다. 본 발명에 따르면, 상기 방법은 상기 피검체로부터 샘플을 수득하고 하나 이상의 대사산물의 농도를 측정하는 단계를 포함하는데, 이 때 농도의 변화는 AD로 진행될 증가된 위험도를 나타낸다. 특히, 본 발명은 제 1항의 특징부에 정의된 단계를 지닌다.

도면의 간단한 설명

도 1은 본 출원의 실험 부분에 기재된 실험 및 분석의 워크플로를 도시한다.

도 2. MCI로 진단된 기준선에 있는 피검체의 3가지 대사산물 (2,4-디하이드록시부탄산, 카르복실산, PC(16:0/16:0))의 농도에 기반한 AD 예측의 실현가능성. (A) 샘플의 1/3에서 독립적으로 시험된 모델 (AUC, OR, RR)의 특징은 2,000회 크로스 확인 진행에 기반한 평균 값 (5번째, 95번째 백분위수)으로서 도시된다. (B) 3가지 대사산물의 빈플롯(Beanplot)이 모델에 포함되었다. (C) 2가지 대사산물의 GCxGC-TOFMS 스펙트럼이 모델에 포함되었다. Acc = 분류 정확도; AUC = 수신자 조작 특성 (ROC) 곡선하 면적; OR = 승산비; RR = 상대 위험도.

도 3. β-아밀로이드1-42 (LiBAM42, 레드), 2,4-디하이드록시부탄산 (블루), 및 동시에 둘 모두의 바이오마커의 진단 성능 (그린).

바람직한 구체예의 설명

약어: AA = 아라키돈산; Acc = 분류 정확도; AD = 알츠하이머병; AUC = 수신자 조작 특성 (ROC) 곡선하 면적; CSF = 뇌척수액; DHA = 도코사헥산산; EPA = 에이코사펜탄산; ESI = 전기분무 이온화; GCxGC-TOFMS = 타임 오브 플라이트 질량 분광분석법에 커플링된 2차원 가스 크로마토그래피; 리소PC = 리소포스파티딜콜린; MCI = 경도 인지 장애; MS = 질량 분광분석법; OR = 승산비; PC = 포스파티딜콜린; RR = 상대 위험도; UPLC-MS = 질량 분광분석법에 커플링된 초고성능 액체 크로마토그래피™.

본 연구에서 본 발명자들은 잘 특성화된 전향적 연구에서 알츠하이머병으로의 진행 및 진단과 관련된 혈청 대사 프로파일을 측정하고자 하였다. 기준선 평가에서, 본 연구에 등록된 피검체는 건강한 대조군, MCI, 및 AD의 세 가지 진단 그룹으로 분류되었다. 광범한 분석적 적용범위를 갖는 2개의 플랫폼을 이용한 지질에서 친수성 대사산물로의 전반적인 대사체학 접근법을 적용하여 본 연구에 수반된 피검체로부터 기준선 혈청 샘플을 분석하고 대사산물 프로파일을 기준선 및 추가조사(follow-up)에서 진단과 연관시켰다 (도 1을 참조하라). 충분한 표현형을 지닌 집단에 기반한 본 발명자들의 발견은 특수한 대사적 이상을 알츠하이머병으로의 진행과 연관시킨다.

본 발명에 따르면, 경도 인지 장애를 지닌 피검체가 갖는 알츠하이머병으로 진행될 증가된 위험도는 침습성 기법 없이 진단될 수 있다. 예후는 쉽고도 신속하며, 이는 복잡한 장비를 필요로 하지 않는다. AD로 진행될 위험의 조기 예측은 의료 영상에 의한 것과 같은 더욱 상세한 모니터를 위해 환자의 계층화를 가능하게 하고, 질환을 치료하기 위한 더욱 효율적인 약리적 요법의 개발을 촉진시키며, 질환의 예방을 목표 삼아 조기 개입을 개시할 수 있다.

본 발명의 첫 번째 구체예는,

(a) 피검체로부터 샘플, 바람직하게는 생물학적 유체를 수득하는 단계, 및

(b) 2,4-디하이드록시부탄산, 글리콜산, 2-하이드록시부티르산, 3-하이드록시부티르산, 3-하이드록시프로피온산, 글리세레이트, 3,4-디하이드록시부티르산 및 2-옥소이소발레르산 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병으로 진행될 피검체의 증가된 위험도를 진단하는 방법으로서,

이 때 건강한 피검체의 개별적인 평균 농도에 비해 증가된 농도(들)는 AD로 진행될 증가된 위험도를 나타낸다.

상기 언급된 대사산물은 카르복실기에 추가하여, 2개 내지 5개의 탄소 원자 및 하나 이상의 하이드록실 또는 케톤(옥소)기를 함유하는 카르복실산기에 속한다. 따라서, 상기 기로부터 하나 이상의 대사산물을 선택하는 것이 바람직하다. 특히, 대사산물은 하이드록실 및 옥소기로부터 선택된 적어도 2개의 작용기를 함유하는 상기 카르복실산으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 대사산물은 상기 기재된 카르복실산기에 속하는 다음 화합물로부터 선택된다:

2,4-디하이드록시부탄산,

글리콜산,

2-하이드록시부티르산,

3-하이드록시부티르산,

3-하이드록시프로피온산,

글리세레이트,

3,4-디하이드록시부티르산,

2-옥소이소발레르산,

2,3-디하이드록시프로피온산,

2-하이드록시펜탄산,

3-하이드록시펜탄산,

4-하이드록시펜탄산,

2-하이드록시-4-옥소-펜탄산,

5-하이드록시-3-옥소-펜탄산,

2,4-디하이드록시펜탄산,

3,5-디하이드록시펜탄산,

4,5-디하이드록시펜탄산,

4-하이드록시-2-옥소-펜탄산, 및

4,5-디하이드록시-2-옥소-펜탄산.

이와 관련하여 "피검체"는 MCI를 갖는 사람을 의미하고, 여기서 MCI는 경도 인지 장애로서 정의되며 정상적 노화 및 알츠하이머병 (AD) 사이의 전이 상으로서 고려된다. MCI는, 비록 상태가 심지어 다시 정상 인지로의 개선을 포함하는 여러 가능한 결과를 지니며 이질적일지라도, AD 발생의 증가된 위험도를 부여한다.

이와 관련하여, "AD로 진행될 증가된 위험도"는 상기 위험도가 건강한 사람의 위험도보다 통계적으로 유의하게 증가된 (높은) 것을 의미한다. 특히 이는 AD가 진행되지 않는다고 진단된 그룹에서의 AD 발생의 승산에 대한, 본 발명의 방법을 이용하여, AD가 진행될 것으로 진단된 그룹에서의 AD 발생의 승산비가 (1.44, 19.02)의 90% 신뢰 구간으로 4.2임을 의미한다.

샘플은 임의의 생물학적 유체일 수 있고, 바람직하게는 상기 유체는 혈액, 혈청 또는 혈장이다.

또 다른 대안에 따르면, 생물학적 유체는 혈액, 혈청, 혈장, 또는 소변이나 뇌척수액이다.

바람직하게는, 생물학적 유체는 관심 대사산물을 평가하기 위한 적합한 대사 분획을 수득하도록 먼저 추출된다. 그러나, 대사산물 마커의 수준을 평가하는데 이용된 방법에 따라, 그러한 추출은 불필요할 수 있다. 평가에 궁극적으로 이용되는 샘플은 또한 측정을 위한 가장 편리한 최종 샘플을 수득하기 위해 분획화 절차를 밟을 수 있다. 생물학적 유체의 특히 바람직하고 편리한 기법은, 선택적인 샘플 추출 후에 요망되는 질량 분광분석법으로의 직접 주입이다.

대사산물의 농도를 측정하는 방법은 어떠한 제한 없이, 예컨대 질량 분광분석법 또는 그 밖의 분광분석 또는 전기화학 검출기와 조합된 크로마토그래피 및/또는 전기영동 방법, 또는 MS 또는 그 밖의 분광분석 또는 전기화학 검출기 단독 또는 그 밖의 생화학 또는 면역화학 방법을 포함한다. 본 발명은 본원에 기재된 특정 방법 및 구성요소 등에 제한되지 않는데, 그 이유는 이들이 다양할 수 있기 때문이다. 또한 본원에서 사용된 용어는 특정 구체예를 기술할 목적으로만 이용되고, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아님이 이해되어야 한다.

본원에서 사용된 "수준"은 피검체로부터 주어진 샘플 중 특수한 대사산물의 절대 또는 반정량 농도나 양을 의미하고 "비교"는 피검체로부터의 샘플 중 주어진 바이오마커들 중 하나 이상의 비율, 수준 또는 농도를 표준 또는 대조군 샘플 중 하나 이상의 상응하는 바이오마커의 비율, 수준 또는 농도와 어떻게 관련시킬 지의 평가를 수행하는 것을 의미한다. 예를 들어, "비교"는 피검체로부터의 샘플 중 하나 이상의 바이오마커의 비율, 수준 또는 농도가 표준 또는 대조군 샘플 중 하나 이상의 상응하는 바이오마커의 비율, 수준 또는 농도와 같은지, 더 많거나 적은지, 또는 다른지를 평가하는 것을 언급할 수 있다.

본 발명의 추가 구체예는 첫 번째 구체예와 합쳐질 수 있고 제한 없이 서로 합쳐질 수 있다. 하기 논의되는 추가 구체예의 대부분은 첫 번째 구체예에 따라 수득된 진단에 비해 한층 나은 진단을 위한 수단을 제공한다.

또 다른 구체예에서, 상기 방법은 PC(16:0/18:1), PC(16:0/20:3), PC(16:0/16:0), PC(18:0/18:1), 글리실-프롤린, 시트르산, 아미노말론산 또는 락트산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 이 때 건강한 피검체의 개개의 평균 농도(들)에 비해 증가된 농도(들)는 AD로 진행될 증가된 위험도를 나타낸다.

또 다른 구체예에서, 상기 방법은 리비톨, 페닐알라닌 또는 D-리보스 5-포스페이트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 이 때 건강한 피검체의 개개의 평균 농도(들)에 비해 감소된 농도(들)는 AD로 진행될 증가된 위험도를 나타낸다.

한 구체예에서, 알츠하이머병으로 진행될 피검체의 위험도를 진단하는 방법은,

(a) 상기 피검체의 생물학적 유체에서 2,4-디하이드록시부탄산, 글리콜산, 2-하이드록시부티르산, 3-하이드록시부티르산, 3-하이드록시프로피온산, 글리세레이트, 3,4-디하이드록시부티르산 및 2-옥소이소발레르산 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물의 수준, 및 임의로 PC(16:0/18:1), PC(16:0/20:3), PC(16:0/16:0), PC(18:0/18:1) 지질, 글리실-프롤린, 시트르산, 아미노말론산 및 락트산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물 또는 리비톨, 페닐알라닌 또는 D-리보스 5-포스페이트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도를 측정하는 단계;

(b) 정상 피검체에서의 상응하는 유체 중 2,4-디하이드록시부탄산, 글리콜산, 2-하이드록시부티르산, 3-하이드록시부티르산, 3-하이드록시프로피온산, 글리세레이트, 3,4-디하이드록시부티르산 및 2-옥소이소발레르산 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물의 수준, 및 임의로 PC(16:0/18:1), PC(16:0/20:3), PC(16:0/16:0), PC(18:0/18:1) 지질, 글리실-프롤린, 시트르산, 아미노말론산 및 락트산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물 또는 리비톨, 페닐알라닌 또는 D-리보스 5-포스페이트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도를 제공하는 단계; 및

(c) 상기 단계 (a)에서 측정된 대사산물(들)의 수준을 상기 단계 (b)에서 제공된 정상 피검체의 수준과 비교하는 단계를 포함하고,

이 때 상기 단계(c)에서의 비교 결과가 단계 (a)의 상기 피검체에서 상기 대사산물 중 하나 이상의 수준이 단계 (b)에서 제공된 정상 피검체의 수준으로부터 통계적으로 유의하게 변화되었음을 나타내는 경우, 상기 피검체는 알츠하이머병이 발생할 증가된 위험도를 갖는 피검체로서 확인된다.

AD가 진행되지 않을 것으로 진단된 경우의 AD 발생의 승산에 대한, 본 발명을 이용하여, AD가 진행될 것으로 진단된 경우의 AD 발생의 승산비는 (1.44, 19.02)의 90% 신뢰 구간으로 4.2이다.

한 구체예에서, 추가로, 샘플 추출물의 옥심화 및 실릴화 이후, 전자 충돌 이온화 (EI)를 이용한 질량 분광분석 검출기 (MS)를 이용하여 스펙트럼 단편화 패턴 [73:998 55:991 75:558 98:355 117:351 57:328 83:271 69:237 54:217 81:203 84:144 132:143 56:133 51:128 129:126 173:121 100:118 67:109 71:105 95:103 113:79 109:74 45:70 105:66 131:59 60:59 49:59 111:58 47:57 61:56 145:53 65:51 146:49 112:49 82:47 64:47 91:46 130:43 118:41 53:41 78:40 85:39 143:38 313:37 107:37 102:36 171:33 97:32 133:31 103:31 68:31 104:30 70:29 135:28 162:25 119:25 187:24 149:24 147:24 74:24 142:23 242:22 269:21 123:21 121:21 87:21 190:20 160:20 66:20 670:19 165:19 144:18 240:17 655:16 581:16 328:16 311:16 172:16 62:16 680:15 309:15 267:15 199:15 185:15 127:15 122:15 108:15 77:15]을 지니고 5% 페닐 메틸 실리콘 모세관 컬럼을 이용한 가스 크로마토그래피 분리(GC)에서 측정된 2742 +/- 30의 보존 지수(retention index)를 지니는 대사산물의 농도를 측정한다.

또 다른 구체예에서, 상기 방법은,

- 샘플 추출물의 옥심화 및 실릴화 이후, 전자 충돌 이온화 (EI)를 이용한 질량 분광분석 검출기 (MS)를 이용하여 스펙트럼 단편화 패턴 [73:999, 45:278, 216:152, 57:126, 74:82, 335:82, 75:79, 320:61, 91:28, 174:21, 105:17, 59:14, 115:7, 55:5, 77:2]을 지니고 5% 페닐 메틸 실리콘 모세관 컬럼을 이용한 가스 크로마토그래피 분리(GC)에서 측정된 2040 +/- 30의 보존 지수를 지니는 대사산물

- 샘플 추출물의 옥심화 및 실릴화 이후, 전자 충돌 이온화 (EI)를 이용한 질량 분광분석 검출기 (MS)를 이용하여 스펙트럼 단편화 패턴 [75:996, 73:927, 117:664, 55:455, 129:347, 132:205, 45:197, 67:180, 69:140, 57:137, 81:124, 145:124, 74:99, 47:97, 131:97, 61:76, 83:69, 56:68, 95:66, 76:63, 79:60, 54:57, 96:52, 77:45, 313:45, 118:43, 82:40, 68:39, 84:36, 97:35, 98:31, 53:28, 93:24, 80:22, 109:19, 133:19, 91:7, 72:6, 116:5, 59:4, 110:4, 94:2]을 지니고 5% 페닐 메틸 실리콘 모세관 컬럼을 이용한 가스 크로마토그래피 분리(GC)에서 측정된 2769.5 +/- 30의 보존 지수를 지니는 대사산물

- 샘플 추출물의 옥심화 및 실릴화 이후, 전자 충돌 이온화 (EI)를 이용한 질량 분광분석 검출기 (MS)를 이용하여 스펙트럼 단편화 패턴 [73:948, 174:852, 86:611, 59:409, 45:299, 100:277, 170:171, 175:143, 69:119, 80:77, 53:75, 74:74, 97:67, 176:54, 68:52, 130:50, 58:48, 89:34, 54:30, 55:30, 87:29, 57:26, 126:26, 75:22, 129:20, 139:20, 78:15, 70:13, 60:11, 81:11, 102:11, 56:10, 127:8, 67:7, 83:7, 140:7, 85:6, 171:4, 77:3, 79:3, 91:3, 101:3, 158:3, 46:2, 47:2, 51:2, 72:2, 82:2, 117:2, 50:1, 61:1, 66:1, 84:1, 98:1, 99:1, 112:1, 131:1]을 지니고 5% 페닐 메틸 실리콘 모세관 컬럼을 이용한 가스 크로마토그래피 분리(GC)에서 측정된 1520.1 +/- 30의 보존 지수를 지니는 대사산물 중 하나 이상의 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함하며,

이 때 건강한 피검체의 개개의 평균 농도(들)에 비해 감소된 농도(들)는 AD로 진행될 증가된 위험도를 나타낸다.

한 구체예에서, 측정되는 대사산물의 농도에서의 상대적 변화를 비교한다. 한 구체예에서, 2,4-디하이드록시부탄산, 글리콜산, 2-하이드록시부티르산, 3-하이드록시부티르산, 3-하이드록시프로피온산, 글리세레이트, 3,4-디하이드록시부티르산 및 2-옥소이소발레르산 및 이들의 유도체 중 하나 이상의 수준에 대한 약 10%, 바람직하게는 30% 또는 심지어 그 초과의 상대적 증가, 바람직하게는 2,4-디하이드록시부탄산의 증가는 알츠하이머병으로 진행될 증가될 위험도를 나타낸다.

또 다른 구체예에서,

- PC(16:0/18:1), PC(16:0/20:3), PC(16:0/16:0), PC(18:0/18:1), 글리실-프롤린, 시트르산, 아미노말론산 또는 락트산 중 하나 이상의 수준의 약 5%, 바람직하게는 10% 또는 이를 초과하는 추가의 상대적 증가; 및 임의로

- 본 출원에 기재된 미확인 카르복실산에 대한 수준의 약 10%, 바람직하게는 약 20% 또는 심지어 이를 초과하는 추가의 상대적 증가는 알츠하이머병으로 진행될 증가된 위험도를 나타낸다.

이와 관련하여, "증가된 상대적 농도"는 샘플에 첨가된 내부 표준의 검출기 풍부도에 관한 주어진 대사산물의 절대 검출기 풍부도로서 정의되는, 대사산물의 상대적 반응이 건강한 피검체의 평균 반응에 대해 개별적으로 환자에서 증가됨을 의미한다.

또 다른 구체예에서, 절대 농도에서의 증가는 증가된 위험도를 나타낸다. 디하이드록시부탄산에 대한 절대치 (정상 수준)는 대략 2 내지 7 ㎛ol/L의 범위이고 PC (16:0/16:0)의 경우 대략 2 내지 10 ㎛ol/L이다. "증가된 절대 농도"는 PC (16:0/16:0)의 경우 정상 수준이 대략적으로 평균 4 내지 6 ㎛ol/L (2-10 ㎛ol/L)인 주어진 대사산물의 농도가 2.5 내지 10 ㎛ol/L의 평균 수준으로 20% 증가됨을 의미한다.

본 발명의 한 구체예에서, 2,4-디하이드록시부탄산, 글리콜산, 2-하이드록시부티르산, 3-하이드록시부티르산, 3-하이드록시프로피온산, 글리세르산, 3,4-디하이드록시부티르산 및 2-옥소이소발레르산 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물 및 PC(16:0/18:1), PC(16:0/20:3), PC(16:0/16:0), PC(18:0/18:1) 지질, 글리실-프롤린, 시트르산, 아미노말론산 또는 락트산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도는 증가된다. 둘 모두의 그룹으로부터의 하나 이상의 대사산물의 증가된 농도 (건강한 피검체의 평균 반응에 대해 개별적으로 환자에서)는 증가된 위험도의 강력한 지표이다.

또한 추가 구체예에서, GC-EI/MS를 이용한 유도체화된 대사산물의 스펙트럼 단편화 패턴: [73:998 55:991 75:558 98:355 117:351 57:328 83:271 69:237 54:217 81:203 84:144 132:143 56:133 51:128 129:126 173:121 100:118 67:109 71:105 95:103 113:79 109:74 45:70 105:66 131:59 60:59 49:59 111:58 47:57 61:56 145:53 65:51 146:49 112:49 82:47 64:47 91:46 130:43 118:41 53:41 78:40 85:39 143:38 313:37 107:37 102:36 171:33 97:32 133:31 103:31 68:31 104:30 70:29 135:28 162:25 119:25 187:24 149:24 147:24 74:24 142:23 242:22 269:21 123:21 121:21 87:21 190:20 160:20 66:20 670:19 165:19 144:18 240:17 655:16 581:16 328:16 311:16 172:16 62:16 680:15 309:15 267:15 199:15 185:15 127:15 122:15 108:15 77:15]을 지니고 5% 페닐 메틸 실리콘 모세관 컬럼을 이용한 가스 크로마토그래피 분리에서 측정된 2742 +/- 30의 보존 지수를 지니는 대사산물의 농도가 증가한다. 여러 지시적 대사산물의 증가는 예후의 정밀도를 향상시킨다.

추가 구체예에서,

- GC-EI/MS를 이용한 유도체화된 대사산물의 스펙트럼 단편화 패턴 [73:999, 45:278, 216:152, 57:126, 74:82, 335:82, 75:79, 320:61, 91:28, 174:21, 105:17, 59:14, 115:7, 55:5, 77:2]을 지니고 5% 페닐 메틸 실리콘 모세관 컬럼을 이용한 가스 크로마토그래피 분리에서 측정된 2040 +/- 30의 보존 지수를 지니는 대사산물,

- GC-EI/MS를 이용한 유도체화된 대사산물의 스펙트럼 단편화 패턴 [75:996, 73:927, 117:664, 55:455, 129:347, 132:205, 45:197, 67:180, 69:140, 57:137, 81:124, 145:124, 74:99, 47:97, 131:97, 61:76, 83:69, 56:68, 95:66, 76:63, 79:60, 54:57, 96:52, 77:45, 313:45, 118:43, 82:40, 68:39, 84:36, 97:35, 98:31, 53:28, 93:24, 80:22, 109:19, 133:19, 91:7, 72:6, 116:5, 59:4, 110:4, 94:2]을 지니고 5% 페닐 메틸 실리콘 모세관 컬럼을 이용한 가스 크로마토그래피 분리에서 측정된 2769.5 +/- 30의 보존 지수를 지니는 대사산물,

- GC-EI/MS를 이용한 유도체화된 대사산물의 스펙트럼 단편화 패턴 [73:948, 174:852, 86:611, 59:409, 45:299, 100:277, 170:171, 175:143, 69:119, 80:77, 53:75, 74:74, 97:67, 176:54, 68:52, 130:50, 58:48, 89:34, 54:30, 55:30, 87:29, 57:26, 126:26, 75:22, 129:20, 139:20, 78:15, 70:13, 60:11, 81:11, 102:11, 56:10, 127:8, 67:7, 83:7, 140:7, 85:6, 171:4, 77:3, 79:3, 91:3, 101:3, 158:3, 46:2, 47:2, 51:2, 72:2, 82:2, 117:2, 50:1, 61:1, 66:1, 84:1, 98:1, 99:1, 112:1, 131:1]을 지니고 5% 페닐 메틸 실리콘 모세관 컬럼을 이용한 가스 크로마토그래피 분리(GC)에서 측정된 1520.1 +/- 30의 보존 지수를 지니는 대사산물 중 하나 이상의 농도를 측정하고, 감소는 알츠하이머병으로 진행될 증가된 위험도를 나타낸다.

한 구체예에서, 2,4-디하이드록시부탄산의 농도를 측정한다. 2,4-디하이드록시부탄산의 증가는 알츠하이머병으로 진행될 증가된 위험도와 강한 상관관계를 나타낸다.

한 구체예에서, 포스파티딜콜린 (16:0/16:0)의 농도를 측정한다. 증가된 2,4-디하이드록시부탄산과 관련된 포스파티딜콜린 (16:0/16:0)의 증가는 알츠하이머병의 예후를 추가로 개선시킨다.

추가 구체예에서, 시트르산, 페닐알라닌 및/또는 글리실-프롤린의 농도를 측정하고, 이러한 농도의 증가는 AD로 진행될 증가된 위험도의 추가 지표이다.

본 발명의 한 구체예에서, 기준 수준에 비해 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%만큼 증가된 2,4-디하이드록시부탄산, 글리콜산, 2-하이드록시부티르산, 3-하이드록시부티르산, 3-하이드록시프로피온산, 글리세레이트, 3,4-디하이드록시부티르산 및 2-옥소이소발레르산 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 대사산물의 농도는 알츠하이머병으로 진행될 증가된 위험도를 나타낸다.

본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 설명된다. 그러나, 상기 설명 및 실시예에 제공된 구체예는 단지 예시를 목적으로 하며, 다양한 변경 및 변형이 본 발명의 범위 내에서 가능함이 이해되어야 한다.

실시예

하기 실시예는 본원에 기재되고 청구된 바이오마커, 조성물, 장치 및/또는 방법이 어떻게 수행되고 평가되는 지에 대한 완전한 기재 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시된 것이며, 단순히 예시하고자 하는 것이지 본 발명자들이 그들의 발명으로 하고자 하는 바의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 수 (예컨대, 양, 온도 등)에 관한 정확성을 확보하려는 노력을 하였으나 일부 오차 및 편차가 본원에서 설명되어야 한다. 구성요소 농도, 요망되는 용매, 용매 혼합물, 온도, 압력 및 이용될 수 있는 그 밖의 반응 범위 및 조건과 같은 방법적 조건의 여러 변형 및 조합이 존재한다.

참가자

MCI의 임상적 AD 치매로의 전환에 대한 예측인자에 중점을 두어, PredictAD 프로젝트 (http://www.predictad.eu/) 내에서, MCI로 진단된 143명의 피검체를 Kuopio 대학에서 수집된 종단적 연구 데이터베이스로부터 풀링시키고, 이들의 결과를 46명의 건강한 대조군 피검체 및 37명의 AD 환자의 결과와 비교하였다 (Hanninen et al., 2002, Kivipelto et al., 2001, Pennanen et al., 2004). 연구 그룹의 설명적 및 임상적 데이터를 표 1에 제공한다.

표 1. 기준선에 있는 연구 집단의 설명적 통계치

^a카이 스퀘어 승산비 4.0 (CI 2.0-8.3)으로 대조군에 대비하여 ε4 대립유전자에 대해 P<0.001 및 승산비 2.2 (1.3-3.7)로 안정성 MCI에 대비하여 P<0.01.

^b카이 스퀘어 승산비 3.5 (1.6-7.6)로 대조군에 대비하여 ε4 대립유전자에 대해 P=0.001 및 승산비 1.9 (1.1-3.5)로 안정성 MCI에 대비하여 P=0.02.

*대조군, 안정성 MCI 및 진행성 MCI에 대비하여 P<0.01

**대조군에 대비하여 P=0.03

*** 대조군에 대비하여 P<0.001 및 안정성 MCI에 대비하여 P=0.03

****대조군, 안정성 MCI 및 진행성 MCI에 대비하여 P<0.001

이러한 연구에 포함된 건강한 대조군 피검체는 인구 기반 코호트로부터의 지원자였고 대조군 피검체의 확인을 위해 이용된 방법은 사전 연구에 기재되어 있다 (Hanninen et al., 2002, Kivipelto et al., 2001). 이들은 신경계 또는 정신의학 질환의 이력이 없었고 상세한 신경심리학적 평가에서 어떠한 장애도 보이지 않았다.

MCI는 Mayo Clinic Alzheimer's Research Center가 본래 제안한 기준을 이용하여 진단되었다 (Petersen et al., 1995, Smith et al., 1996). 이러한 기준은 이후 변형되었으나, 본 연구 인원을 모집했던 당시에, 요구되는 MCI 기준은 다음과 같았다: (1) 환자, 가족, 또는 의사에 의한 기억력 저하; (2) 일상 생활의 정상적인 활동; (3) 정상적인 전반적 인지 기능; (4) 연령-적정 평균보다 낮은 >1.5 S.D. 점수에 의해 명백한 바와 같이 기억 또는 인지 기능의 한 다른 영역에서의 객관적 손상; (5) 0.5의 임상적 치매 척도 (CDR) 점수; 및 (6) 치매의 부재. 피검체를 다소 상이한 신경심리학적 시험 배터리를 이용한 상이한 연구 데이터베이스로부터 풀링시켰기 때문에, 모든 MCI 피검체로 수행된 두 스케일은 이들의 인지 상태, MMSE 및 임상적 치매 척도의 박스 합계 (CDR-SB)를 나타내도록 선택되었다. 비록 MCI를 진단하는데 사용된 신경심리학적 시험 배터리가 다소 다양하지만, 모든 MCI 피검체는 모집 당시에 기억상실 증후군의 아형을 지니는 것으로 고려되었다.

AD의 진단은 의학적 이력의 평가, 의사에 의해 수행된 검진 및 신경학적 검사, 및 상세한 신경심리학적 평가를 포함한다. 인지능 저하의 중증도는 CDR 스케일 (Berg, 1988)에 따라 등급을 매겼다. 뇌 MRI 스캔, 뇌척수액 (CSF) 분석, 심전도 검사 (EKG), 흉부 방사선촬영, 고혈압 및 우울증에 대한 스크리닝 및 혈액 검사도 수행하여 증상의 기초가 되는 다른 가능한 병리학을 배제시켰다. 치매의 진단은 문헌[Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition (DSM-IV) (American Psychiatric Association, 1994)]의 기준에 기반하였고 AD의 진단은 문헌[National Institute of Neurologic and Communicative Disorders and Stroke and Alzheimer's Disease and Related Disorders Association (NINCDS-ADRDA) criteria (McKhann et al., 1984)]에 기반하였다. 여러 백질 변성 또는 다른 이상을 갖는 피검체를 배제하기 위해 모든 MR 이미지는 또한 숙련된 신경방사선전문의에 의해 판독되었다. 뇌졸중 또는 일과성 허혈 발작의 이력을 갖는 연구 피검체 및 이에 따라 광범한 융합성 백질 변성을 갖는 피검체가 배제되었다.

추가조사를 진행하는 동안 AD가 발생된 MCI 피검체를 진행성 MCI (P-MCI) 피검체 (n=52)로서 간주하였고 상태가 안정하게 유지되거나 개선된 피검체 (즉, 이후 대조군으로서 진단된 피검체)를 안정성 MCI (S-MCI) (n = 91)를 갖는 것으로 고려하였다. P-MCI 피검체에 대한 추가조사 시간 (27 ± 18개월, 표 1)은 기준선 날짜에 시작하도록 설정되었고 AD 진단시에 완료되는 것으로 간주되었다. S-MCI 피검체의 경우에, 추가조사 시간 (28 ± 16개월, 표 1)은 기준선 날짜로부터 이용가능한 마지막 평가 날짜까지의 시간으로서 계산되었다. 모든 피검체에 대해 MR 이미지를 Kuopio 대학 병원의 임상 방사선과에서 1.5 T MRI 스캔으로 획득하였다 (Julkunen et al., 2009). 연구 피검체의 APOE 유전형을 표준 프로토콜을 이용하여 측정하였다 (Tsukamoto et al., 1993). 연구 그룹내 APOE 대립유전자 분포를 표 1에 제공한다.

모든 피검체로부터 헬싱키의 선언서에 따른 사전 서면 동의를 받았고 연구는 Kuopio 대학 병원의 윤리 위원회에 의해 승인되었다.

실험 및 분석의 워크플로를 도 1에 도시한다.

실시예 1. UPLC - MS 을 이용한 지질체학적 분석

혈청 샘플 (10 ㎕)을 에펜도르프 튜브에서 10 ㎕의 0.9% 소듐 클로라이드와 혼합시키고, 10개 지질 (0.2 ㎍/샘플; PC(17:0/0:0), PC(17:0/17:0), PE(17:0/17:0), PG(17:0/17:0), Cer(d18:1/17:0), PS(17:0/17:0), PA(17:0/17:0), MG(17:0/0:0/0:0), DG(17:0/17:0/0:0), TG(17:0/17:0/17:0))로 구성된 표준 혼합물로 스파이킹하고, 100 ㎕의 클로로포름/메탄올 (2:1)로 추출하였다. 볼텍싱 (2분) 및 정치 (1 h)시킨 후 튜브를 10 000 rpm에서 3분 동안 원심분리시키고, 60 ㎕의 하부 유기상을 분리시키고, 3개의 표지된 지질 (0.1 ㎍/샘플; LPC(16:1/0:0-D₃), PC(16:1/16:1-D₆), TG(16:0/16:0/16:0-¹³C3))을 함유하는 표준 혼합물로 스파이킹하였다.

지질 추출물을 Acquity 초고성능 LC™와 조합된 Waters Q-Tof Premier 질량 분광분석기 (UPLC; Waters, Milford, MA) 상에서 무작위 순서로 분석하였다. 컬럼 (50℃에서)은 1.7 ㎛ 입자를 지닌 Acquity UPLC™ BEH C18 1 × 50 mm였다. 용매 시스템은 1) 초순수 (1% 1M NH₄Ac, 0.1% HCOOH) 및 2) LC-MS 등급 아세토니트릴/이소프로판올 (5:2, 1% 1M NH₄Ac, 0.1% HCOOH)을 포함하였다. 구배는 65% A/35% B에서 출발하여, 6분 후에 100% B에 도달하고, 다음 7분 동안 거기에 유지되었다. 다음 진행 이전에 5분의 재평형화 단계가 있었다. 유속은 0.200 ml/분이었고 주입량은 1.0 ㎕였다 (Acquity Sample Organizer; Waters, Milford, MA). 락(lock) 분무 참조 화합물로서 레세르핀(Reserpine)을 이용하였다. ESI+ 모드를 이용하여 지질 프로파일링을 수행하고 데이터를 0.2초의 스캔 지속기간으로 m/z 300-1200의 질량 범위에서 수집하였다. 데이터를 MZmine 2 소프트웨어 (Pluskal et al., 2010)를 이용하여 프로세싱하였고 지질 확인은 내부 스펙트럼 라이브러리에 기반하였다.

질량 분광분석법에 커플링된 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC-MS)에 기반한 전반적인 지질체학 방법은 인지질, 스핑고지질, 및 중성 지질과 같은 분자 지질을 포괄한다 (Nygren et al., 2011). 분석은 음성 이온화 모드 (ESI-)에서 수행되므로, 주로 극성 인지질을 포함한다; 모든 샘플에 걸쳐 플랫폼-특이적 방법을 이용하여 계산된 대사산물 피크 (확인 또는 미확인) 및 그 농도의 목록으로 구성된 최종 데이터세트. 미확인된 것을 포함하는 모든 대사산물 피크가 데이터 분석에 포함되었다. 본 발명자들은 플랫폼으로부터 확인된 완전한 데이터의 포함이 전체적인 대사체를 가장 잘 나타내고, 미확인 피크는, 만약 흥미롭다고 고려되는 경우 추가 실험을 이용하여 새로이 확인함에 의해 나중에 여전히 추가조사될 수 있다고 판단하였다.

분석적 플랫폼을 이용하여, 총 139개의 분자 지질을 측정하였다. 그 후 데이터를 군집 분석을 위해 추가로 전환시켰다.

실시예 2. GCxGC - TOFMS 를 이용한 대사체학적 분석

각각의 혈청 샘플 (30 ㎕)을 내부 표준 (20 ㎕의 표지된 팔미트산, c=258 mg/L)으로 스파이킹한 후, 혼합물을 400 ㎕의 메탄올로 추출하였다. 원심분리 후에, 상청액을 증발 건조시킨 다음, 원래 대사산물을 2단계 유도체화에 의해 이의 메톡심 (MEOX) 및 트리메틸실릴 (TMS) 유도체(들)로 전환시켰다. 먼저, 25 ㎕의 MOX 시약을 잔류물에 첨가하고 혼합물을 60분 동안 45℃에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 25 ㎕의 MSTFA를 첨가하고, 혼합물을 60분 동안 45℃에서 인큐베이션시켰다. 마지막으로, 헥산 중 보존 지수 표준 혼합물 (n-알칸)을 상기 혼합물에 첨가하였다.

분석을 위해, 극저온 변조기가 장착된 Leco Pegasus 4D GC×GC-TOFMS 기계 (Leco Corp., St. Joseph, MI)를 이용하였다. 기계의 GC 부분은 분할/비분할 주입기가 구비된 Agilent 6890 가스 크로마토그래피였다 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). 첫 번째-디멘션 크로마토그래피 컬럼은 내부 직경이 0.18 mm이고 고정상 필름 두께가 0.20 ㎛인 10 m RTX-5 모세관 컬럼이었고, 두 번째-디멘션 크로마토그래피 컬럼은 내부 직경이 100 ㎛이고 필름 두께가 0.1 ㎛인 1.5 m BPX-50 모세관 컬럼이었다. DPTMS 비활성화 유지 간격 (3 m x 0.53 mm i.d.)을 첫 번째 컬럼의 앞에 이용하였다. 고순도 헬륨을 정압 모드 (39.6 psig)에서 캐리어 가스로서 이용하였다. 두 번째 디멘션에서 5 s 분리 시간을 이용하였다. MS 스펙트럼을 100 스펙트럼/sec로 45-700 amu에서 측정하였다. 260℃에서의 분할 주입 (1 ㎕, 분할률 1:20)을 이용하였다. 온도 프로그램은 다음과 같았다: 첫 번째-디멘션 컬럼 오븐 램프는 50℃에서 시작하여 1분 동안 유지된 후, 온도는 295℃까지 10℃/분의 속도로 프로그래밍된 후 이 온도에서 3분 동안 유지되었다. 두 번째-디멘션 컬럼 온도는 상응하는 첫 번째-디멘션 컬럼보다 20℃ 높게 유지되었다. 프로그래밍 속도 및 유지 시간은 두 컬럼에 대해 동일하였다.

타임 오브 플라이트 질량 분광분석법에 커플링된 포괄적인 2차원 가스 크로마토그래피 (GCxGC-TOFMS)에 기반한 소형 극성 대사산물에 대한 이러한 플랫폼은 아미노산, 유리 지방산, 케토산, 다양한 그 밖의 유기산, 스테롤, 및 당과 같은 소분자를 포괄한다 (Castillo et al., 2011). 대략 544개의 소형 극성 대사산물이 샘플에서 검출되었다. 그 후 데이터를 군집 분석을 위해 추가로 전환시켰다.

실시예 3. 군집 분석

대사산물 사이의 고도의 공동-조절로 인해 (Steuer et al., 2003), 측정된 모든 대사산물이 독립적이라고 가정할 수 없다. 따라서 전체적인 대사체는 먼저 데이터를 Bayesian 모델-기반 군집화 (Fraley and Raftery, 2007)를 이용하여 군집의 서브세트로 클러스터링함에 의해 조사되었다. 지질체학 플랫폼 데이터를 7 (LC)로, 그리고 GCxGC-TOFMS 기반 대사체학 데이터를 6개 군집 (MC)으로 각각 분해시켰다. 각각의 군집 및 대표적인 대사산물의 설명을 표 2에 제시한다. 예상한 바와 같이, 큰 한도의 군집의 구분은 상이한 대사산물 기능성 그룹 또는 구조적 그룹에 따른다. 데이터를 0 평균(zero mean) 및 단위 변량으로 스케일링하여 서로 비슷한 대사산물 프로파일을 수득하였다. Bayesian 모델-기반 군집화를 스케일링된 데이터에 적용시켜 모든 샘플에 걸쳐 유사하게 나타난 지질을 그룹화하였다. 분석은 R 통계 언어 (Dalgaard, 2004)에서 패키지 "mclust"로서 실행되는 MCLUST (Fraley and Raftery, 2007) 방법을 이용하여 수행되었다. MCLUST에서 관찰된 데이터는 여러 군집의 혼합물로서 간주되며 각각의 군집은 유일한 확률 밀도 함수로부터 비롯된 것이다. 확률 분포를 제한하는 군집-특이적 파라메터와 함께 혼합물 중 군집의 수는 이후 다른 모델과 비교될 수 있는 모델을 규정할 것이다. 군집화 프로세스는 최적의 모델을 선택하고 그에 따른 데이터 분할을 결정한다. 4개 내지 15개 범위의 군집의 수 및 모든 이용가능한 모델 패밀리가 본 연구에서 고려되었다. 모델은 주변 우도의 근사치인 Bayesian 정보 기준 (BIC)을 이용하여 비교되었다. 최선의 모델은 데이터의 최대 주변 우도, 즉 최고 BIC 값을 제공하는 것이다.

표 2. 대사체 및 지질체 군집 설명

^a기준선에서 대조군, MCI, 및 AD 진단 그룹에 걸친 ANOVA.

약어: AA, 아라키돈산; DHA, 도코사헥산산; EPA, 에이코사펜탄산; 리소PC, 리소포스파티딜콜린; PC, 포스파티딜콜린.

실시예 4. 설명적 통계 분석

임상 데이터에 대한 통계 분석을 윈도우용 SPSS 소프트웨어 릴리스 14.0.1에 의해 수행하였다 (SPSS Inc; Chicago, IL). 상이한 연구 그룹간 비교는 독립적인 샘플 t-시험에 의해 수행되었다. 달리, 정상성에 대한 가정이 충족되지 않는 경우, 비파라메터 시험을 이용하였다. 범주형 데이터의 경우, 상이한 그룹간 비교는 카이 스퀘어 시험에 의해 이루어졌다.

Matlab (MathWorks, Natick, MA)에서 실행되는 일원 변량 분석 (ANOVA)을 이용하여 진단 그룹간 군집내 평균 대사산물 프로파일을 비교하였다. 개별적인 대사산물 수준에서의 통계적 분석을 R을 이용하여 수행하였다. 기준선에서 3개의 진단 그룹에 걸쳐 대사산물의 중앙값을 Kruskal-Wallis 일원 변량 분석을 이용하여 비교하는 한편, P-MCI 및 S-MCI 그룹의 중앙값을 Wilcoxon 시험에 의해 비교하였다. 개별적인 대사산물 수준은 "beanplot" R 패키지에서 실행된 빈플롯을 이용하여 가시화되었다 (Kampstra, 2008). 빈플롯은 각각의 그룹 내에서 평균 대사산물 수준에 대한 정보, 데이터-포인트 분포의 밀도를 제공할 뿐 아니라 개개의 데이터 포인트를 제시한다.

실시예 5. 진단 모델

2개의 상에서 최선의 마커 조합을 탐색하였다: 첫 번째 상에서 벌점 일반화 선형 모델 (Friedman et al., 2010)을 이용하여 현저한 마커 세트를 미리 스크리닝하였고 두 번째 상에서 단계적 최적화 알고리듬을 이용하여 마커 조합을 최적화하였다. 두 개의 상 모두에서 1000회의 크로스 확인 진행을 수행하였다. 각각의 진행에서, 샘플의 2/3 및 1/3을 각각 트레이닝 및 시험 세트로 무작위로 선택하였다. 첫 번째 상에서, 최저 CV-오차를 발생시키는 마커를 선택하였다. 두 번째 상에서, R에서 실행된 로지스틱 회귀 모델을 이용하여 관심 그룹을 구별하였다. 로지스틱 회귀 모델에서 최선의 마커 조합을 Akaike's 정보 기준을 이용하여 단계적 알고리듬에 의해 선택하였다 (Yamashita et al., 2007). 그 후 최선의 모델을 시험 세트 샘플에 이용하여 이들의 예측 부류를 산출하였다. 크로스 확인 진행의 각각에서 최적 마커 조합, 곡선하 면적(AUC) 통계치를 이용한 수신자 조작 특성 (ROC) 곡선, 승산비 및 상대 위험도를 기록하였다. 그 후 상이한 바이오마커 시그니처를 이들이 최선의 수행 모델로서 선택된 횟수에 기반하여 비교하였다. 이어서 상위 랭크된 시그니처의 성능을 상기와 동일한 절차를 이용하여 기록하였으나, 단지 대사산물의 선택된 조합만을 고려하였다. 곡선하 면적(AUC) 통계치를 이용한 수신자 조작 특성 (ROC) 곡선, 예측 정밀도, 승산비 및 상대 위험도를 2000회 크로스 확인 진행의 각각에 대하여 독립적으로 시험된 데이터 (샘플의 1/3)에서의 성능에 기반하여 기록하였다.

본 발명자들은 기준선에서의 대사체학 프로파일에 기반하여 안정성 및 진행성 MCI를 비교함에 의해, AD 예측의 실현가능성을 조사하였다. AD 예측의 실현가능성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 기준선에서의 AD 및 대조군의 비교에 기반하여 각각의 군집으로부터 상위 랭크된 대사산물을 선택하였고, 다중-크로스 확인 진행에서 모델 선택을 수행하였다. 그러한 초기 대사산물의 선택 이유는 군집이 이미 어느 정도 밀접하게 연관된 대사산물의 그룹을 나타내고 있기 때문이다.

최선의 모델은 3개의 대사산물을 함유하였다: LC3로부터의 PC (PC(16:0/16:0)), 카르복실산 (MC2) 및 2,4-디하이드록시부탄산 (MC1; PubChem CID 192742). 상위 모델은 1000회 크로스 확인 진행 중 195개에서 선택되었다. 다른 최선-선택된 모델은 2개의 대사산물을 함유하였으나 (카르복실산 및 2,4-디하이드록시부탄산), 다양한 지질 (리소PC(16:0), PC(16:0/20:5), PC(18:0/20:4) 또는 PC(O-18:1/16:0) 포함)을 지니거나 지니지 않았다. 도 2는 2000회 샘플링에서 수득된 독립적으로 시험된 데이터에 기반한, 조합된 3-대사산물 진단 모델의 개요를 제시한다.

대사산물 바이오마커 시그니처는 AD로의 진행을 예측하는 것으로 확인되었다 (도 2). P-MCI 및 S-MCI 환자를 구분하는 마커 패널에서의 주요 기여성 대사산물은 2,4-디하이드록시부탄산이었다. 흥미롭게도, 이러한 유기산은 CSF의 주요 구성요소이나 (Hoffmann et al., 1993, Stoop et al., 2010) 혈장에서는 CSF에서보다 거의 100배 더 낮은 농도로 발견된다 (Hoffmann et al., 1993). 2,4-디하이드록시부탄산의 생화학에 대해 이용가능한 데이터는 매우 부족하다. 한 보고서에서, 상기 대사산물은 D-갈락투론산 (Niemela and Sjostrom, 1985), 글루쿠론산의 입체이성질체인 요산으로부터 저산소 조건하에 과잉 생산되었다. 글루쿠론산은 본 발명자들의 연구에서 P-MCI 그룹에서 한계 유의성 수준으로 감소된다 (P=0.10). 이러한 설명의 뒷받침으로, 리보스-5-포스페이트의 감소 및 해당과정의 최종 생성물인 락트산의 증가를 포함하는, 경로 분석에 의해 제시된 바와 같이 펜토스 포스페이트 경로에서 유의한 차이가 존재하였다. 뇌에서의 저산소 조건하에 더 많은 글루코스가 펜토스 포스페이트 경로를 통해 대사된다고 알려져 있다 (Hakim et al., 1976). APP23 유전자이식 마우스에서의 연구는 실제로 저산소증이 알츠하이머병으로의 진행을 촉진시킴을 제시하였다 (Sun et al., 2006).

실시예 6. 뇌척수액에서 대사체학적 분석

GCxGC-TOFMS 플랫폼을 또한 이용하여 혈청 대사체학 연구에 포함된 환자의 서브세트로부터의 뇌척수액 (CSF) 샘플을 분석하였다 (표 1). 두 그룹을 비교하였다: (1) 대조군 - 대조군과 안정성 MCI를 합침 (N=26), 및 (2) AD 그룹 - AD 및 진행성 MCI (n=40). 한 연구는 혈액에서 측정된 바와 같이 AD와 연관된 대사산물 중 일부가 역시 CSF에 존재함을 확인시켜 주었다. 더욱이, 2,4-디하이드록시부탄산이 AD 그룹에서 현저하게 상향조절된 것이 발견되었는데 (P<0.05), 이는 이러한 대사산물의 상승된 혈청 수준이 뇌에서 2,4-디하이드록시부탄산 대사의 변화를 반영할 수 있음을 나타낸다.

AD, β-아밀로이드1-42 (Aβ42), 총 tau 단백질 (T-tau), 및 트레오닌 위치 181에서 인산화된 tau (P-tau)의 확립된 CSF 마커도 측정하였다. 이들 중에서, Aβ42만이 AD 그룹 (P<0.05)에서 유의하게 하향조절되었다. 그러나, Aβ42 및 2,4-디하이드록시부탄산의 CSF 프로파일은 상관 관계가 없었다. 둘 모두의 바이오마커는 단독으로 이용시 유사한 진단 모델을 생성하였으나, Aβ42와 2,4-디하이드록시부탄산을 조합했을 때, 모델은 현저하게 개선되었다 (AUC=0.80)(도 3). CSF에서 2,4-디하이드록시부탄산과 AD의 연관성은 상기 대사산물이 AD 병리생리학과 관련됨을 나타낸다.

참고문헌

Claims

(a) 피검체로부터 생물학적 유체 샘플을 수득하는 단계, 및
(b) 2,4-디하이드록시부탄산, 글리콜산, 2-하이드록시부티르산, 3-하이드록시부티르산, 3-하이드록시프로피온산, 글리세레이트, 3,4-디하이드록시부티르산 및 2-옥소이소발레르산 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병(AD)으로 진행될 피검체의 증가된 위험도를 진단하는 방법으로서,
건강한 피검체의 개별적인 평균 농도에 비해 증가된 농도(들)가 AD로 진행될 증가된 위험도를 나타내는 방법.
제 1항에 있어서, PC(16:0/18:1), PC(16:0/20:3), PC(16:0/16:0), PC(18:0/18:1), 글리실-프롤린, 시트르산, 아미노말론산 및 락트산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 건강한 피검체의 개별적인 평균 농도에 비해 증가된 농도(들)가 AD로 진행될 증가된 위험도를 나타내는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 리비톨, 페닐알라닌 및 D-리보스 5-포스페이트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 건강한 피검체의 개별적인 평균 농도에 비해 감소된 농도(들)가 AD로 진행될 증가된 위험도를 나타내는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 추출물의 옥심화 및 실릴화 이후, 전자 충돌 이온화 (EI)를 이용한 질량 분광분석 검출기 (MS)를 이용하여 스펙트럼 단편화 패턴 [73:998 55:991 75:558 98:355 117:351 57:328 83:271 69:237 54:217 81:203 84:144 132:143 56:133 51:128 129:126 173:121 100:118 67:109 71:105 95:103 113:79 109:74 45:70 105:66 131:59 60:59 49:59 111:58 47:57 61:56 145:53 65:51 146:49 112:49 82:47 64:47 91:46 130:43 118:41 53:41 78:40 85:39 143:38 313:37 107:37 102:36 171:33 97:32 133:31 103:31 68:31 104:30 70:29 135:28 162:25 119:25 187:24 149:24 147:24 74:24 142:23 242:22 269:21 123:21 121:21 87:21 190:20 160:20 66:20 670:19 165:19 144:18 240:17 655:16 581:16 328:16 311:16 172:16 62:16 680:15 309:15 267:15 199:15 185:15 127:15 122:15 108:15 77:15]을 지니고, 5% 페닐 메틸 실리콘 모세관 컬럼을 이용한 가스 크로마토그래피 분리(GC)에서 측정된 2742 +/- 30의 보존 지수를 지니는 대사산물의 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 건강한 피검체의 개별적인 평균 농도에 비해 증가된 농도(들)가 AD로 진행될 증가된 위험도를 나타내는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 추출물의 옥심화 및 실릴화 이후, 전자 충돌 이온화 (EI)를 이용한 질량 분광분석 검출기 (MS)를 이용하여 스펙트럼 단편화 패턴 [73:999, 45:278, 216:152, 57:126, 74:82, 335:82, 75:79, 320:61, 91:28, 174:21, 105:17, 59:14, 115:7, 55:5, 77:2]을 지니고, 5% 페닐 메틸 실리콘 모세관 컬럼을 이용한 가스 크로마토그래피 분리(GC)에서 측정된 2040 +/- 30의 보존 지수를 지니는 대사산물의 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 건강한 피검체의 개별적인 평균 농도에 비해 감소된 농도(들)가 AD로 진행될 증가된 위험도를 나타내는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 추출물의 옥심화 및 실릴화 이후, 전자 충돌 이온화 (EI)를 이용한 질량 분광분석 검출기 (MS)를 이용하여 스펙트럼 단편화 패턴 [75:996, 73:927, 117:664, 55:455, 129:347, 132:205, 45:197, 67:180, 69:140, 57:137, 81:124, 145:124, 74:99, 47:97, 131:97, 61:76, 83:69, 56:68, 95:66, 76:63, 79:60, 54:57, 96:52, 77:45, 313:45, 118:43, 82:40, 68:39, 84:36, 97:35, 98:31, 53:28, 93:24, 80:22, 109:19, 133:19, 91:7, 72:6, 116:5, 59:4, 110:4, 94:2]을 지니고, 5% 페닐 메틸 실리콘 모세관 컬럼을 이용한 가스 크로마토그래피 분리(GC)에서 측정된 2769.5 +/- 30의 보존 지수를 지니는 대사산물의 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 건강한 피검체의 개별적인 평균 농도에 비해 감소된 농도(들)가 AD로 진행될 증가된 위험도를 나타내는 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 추출물의 옥심화 및 실릴화 이후, 전자 충돌 이온화 (EI)를 이용한 질량 분광분석 검출기 (MS)를 이용하여 스펙트럼 단편화 패턴 [73:948, 174:852, 86:611, 59:409, 45:299, 100:277, 170:171, 175:143, 69:119, 80:77, 53:75, 74:74, 97:67, 176:54, 68:52, 130:50, 58:48, 89:34, 54:30, 55:30, 87:29, 57:26, 126:26, 75:22, 129:20, 139:20, 78:15, 70:13, 60:11, 81:11, 102:11, 56:10, 127:8, 67:7, 83:7, 140:7, 85:6, 171:4, 77:3, 79:3, 91:3, 101:3, 158:3, 46:2, 47:2, 51:2, 72:2, 82:2, 117:2, 50:1, 61:1, 66:1, 84:1, 98:1, 99:1, 112:1, 131:1]을 지니고, 5% 페닐 메틸 실리콘 모세관 컬럼을 이용한 가스 크로마토그래피 분리(GC)에서 측정된 1520.1 +/- 30의 보존 지수를 지니는 대사산물의 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 건강한 피검체의 개별적인 평균 농도에 비해 감소된 농도(들)가 AD로 진행될 증가된 위험도를 나타내는 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 농도에서의 상대적 변화를 비교하는 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 절대 농도에서의 변화가 증가된 위험도를 나타내는 방법.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 2,4-디하이드록시부탄산, 글리콜산, 2-하이드록시부티르산, 3-하이드록시부티르산, 3-하이드록시프로피온산, 글리세르산, 3,4-디하이드록시부티르산 및 2-옥소이소발레르산 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물 및 PC(16:0/18:1), PC(16:0/20:3), PC(16:0/16:0), PC(18:0/18:1), 글리실-프롤린, 시트르산, 아미노말론산 또는 락트산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도가 증가하는 방법.
제 10항에 있어서, 추가로, GC-EI/MS를 이용한 유도체화된 대사산물의 스펙트럼 단편화 패턴: [73:998 55:991 75:558 98:355 117:351 57:328 83:271 69:237 54:217 81:203 84:144 132:143 56:133 51:128 129:126 173:121 100:118 67:109 71:105 95:103 113:79 109:74 45:70 105:66 131:59 60:59 49:59 111:58 47:57 61:56 145:53 65:51 146:49 112:49 82:47 64:47 91:46 130:43 118:41 53:41 78:40 85:39 143:38 313:37 107:37 102:36 171:33 97:32 133:31 103:31 68:31 104:30 70:29 135:28 162:25 119:25 187:24 149:24 147:24 74:24 142:23 242:22 269:21 123:21 121:21 87:21 190:20 160:20 66:20 670:19 165:19 144:18 240:17 655:16 581:16 328:16 311:16 172:16 62:16 680:15 309:15 267:15 199:15 185:15 127:15 122:15 108:15 77:15]을 지니고, 5% 페닐 메틸 실리콘 모세관 컬럼을 이용한 가스 크로마토그래피 분리에서 측정된 2742 +/- 30의 보존 지수를 지니는 대사산물의 농도가 증가하는 방법.
제 7항에 있어서, 추가로, GC-EI/MS를 이용한 유도체화된 대사산물의 스펙트럼 단편화 패턴: [73:999, 45:278, 216:152, 57:126, 74:82, 335:82, 75:79, 320:61, 91:28, 174:21, 105:17, 59:14, 115:7, 55:5, 77:2]을 지니고, 5% 페닐 메틸 실리콘 모세관 컬럼을 이용한 가스 크로마토그래피 분리에서 측정된 2040 +/- 30의 보존 지수를 지니는 대사산물의 농도가 감소하는 방법.
제 7항에 있어서, 추가로, GC-EI/MS를 이용한 유도체화된 대사산물의 스펙트럼 단편화 패턴: [75:996, 73:927, 117:664, 55:455, 129:347, 132:205, 45:197, 67:180, 69:140, 57:137, 81:124, 145:124, 74:99, 47:97, 131:97, 61:76, 83:69, 56:68, 95:66, 76:63, 79:60, 54:57, 96:52, 77:45, 313:45, 118:43, 82:40, 68:39, 84:36, 97:35, 98:31, 53:28, 93:24, 80:22, 109:19, 133:19, 91:7, 72:6, 116:5, 59:4, 110:4, 94:2]을 지니고, 5% 페닐 메틸 실리콘 모세관 컬럼을 이용한 가스 크로마토그래피 분리에서 측정된 2769.5 +/- 30의 보존 지수를 지니는 대사산물의 농도가 감소하는 방법.
제 7항에 있어서, 추가로, GC-EI/MS를 이용한 유도체화된 대사산물의 스펙트럼 단편화 패턴: [73:948, 174:852, 86:611, 59:409, 45:299, 100:277, 170:171, 175:143, 69:119, 80:77, 53:75, 74:74, 97:67, 176:54, 68:52, 130:50, 58:48, 89:34, 54:30, 55:30, 87:29, 57:26, 126:26, 75:22, 129:20, 139:20, 78:15, 70:13, 60:11, 81:11, 102:11, 56:10, 127:8, 67:7, 83:7, 140:7, 85:6, 171:4, 77:3, 79:3, 91:3, 101:3, 158:3, 46:2, 47:2, 51:2, 72:2, 82:2, 117:2, 50:1, 61:1, 66:1, 84:1, 98:1, 99:1, 112:1, 131:1]을 지니고, 5% 페닐 메틸 실리콘 모세관 컬럼을 이용한 가스 크로마토그래피 분리에서 측정된 1520.1 +/- 30의 보존 지수를 지니는 대사산물의 농도가 감소하는 방법.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 2,4-디하이드록시부탄산의 농도를 측정하는 방법.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 포스파티딜콜린 (16:0/16:0)의 농도를 측정하는 방법.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 시트르산의 농도를 측정하는 방법.
제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 페닐알라닌의 농도를 측정하는 방법.
제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 글리실-프롤린의 농도를 측정하는 방법.
제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 2,4-디하이드록시부탄산, 글리콜산, 2-하이드록시부티르산, 3-하이드록시부티르산, 3-하이드록시프로피온산, 글리세레이트, 시트르산, 락트산, 3,4-디하이드록시부티르산 및 2-옥소이소발레르산 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물의 농도가 기준 수준에 비해 적어도 5%만큼 증가하는 방법.